sind Substanzen, die als Arzneimittel eingesetzt werden, jedoch im Wettkampf verboten sind, und zwar solche, die auf das Nerven-, Herz-Kreislauf-, Atmungs-, Verdauungs-, Harn-, Muskel- und Skelettsystem, auf die Geschlechtsorgane, die Haut und gegen Infektionserreger wirken.
Grenzwerte gelten für Salizylsäure, Arsen, Dimethylsulfoxid und verfügbares CO2.
3. Ausnahmen
Erlaubt ist die Anwendung von Impfstoffen bis spätestens 14 Tage vor Beginn der Pferdeleistungsschau, Substanzen zur Bekämpfung von Endoparasiten, Paramunitäts-Inducern, externen Desinfektionsmitteln und Insektenschutzmitteln. Dies trifft auf Substanzen zu, die in Deutschland für Pferde/Ponys zugelassen sind.
2 Pharmakokinetische Grundprinzipien
Die Pharmakokinetik beschäftigt sich als Teilgebiet der Pharmakologie mit den Konzentrationsprofilen, die nach Gabe eines Arzneimittels im Körper zu erwarten sind (DERENDORF et al. 2002). Die Konzentration eines Arzneistoffs im Körper ändert sich nach seiner Applikation als Funktion der Zeit und wird von folgenden Faktoren beeinflusst:
Freisetzung des Medikaments aus der Arzneiform (Liberation), Absorption (Resorption), Verteilung im Organismus (Distribution), Metabolisierung (Biotransformation) und Elimination (KOCH und RITSCHEL 1986). Diese Vorgänge im Organismus werden durch pharmokokinetische Parameter, wie z.B. Bioverfügbarkeit, Verteilungsvolumen, Clearance und Halbwertszeit beschrieben (FICHTL 2001).
Um den zeitlichen Verlauf der Konzentration eines Pharmakons im Plasma, Blut und Urin darzustellen, wurden Modelle entwickelt, die die komplexen Verteilungs- und Eliminationsvorgänge im Körper mathematisch beschreiben (DYKE und SAMS 1994). Diese Modelle unterteilen den Organismus in Verteilungsräume (Kompartimente). Als Kompartiment wird ein Raum bezeichnet, für den eine gleichmäßige Verteilung postuliert wird, z.B. Blutplasma, Magen-Darm-Trakt oder bestimmte Gewebe (DOST 1968).
Im Ein-Kompartiment-Modell verteilt sich eine Substanz nach intravenöser Applikation hypothetisch im Körper als einem einzigen zentralen Kompartiment. Bei Elimination nach einer Kinetik erster Ordnung gehorcht die Konzentration C folgender Funktion:
t k
0 e e
C
C= ⋅ − ⋅ [1] ln C=ln C0−ke⋅t [2]
C0 = Plasmakonzentration zum Zeitpunkt 0, unmittelbar nach der Injektion ke = Eliminationskonstante
t = Zeit
Die graphische Darstellung von Gleichung [1] ergibt eine Exponentialkurve (s. Abb. 1 (a)).
Durch Logarithmieren kann sie in die Form einer Geradengleichung überführt werden (Gleichung [2], Abb. 1 (b)).
a.) linear
t C
Abb. 1: Lineare (a) und halblogarithmische (b) Darstellung der Plasmakonzentration (C) als Funktion der Zeit (t) im Ein-Kompartiment-Modell
Die Eliminationskonstante entspricht der Steigung der Geraden der logarithmischen Funktion und dient der Ermittlung der Halbwertszeit.
Die Halbwertszeit ist die Zeitspanne, in der eine Konzentration auf die Hälfte ihres ursprünglichen Wertes abfällt (DERENDORF et al. 2002). Sie ist abhängig von der Elimination und der Verteilung eines Pharmakons.
Es gilt folgende Beziehung:
e
1/2 k
t =ln2
t1/2 = Halbwertszeit
ke = Eliminationskonstante
Die Halbwertszeit ist in der Pharmakokinetik ein wichtiger Parameter, der vor allem zur Berechnung von Dosierungsintervallen genutzt wird. Zum anderen kann man mit Hilfe der Halbwertszeit ungefähr vorhersagen, wann ein Medikament abgesetzt werden muss, um es bei einem Wettkampf nicht mehr nachweisen zu können. Es gilt allgemein, dass eine Substanz ca.
fünf Halbwertszeiten benötigt, um zu etwa 97 % ausgeschiedenen zu sein (KAMERLING und OWENS 1994). Die Zeit, bis zur vollständigen Ausscheidung einer Substanz, d.h. bis das letzte Arzneimittelmolekül eliminiert ist, hängt von der Anzahl der applizierten Moleküle ab
b.) logarithmisch
t ln C
[3]
und wird mit etwa 66-77 Halbwertszeiten veranschlagt (TOBIN 1986, TOBIN et al. 1982).
Das Zwei-Kompartiment-Modell beschreibt die Kinetik der meisten Therapeutika laut BAGGOT (1978) am besten. Hierbei wird angenommen, dass sich der Arzneistoff nach der Applikation zunächst homogen in einem zentralen Kompartiment, womit in der Regel das Plasma und gut durchblutete Organe, wie Leber, Niere, Lunge gemeint sind, verteilt. Aus diesem zentralen Kompartiment wird die Substanz in schlechter durchblutete Gewebe (z.B.
Muskulatur oder Haut), das sogenannte periphere Kompartiment, transferiert. Die Elimination findet ausschließlich über das zentrale Kompartiment statt. Im Zwei-Kompartiment-Modell zeigt die Konzentrationszeitkurve einen biexponentiellen Verlauf (s. Abb. 2), wobei die erste Phase als Verteilungsphase (α), die zweite als Eliminationsphase (ß) bezeichnet wird.
Gleichung [4] und Abbildung 2 beschreiben die Arzneistoffkonzentration (C) im Zwei-Kompartiment-Modell als Funktion der Zeit:
t e β t B e α A
C= ⋅ − ⋅ + ⋅ − ⋅ [4]
t ln C
Aus der Eliminationskonstanten ß errechnet sich mit Hilfe von Gleichung [3] die terminale Halbwertszeit. Extrapolation der durch ß beschriebenen Geraden auf die y-Achse ergibt die Konzentration B einer Substanz nach Erreichen des Verteilungsgleichgewichtes. Die in Abbildung 2 dargestellte Gerade mit der Steigung α und dem Schnittpunkt A auf der y-Achse beschreibt die initiale Phase der Verteilung und beginnenden Ausscheidung. Addition der Konzentrationen A und B ergibt die fiktive Anfangskonzentration C0.
A ß α
B
Abb.2: Halblogarithmische Darstellung der Plasmakonzentration (C) als Funktion der Zeit (t) im Zwei-Kompartiment-Modell
Neben dem Zwei-Kompartiment-Modell gibt es weiterhin Mehr-Kompartiment-Modelle, je nachdem, in wievielen Verteilungsräumen sich eine Substanz anreichert. DERENDORF et al.
(2002) beschreiben beispielsweise ein Drei-Kompartiment-Modell, in dem ein sogenanntes
„flaches“ Kompartiment schnell im Verteilungsgleichgewicht mit dem zentralen Kompartiment steht, während die Verteilung und Rückverteilung in ein „tiefes“
Kompartiment länger dauert.
Wird ein Arzneimittel extravasal (z.B. p.o., i.m., s.c.) verabreicht, muss bei der Berechnung der Konzentrationen noch die Resorption berücksichtigt werden. So ergibt sich für die Plasmakonzentration (C) bei Resorption gemäß Kinetik 1. Ordnung als Funktion der Zeit die sogenannte Bateman-Funktion (FICHTL 2001):
)
C = Konzentration zum Zeitpunkt t D = gegebene Dosis
Vd = Verteilungsvolumen ka = Resorptionskonstante ke = Eliminationskonstante
Die „Resorptionsrate“ einer extravasal verabreichten Substanz bestimmt neben anderen Faktoren die Bioverfügbarkeit.
DERENDORF et al. (2002) beschreiben als Bioverfügbarkeit „das Ausmaß und die Geschwindigkeit, mit der der therapeutisch wirksame Bestandteil eines Arzneistoffs in den systemischen Kreislauf gelangt“. Die Bioverfügbarkeit nach intravenöser Applikation wird mit 100 % angenommen. Die Resorption nicht intravenös verabreichter Medikamente (p.o., s.c., i.m.,i.p. usw.), wird durch zahlreiche Faktoren beeinflusst, so dass der den systemischen Kreislauf erreichende Anteil in der Regel geringer ist. Das Ausmaß der Resorption aus dem Magen-Darm-Trakt wird z.B. bestimmt von der Dosis des Medikaments, seinen
physikalischen-chemischen Eigenschaften (Ionisierungszustand, Lipophilie), der intestinalen Durchblutung, der Größe der Resorptionsoberfläche, der Zerstörung durch Darmenzyme oder der Interaktion mit anderen Arzneimitteln (BENET et al. 1996). Aus dem Darm gelangen Substanzen über die Pfortader zuerst in die Leber, wo sie eventuell metabolisiert werden (hepatischer „First-Pass-Effekt“). Einige Substanzen werden anschließend in die Galle und so mit den Faeces ausgeschieden. Manche Substanzen unterliegen dem sogenannten enterohepatischen Kreislauf. Das bedeutet, dass der mit der Galle in den Darm ausgeschiedene metabolisierte Arzneistoff, von Darmenzymen (z.B. ß-Glucuronidase) in seine ursprüngliche Form verwandelt und daraufhin erneut resorbiert wird (BENET et al.
1996). Bei einigen Medikamenten erreicht der „First-Pass-Effekt“ ein Ausmaß, dass die Substanzen in der Leber bei erster Passage vollständig inaktiviert werden (SAMS 1996).
Zur Berechnung der Bioverfügbarkeit (F) wird die Fläche unter der Konzentrations-Zeitkurve (area under the curve, AUC) verwendet. Der Quotient
AUC 100 D
AUC F% D
iv niv
niv
iv ⋅
⋅
= ⋅
[6]
D = Dosis iv = intravenös niv = nicht-intravenös
beschreibt schließlich in Verbindung mit der errechneten maximalen Konzentration (Cmax) und der Zeit (tmax) bis zum Erreichen dieser Konzentration die Bioverfügbarkeit.
Über die Verteilung eines Pharmakons im Körper gibt das Verteilungsvolumen (Vd) Aufschluss. Es gilt als Proportionalitätsfaktor zwischen der im Organismus vorhandenen Menge eines Arzneistoffs (X) und seiner Plasmakonzentration (C) (FICHTL 2001).
C Vd=X
[7]
BAGGOT (1978) beschreibt das Verteilungsvolumen als einen pharmakokinetischen Term, der dazu genutzt wird, die Dosis zu berechnen, die benötigt wird, um eine gewünschte Plasmakonzentration zu erhalten. Es ist ein Maß für die Gewebegängigkeit eines Arzneimittels und nach intravenöser Applikation initial gering, da sich die gesamte Arzneimittelmenge in der Blutbahn befindet. Mit der anschließenden Verteilung der Substanz in die Körpergewebe vergrößert sich das Verteilungsvolumen. Ist es gleich dem Volumen des Gesamtkörperwassers, bedeutet das, dass die Substanz intra- und extrazellulär verteilt wird.
Arzneimittel, die eine hohe Plasmaproteinbindung eingehen, haben ein geringes Verteilungsvolumen, das nicht wesentlich größer ist als das Plasmavolumen (SAMS 1996).
Als Maß zur Ermittlung der Ausscheidungsgeschwindigkeit eines Arzneistoffs dient die Clearance (DERENDORF et al 2002). Sie kann mit folgender Gleichung beschrieben werden:
C dE/dt Cl=
[8]
Cl = Clearance
dE/dt = ausgeschiedene Arzneistoffmenge pro Zeit C = Arzneistoffkonzentration
Da mehrere Organe an der Elimination eines Arzneistoffs beteiligt sind, setzt sich die Gesamtclearance (ClT) aus der Summe einzelner Organclearances zusammen (SAMS 1992):
ClT = ClH + ClR + Clandere [9]
ClH = hepatische Clearance ClR = renale Clearance
Hauptausscheidungsorgane sind Niere und Leber. Die renale Elimination erfolgt durch glomeruläre Filtration, tubuläre Sekretion und tubuläre Rückresorption. Da das Ausmaß der renalen Elimination von der Durchblutung der Nieren und dem Harn pH-Wert abhängt, ist sie
teilweise erheblichen Schwankungen unterworfen. So werden beispielsweise schwache Säuren (wie z.B. Phenylbutazon) durch den Abfall des Harn pH-Wertes, wie es nach einem Wettkampf beobachtet wird, verstärkt tubulär rückresorbiert, was eine längere Ausscheidungszeit einer Substanz zur Folge haben kann (KAMERLING und OWENS 1994).
Die hepatische Clearance setzt sich aus Metabolismus und Sekretion der Substanzen in die Gallenblase zusammen. Sie kann nicht direkt gemessen werden, sondern wird aus der Differenz der totalen und renalen Clearance errechnet (SAMS 1996). In sogenannten Phase-I-Reaktionen werden die Arzneistoffe enzymatisch verändert (oxidiert, reduziert oder hydrolytisch gespalten) und in der Phase-II-Reaktion an hydrophile Gruppen (z.B.
Glucuronsäure u.a.) gekoppelt. Diese Kopplungsprodukte werden aufgrund ihrer hohen Wasserlöslichkeit schneller ausgeschieden (FREY 1996). Andere Wege der Elimination (Clandere), beispielsweise über Speichel, Schweiß und Tränen sind nach BENET et al. (1996) zumeist quantitativ vernachlässigbar.
Um über einen bestimmten Zeitraum einen gewissen Wirkspiegel aufrecht zu erhalten, ist bei vielen Arzneimitteln die mehrmalige Applikation erforderlich. Zur Festlegung des Dosierungsintervalls ist die Kenntnis der Verteilung und Ausscheidung wichtig. Die Einhaltung von etwa zwei Halbwertszeiten zwischen zwei Applikationen gilt in vielen Fällen als sinnvoll (KIETZMANN 1983). Die Arzneistoffkonzentration fluktuiert nach Mehrfachapplikation zwischen einem Maximum und einem Minimum (s. Abb. 3). Ein Gleichgewichtszustand (Steady-State) ist ereicht, wenn die Erhaltungsdosis die Menge ersetzt, die innerhalb eines Dosierungsintervalls eliminiert wird (BAGGOT 1978).
0 5 10 15 20
0 50 100
t C
Abb. 3: Verlauf der Arzneistoffkonzentration (C) nach mehrmaliger Applikation
3 Analytik
3.1 Allgemeiner Überblick
Um Substanzen in biologischen Flüssigkeiten wie Blut und Urin zu identifizieren und quantifizieren, müssen sie zunächst von anderen Substanzen, die sich ebenfalls in diesen Matrices befinden, getrennt werden. Diese Trennung erreicht man mittels Chromatographie.
Bei der Chromatographie werden Stoffgemische über zwei nicht miteinander mischbare Phasen, von denen sich eine (mobile Phase) an der anderen (stationäre Phase) vorbeibewegt, verteilt (SCHWEDT 1986). Aufgrund ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften kommt es zu einer ständigen Adsorption (Oberflächenanhaftung) an und Desorption (Ablösung) von der stationären Phase mit Weitertransport durch die mobile Phase. Die Trennung der Substanzen erfolgt aufgrund ihrer unterschiedlichen Verweilzeiten (Retentionszeiten) in dem chromatographischen System (GOTTWALD 1996). Man unterscheidet Papierchromatographie, Dünnschichtchromatographie, Säulen-Flüssigkeits-Chromatographie und Gaschromatographie (s.Tab.3) (SCHWEDT 1986).
DYKE und SAMS (1994) stellten heraus, dass die in der Dopinganalytik am häufigsten angewandten Verfahren chromatographische sind. Die Gaschromatographie wird in Kombination mit der Massenspektrometrie (GC/MS) eingesetzt, um ein Ergebnis zu bestätigen. Da die Analytik in dieser Arbeit mittels Gaschromatographie erfolgt, soll auf dieses Verfahren näher eingegangen werden.
Tab. 3: Chromatographische Methoden, Verfahren und Techniken (nach SCHWEDT 1986) 1. Papierchromatographie
2. Dünnschichtchromatographie (DC)
einschließlich Hochleistungs-DC (engl. HPTLC: high performance thin-layer chromatography) als:
Verteilungs- Adsorptions-, Gel- oder Ionenaustausch-Chromatographie auf Schichten