Berechnung der Ausscheidungszeiten von Coffein und Theobromin

6.1 Berechnung der Ausscheidungszeiten von Coffein nach intravenöser Applikation

Die Berechnungen der Ausscheidungszeiten von Coffein aus dem Plasma wurden bis zum Erreichen der irrelevanten Plasmakonzentration (IPC) unter Berücksichtigung der Dosierungsintervalle von 13 und 24 Stunden sowie bis zum Erreichen der Nachweisgrenze respektive der Quantifizierungsgrenze durchgeführt. Grundlage der Berechnungen bilden die in Tabelle 39 aufgeführten Daten. Die Berechnungen der Ausscheidungszeiten erfolgte anhand nachstehender Formel (KIETZMANN, 1983):

max ln( ) max

lnC C t

t_A - ^Grenze +

= b [h]

tA = Ausscheidungszeit

tmax = Zeitpunkt bis zum Erreichen der maximal Konzentration Cmax

Cmax = maximale Konzentration im Plasma

CGrenze = Irrelevante Plasmakonzentration, Quantifizierungsgrenze, Nachweisgrenze β = Eliminationskonstante

In der nachfolgenden Tabelle 44 sind die Ergebnisse der aufgeführten Berechnungen für die einzelnen Pferde dargestellt.

Tab. 44: Ausscheidungszeiten von Coffein aus dem Plasma nach intravenöser

Applikation von 4 mg/kg Körpergewicht bis zum Erreichen der IPC (nach einem Dosierungsintervall von 13 bzw. 24 Stunden) bzw. der LOQ und LOD nach KIETZMANN (1983)

6.2 Berechnung der Ausscheidungszeiten von Coffein nach oraler Applikation

Die Ausscheidungszeiten von Coffein nach oraler Applikation wurden bis zur Nachweis- bzw. Quantifizierungsgrenze unter Anwendung der in Kapitel IV.6.1 aufgeführten Formel nach KIETZMANN (1983) berechnet. Die zur Berechnung der Ausscheidungszeiten benötigten pharmakokinetischen Daten sind der Tabelle 40 zu entnehmen. Die Ausscheidungszeiten sind in nachfolgender Tabelle 45 aufgeführt.

Tab. 45: Ausscheidungszeiten von Coffein aus dem Plasma nach oraler Applikation von Coffein bis zum Erreichen der LOQ bzw. der LOD nach KIETZMANN

(1983):

6.3 Berechnung der Ausscheidungszeiten von Theobromin nach oraler Applikation

Die Ausscheidungszeiten von Theobromin bis zur Nachweis- bzw. Quantifizierungsgrenze wurden mit Hilfe der Formel nach KIETZMANN (1983) (siehe Kapitel IV.6.1) berechnet.

Grundlage der Berechnungen bilden die in Tabelle 41 aufgeführten Daten. Die Ausscheidungszeiten sind in nachfolgender Tabelle 46 dargestellt.

Tab. 46: Ausscheidungszeiten von Theobromin aus dem Plasma nach oraler Applikation von Theobromin bis zum Erreichen der LOQ bzw. der LOD nach

KIETZMANN (1983):

V. DISKUSSION

Ziel der vorliegenden Studie war es, nach Optimierung und Validierung einer Analysemethode das Ausscheidungsverhalten von Coffein und Theobromin in Plasma und Urin nach intravenöser bzw. oraler Applikation von jeweils 4 mg/kg Körpergewicht Coffein und Theobromin zu untersuchen. Die in Plasma und Urin ermittelten Daten wurden pharmakokinetischen Berechnungen unterzogen. Unter Anwendung eines von TOUTAIN und LASSOURD (2002) entwickelten PK/PD-Modells konnten aus diesen Ergebnissen irrelevante Plasma- und Urinkonzentrationen bestimmt werden, mit dem Ziel eine Aussage darüber zu treffen, wie lange Coffein und Theobromin in beiden Matrices detektierbar sind und welche Konsequenzen sich daraus für die Dopingrelevanz ergeben.

1. Analysemethode (HPLC/MS/MS)

Die in dieser Arbeit beschriebene Analysemethode für Coffein und Theobromin wurde in Anlehnung an eine Routinemethode, die im Institut für Biochemie der Deutschen Sporthochschule Köln im Rahmen der Dopinganalytik polarer Substanzen eingesetzt wird, durchgeführt. Die mittels dieser Methode untersuchten Vorversuchsproben ließen erkennen, dass für eine Quantifizierung von Coffein und Theobromin sowie der Metaboliten Theophyllin und Paraxanthin Modifikationen der bisherigen Methode für Plasma und Urin erforderlich waren.

Zur Bestimmung der Substanzen Coffein, Theobromin und ihrer Metaboliten bis zu einer Konzentration von 10 µg/ml wurde daher sowohl bei der Urinaufarbeitung, als auch bei der Plasmaaufarbeitung ein Volumen von 2,5 ml gewählt, was zu einer prägnanten Ausbildung des Messsignals und einer guten Integration führte. Bei Werten über 10 µg/ml wurde das Volumen der aufgearbeiteten Proben auf 1 ml reduziert, um auswertbare Peaksignale zu erreichen. Um die bei der Urinaufarbeitung zunächst beobachteten und durch Matrixbestandteile begründeten Störpeaks zu beheben, wurden die Urinproben vor Aufgabe auf die Festphasenextraktionssäule zentrifugiert. Auf diese Weise konnte die Reinheit der Extrakte verbessert werden. Im Rahmen der Plasmaaufarbeitung wurde zusätzlich eine Proteolyse vorgenommen, die bei Coffein zu einer um 10 % verbesserten Ausbeute führte.

Die Substanzausbeute von Theobromin und Theophyllin war im Vergleich zur Aufarbeitung

ohne Protelyse nahezu doppelt so hoch. Diese Erkenntnisse entsprachen weitestgehend denen in der Literatur veröffentlichten Angaben von KELLY und LAMBERT (1978), GREEN et al.

(1983) und CHOU et al. (2001), die im Pferdeplasma für Coffein eine Proteinbindung von 2 bzw. 12 % und für Theophyllin eine Proteinbindung von 20 % angeben. Laut KELLY und LAMBERT (1978) liegt Theobromin allerdings im Pferdeplasma nur zu 3 % proteingebunden vor, was jedoch mit der Feststellung, dass nach Proteolyse die Ausbeute von Theobromin fast doppelt so hoch war, nicht in Einklang zu bringen ist. Als interne Standards (IS) wurden sowohl im Plasma als auch im Urin deuteriertes Coffein und Theobromin (D3-Coffein bzw.

D6-Theobromin) sowie ein am Stickstoffatom markiertes Theophyllin (1,3-15N2-Theophyllin) ausgewählt.

Die Ergebnisse der Validierung, die die Kriterien Selektivität, Linearität, Richtigkeit, Präzision, Stabilität und Wiederfindung beinhaltete, belegten, dass diese Analysemethoden geeignet sind, Coffein und seine Metaboliten in einem Konzentrationsbereichen von 13 ng /ml bis 50000 ng/ml im Plasma bzw. von 33 ng/ml bis 30000 ng/ml im Urin nachzuweisen.

Die im Plasma festgestellte Quantifizierungsgrenze von 100 ng/ml für Coffein, Theobromin und Theophyllin war im Vergleich zu den Quantifizierungsgrenzen im Urin höher. Dies ist zum einen in den unterschiedlichen Eigenschaften der biologischen Matrix begründet. Zum anderen resultiert die Quantifizierungsgrenze aus den von den Leitlinien der EHSLC (2002) vorgeschriebenen umfangreichen Kriterien, die zur Erfüllung der Validierung für jede Substanz einzeln eingehalten werden mussten. Die Quantifizierungsgrenze im Urin betrug für Coffein, Theophyllin und Paraxanthin 50 ng/ml. Für Theobromin konnte eine LOQ von 100 ng/ml ermittelt werden. Die LOQ liegt somit außer bei Theobromin im Urin niedriger als im Plasma, so dass der Tatsache, dass Urin die dopingrelevantere Matrix ist, Rechnung getragen werden kann. Die im Plasma erreichten Nachweisgrenzen betrugen 14 ng/ml für Coffein, 15 ng/ml für Theobromin und 13 ng/ml für Theophyllin. Die für Coffein ermittelte Nachweisgrenze liegt nur geringgradig oberhalb von dem von der MRA für Coffein festgesetzten Grenzwert von 10 ng/ml. Gleiches gilt für die im Urin ermittelte Nachweisgrenze für Coffein von 33 ng/ml, die um 3 ng/ml von dem, von dem Pferdesportverband in Hongkong (zitiert nach TOBIN et al., 1999) festgesetzten Grenzwert von 30 ng/ml Urin, abweicht. Die im Urin und Plasma eingesetzte Methode erweist sich demnach als nicht geeignet, um sowohl einen im Sinne der MRA als auch im Sinne des Pferdesportverbandes in Hongkong coffeinpositiven Dopingbefund eines Pferdes im Plasma und Urin quantifizieren zu können. Betrachtet man allerdings die nach TOUTAIN und

LASSOURD (2002) ermittelte IPC und IUC, die bei der Annahme eines Dosierungsintervalls von 24 Stunden weit unterhalb der von der MRA und dem Pferdesportverband in Hongkong festgesetzten Grenzwerte liegen, so ist auch noch unterhalb dieser Grenzwerte eine pharmakodynamische Wirkung nicht ausschließbar. Demzufolge ist jeder Nachweis von Coffein als dopingrelevant zu interpretieren, so dass die mittels dieser Methode erreichten Nachweisgrenzen als ausreichend sensitiv zu werten sind.