Abb. 32: Urinkonzentrationsverläufe von Theobromin bei sechs Pferden nach einmaliger oraler Applikation von 4 mg Theobromin pro kg Körpergewicht
3. Bewertung der Ergebnisse
Mit dieser Arbeit wurde eine geeignete Analysemethode für den Nachweis von Coffein und seiner Metaboliten Theobromin, Theophyllin und Paraxanthin entwickelt und validiert. Eine Etablierung dieser Methode in die internationale Routinediagnostik kann zum vereinheitlichten Nachweis von Coffein und seinen Metaboliten in Dopingproben genutzt werden.
Anhand der Ermittlung der irrelevanten Plasma- und Urinkonzentrationen nach TOUTAIN und LASSOURD (2002) sollte überprüft werden, ob eine Festlegung von Grenzwerten für Coffein im Hinblick auf die pharmakologische Relevanz möglich ist. Grundsätzlich erscheint diese Vorgehensweise bei therapeutisch häufig eingesetzten Medikamenten durchaus sinnvoll, um trotz Teilnahme an Wettkämpfen eine adäquate veterinärmedizinische Versorgung zu gewährleisten. Für Coffein allerdings ist von einer Festlegung von Grenzwerten aus folgenden Gründen abzuraten.
Coffein ist in der Veterinärmedizin als Therapeutikum nicht zugelassen. Dementsprechend ist auch kein Handelspräparat erhältlich. Eine Umwidmung aufgrund eines therapeutischen Notstandes kommt ebenfalls nicht in Frage, da ausreichend Medikamente mit einem potentielleren Wirkunsgspektrum des Coffeins zur Verfügung stehen. Der Einsatz von Coffein ist aus veterinärmedizinischer Sicht demnach unbegründet und würde einen Verstoß gegen das Arzneimittelrecht bedeuten (§ 21, Arzneimittelgesetz).
Die nach TOUTAIN und LASSOURD (2002) ermittelten irrelevanten und somit pharmakologisch nicht effektiven Plasma- und Urinkonzentrationen von Coffein lagen durchschnittlich unterhalb der mittels dieser Methode erreichten Nachweisgrenzen. Dies
würde bedeuten, dass für Coffein noch unterhalb der Nachweisgrenze eine pharmakologische Wirkung, die unter Umständen im Wettkampf leistungsbeeinflussend sein kann, nicht ausschließbar ist. Die MRA und der Pferdeverband in Hongkong sehen den von ihnen festgelegten Grenzwert von 10 ng/ml Plasma, der sich mit der IPC bei einem Dosierungsintervall von 13 Stunden deckt, als niedrig genug an, um einen unfairen Wettkampf zu verhindern. Er wird jedoch als hoch genug betrachtet, um Meldungen von unbedeutenden Konzentrationen, die vermutlich auf Umweltkontaminationen zurück zu führen sind, zu vermeiden (TOBIN et al., 1999).
Der Verband in Hongkong hat zusätzlich einen Grenzwert für Urin von 30 ng/ml festgelegt.
Da die in dieser Arbeit erreichte Nachweisgrenze sowohl im Plasma als auch im Urin unterhalb dieser Grenzwerte liegt, ist jeglicher Nachweis von Coffein als positiver Dopingbefund zu bewerten ist.
Dies gilt vor allem dann, wenn zusätzlich die Metaboliten Theobromin, Theophyllin und Paraxanthin im Plasma oder Urin detektierbar sind. Denn liegt eine Theobrominapplikation vor, die unwissentlich durch eine Kontamination des Futters zustande kommen kann, sind keine Metaboliten im Plasma detektierbar.
Während für Theobromin aufgrund des Grenzwertes eine besondere Situation besteht, gilt für Coffein, dass jeglicher Nachweis dieser Substanz im Plasma oder Urin als dopingrelevant zu interpretieren ist und entsprechend geahndet werden muss.
VI. ZUSAMMENFASSUNG
Simone Kaiser (2006):
Untersuchung zur Pharmakokinetik der Methylxanthine Coffein und Theobromin hinsichtlich der Dopingrelevanz beim Pferd
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung des pharmakokinetischen Verhaltens von Coffein und Theobromin und die Optimierung und Validierung einer geeigneten Analysemethode zur Detektion und Quantifizierung von Coffein, Theobromin und der Metaboliten Theophyllin und Paraxanthin in Pferdeplasma und -urin.
Die Validierung und die Messung der Plasma- und Urinproben erfolgten mit Hilfe eines Hochflüssigkeitschromatographen mit angeschlossenem Tandemmassenspektrometer. Die Validierung umfasste die Kriterien Selektivität, Linearität, Richtigkeit, Präzision, Stabilität und Wiederfindung. Die Bestimmungsgrenzen für Coffein, Theobromin und Theophyllin lagen im Plasma bei 100 ng/ml und im Urin bei 50 ng/ml für Coffein, Theophyllin und Paraxanthin. Die Bestimmungsgrenze für Theobromin betrug 100 ng/ml. Die Nachweisgrenzen im Plasma betrugen für Coffein 14 ng/ml, für Theobromin 15 ng/ml und für Theophyllin 13 ng/ml. Im Urin lagen die Nachweisgrenzen für Coffein bei 33 ng/ml, für Theobromin bei 26 ng/ml, für Theophyllin bei 20 ng/ml und für Paraxanthin bei 32 ng/ml.
In dem ersten Abschnitt der pharmakokinetischen Studie wurde sechs Pferden einmalig 4 mg Coffein pro kg Körpergewicht intravenös verabreicht. Die Maximalkonzentrationen von Coffein im Plasma lagen bei 4410 bis 12237 ng/ml. Die Maximalkonzentrationen von Coffein im Urin lagen zwischen 5704 und 12053 ng/ml. 144 Stunden nach Applikation war die Konzentration von Coffein im Plasma und im Urin bei allen sechs Pferden unterhalb der Nachweisgrenze. Im Plasma und Urin konnten die Metaboliten Theophyllin, Theobromin und Paraxanthin detektiert werden. Die Konzentrationen im Plasma lagen jedoch größten Teils unterhalb der Quantifizierungsgrenze.
Anschließend wurden die analysierten Ergebnisse der Coffeinkonzentration im Plasma und Urin mit Hilfe eines Pharmakokinetisch/Pharmakokodynamischen-Modells nach TOUTAIN und LASSOURD (2002) quantitativ verknüpft. Durch die Berechnungen werden so genannte
irrelevante Plasma- und Urinkonzentrationen ermittelt, bei denen eine Wirkung von Coffein auf den Organismus ausgeschlossen wird. Berechnungen der effektiven Plasmakonzentration, der irrelevanten Plasmakonzentration und der irrelevanten Urinkonzentration nach dem PK/PD-Modell von TOUTAIN und LASSOURD (2002) zeigten, dass die irrelevante Plasma- (10,8 ng/ml) und Urinkonzentration (4,5 ng/ml) bei einem Dosierungsintervall von 13 Stunden deutlich unterhalb der Nachweisgrenzen liegen. Daraus ist zu folgern, dass jeglicher Nachweis von Coffein im Plasma oder Urin als positiver Dopingbefund zu betrachten ist.
Im zweiten Abschnitt der pharmakokinetischen Studie wurde sechs Pferden einmalig 4 mg Coffein pro kg Körpergewicht oral verabreicht. Die orale Bioverfügbarkeit von Coffein betrug 56,9 %. Die Maximalkonzentrationen von Coffein im Plasma lagen bei 2331 bis 4118 ng/ml. Die Maximalkonzentrationen von Coffein im Urin lagen bei 2373 bis 7950 ng/ml. 120 Stunden nach Applikation war die Konzentration von Coffein im Plasma und im Urin bei allen sechs Pferden unterhalb der Nachweisgrenze. Im Plasma und Urin konnten die Metaboliten Theophyllin, Theobromin und Paraxanthin detektiert werden. Auch hier lagen die Konzentrationen im Plasma lagen größten Teils unterhalb der Quantifizierungsgrenze.
Im dritten Abschnitt der pharmakokinetischen Studie wurde sechs Pferden einmalig 4 mg Theobromin pro kg Körpergewicht oral verabreicht. Die Maximalkonzentrationen von Theobromin im Plasma lagen bei 1442 bis 5177 ng/ml. Die Maximalkonzentrationen von Theobromin im Urin lagen bei 40211 bis 88140 ng/ml. 168 Stunden nach Applikation war die Konzentration von Theobromin im Plasma bei allen sechs Pferden unterhalb der Nachweisgrenze. Nach 144 Stunden unterschritten alle Pferde die Nachweisgrenze im Urin.
Im Plasma und Urin konnten keine Metaboliten detektiert werden.
Anhand des Metabolitenmusters kann auf die applizierte Ursprungssubstanz geschlossen werden. Ist im Plasma oder Urin fast ausschließlich Theobromin nachweisbar, liegt eine Theobromingabe vor.
In Anbetracht der relativ geringen Anzahl von Versuchtieren und der erheblichen interindividuellen Variabilität, lässt die Streuung keine absolut sichere Aussage über die Ausscheidungszeiten von Coffein und Theobromin zu.
Der Ansatz, die Anwendung therapeutisch relevanter Substanzen bis zu einem Schwellenwert zuzulassen, erscheint für Coffein nicht sinnvoll. Jeglicher Nachweis von Coffein im Plasma oder Urin muss daher als dopingrelevant gelten und entsprechend geahndet werden.
VII. SUMMARY
Simone Kaiser (2006):
Investigation of pharmacokinetic mechanisms of the methylxanthines caffeine and theobromine with respect to its relevance in horse-doping
The aim of this study was to investigate the pharmacokinetic behaviour of caffeine and theobromine and to optimise and validate a suitable method for the analyses for detection and quantification of caffeine, theobromine and the metabolites theophylline and paraxanthine in blood and urine samples of horses.
Validation and measurement of samples occurred by using a high performance liquid chromatograph (HPLC) with connected tandem-mass-spectrometer. Validation contained the criteria selectivity, linearity, accuracy, precision, stability and recovery. The limit of quantification for caffeine, theobromine and theophylline was fixed at 100 ng/ml in plasma and at 50 ng/ml for caffeine, theophylline and paraxanthine in urine. The limit of quantification for theobromine was fixed at 100 ng/ml. The limit of detection was fixed at 14 ng/ml for caffeine, 15 ng/ml for theobromine and 13 ng/ml for theophylline. In urine the limit of detection was fixed at 33 ng/ml for caffeine, 26 ng/ml for theobromine, 20 ng/ml for theophylline and 32 ng/ml for paraxanthine.
In the first part of the pharmacokinetic experiment caffeine was administered at a single intravenous dose of 4 mg/kg body weight to six horses. The maximum concentrations of caffeine in plasma ranged between 4410 and 12237 ng/ml. The maximum concentrations of caffeine in urine ranged between 5704 and 12053 ng/ml. 144 hours after administration the concentrations in plasma and urine of all six horses were below limit of detection. In plasma and urine the metabolites theophylline, theobromine and paraxanthine were detectable.
However these concentrations in plasma were mainly below limit of quantification.
Afterwards the results were integrated into a pharmacokinetic/pharmacodynamic approach of TOUTAIN and LASSOURD (2002) to calculate the irrelevant plasma and urine concentrations where caffeine has no effect on the organism anymore. The calculation of the effective plasma concentration, the irrelevant plasma concentration and irrelevant urine
concentration with the pharmacokinetic/pharmacodynamic model of TOUAIN and LASSOURD (2002) showed that the irrelevant plasma concentration (at 10.8 ng/ml) and urine concentration (at 4.5 ng/ml) at a dosing interval of 13 hours are far below the limit of detection. Therefore it is concluded that any detection of caffeine in plasma or urine has to be considered as a positive result of doping.
In the second part of the pharmacokinetic experiment caffeine was administered at a single oral dose of 4 mg/kg body weight to six horses. The bioavailability was 56.9 %. The maximum concentrations of caffeine in plasma ranged between 2331 and 4118 ng/ml. The maximum concentrations of caffeine in urine ranged between 2373 and 7950 ng/ml. 120 hours after administration the concentrations in plasma and urine of all six horses were below limit of detection. In plasma and urine the metabolites theophylline, theobromine and paraxanthine were detectable. As well as in the first study these plasmaconcentrations were mainly below limit of quantification.
In the third part of the pharmacokinetic experiment theobromine was administered at a single oral dose of 4 mg/kg body weight to six horses. The maximum concentrations of theobromine in plasma ranged between 1442 and 5177 ng/ml. The maximum concentrations of theobromine in urine ranged between 40211 and 88140 ng/ml. 168 hours after administration the concentrations in plasma of all six horses were below limit of detection. After 144 hours the concentrations in urine have fallen below limit of detection. No metabolites could be detected in plasma and urine.
Using pattern of the metabolites the parent substance can be concluded. If there is almost sole theobromine in plasma or urine detectable, application of theobromine has been submitted.
The considerable variance of calculations demonstrates the interindividual variability and the number of probands is too small to make a prediction about excretion times of caffeine and theobromine.
The hypothesis to establish a selected cut-off value for therapeutics seems not to be acceptable for caffeine. Any detection of caffeine in plasma or urine samples should be considered as relevant for doping and should be punished appropriately.
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