III. MATERIAL UND METHODE
6. Validierung der Analysemethode
Die Validierung ist als ein Instrument der Qualitätssicherung die Voraussetzung für eine quantitative Bestimmung verschiedener Substanzen. Sie bezeichnet den Nachweis und die Dokumentation der Zuverlässigkeit einer bereits optimierten Analysemethode zur Gewinnung reproduzierbarer Daten. Diese Methode ist dann als valide zu bezeichnen, wenn das gewählte Verfahren für die Aufbereitung, für die Chromatographie und für die Detektion zu reproduzierbaren Daten führt. Diese sind für die Entwicklung und Interpretation von pharmakokinetischen Daten im Hinblick auf die Substanzgruppe der Methylxanthine von Wichtigkeit.
Während im Urin die Methode für Coffein, Theobromin, Theophyllin und Paraxanthin validiert wurde, war im Plasma nur die Methodenvalidierung für Coffein, Theobromin und Theophyllin von Bedeutung. Im Rahmen der Vorversuchsergebnisse konnte im Plasma kein Paraxanthin nachgewiesen werden, so dass diesbezüglich keine Validierung erfolgen musste.
Die nachfolgend aufgeführten Elemente sind in die Validierung eingeflossen.
6.1 Selektivität
Selektivität beschreibt ein Maß für die Güte einer analytischen Methode, zwischen zwei Substanzen zu unterscheiden bzw. diese voneinander trennen zu können. Gekennzeichnet ist die Selektivität durch eine ausreichende Trennung des Analyten von coeluierenden Störpeaks im Chromatogramm zu der Retentionszeit des Analyten (DOLAN, 2000). Zur Sicherung der Selektivität wurden jeweils Plasma- und Urinproben von sechs Pferden zur gleichen Zeit mit den unter Kapitel III 6.2 aufgeführten Kalibrationsreihen aufgearbeitet und chromatographisch-massenspektrometrisch analysiert.
6.2 Linearität
Die Linearität einer Analysemethode beschreibt die Proportionalität zwischen den Messergebnissen und den theoretischen Konzentrationen und gilt für einen bestimmten Konzentrationsbereich (EHSLC, 2002). Zur Überprüfung der Linearität wurden mindestens fünf Leermatrixproben mit unterschiedlichen Konzentrationen dotiert. Diese sind so zu wählen, dass sie den gesamten Messbereich abdecken, äquidistant sind und aus mindestens zwei Wiederholungen pro Messpunkt bestehen (DIN 38402 A51, 1986). Konzentrationen unterhalb der Nachweisgrenze und Leerwerte sind für die Kalibrationsgerade nicht zulässig (DIN 32645, 1994). Die dotierten Plasma- und Urinproben müssen an drei unterschiedlichen Tagen aufgearbeitet und gemessen werden.
Aufgrund der Tatsache, dass der Vorversuch bei einigen Analyten sehr hohe Konzentrationen ergab, erfolgte eine Aufteilung des Konzentrationsbereiches in drei Kalibrationsgeraden, mit denen entsprechend verfahren wurde. Die gewählten Konzentrationen für die Matrices Plasma und Urin sind den Tabellen 13 und 14 zu entnehmen.
Tab. 13: Verwendete Konzentrationen von Coffein, Theobromin und Theophyllin im Plasma zur Erstellung der drei Kalibrationsgeraden
Matrix: Konzentration von Coffein, Theobromin
Plasma und Theophyllin in ng/ml
Kalibrationsgerade I 0, 20, 60, 100, 300, 600, 1000 Kalibrationsgerade II 1000, 2000, 4000, 6000, 8000, 10000 Kalibrationsgerade III 10000, 20000, 30000, 40000, 50000
Tab. 14: Verwendete Konzentrationen von Coffein, Theobromin, Theophyllin und Paraxanthin im Urin zur Erstellung der drei Kalibrationsgeraden
Matrix: Konzentration von Coffein, Theobromin,
Urin Theophyllin und Paraxanthin in ng/ml
Kalibrationsgerade I 0, 25, 50, 100, 250, 500, 1000 Kalibrationsgerade II 1000, 2000, 4000, 6000, 8000, 10000 Kalibrationsgerade III 1000, 2500, 5000, 10000, 20000, 30000
Die erhaltenen Rohwerte werden gegen die Konzentration der Kalibratoren aufgetragen und standardmäßig visuell auf Ausreißer und Linearität untersucht (U.S. DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SEVICES, 1999).
6.3 Nachweisgrenze
Die Nachweisgrenze (Detektionsgrenze, limit of detection, LOD) stellt die niedrigste Konzentration eines Analyten dar, die unter den beschriebenen Bedingungen ein vom Leerwert unterscheidbares Instrumentensignal ergibt. Zur Ermittlung der Nachweisgrenze wurde die Kalibrationskurvenmethode nach DIN 32645 (1994) eingesetzt. Aus den Residuen der linearen Regression wird zuerst die Reststandardabweichung sx0 aus der Summe der Abweichungsquadrate Qx und den Freiheitsgraden f der linearen Kalibration berechnet:
sxo= f Qx
Mit Hilfe dieser Reststandardabweichung sx0 und dem Mittelwert x aller Konzentrationen kann unter Annahme einer t-Verteilung für eine vorgegebene Fehlerwahrscheinlichkeit α das (1α)-Konfidenzintervall (Vertrauensbereich VB) für den Merkmalswert Null errechnet werden:
VB0= sx0×tf,a × 1+ 2 +1 Qx
x n
Der Term tf,a kann aus statistischen Tabellen entnommen, oder aber wie folgt errechnet werden:
a ,
tf = TINV
(
a; f)
TINV = t-Wert der t-Verteilung unter den Bedingungen des Freiheitsgrads (f) sowie der Fehlerwahrscheinlichkeit (α).
Mit Hilfe der Steigung a der linearen Regressionsgeraden kann die Nachweisgrenze (LOD) mit einer Fehlerwahrscheinlichkeit von α folgendermaßen errechnet werden:
a VB0
LOD=
6.4 Bestimmungsgrenze
Als Bestimmungsgrenze (Quantifizierungsgrenze, limit of quantification, LOQ) wird die niedrigste Konzentration bezeichnet, bei der eine quantitative Aussage über einen Analyten möglich ist. Dabei darf die Abweichung dieser Konzentration zwischen dem mittleren Messergebnis und dem erwarteten Referenzwert nicht mehr als 20 % betragen (EHSLC, 2002). Die LOQ wurde anhand der jeweiligen unteren Kalibrationsgeraden für Plasma und Urin berechnet. Dazu wurden fünf Plasmaproben im gewählten Konzentrationsbereich von 100 ng/ml der Substanzen Coffein, Theobromin und Theophyllin an drei unterschiedlichen Tagen aufgearbeitet und chromatographisch-massenspektrometrisch quantifiziert. Ebenso wurde mit den Urinproben verfahren. Allerdings wurden hier Konzentrationen von 50 ng/ml der Substanzen Coffein, Theophyllin und Paraxanthin und 100 ng der Substanz Theobromin verwendet.
6.5 Richtigkeit
Die Richtigkeit ist ein Maß für die Übereinstimmung zwischen einem mittleren Messergebnis und dem erwarteten Referenzwert. Zur Überprüfung der Richtigkeit wurden jeweils fünf Plasma- und Urinleermatrixproben mit einer hohen (high quality control standard, HQC), einer mittleren (midrange quality control standard, MQC) und einer niedrigen (low quality control standard, LQC) Kalibrationskonzentration des Analyten dotiert und chromatographisch-massenspektrometrisch quantifiziert (EHSLC, 2002). Abweichungen der Mittelwerte der gemessenen Konzentrationen von den erwarteten Werten galten in einem Bereich bis einschließlich 15 % bei der HQC und der MQC als akzeptabel. Bei der LQC sollte eine Abweichung von 20 % nicht überschritten werden (U.S. DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES, 2001). In Tabelle 15 und 16 sind die zur Überprüfung der Richtigkeit gewählten Konzentrationen im Plasma bzw. im Urin aufgeführt.
Tab. 15: Die zur Überprüfung der Richtigkeit im Plasma eingesetzten Konzentrationen Substanz Konzentration [ng/ml]
Coffein 100, 1000, 10000 Theobromin 100, 1000, 10000 Theophyllin 100, 1000, 10000
Tab. 16: Die zur Überprüfung der Richtigkeit im Urin eingesetzten Konzentrationen Substanz Konzentration [ng/ml]
Coffein 50, 100, 20000 Theobromin 100, 2500, 20000 Theophyllin 50, 2500, 20000 Paraxanthin 50, 250, 1000
6.6 Präzision
Die Präzision beschreibt die Übereinstimmung zwischen wiederholten Messungen an Aliquots identischer Proben. Dabei unterscheidet man die Wiederholpräzision sw
(Tagespräzision, intraday batch reproducibility) und die Zwischenpräzision sb (interday reproducibility). Zur Bestimmung der Präzision wurden jeweils fünf Plasma- und Urinleermatrixproben mit einer hohen, einer mittleren und einer niedrigen Konzentration an drei unterschiedlichen Tagen aufgearbeitet und chromatographisch-massenspektrometrisch quantifiziert. In Tabelle 17 und 18 sind die zur Überprüfung der Präzision gewählten Konzentrationen im Plasma bzw. im Urin aufgeführt.
Tab. 17: Die zur Überprüfung der Präzision im Plasma eingesetzten Konzentrationen Substanz Konzentration [ng/ml]
Coffein 100, 1000, 10000 Theobromin 100, 1000, 10000 Theophyllin 100, 1000, 10000
Tab. 18: Die zur Überprüfung der Präzision im Urin eingesetzten Konzentrationen Substanz Konzentration [ng/ml]
Coffein 50, 100, 20000 Theobromin 100, 2500, 20000 Theophyllin 50, 2500, 20000 Paraxanthin 50, 250, 1000
Die Berechnung der Präzisionen wurde wie folgt durchgeführt (HERBOLD u. SCHMITT,
Relativ zum gemessenen Mittelwert durften die Präzisionen nicht mehr als 15 % im Bereich der hohen und mittleren Kalibrationskonzentration und nicht mehr als 20 % bei der niedrigen Konzentration abweichen (EHSLC, 2002).
6.7 Stabilität
Um die Stabilität der Analyten in der jeweiligen Matrix für den gesamten Zeitraum des Versuches, der Probenlagerung sowie der Analyse zu überprüfen, wurden jeweils zwölf Plasma- und Urinleermatrixproben mit einer hohen und einer niedrigen Kalibrationskonzentration der Methylxanthinstandards dotiert (EHSLC, 2002). Die ausgewählten Konzentrationen sind Tabelle 19 zu entnehmen. Unmittelbar nach der Probenherstellung erfolgte die Aufarbeitung und chromatographisch-massenspektrometrische Quantifizierung von jeweils sechs Proben der unterschiedlichen Konzentrationen. Die übrigen sechs Proben der entsprechenden Konzentrationen wurden unter den gleichen Bedingungen wie die Ausscheidungsproben vier Wochen lang bei - 20 ºC gelagert, dann aufgearbeitet und mittels HPLC/MS/MS untersucht. Dieser Zeitraum entsprach der maximalen Lagerungsdauer der zu messenden Ausscheidungsproben der Pferde.
Der Vergleich der Messergebnisse wurde anschließend anhand des U-Tests (Mann-Whitney-Rangsummentest) durchgeführt.
Tab. 19: Ausgewählte Konzentrationen von Coffein, Theobromin, Theophyllin und Paraxanthin in den Matrices Urin und Plasma für den Stabilitätstest
Matrix Konzentration in ng/ml
Urin 100, 1000
Plasma 100, 1000
6.8 Wiederfindung
Die Wiederfindung ist das Verhältnis des unter Wiederholbedingungen gemessenen Mittelwertes zum richtigen Wert des Analyten in der Probe und wird nach den Vorgaben der DIN 17025 durchgeführt.
Die Bestimmung der Wiederfindung der Analyten Coffein, Theobromin, Theophyllin und Paraxanthin erfolgte anhand der Anwendung eines Mischstandards, wobei im Plasma und im Urin Konzentrationen von 1000 ng/ml Matrix Einsatz fanden.
Von diesem Konzentrationsbereich wurden insgesamt zwölf Plasma- und zwölf Urinproben aufgearbeitet. Dabei wurden die Analyten bei Probe eins bis sechs zu Beginn der Aufarbeitung der biologischen Matrix zugesetzt, wohingegen der interne Mischstandard erst nach dem Einengen des aus der Festphasenextraktion gewonnenen Eluates zugesetzt wurde. Um eine schonende und möglichst verlustarme Einengung des internen Standards zu gewährleisten, wurden die verwendeten Spitzgläser über Nacht im Exsikator gelagert. Anschließend erfolgte die Anlösung mit Ammoniumacetat-Puffer und die Überführung in die HPLC-Probengefäße zur Messung im HPLC/MS/MS-System.
Die übrigen sieben bis zwölf Plasma- respektive Urinproben wurden wie gewohnt aufgearbeitet, mit dem Unterschied dass sowohl der interne Mischstandard, als auch der Analyten-Mischstandard erst nach der Einengungsphase am Rotationsverdampfer hinzugegeben und im Exsikator über Nacht eingeengt wurden. Anschließend wurde wie bei