4 ERGEBNISSE
4.2. Ergebnisse der Validierung
4.2.1. Selektivität
Die Analyten konnten bei ausreichender Trennung und ohne Verfälschung von fremden, in der Probe vorkommenden Matrixinhaltstoffen erfasst werden.
Lediglich die Unterscheidung von Theophyllin und Paraxanthin gelang zunächst nicht, da sie eine nahezu identische Retentionszeit und beide das Produktion m/z 181.0→ 124.0 aufwiesen.
Nach weiteren Untersuchungen fand sich als einziges Unterscheidungsmerkmal das Produktion m/z 181.0→ 55.0, welches nur bei Paraxanthin dedektierbar war. Somit mu
llin und Paraxanthin angesehen werden, und die Quantifizierung über die Differenzmethode erfolgen.
as bedeutet, dass wenn in Proben das Produktion m/z 181.0→ 55.0 keinen Peak zeigt, davon usgegangen werden kann, dass der Peak des Produktions m/z 181.0→ 124.0 allein durch
hervorgerufen wird. Ist jedoch ein Peak des Produktions m/z 181.0→ 55.0 orhanden, muss hierüber die Paraxanthinkonzentration quantifiziert werden und von der über en Peak des Produktions m/z 181.0→ 124.0 als Summenkonzentration von Theophyllin und araxanthin ermittelten Wertes abgezogen werden.
den Abbildungen 18 und 19 sind beispielhaft Chromatogramme von Theobromin und araxanthin im Urin dargestellt. Es wird jeweils ein Chromatogramm einer Leerurinprobe und
iner Pro onzentration von 100 ng Analyt pro 1ml Urin gezeigt.
sste der Peak des Produktions m/z 181.0→ 124.0 als ein Summenpeak von Theophy
D a
Theophyllin v
d P In P
eines e be mit der K
ERGEBNISSE
Abb.18: HPLC/MS/MS- Chromatogramme von Leerwerturinproben zu den entsprechenden Retentionszeiten von Theobromin und Paraxanthin.
Abb.19: HPLC/MS/MS-Chromatogramme von Urinproben, denen 100 ng Theobromin respektive Paraxanthin pro ml Urin zugesetzt wurden, zu den entsprechenden Retentionszeiten.
Die Abbildungen 20 und 21 zeigen Chromatogramme von Plasmaproben. Hier werden zunächst Chromatogramme von Leerplasmaproben und anschließend Chromatogramme von jeweils mit 100 ng/ml Plasma dotierten Coffein- bzw. Theophyllinproben dargestellt.
ERGEBNISSE
Abb.20: HPLC/MS/MS- Chromatogramme von Leerwertplasmaproben zu den entsprechenden Retentionszeiten von Coffein und Theophyllin
Abb.21: HPLC/MS/MS–Chromatogramme von Plasmaproben, denen 100 ng Coffein respektive Theophyllin pro ml Plasma zugesetzt wurden, zu den entsprechenden Retentionszeiten.
ERGEBNISSE
4.2.2. Linearität
lasma:
a wurden Theophyllin, Theobromin und Coffein in den Bereichen von 20 bis 1000
its in den Vorversuchen zeigte, dass mit keiner höheren Plasmakonzentration ieses Metaboliten zu rechnen ist.
Die Abweichungen der geme ten Konzentrationen der Analyten betrug an allen Messtagen im niedrigsten trationsbereich weniger als 20% und in den höheren Konzen
Als Beispiel für die Linearität der Analyten im Plasma sind in Abbildung 22 und 23 jeweils eine Kalibrationsgerade von Coffein und Theobromin im Konzentrationsbereich von 20 bis
l Plasm tellt.
P
Im Plasm
ng/ml, von 1000 bis 10000ng/ml sowie von 10000 bis 50000 ng/ml überprüft. Die Linearität von Paraxanthin im Plasma wurde lediglich in dem Bereich von 20 bis 1000 ng/ml untersucht, da sich bere
d
ssenen von den erwarte Konzen trationsbereichen weniger als 15%.
1000 ng/m a darges
y = 0.0058x - 0.0126
bb.22: Kalibrationskurve mit Angabe der Kalibrationsgleichung und des Messpunkte vor
Konzentration [ng/ml]
A
Korrelationskoeffizienten für Coffein im Plasma; je Konzentrationsstufe liegen zwei
ERGEBNISSE
4 4.5
y = 0.0040x + 0.0087 R2 = 0.9987
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
0 200 400 600 800 1000
Konzentration [ng/ml]
Quotient (Subst./IS)
: Kalibrationskurve mit Angabe der Kalibrationsgleichung und des
Korrelationskoeffizienten für Theobromin im Plasma; je Konzentrationsstufe
Urin:
Bei der Prüfung der Kalibrationskurven konnte für Coffein im Konzentrationsbereich von 25 bis 1000 ng/ml ohl im reich von 25 bis 1000 ng/ml, als auch von 1000 bis 30000 ng/m raxanthin im zentrationsbereich von 25 bis 1000 ng/ml die Linearität angenommen werden. Die Linearität von Theobromin konnte weder in den
iedrigen noch in den hohen Konzentrationsbereichen bestätigt werden, so dass in diesem Fall
erdeutlichten anhand des F- Tests, dass diese signifikant kleinere Varianzen beim uadratischen Regressionsmodell aufwiesen, als es bei der linearen Regression der Fall war.
bbildung 24 und 25 zeigen beispielhaft je eine Kalibrationskurve von Theophyllin und heobromin eines Messtages.
Abb.23
liegen zwei Messpunkte vor
, für Theophyllin sow Be
l und für Pa Kon
n
das quadratische Regressionsmodell gewählt wurde. Die Untersuchungen der Residuen v
q A T
ERGEBNISSE
0 200 400 600 800 1000 1200
n ation [ng/ml]
Konze tr
Abb rve der Kalibrationsgleichung und des
Korrelationskoeffizienten für Theophyl in; je Konzentrationsstufe liegen zwei Messpunkte vor
.24: Kalibrationsku mit Angabe
lin im Ur
0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000
Konzentration [ng/ml]
Quotient (t./IS)
bb.25: Kalibrationskurve mit Angabe der Kalibrationsgleichung und des
Korrelationskoeffizienten für Theobromin im Urin; je Konzentrationsstufe liegen zwei Messpunkte vor
20 2
Subs
A
ERGEBNISSE
Die Abweichungen der gemess en er onzentrationen betrugen auch im Urin an allen Messtagen bei Coffein, Theobr Theophyllin und Paraxanthin im niedrigsten Konzentrationsbereich weniger als 20% und in den höheren Konzentrationsbereichen weniger als 15%.
4.2.3. Na isgrenze (L
lasma:
LOD) für heophyllin, Theobromin, Coffein und Paraxanthin im Plasma werden in Tabelle 13 aufgeführt.
N (LOD
enen von d warteten K omin,
chwe OD)
P
Die nach Kapitel 3.3.3. ermittelten Nachweisgrenzen (limit of detection, T
achweisgrenze )
[ng/ml]
Theophyllin 13
Theobromin 15
Paraxanthin 29
Coffein 14
Tab.13: Nachweisgrenzen von Theophyllin, Theobromin, Coffein und Paraxanthin im Plasma
rin:
Die ittelten Nachweisgrenzen für Theophyllin, Theobromin, Coffein und Paraxanthin im rin sind T elle 14 zu entnehme
Nach enze (LOD) U
erm
U ab n.
weisgr
[ng/ml]
Theophyllin 20
Theobromin 26
Paraxanthin 32
Coffein 33
Tab.14: Nachweisgrenzen von Theophyllin, Theobromin, Coffein und Paraxanthin im Urin
ERGEBNISSE
4.2.4. Bestimmungs-/Quantifizierungsgrenze (LOQ)
Plasma:
Die nach Kapitel 3.3.4. ermittelten Bestimmungs- bzw. Quantifizierungsgrenzen (limit of
B r ze (LOQ)
quantification, LOQ) für Theophyllin, Theobromin, Coffein und Paraxanthin im Plasma werden in Tabelle 15 aufgeführt.
estimmungsg en
[ng/ml]
Theophyllin 100
Theobromin 100
Paraxanthin 100
Coffein 100
Tab.1 eophyllin, Theobromin, Coffein und Paraxanthin im
Pla
rin:
ttelten Paraxanthin
Urin sind Tabelle 16 zu entnehmen.
Besti ze
5: Bestimmungsgrenzen von Th sma
U
Die ermi Bestimmungsgrenzen für Theophyllin, Theobromin, Coffein und im
mmungsgren (LOQ)
[ng/ml]
Theophyllin 50
Theobromin 100
Paraxanthin 50
Coffein 50
Tab.16: Bestimmungsgrenzen von Theophyllin, Theobromin, Coffein und Paraxanthin im Urin
ERGEBNISSE
4.2.5. Richtigk
lasma
Die Tabellen 17, 18, 19 und 20 enthalten die Ergebnisse der Überprüfung der Methode auf Richtigkeit. In den Tabellen ist jew er Mittelwert der gemessenen Konzentrationen aus 5 Einzelbestimmungen und die relative Abweichung aufgelistet.
Die ative Abw ng betrug i eren Konzentrationsbereich weniger als 20% und in den oberen Konzentrationsbereich eniger als 1 . Allerdings waren am dritten Tag sowohl bei Coffein als auch bei Theobromin bei einer Konzentration von 100 ng/ml relative
bweichungen knapp oberhalb von 20% erkennbar.
eit
P
eils d
rel eichu m unt
en w 5%
A
Mittelwert der
erwartete gemessenen Relative
Tag Konzentrationen Theophyllin- Abweichung [ng/ml] Konzentrationen RA [%]
Tab.17: Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Theophyllin im Plasma
ERGEBNISSE
Mittelwert der
erwartete gemessenen Relative
Tag Konzentrationen Theobromin- Abweichung [ng/ml] Konzentrationen RA [%]
Tab.1 Ergebnisse der Überprüfung der R igkeit vo eobromin im Plasma
M ert der
8: icht n Th
ittelw
erwartete gemessenen Relative Tag Konzentrationen Paraxanthin- Abweichung
[ng/ml] Konzentrationen RA [%]
Tab.1 Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Paraxanthin im Plasma
M ert der
9:
ittelw
erwartete gemessenen Relative Tag Konzentrationen Coffein- Abweichung
[ng/ml] Konzentrationen RA [%]
Tab.20: Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Coffein im Plasma
ERGEBNISSE
Urin:
Die Überprüfung der Methode auf Richtigkeit im Urin wurde für die Konzentrationen 50, 2500 und 20000 ng/ml Urin bei Theophyllin, Theobromin, Paraxanthin und Coffein bestätigt.
ie entsprechenden Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen 21, 22, 23 und 24 aufgeführt.
Im lag lativ eich i allen Substanzen im niedrigen
Konzentrationsbereich unter 20% und in höheren Konzentrationsbereichen unter 15%.
M ert der
D
Urin die re e Abw ung be
ittelw
erwartete gemessenen elative R Tag Konzentrationen Theophyllin- Abweichung
[ng/ml] Konzentrationen RA [%]
Tab.21: Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Theophyllin im Urin
Mittelwert der
erwartete gemessenen Relative
Tag Konzentrationen Theobromin- Abweichung [ng/ml] Konzentrationen RA [%]
ab.22: Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Theobromin im Urin T
ERGEBNISSE
Mittelwert der
erwartete gemessenen Relative
Tag Konzentrationen Paraxanthin- Abweichung [ng/ml] Konzentrationen RA [%]
[ng/ml]
50 55,1 10,3
1 250 228,4 -8,7
1000 935,0 -6,5
50 41,9 -16,2
2 250 248,2 -0,7
1000 1021,2 2,1
50 54,4 8,8
3 250 246,9 -1,3
1000 1040,0 4,0
Tab.23: Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Paraxanthin im Urin
Mittelwert der
erwartete gemessenen Relative Tag Konzentrationen Coffein- Abweichung
[ng/ml] Konzentrationen RA [%]
[ng/ml]
50 58,1 16,2
1 100 103,1 3,1
20000 19758,4 -1,3
50 55,8 11,7
2 100 87,9 -12,1
20000 19739,6 -1,2
50 44,8 -10,3
3 100 98,2 -1,8
20000 19051,0 -4,8
Tab.24: Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Coffein im Urin
ERGEBNISSE
4.2.6. Präzision
Plasma
e Ergebnisse der Präzisionsberechnung der traday- und der Präzi A ma aufgeführt. Sowohl die Intra ls a day lagen bei allen Substanzen innerhalb der
bweichungsgrenze vo 20% im 1 nzentrationsbereich.
ophyllin Theobromin
In den folgenden Tabellen 25 und 26 sind di
In Interday- sion der vier nalyten im Plas day- a uch die Inter -Präzision
A n niedrigen und 5% im hohen Ko
The
erwartete Intraday Interday Intraday Interday Konzentrationen Präzision Präzision Präzision Präzision
[ng/ml] [%] [%] [%] [%]
100 15,5 7,5 9,8 19,3
1000 9,0 2,7 6,8 3,2
10000 8,0 1,8 3,8 4,4
Tab.25: Intraday- und Interdaypräzision von Theophyllin und Theobromin im Plasma
Coffein Paraxanthin
erwartete Intraday Interday Intraday Interday Konzentrationen Präzision Präzision Präzision Präzision
[ng/ml] [%] [%] [%] [%]
100 15,8 11,7 14.79 10.58
1000 7,3 5,0 5.4 1.8
10000 10,8 8,4 n.m. n.m.
Tab.26: Intraday- und Interdaypräzision von Coffein und Paraxanthin im Plasma
ERGEBNISSE
Urin:
Die Ergebnisse der Präzision für die Quantifizierung von Theophyllin und Theobromin sowie anthin und Coffein im Urin sind den unten aufgeführten Tabellen 27 und 28 zu
Theophyllin Theobromin
von Parax entnehmen.
erwartete Intraday Interday erwartete Intraday Interday Konzentrationen Präzision Präzision Konzentrationen Präzision Präzision
[ng/ml] [%] [%] [ng/ml] [%] [%]
50 8,2 4,6 100 3,2 9,7
2500 8,3 5,9 2500 6,9 3,5
20000 14,9 5,2 20000 16,8 5,2
Intraday- und Interdaypräzision von Theophyllin und Theobromin im Urin
Paraxanthin Coffein
Tab.27:
erwartete Intraday Interday erwartete Intraday Interday Konzentrationen Präzision Präzision Konzentrationen Präzision Präzision
[ng/ml] [%] [%] [ng/ml] [%] [%]
50 9,1 14,8 50 14,2 13,3
250 7,4 4,6 100 13,3 13,0
1000 14,9 5,6 20000 8,1 2,1
Tab.28: Intraday- und Interdaypräzision von Coffein und Paraxanthin im Urin
ERGEBNISSE
, Theobromin und Paraxanthin sind innerhalb des Zeitraums von 28 Tagen stabil.
on geltenden Abweichung 15% im hohen Konzentrationsbereich liegt.
it den jeweiligen Konzentrationen am Tag 0 und am Tag 28 sind in der folgenden Tabelle 4.2.7. Stabilität
Plasma:
Theophyllin
Die Ergebnisse und der Vergleich der Messdaten mit Hilfe des U-Tests lassen darauf schließen, dass Coffein zwar nach einem Zeitraum von 28 Tagen einen Substanzverlust aufweist, dieser jedoch innerhalb der für die Richtigkeit und Präzisi
von 20% im niedrigen Konzentrationsbereich und
Die Ergebnisse der Stabilitätsprüfung von Theophyllin, Theobromin, Paraxanthin und Coffein m
29 dargestellt.
Tag 0 Tag 28
erwartete Mittelwert der Mittelwert der
Analyt Konzentrationen gemessenen gemessenen Abweichung Konzentrationen Konzentrationen
[ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [%]
100 100,0 98,5 -1,5
Theophyllin 1000 977,5 970,8 -0,7
100 97,3 97,4 0,1
Theobromin 1000 1066,3 984,8 -7,6 100 82.62 79.94 -3.2 Paraxanthin 1000 996.36 907.92 -8,9
100 95,4 78,8 -17,2
Coffein 1000 953,9 901,7 -5,5
Tab.29: Stabilitätsdaten von Theophyllin, Theobromin, Paraxanthin und Coffein im Plasma
Urin:
ERGEBNISSE
Die Ergebnisse der Stabilitätsuntersuchungen der Substanzen im Urin sind in der folgenden Tabelle 30 aufgeführt.
Tag 0 Tag 28
erwartete Mittelwert der Mittelwert der
Analyt Konzentrationen gemessenen gemessenen Abweichung Konzentrationen Konzentrationen
[ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [%]
100 96,7 100,7 -3,9
Theophyllin 1000 1051,0 1001,5 -4,7
100 100,3 98,0 -2,3
Theobromin 1000 1134,2 982,7 -13,6
100 104,3 103,3 -1,0
Paraxanthin 1000 946,9 896,6 -5,3
100 89,0 92,1 3,4
Coffein 1000 943,2 1134,2 4,7
Tab.30: Stabilitätsdaten von Theophyllin, T min, Paraxanthin und Coffein im Urin
Diese Ergebnisse verdeutlichen unter Berücksi ng des U-Tests, dass sowohl Coffein und Theobromin, als auch Theophyllin und Par in in einem Zeitraum von 28 Tagen geringgradige Konzentrationsveränderungen aufweisen. Diese Abweichungen liegen jedoch innerhalb der Messungenauigkeit, so dass tabilität dieser Substanzen für diesen Zeitraum angenommen werden kann.
heo
cht ax ein
bro
igu anth
e S
ERGEBNISSE
4.2.8. Wiederfindung
Plasma:
Die Ergebnisse der Berechnung der Wiederfindung der Substanzen Theophyllin, Theobromin, Paraxanthin und Coffein im Plasma sind in Tabelle 31 beschrieben.
Mittlere
Substanzen Wiederfindungsrate [%]
Theophyllin 90,2 Theobromin 84,9 Paraxanthin 90,2
Coffein 100,0
Tab.31: Wiederfindungsraten von Theophyllin, Theobromin, Paraxanthin und Coffein im Plasma
rin:
Mittlere
U
Die Wiederfindungsergebnisse der Analyten im Urin sind der Tabelle 32 zu entnehmen.
Substanzen Wiederfindungsrate [%]
Theophyllin 96,1 Theobromin 93,4 Paraxanthin 95,9
Coffein 92,4
Tab.32: Wiederfindungsraten von Theophyllin, Theobromin, Paraxanthin und Coffein im Plasma
ERGEBNISSE
4.3. Ergebnisse des Hauptversuches
4.3.1.
In Anlehnung an den Hauptversuch gliedert sich die Untersuchung der Plasmaproben in drei ischen der applizierten Substanz sowie den entstandenen Metaboliten unterschieden wird.
8.834 ng pro ml Plasma gemessen werden. Wie
allen Pferden ml Plasma nicht unterschritten. In Abb.
6 sind die Plasmakonzentrationsverläufe von Theophyllin aller Pferde dargestellt.
anthin erst nach zwei Stunden gemessen werden. Die gemessenen Coffeinplasmakonzentrationen der Pferde 2 und 4 blieben unterhalb der ermittelten
ierun Wert
oberhalb d ale
offeinplasmakonzentration von 1.283 ng/ml wies Pferd 5 nach zwei Stunden auf. Abb. 27 nd 28 zeigen die gemittelten Plasmakonzentrationsverläufe von Paraxanthin und Coffein und Theophyllin, Abb. 29 das prozentuale Verhältnis von Theophyllin und Paraxanthin. Die Einzelwerte der Theophyllin-, Paraxanthin- und Coffeinplasmakonzentrationen aller Pferde sind in den Tabellen 43, 44 und 45 im Anhang aufgeführt.
Plasma
Abschnitte (Kapitel 4.3.1.1. bis Kapitel 4.3.1.3), in denen jeweils zw
4.3.1.1. Theophyllin und Metaboliten nach intravenöser Applikation
Nach intravenöser Verabreichung von Theophyllin konnten im Plasma maximale Theophyllinkonzentrationen von 5.165 bis
aus Abbildung 26 ersichtlich, wurden diese bei allen Pferden innerhalb der ersten zwei bis fünf Minuten erreicht. In den darauffolgenden zehn Minuten fielen die Konzentrationen zunächst stark ab, um dann bei den Pferden 1, 2, 4, 5 und 6 nochmals geringgradig anzusteigen, bevor sie nach 30 Minuten langsam kontinuierlich abnahmen. Bei
wurde innerhalb des Probenentnahmezeitraumes von sechzig Stunden die Quantifizierungsgrenze von 100 ng Theophyllin pro
2
Im Plasma ließen sich außerdem die Metaboliten Paraxanthin und Coffein nachweisen.
Theobromin hingegen konnte nicht detektiert werden.
Die maximalen Paraxanthinkonzentrationen von 370 bis 868 ng/ml wurden bei den Pferden 1, 2, 3, 4 und 6 nach zwei Minuten gemessen. Lediglich bei Pferd 5 konnten die höchste Konzentration von Parax
Quantifiz gsgrenze von 100 ng/ml. Bei den Pferden 1 und 3 konnte jeweils nur ein er Quantifizierungsgrenze gemessen werden. Die maxim C
u
0
Stund en nach Ap p likat
Konzentration Theophyllin [ng/ml]
Abb. 26 : Plasmakonzentrationsverläufe von Theophyllin bei sechs Pferden nach ein aliger intravenöser Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht, Ausschnittsvergrößerung zeigt den Konzentrationsverlauf innerhalb der ersten Stunde
89 ERGEBNISSE
ERGEBNISSE
Abb. 27: Gemittelter Plasmakonzentrations uf von Theophyllin und den Metaboliten Paraxanthin und Coffein (Theobro wurde nicht nachgewiesen)
verla
Abb.28: Gemittelter Plasmakonzentrationsv der Metaboliten Paraxanthin und Coffein nach intravenöser Applikation von g Theophyllin sowie der
Quantifizierungsgrenze (LOQ) un chweisgrenze (LOD) erl
ERGEBNISSE
Theophyllin Paraxanthin Theobromin Coffein
Abb. 29: Prozentuales Verhältnis von Theophyllin und dem Metaboliten Paraxanthin und Coffein im Plasma nach intravenöser Applikation von 4 mg/kg Körpergewicht im Mittel bis zum Erreichen von LOQ (es wurde kein Theobromin nachgewiesen)
4.3.1.2. Theophyllin und Metaboliten nach oraler Applikation Die maximalen Plasmakonzentrationen von The
zwischen 1.791 ng/ml und 3.483 ng/ml. Der
Konzentration variiert von vierzig Minuten bis zwölf Stunde wurde von zwei Pferden nach 60 Stunden, von dr
Pferd erst nach 108 Stunden unterschritten.
Auch nach oraler Applikation konnte der Me maximalen Konzentrationen lagen zwischen
40 Minuten und 12 Stunden erreicht. Ab 48 Stunde die Werte aller Pferde die Quantifik
Coffein war lediglich in Spuren im Bere Theobromin konnte nicht nachgewiesen werden.
ophyllin nach oraler Verabreichung lagen Zeitraum des Erreichens der maximalen n. Die Quantifizierungsgrenze ei Pferden nach 96 Stunden und von einem tabolit Paraxanthin nachgewiesen werden. Die 157 ng/ml und 370 ng/ml und wurden zwischen n nach der Verabreichung unterschritten ationsgrenze für Paraxanthin von 100ng/ml.
ich der Nachweisgrenze von 14 ng/ml erkennbar.
Die Einzelwerte d ind in
en Tabellen 46 und 47 im Anhang aufgeführt. Abb. 30 zeigt die akonzentrationsverläufe aller sechs Pferde, Abb. 31 die gemittelten Plasm
d
er Theophyllin- und Paraxanthinplasmakonzentrationen aller Pferde s
ERGEBNISSE
Plasmakonzentrationsverläufe von Theophyllin und Paraxanthin und Abb. 32 deren prozentuales Verhältnis.
Abb. 30: Gemittelter Plasmakonzentrationsve f von Theophyllin und Paraxanthin im Plasma nach oraler Applikation von 4 m ewicht im Mittel bis zum Erreichen von LOQ (es wurde kein in und kein Coffein nachgewiesen)
g/kg Körperg
Theophyllin Paraxanthin Theobromin Coffein
Abb. 31: Prozentuales Verhältnis von Theophyl d dem Metaboliten Paraxanthin im Plasma nach oraler Applikation von g Körpergewicht im Mittel bis zum Erreichen von LOQ (es wurde kein in und kein Coffein nachgewiesen)
0 5 0 0
1 1 0 0 0
1 5 0 0 2 0 0 0 2 5 0 0 3 0 0 0 3 5 0 0 4 0 0 0
0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 2 0
S t u n d e n n a c h A p p lik a t io n
Konzentration [ng/ml]
P fe r d 1 P fe r d 2 P fe r d 3 P fe r d 4 P fe r d 5 P fe r d 6
0 5 0 0 1 0 0 0 1 5 0 0 2 0 0 0 2 5 0 0 3 0 0 0 3 5 0 0 4 0 0 0
0 5 1 0 1 5 2 0 2 5
Abb. 32: Plasmakonzentrationsverläufe von Theophyllin nach einmaliger oraler Applikation von 4mg Theophy gewicht, Ausschnittsvergrößerung zeigt die ersten 25 Stunden nach Applikation
93 ERGEBNISSE
3 0
llin pro kg Körper
ERGEBNISSE
und 3 weicht der Verlauf wie folgt ab: Die Pl akonzentrationen schwanken innerhalb der ersten zwanzig Minuten stark zwischen hohen
im rla n ferde kontinuierlic a o ati erli
ie Werte der Pferde 1, 2 und 5 unterschreiten bereits nach 96 Stunden die isen über en Probenentnahmezeitraum von 168 Stunden Theobrominplasmakonzentrationen oberhalb er Quantifizierungsgrenze auf. Wie die prozentuale Darstellung in Abb. 33 zeigt, läßt sich im Plasma lediglich Theobromin
br inap werden. Die Einzelwerte der
r inpl in Tab. 48 im Anhang aufgeführt.
T obrom und Metaboli n nach ntraven ser Ap likation
ie der Abbildu g 34 z entneh en ist, ahmen ie max alen smako ntratio ze Pfer erte isch 5.715 /ml u 12.40 ng/ml
ei 45 M ten n intr nöser erabr ung icht. r Kon ration
ällt n den den stark m d
inut ach Appl tion tinuie h lan m w r abzufallen. Bei den Pferden 2 asm
und niedrigen Werten, um danach ähnlich wie Ve uf der a deren P h langs m an K nzentr on zu v eren.
D
Quantifizierungsgrenze, die des Pferdes 6 nach 144 Stunden. Die Pferde 3 und 4 we d
d
nach intravenöser Verabreichung von Theobromin
nachweisen. Coffein, Theophyllin und Paraxanthin konnten nach intravenöser Theo om plikation nicht nachgewiesen
Theo omb asmakonzentrationen aller Pferde sind
0%
Theophyllin Paraxanthin Theobromin Coffein
Abb. 33: Prozentuales Verhältnis von Theobromin und Metaboliten im Plasma nach intravenöser Applikation von 4 mg/kg Körpergewicht im Mittel (es wurde kein Theophyllin, kein Paraxanthin und kein Coffein nachgewiesen)
0
Abb. 34: Plasmakonzentrationsverläufe von Theobromin nach einmaliger intravenöser Applikation von 4 mg Theobro kg Körpergewic Ausschnittsvergrößerung gt die erste Stunde nach Applikation
95 ERGEBNISSE
ht,
ERGEBNISSE
4.3.2. Pharmakokinetische Berechnungen
4.3.2.1. Pharmakokinetik von Theophyllin nach intravenöser Applikation
Die Berechnung der pharmakokinetischen Parameter für Theophyllin nach intravenöser Verabreichung erfolgte anhand eines Zwei-Kompartiment-Modells, da aufgrund der in Abb.
5 dargestellten halblogarithmischen Darstellung der gemittelten lasmakonzentrationsverläufe des Theophyllins von einem biexponentiellen Phasenverlauf ausgegangen werden konnte.
3 P
1 10 100 1000 10000
0 10 20 0 50 60
Z
30 4
eit [h]
Konzentration [ng/ml]
Mittelwert LOQ LOD
bb.35: Halblogarithmische Darstellung der gemittelten Theophyllinkonzentrationsverläufe im r
ie Ergebnisse der pharmakologischen Berechnungen durch das Programm WinNonlin® 4.1 lle 33 dargestellt.
A
Plasma nach einmaliger intravenöser Applikation von Theophyllin, sowie de Quantifizierungsgrenze (LOQ) und der Nachweisgrenze (LOD)
D
(Pharsight, Mountain View California, USA) sind in Tabe
ERGEBNISSE
Para- Einheit Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Mittel- Standard-
meter 1 2 3 4 5 6 wert abweichung
AUC [ng/ml*h] 87652 80682 49055 53372 89035 74065 72310 17249
α [h-1] 2.64 3.17 31.95 4.33 38.75 15.02 15.98 15.83
β [h-1] 0.04 0.06 0.07 0.05 0.04 0.06 0.05 0.01
α 0,5 [h] 0.3 0.2 0.1 0.2 0.1 0.1 0.2 0.1
β 0,5 [h] 16.6 12.6 10.1 14.5 15.6 12.3 13.6 2.4 C max [ng/ml] 8808 6657 16149 4941 11786 10323 9777 3975 CL [ml/h/kg] 45.6 49.6 81.5 74.9 44.9 54.0 58.4 15.8 MRT [h] 23.5 17.9 14.5 20.7 22.5 17.6 19.4 3.4 Vss [ml/kg] 1071.2 890.1 1180.4 1548.4 1008.9 949.5 1108.1 237.9 Tab.33: Pharmakokinetische Daten bis zur Quantifizierungsgrenze nach einmaliger
intravenöser Applikation von 4 mg Theophyllin pro kg Körpergewicht
nter der Kurve (area under the curve)
= Hybridkonstante Verteilungsphase
= Hybridkonstante der Eliminationsphase
0,5 = Halbwertzeit für die Eliminationsphase
ax = maximale Konzentration AUC = Fläche u
α β
α 0,5 = Halbwertzeit für die Verteilungsphase β
C m
CL = Clearance
MRT = mittlere Verweildauer eines Moleküls im Organismus Vss = Verteilungsvolumen im Steady State
4.3.2.2. Pharmakokinetik von Theophyllin nach oraler Applikation
Die Berechnungen der pharmakokinetischen Parameter für Theophyllin nach oraler Applikation wurde anhand eines Ein-Kompartiment-Modells durchgeführt, da die in Abb. 36 gezeigte halblogarithmische Darstellung der gemittelten Plasmakonzentrationen von Theophyllin sich monoexponentiell verhielt.
Die Ergebnisse der pharmakokinetischen Berechnungen sind in Tabelle 34 zusammengefasst.
ERGEBNISSE
Abb.36: Halblogarithmische Darstellung der gemittelten Theophyllinkonzentrationsverläufe im Plasma nach einmaliger oraler Applikation von Theophyllin, sowie der
Nachweisgrenze (LOD)
Pferd Pferd Mittel- Standard- Quantifizierungsgrenze (LOQ) und der
Para- Einheit Pferd Pferd Pferd Pferd
meter 1 2 3 4 5 6 wert abweichung
AUC [ng/ml*h] 56495 40490 84566 66423 79068 41928 61495 18517 K01 HL [h-1] 3.37 1.03 0.95 2.09 0.12 2.25 1.64 1.16
Tab.34: Pharmakokinetische Daten bis zur oraler Applikation von 4 mg Theoph
AUC = Fläche unter der Kurve (area under the curve)
K01 HL = Halbwertszeit der Resorptionskonstante
K10 HL = Halbwertszeit der Eliminationskonstante
CL = Clearance
Tmax = Zeit bis zum Erreichen der maxima Cmax = maximale Konzentration
Kel = Eliminationskonstante
Quantifizierungsgrenze nach einmaliger yllin pro kg Körpergewicht
n n
len Konzentration (Cmax)
ERGEBNISSE
Aus den ermittelten Parametern lässt sich zusätzlich die orale Bioverfügbarkeit (F) von Theophyllin bestimmen. Sie wird über das Verhältnis der Flächen unter den Kurven nach intravenöser (AUC i.v.) und nach oraler (AUC oral) Verabreichung wie folgt berechnet:
100
. .
⎟⎟⋅
⎠
⎜⎜ ⎞
⎝
=⎛
v i oral
AUC
F AUC [%]
Die orale Bioverfügbarkeit von Theophyllin wurde mit 85% errechnet.
4.3.2.3. Pharmakokinetik von Theobromin nach intravenöser Applikation
Zur Berechnung der pharmakokinetischen Parameter des intravenös verabreichten Theobromins wurde, aufgrund des in Abb. 37 dargestellten biexponentiellen Verlaufes der halblogarithmischen Darstellung der Plasmakonzentrationsmittelwerte, ein Zwei-Kompartiment-Modell gewählt. Die Ergebnisse der pharmakokinetischen Berechnungen sind in Tabelle 35 zusammengefasst.
1 10 100 1000 10000
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Zeit [h]
Konzentration [ng/ml]
Theobromin- Mittelwerte LOQ
LOD
Abb.37: Halblogarithmische Darstellung der gemittelten Theobrominkonzentrationsverläufe im Plasma nach einmaliger intravenöser Applikation von Theobromin, sowie der
Quantifizierungsgrenze (LOQ) und der Nachweisgrenze (LOD)
ERGEBNISSE
Para- Einheit Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Pferd Mittel- Standard-
meter 1 2 3 4 5 6 wert abweichung
AUC [ng/ml*h] 28895 111380 94570 131372 90244 97882 92391 34500
α [h-1] 23.72 0.08 0.13 5.68 23.53 6.2 9.89 10.96
β [h-1] 0.2 0.02 0.02 0.02 0.04 0.03 0.06 0.07
α 0,5 [h] 0.1 9.1 5.2 0.1 0.1 0.1 2.2 3.8
β 0,5 [h] 3.5 30.9 25.1 29.1 18.5 21.3 21.4 9.9 C max [ng/ml] 20382 6585 5174 5626 18911 6397 8539 5827 CL [ml/h/kg] 138.4 35.9 42.3 30.5 44.3 40.9 55.4 41.0 MRT [h] 4.9 23.2 28.9 41.8 26.5 30.5 25.9 12.1 Vss [ml/kg] 680.6 834.5 1221.7 1272.1 1174.5 1247 1071.7 250.3 Tab.35: Pharmakokinetische Daten bis zur Quantifizierungsgrenze nach einmaliger
intravenöser Applikation von 4 mg Theobromin pro kg Körpergewicht
UC = Fläche unter der Kurve (area under the curve)
= Hybridkonstante Verteilungsphase
= Hybridkonstante der Eliminationsphase
0,5 = Halbwertzeit für die Verteilungsphase
0,5 = Halbwertzeit für die Eliminationsphase
max = maximale Konzentration
L = Clearance
RT = mittlere Verweildauer eines Moleküls im Organismus ss = Verteilungsvolumen im Steady State
A
α β α β
C C M V
ERGEBNISSE
ten im Urin Theophyllin und
l. Theobromin konnte nicht nachgewiesen werden.
izierungsgrenze von 50 ng Theophyllin pro ml ten Probenentnahmezeitraum in Konzentrationen ungsgrenze von 50 ng pro ml Urin nachzuweisen. Die höchsten
chen 745 ng/ml und 2.980 ng/ml und wurden rei bis zwölf Stunden gemessen. Die Einzelwerte der - und Paraxanthinurinkonzentrationen aller Pferde sind in den Tabellen 49 und 50 Anhang aufgeführt. Das prozentuale Verhältnis von Theophyllin und Paraxanthin wird in Abb. 39 veranschaulicht. In Abb.38 werden die Theophyllinkonzentrationsverläufe aller Pferde im Urin nochmals graphisch dargestellt.
chen 745 ng/ml und 2.980 ng/ml und wurden rei bis zwölf Stunden gemessen. Die Einzelwerte der - und Paraxanthinurinkonzentrationen aller Pferde sind in den Tabellen 49 und 50 Anhang aufgeführt. Das prozentuale Verhältnis von Theophyllin und Paraxanthin wird in Abb. 39 veranschaulicht. In Abb.38 werden die Theophyllinkonzentrationsverläufe aller Pferde im Urin nochmals graphisch dargestellt.