III. MATERIAL UND METHODE
2. Ergebnisse der Validierung
2.1 Selektivität
Die Selektivität der Methode wurde für die Substanzen Coffein, Theobromin, Theophyllin und Paraxanthin überprüft. Zu den Retentionszeiten der Analyten und der internen Standards traten keine Störpeaks im Chromatogramm auf, so dass eine ausreichende Trennung dieser Substanzen gewährleistet und die Selektivität der Methode somit bestätigt ist. Den Abbildungen 14 und 15 sind beispielhaft Chromatogramme von Coffein und dem Metaboliten Theophyllin als Leerplasmaprobe und mit einer Konzentration dieser Stoffe von 100 ng/ml Plasma dargestellt. Abbildungen 16 und 17 zeigen beispielhaft Chromatogramme von Theobromin und Paraxanthin als Leerurinprobe sowie mit einer Konzentration von 100 ng /ml Urin.
Abb. 14: HPLC/MS/MS–Chromatogramme von Coffein- und Theophyllinplasmaproben zu den entsprechenden Retentionszeiten, denen keine Substanz zugesetzt wurde.
Abb. 15: HPLC/MS/MS–Chromatogramme von Coffein- und Theophyllinplasmaproben zu den entsprechenden Retentionszeiten, denen 100 ng Coffein respektive Theophyllin pro ml Plasma zugesetzt wurden.
Abb.16: HPLC/MS/MS-Chromatogramme von Theobromin- und Praxanthinurinproben zu den entsprechenden Retentionszeiten, denen keine Substanz zugesetzt wurde.
Abb.17: HPLC/MS/MS-Chromatogramme von Theobromin- und
Paraxanthinurinproben zu den entsprechenden Retentionszeiten, denen 100 ng Theobromin respektive Paraxanthin pro ml Urin zugesetzt wurden.
2.2 Linearität
Plasma
Die Substanzen Coffein, Theobromin und Theophyllin sind linear in den überprüften Bereichen von 20 bis 1000 ng/ml, von 1000 bis 10000 ng/ml und von 10000 bis 50000 ng/ml.
Im Plasma betrugen die Abweichungen der gemessenen von den erwarteten Konzentrationen der untersuchten Methylxanthine an allen Messtagen im niedrigsten Konzentrationsbereich weniger als 20 % und in den höheren Konzentrationsbereichen weniger als 15 %.
Als Beispiel für die Linearität der Substanzen im Plasma sind in den Abbildungen 18 und 19 die Kalibrationskurven von Coffein und Theobromin in einem Konzentrationsbereich von 20 bis 1000 ng/ml Plasma darstellt.
y = 0.0058x - 0.0126
Abb. 18: Kalibrationskurve mit Angabe der Kalibrationsgleichung und des
Korrelationskoeffizienten für Coffein im Plasma; je Konzentrationsstufe liegen zwei Messpunkte vor.
Abb. 19: Kalibrationskurve mit Angabe der Kalibrationsgleichung und des
Korrelationskoeffizienten für Theobromin im Plasma; je Konzentrationsstufe liegen zwei Messpunkte vor.
Urin
Bei der visuellen Prüfung der Kalibrationskurven konnte für Coffein die Linearität in dem Konzentrationsbereich von 25 bis 1000 ng/ml bestätigt werden. In den höheren Konzentrationsbereichen von 1000 bis 30000 ng/ml war diese jedoch nicht gegeben, so dass in diesem Fall das quadratische Regressionsmodell gewählt wurde. Die Untersuchungen der Residuen verdeutlichten anhand des F-Tests, dass diese signifikant kleinere Varianzen beim quadratischen Regressionsmodell aufwiesen, als es bei der linearen Regression der Fall war.
Die Linearität von Theobromin konnte in den Konzentrationsbereichen von 25 bis 1000 ng/ml und von 1000 bis 30000 ng/ml nicht visuell bestätigt werden. Auch hier erfüllte das quadratische Modell für beide Konzentrationsbereiche die Anforderungen. Für Theophyllin konnte die Linearität in den entsprechenden Konzentrationsbereichen von 25 bis 1000 ng/ml bzw. von 1000 bis 30000 ng/ml bestätigt werden. Paraxanthin wurde nur im
0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000
Konzentration [ng/ml]
Quotient (Subst./IS)
Abb. 20: Kalibrationskurve mit Angabe der Kalibrationsgleichung und des
Korrelationskoeffizienten für Coffein im Urin; je Konzentrationsstufe liegen
y = -1E-07x2 + 0.01x + 10.773 R2 = 0.9963
0 50 100 150 200 250
0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000
Konzentration [ng/ml]
Quotient (Subst./IS)
Abb. 21: Kalibrationskurve mit Angabe der Kalibrationsgleichung und des
Korrelationskoeffizienten für Theobromin im Urin; je Konzentrationsstufe liegen zwei Messpunkte vor.
Die Abweichungen der gemessen von den erwarteten Konzentrationen betrugen auch im Urin an allen Messtagen bei Coffein, Theobromin und Theophyllin und Paraxanthin im niedrigsten Konzentrationsbereich weniger als 20 % und in den höheren Konzentrationsbereichen weniger als 15 %.
2.3 Nachweisgrenze
Plasma
Die Nachweisgrenzen für Coffein, Theobromin und Theophyllin im Plasma sind in nachfolgender Tabelle 20 aufgeführt.
Tab. 20: Nachweisgrenzen für Coffein, Theobromin und Theophyllin im Plasma Nachweisgrenze (LOD)
[ng/ml]
Coffein 14
Theobromin 15
Theophyllin 13
Urin
Die Nachweisgrenzen für Coffein, Theobromin, Theophyllin und Paraxanthin im Urin sind in Tabelle 21 aufgeführt.
Tab. 21: Nachweisgrenzen für Coffein, Theobromin, Theophyllin und Paraxanthin im Urin
Nachweisgrenze (LOD) [ng/ml]
Coffein 33
Theobromin 26
Theophyllin 20
Paraxanthin 32
2.4 Bestimmungsgrenze
Plasma
Die Bestimmungsgrenzen für Coffein, Theobromin und Theophyllin im Plasma sind der nachfolgenden Tabelle 22 zu entnehmen.
Tab. 22: Bestimmungsgrenzen für Coffein, Theobromin und Theophyllin im Plasma Bestimmungsgrenze (LOQ)
[ng/ml]
Coffein 100
Theobromin 100
Theophyllin 100
Urin
Die Bestimmungsgrenzen für Coffein, Theobromin, Theophyllin und Paraxanthin im Urin sind in Tabelle 23 aufgelistet.
Tab. 23: Bestimmungsgrenzen für Coffein, Theobromin, Theophyllin und Paraxanthin im Urin
Bestimmungsgrenze (LOQ) [ng/ml]
Coffein 50
Theobromin 100
Theophyllin 50
Paraxanthin 50
2.5 Richtigkeit
Plasma
Die Überprüfung der Methode auf Richtigkeit im Plasma konnte für die Konzentrationen von 100, 1000 und 10000 ng/ml Plasma bei Coffein, Theobromin und Theophyllin bestätigt werden. Tabelle 24 weist die entsprechenden Ergebnisse auf.
Tab. 24: Relative Abweichung (RA) von Coffein, Theobromin und Theophyllin zur Beschreibung der Richtigkeit der Methode für die Matrix Plasma
Erwartete Coffein Theobromin Theophyllin
Konzen- Mittelwert der Relative Mittelwert der Relative Mittelwert der Relative Tag trationen gemessenen Abweichung gemessenen Abweichung gemessenen Abweichung
[ng/ml] Konzentrationen RA [%] Konzentrationen RA [%] Konzentrationen RA [%]
[ng/ml] [ng/ml] [ng/ml]
100 105,1 5,1 95,0 5,0 100,3 0,3
1 1000 967,2 3,3 996,6 0,3 1049,7 5,0
10000 9554,6 4,5 10098,0 1,0 10127,5 1,3
100 96,6 3,4 91,6 8,4 116,6 16,6
2 1000 1138,9 13,9 1039,5 4,0 1008,0 0,8
10000 10555,3 5,6 9739,6 2,6 10000,4 0
100 121,2 21,2 127,4 27,4 109,0 9,0
3 1000 1062,6 6,3 976,7 2,3 998,2 2,8
10000 10172,2 1,7 1056,8 5,2 10358,0 3,6
Die relative Abweichung betrug im unteren Konzentrationsbereich weniger als 20 % und in den oberen Konzentrationsbereichen weniger als 15 %. Allerdings waren am dritten Tag sowohl bei Coffein als auch bei Theobromin bei einer Konzentration von 100 ng/ml relative Abweichungen oberhalb von 20 % erkennbar.
Urin
In den nachfolgenden Tabellen 25 und 26 sind die Ergebnisse zur Überprüfung der Richtigkeit für die angewandte Methode bei Theobromin und Theophyllin, sowie bei Coffein und Paraxanthin zusammengestellt. Die entsprechend eingesetzten Konzentrationen sind ebenfalls diesen Tabellen zu entnehmen.
Tab. 25: Relative Abweichung (RA) von Theobromin und Theophyllin zur Beschreibung der Richtigkeit der Methode für die Matrix Urin
Mittelwert der Mittelwert der
erwartete gemessenen Relative erwartete gemessenen Relative
Tag Konzentrationen Theobromin- Abweichung Konzentrationen Theophyllin- Abweichung [ng/ml] Konzentrationen RA [%] [ng/ml] Konzentrationen RA [%]
Tab. 26: Relative Abweichung (RA) von Coffein und Paraxanthin zur Beschreibung der Richtigkeit der Methode für die Matrix Urin
Mittelwert der Mittelwert der
erwartete gemessenen Relative erwartete gemessenen Relative
Tag Konzentrationen Coffein- Abweichung Konzentrationen Paraxanthin- Abweichung [ng/ml] Konzentrationen RA [%] [ng/ml] Konzentrationen RA [%]
Die relative Abweichung lag bei allen Substanzen im niedrigen Konzentrationsbereich unter 20 % und in höheren Konzentrationsbereichen unter 15 %.
2.6 Präzision
Plasma
Die folgende Tabelle 27 beinhaltet die Ergebnisse der Präzisionsberechnung für Coffein, Theobromin und Theophyllin im Plasma.
Tab. 27 Intraday- und Interday-Präzision von Coffein, Theobromin und Theophyllin im Plasma
Coffein Theobromin Theophyllin
erwartete Intraday Interday Intraday Interday Intraday Interday Konzentrationen
Sowohl die Intraday- als auch die Interday-Präzision lagen bei allen Substanzen innerhalb der Abweichungsgrenze von 20 % im Bereich der niedrigsten und 15 % im Bereich der höheren Konzentrationen.
Urin
In den nachfolgenden Tabellen 28 und 29 sind die Ergebnisse der Intraday- und Interday-Präzision im Urin aufgeführt.
Tab. 28: Intraday- und Interday-Präzision von Theobromin und Theophyllin im Urin
Theobromin Theophyllin
erwartete Intraday Interday erwartete Intraday Interday
Konzentrationen Präzision Präzision Konzentrationen Präzision Präzision
[ng/ml] [%] [%] [ng/ml] [%] [%]
100 3,2 9,7 50 8,2 4,6
2500 6,9 3,5 2500 8,3 5,9
20000 16,8 5,2 20000 14,9 5,2
Tab. 29: Intraday- und Interday-Präzision von Coffein und Paraxanthin im Urin
Coffein Paraxanthin
erwartete Intraday Interday erwartete Intraday Interday
Konzentrationen Präzision Präzision Konzentrationen Präzision Präzision
[ng/ml] [%] [%] [ng/ml] [%] [%]
50 14,2 13,3 50 9,1 14,8
100 13,3 13,0 250 7,4 4,6
20000 8,1 2,1 1000 14,9 5,6
Intraday- und Interday-Präzision liegen bei allen Substanzen innerhalb der Abweichungsgrenze von 20 % im Bereich der niedrigsten und 15 % im Bereich der höheren Konzentrationen
2.7 Stabilität
Plasma
Die Ergebnisse der Stabilitätsprüfung von Coffein, Theobromin und Theophyllin im Plasma mit den jeweiligen Konzentrationen am Tag 0 und nach 28 Tagen sind in den Tabellen 30 bis 32 aufgeführt.
Tab. 30: Stabilitätsdaten für Coffein im Plasma
Tag 0 Tag 28
erwartete Mittelwert der Mittelwert der
Konzentrationen gemessenen gemessenen Abweichung Konzentrationen Konzentrationen
[ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [%]
100 95,4 78,8 -17,2
1000 953,9 901,7 -5,5
Tab. 31: Stabilitätsdaten für Theobromin im Plasma
Tag 0 Tag 28
erwartete Mittelwert der Mittelwert der
Konzentrationen gemessenen gemessenen Abweichung Konzentrationen Konzentrationen
[ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [%]
100 97,3 97,4 0,1
1000 1066,3 984,8 -7,6
Tab. 32: Stabilitätsdaten für Theophyllin im Plasma
Tag 0 Tag 28
erwartete Mittelwert der Mittelwert der
Konzentrationen gemessenen gemessenen Abweichung Konzentrationen Konzentrationen
[ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [%]
100 100,0 98,5 -1,5
1000 977,5 970,8 -0,7
Diese Ergebnisse und der Vergleich der Messdaten mit Hilfe des in Kapitel III.6.7 aufgeführten U-Tests lassen darauf schließen, dass Coffein zwar nach einem Zeitraum von 28 Tagen einen Substanzverlust aufweist, dieser jedoch innerhalb der für die Richtigkeit und Präzision geltenden Abweichung von 20 % im niedrigen Konzentrationsbereich und 15 % im hohen Konzentrationsbereich liegt. Theobromin und Theophyllin sind innerhalb des Zeitraums von 28 Tagen stabil.
Urin
Die Ergebnisse der Stabilitätsprüfung für die Substanzen Coffein, Theobromin, Theophyllin und Paraxanthin im Urin mit den jeweiligen Konzentrationen am Tag 0 und nach 28 Tagen sind in Tabellen 33 bis 36 aufgeführt.
Tab. 33: Stabilitätsdaten für Coffein im Urin
Tag 0 Tag 28
erwartete Mittelwert der Mittelwert der
Konzentrationen gemessenen gemessenen Abweichung Konzentrationen Konzentrationen
[ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [%]
100 89,0 92,1 3,4
1000 943,2 1134,2 4,7
Tab. 34: Stabilitätsdaten für Theobromin im Urin
Tag 0 Tag28
erwartete Mittelwert der Mittelwert der
Konzentrationen gemessenen gemessenen Abweichung Konzentrationen Konzentrationen
[ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [%]
100 100,3 98,0 -2,3
1000 1134,2 982,7 -13,6
Tab 35: Stabilitätsdaten für Theophyllin im Urin
Tag 0 Tag 28
erwartete Mittelwert der Mittelwert der
Konzentrationen gemessenen gemessenen Abweichung Konzentrationen Konzentrationen
[ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [%]
100 96,7 100,7 -3,9
1000 1051,0 1001,5 -4,7
Tab. 36: Stabilitätsdaten für Paraxanthin im Urin
Tag 0 Tag 28
erwartete Mittelwert der Mittelwert der
Konzentrationen gemessenen gemessenen Abweichung Konzentrationen Konzentrationen
[ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [%]
100 104,3 103,3 -1,0
1000 946,9 896,6 -5,3
Diese Ergebnisse verdeutlichen unter Berücksichtigung des in Kapitel III.6.7 aufgeführten
U-Tests, dass sowohl Coffein und Theobromin als auch Theophyllin und Paraxanthin in einem Zeitraum von 28 Tagen geringgradige Konzentrationsveränderungen aufweisen. Diese Abweichungen liegen jedoch innerhalb der bei der Richtigkeit und Präzision geltenden Abweichungen von 20 % für den niedrigen Konzentrationsbereich und 15 % für den höheren Konzentrationsbereich, so dass eine Stabilität dieser Substanzen für diesen Zeitraum angenommen werden kann.
2.8 Wiederfindung
Plasma
Die prozentualen Wiederfindungsraten der Substanzen Coffein, Theobromin und Theophyllin im Plasma sind Tabelle 37 zu entnehmen.
Tab. 37: Wiederfindungsraten von Coffein, Theobromin, Theophyllin im Plasma
Substanzen Anzahl der Mittlere Standard- Variations- Proben Wiederfindungsrate [%] abweichung koeffizient [%]
Coffein 6 100,0 0,4 6,6
Theobromin 6 84,9 0,3 10,9
Theophyllin 6 90,2 0,3 4,5
Urin
Die Ergebnisse der Wiederfindung von Coffein, Theobromin, Theophyllin und Paraxanthin im Urin sind in Tabelle 38 beschrieben.
Tab. 38: Wiederfindungsraten von Coffein, Theobromin, Theophyllin und Paraxanthin im Urin
Substanzen Anzahl der Mittlere Standard- Variations- Proben Wiederfindungsrate [%] abweichung koeffizient [%]
Coffein 6 92,4 0,2 2,5
Theobromin 6 93,4 0,2 4,4
Theophyllin 6 96,1 0,2 0,5
Paraxanthin 6 95,9 0,2 8,7