Methodenentwicklung

Herstellung der Standardlösungen:

Vor der Aufarbeitung wurden die zur quantitativen Bestimmung notwendigen Standard-Lösungen hergestellt. Mit den Internen Standards wurde anschließend ebenso verfahren. Zur Ermittlung des geeigneten Lösungsmittels wurden die Methylxanthine in den verschiedenen Lösungsmitteln 0,06 molare Salzsäure, destillierter Methanol, Milli-Q-Wasser und 0,05

olare Natronlauge gelöst: Zuerst wurde eine Lösung in Methanol versucht. Sie gelang nur

wurde als Mischstandard aus stickstoffmarkiertem Theophyllin ,3-¹⁵N2-Theophyllin), deuteriertem Coffein (D3-Coffein) und deuteriertem Theobromin (D6 -heobromin) hergestellt. Als Interner Standard für Paraxanthin wurde ebenfalls das markierte

6-Theobromin ca.

alb so groß war wie die Intensitäten der anderen internen Standards, wurde bei der m

unvollständig. Erst nach Zugabe von 32%iger HCl und Verbringung in ein 50°C warmes Ultraschallwasserbad lösten sich die Analyten rückstandsfrei. Jedoch kristallisierte die Lösung bei Erreichen der Raumtemperatur wieder. Die beste Löslichkeit bestand bei 0,05 molarer Natronlauge, jedoch war die Stabilität der Analyten in diesem Lösungsmittel nicht ausreichend. Als am besten geeignet erwies sich schließlich die Lösung in Milli-Q-Wasser.

Die Standardlösung wurde als Mischstandard mit den Methylxanthinen Theophyllin, Coffein, Theobromin und dem möglichen Metaboliten Paraxanthin hergestellt. Dazu wurden jeweils 10 mg dieser Substanzen per Feinwaage eingewogen und in Milli-Q-Wasser gelöst und so eine 0,1%ige Stammlösung hergestellt. Aus dieser 100µg/ml Stammlösung wurde durch 1:10 Verdünnung die Arbeitslösung mit der Konzentration von 10 µg/ml hergestellt.

Auch der Interne Standard (1

T

Theophyllin genutzt. Da die massenspektrometrische Signalintensität für D h

Herstellung des internen Mischstandards die Konzentration von D6-Theobromin verdoppelt.

Es wurden also je 10 mg des D3-Coffeins und des markierten Theophyllins und 20 mg des D6 -Theobromins per Feinwaage eingewogen und ebenfalls in 100 ml Milli-Q-Wasser gelöst. Aus dieser Stammlösung wurden dann durch Verdünnungen Arbeitslösungen mit der Konzentration von 10 µg bzw. 20µg/ml hergestellt.

Beide Lösungen wurden sowohl zur Quantifizierung der Urin- als auch der Plasmaproben genutzt.

MATERIAL UND METHODE

Überprüfung der Messmethode:

Zur Überprüfung der Messmethode des LC/MS/MS-Systems musste als erstes das sogenannte Tuning des HPLC-Gerätes erfolgen. Dabei werden die Substanzen anhand ihrer spezifischen Ionenübergänge in die einzelnen Ionenfragmente identifiziert und konnten anhand dieser im Computersystem des Gerätes gespeichert werden. Per Direkteinlass wurden anschließend die

n aus beiden Stoffen handelte. Um dieses Problem zu lösen, wurden alle weiteren nenübergänge der beiden Stoffe verglichen. Als einziger Unterschied erwies sich der

erhält man die

1 ml Methanol konditioniert und mit 1 ml Milli-Q-Wasser equilibriert, bevor 50 µl des Internen Mischstandards per Hamilton-Spritze auf die Säule Kollisionsenergie und die Linsensysteme des Massenspektrometers für jeden einzelnen Analyten optimiert.

Im Rahmen dieser Untersuchungen wurde festgestellt, dass der Ionenübergang in die beiden Hauptfragmente, der die substanzspezifische Identifikation ermöglichen soll, bei Theophyllin und Paraxanthin identisch ist. Somit ließ sich bei einer Probe anhand dieses Ionenüberganges 181.0/124.0 nicht eindeutig ersehen, ob es sich um Theophyllin, Paraxanthin oder eine Kombinatio

Io

Ionenübergang 181.0/55.0, welcher nur beim Paraxanthin auftrat. Also konnte Paraxanthin anhand dieser Fragmentierung identifiziert und quantifiziert werden. Theophyllin musste deshalb durch die Differenzmethode quantifiziert werden. Das bedeutet, dass man die Intensität des gemeinsamen Ionenübergangs als Summe der beiden Analyten betrachtet. Von der errechneten Summenkonzentration subtrahiert man die Paraxanthinkonzentration, welche aus der Intensität des einzelnen Ionenübergangs errechnet wurde. Somit

Theophyllinkonzentration.

Ermittlung der geeigneten Urinaufarbeitung:

Zur Optimierung der Analytenausbeute wurden bei der Methodenentwicklung der Urinaufarbeitung zunächst verschiedene Festphasenextraktionen angewandt und deren Ergebnisse miteinander verglichen. Aus verschiedenen vorangegangenen Untersuchungen war bereits bekannt, dass eine Flüssig-Flüssig-Extraktion bei Methylxanthinen wenig ergiebig ist. Zum Vergleich wurden Oasis^® HBL 3cc (60mg) Extraction Cartridges der Firma Waters, C 18-Ionentauschersäulen Chromabond^® 6ml/ 500mg, octadecyl- modifiziertes Kieselgel und selbsthergestellte PAD-Säulen eingesetzt.

Beide C 18 Säulen wurden mit

MATERIAL UND METHODE

aufgetragen wurde. Im Anschluss daran wurden die 2 ml mit unterschiedlichen Mengen der Standardlösung versetzten Urinproben zugegeben. Die Säulen wurden anschließend mit einem Wasser-Methanol-Gemisch (95:5) gewaschen und mit 1 ml Methanol eluiert. Das Eluat wurde am Rotationsverdampfer eingeengt, anschließend mit 100µl LC-Puffer (80%

Ammoniumacetat, 20% Acetonitril und 0,1% Eisessig) angelöst und in die Messgefäße für die HPLC überführt.

Die PAD-Säulen wurden durch Einhängen von Pasteurpipetten in eine Halterung, Einlegen einer kleinen Glaskugel in die Pipettenmündung und anschließendem Aufbringen von ca. 2ml uilibriert und konditioniert wurde durch weimaliges Waschen mit Milli-Q-Wasser. Der Interne Standard und die 2 ml Urinproben

1 ml Aceton, das Eluat benfalls am Rotationsverdampfer eingeengt und in 100 µl LC-Puffer gelöst in Messgefäße

xtraktionsergebnis zeigten die Oasis^®-Säulen, aber da die Ausbeute und das

viel besseren Ausbeute, reduzierte aber die Störpeaks noch nicht

etzte Messschwankungen konnten durch Intensivierung der Reagenzgläserwaschschritte

1 ml 6-molare Salzsäure zugegeben und wiederum fünfmal mit Wasser nd zum Schluss zweimal mit einem Methanol-Aceton-Gemisch gespült. Die

LC-MS-hromatogramme zeigten weniger Störpeaks, so dass die Interpretation der Analytenpeaks produzierbar und präzise war.

einer Polystyrolharzlösung selbsthergestellt. Eq z

wurden wie bei den anderen Säulen aufgetragen und anschließend mit ca. 2 ml Milli-Q-Wasser gewaschen. Eluiert wurde bei diesen Säulen zweimal mit

e

überführt.

Das beste E

deutliche Vorhandensein von Störpeaks noch nicht zufriedenstellend waren, wurde die Methode weiter modifiziert. Die Konditionierung und Equilibrierung wurden auf jeweils 2 ml erhöht, das Urinprobenvolumen auf 2,5 ml erhöht, der Waschschritt nach Aufbringen der Probe auf zweimal 1 ml Methanol-Wasser-Gemisch verdoppelt und anstatt mit Methanol wurde dreimal mit 0,5 ml Aceton eluiert und in 120 µl LC- Puffer angelöst.

Dies führte zu einer sehr

ausreichend. Dies gelang erst durch mehrfaches Zentrifugieren der Urinprobe während der Aufarbeitung: Einmal 10 Minuten bei 1800 U/min vor Auftragen der Probe auf die Säule und noch ein zweites Mal nach dem Anlösen in LC-Puffer, so dass nur der Überstand in das Messgefäß überführt wurde.

L

deutlich reduziert werden. Die Reagenzgläser wurden nach Gebrauch einmal mit der Bürste und viermal ohne Bürste mit heißem Wasser gewaschen, dann mit je 1 ml 6-molarer Natronlauge für eine Stunde bei 100°C gekocht. Anschließend wieder fünfmal mit Wasser gespült, danach wurde

u C re

MATERIAL UND METHODE

Der Einfluss von unterschiedlichen pH-Werten wurde wie folgt untersucht: Von sechs rinproben der gleichen Konzentration wurden zwei mit 1-molarer Salzsäure auf einen sauren

von 12 eingestellt. Zwei Proben blieben unverändert bei dem hysiologischen pH-Wert von ca. 8. Danach wurden alle Proben nach oben aufgezeigtem

n wurden vor Aufbringen auf die Säulen mit 500µg einer Proteaselösung (aus inderpancreas, Typ 1, 5mg/ml) versetzt, eine Stunde im 50°C -warmen Wasserbad inkubiert

rstand wurde nschließend auf die Oasis^®-Säule überführt. Die weitere Aufarbeitung verlief genau wie bei

ich zwischen der Festphasenextraktion und der von BEAUDRY et al. (2006) ublizierten Direktinjektion von Pferdeplasma nach Proteinfällung mit Methanol und

entrifugation in die HPLC zeigte eine wesentlich bessere Empfindlichkeit bei der estphasenextraktion.

U

pH-Wert von 2,5 und zwei Proben durch 1-molare Kaliumhydroxidlösung auf einen alkalischen pH-Wert

p

Schema aufgearbeitet und gemessen. Es zeigten sich keine gravierenden Unterschiede, weder bei der Ausbeute noch beim biologischen Untergrundrauschen in den einzelnen Ionenspuren.

Ermittlung der geeigneten Plasmaaufarbeitung

Für die Plasmaprobenaufarbeitung wurde zunächst die Aufarbeitung der Urinproben übernommen und zur Optimierung der Ausbeute weiter modifiziert.

Um den Einfluss von Proteinbindungen der Methylxanthine im Plasma auf die Substanzausbeute bei der Aufarbeitung zu untersuchen, wurden folgende Versuchsreihen verglichen:

Die ersten zwölf Proben wurden genau wie die Urinproben aufgearbeitet, und die zweiten zwölf Probe

R

und anschließend 10 Minuten bei 1800 U/min zentrifugiert. Nur der Übe a

den ersten zwölf Proben.

Die Auswertung zeigte eine fast doppelt so hohe Theophyllin-, Theobromin- und Paraxanthinausbeute bei den Proben mit Proteindenaturierung im Gegensatz zu der Probenreihe ohne Proteolyse. Somit wurde die Proteindenaturierung in die Plasmaprobenaufarbeitung übernommen.

Ein Vergle p

Z F

MATERIAL UND METHODE

3.2.4. Aufbereitung d

Für die Aufarbei enextraktion dienten Oasis^®- Säulen 3cc (60mg) als Absorbens.

Die Urinproben wurden aufgetaut und pro Probe wurden 2,5 ml per Pipette entnommen und in ein Reagenzspitzglas überführt. Ansch

(10µg/ml) d h wurde die Probe 10 Minuten bei

1800 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Die Oasis^®- Säulen 3cc (60mg) wurden mit 2

ml Me i Der Überstand der

zentrifugierten P liquotiert und zweimal mit 1 ml eines

Meth wurden Spitzgläser in die

Reagenzgla um das Probeneluat aufzufangen.

Eluiert wurde dreim Anschluss wurde das Eluat am

Rotationsverda be wurde schließlich mit 120µl

Ammoniumac bei 1800 Umdrehungen pro Minute

zentrifugiert, der Überstand in HPLC-Probengefäße überführt und zur Messung in die HPLC verbrach

Die Aufarbeitu enfassend dargestellt.

Die beschriebene Aufarbeitung wurde zur Quantifizierung von Proben mit Konzentrationen bis zu 10.000ng er analytischen Säule und des Detektors ei Konzentrationen über 10.000 ng/ml zu vermeiden, wurde die Aufarbeitung wie folgt

terner ischstandard wurde von 50 µl auf 100 µl erhöht und anstatt in 120 µl wurde das eingeengte luat in 250µl Ammoniumacetatpuffer gelöst. Ebenso wurde mit der Kalibrationsreihe erfahren.

er Urinproben

tung der Urinproben mittels Festphas

ließend wurde 50 µl Interner Mischstandard azugegeben und die Probe gevortext. Danac

thanol kondit oniert und mit 2 ml Milli-Q-Wasser equilibriert.

robe wurde nun auf die Säulen a

anol-Milli-Q-Wasser-Gemisches (10:90) gespült. Hiernach shalterung der Unterdruckkammer gestellt,

al mit jeweils 0,5 ml Aceton. Im mpfer eingeengt. Die trockene Pro etatpuffer angelöst, erneut 10 Minuten t.

ng der Urinproben wird in Abb.9 zusamm

/ml angewendet. Um eine Sättigung d b

modifiziert: Es wurden lediglich 1 ml statt 2,5 ml der Probe aufgearbeitet, die Menge in M

E v

MATERIAL UND METHODE

Probenvorbereitung

(Konzentrationsbereich bis 10.000ng/ml)

↓

2,5 ml Urin in ein Reagenzspitzglas

↓

+ 50 µl Interner Mischstandard [10µl/ml]

mittels Hamiltonspritze, schütteln (Vortex)

↓

Zentrifugation : 10 min bei 1800 U/min Überstand dekantieren, Sediment verwerfen

↓

Waters Oasis HLB 3cc (60mg) Extraction Cartridges: ®

mit 2 ml Methanol konditionieren mit 2 ml Milli-Q-W sser equilibrieren a

2,5 ml des Urinprobenüberstandes auf die Säule überführen mit 2 x 1 ml Methanol/Wasser (10/90)spülen

mit 3 x 0,5 ml Aceton eluieren Eluat in Reagenzspitzgläsern auffangen

↓

Eluat am Rotationsverdampfer einengen

↓

Substrat in 120 µl Ammoniumacetatpuffer anlösen, schütteln (Vortex)

↓

Zentrifugation : 10 min bei 1800U/min

↓

Überstand mit Pasteurpipetten in Autosamplervials überführen 10µl in das HPLC/MS/MS injizieren

Abb.9: Pferdeurin mittels

H is 10.000 ng/ml

.2.5. Aufbereitung der Plasmaproben

lasmaproben erfolgte wie die der Urinproben mit der Modifikation der roteindenaturierung:

Probenaufarbeitung zum Nachweis von Methylxanthinen im PLC/MS/MS im Konzentrationsbereich b

3

Die Aufarbeitung der P P

MATERIAL UND METHODE

Probenvorbereitung

(Konzentrationsbereich bis 10.000ng/ml)

↓

2,5 ml Plasma in ein Reagenzspitzglas

↓

+ 50 µl Interner Mischstandard [10 µl/ml]

mittels Hamiltonspritze, schütteln (Vortex)

↓

+ 100µl einer 0,5%igen Proteaselösung (P 4630 Typ 1)

↓

Inkubation für 60 Min. bei 50 °C im Wasserbad

↓

Zentrifugation : 10 min bei 1800 U/min Überstand dekantieren, Sediment verwerfen

↓

Waters Oasis^®HLB 3cc (60mg) Extraction Cartridges:

mit 2 ml Methanol konditionieren mit 2 ml Milli-Q-Wasser equilibrieren

2,5 ml des Plasmaprobenüberstandes auf die Säule überführen mit 2 x 1 ml Methanol/Wasser (10/90)spülen

mit 3 x 0,5 ml Aceton eluieren Eluat in Reagenzspitzgläsern auffangen

↓

am Rotationsverdampfer einengen Eluat

↓

Substrat in 120 µl Ammoniumacetatpuffer anlösen, schütteln (Vortex)

↓

Zentrifugation : 10 min bei 1800U/min

↓

Überstand mit Pasteurpipetten in Autosamplervials überführen 10µl in das HPLC/MS/MS injizieren

ich bis 10.000 ng/ml

Abb.10: Probenaufarbeitung zum Nachweis von Methylxanthinen im Pferdeplasma mittels HPLC/MS/MS im Konzentrationsbere

Auch diese Aufarbeitung wurde im Konzentationsbereich über 10.000ng/ml entsprechend der Urinproben verändert.

MATERIAL UND METHODE

3.3. Validierung der Methode

Da jede experimentelle Messung mit Fehlern behaftet ist, soll mit der Validierung der Eignungsnachweis einer Methode für den vorgesehenen Zweck erbracht werden. Nachfolgend

ufgeführte Kriterien sind in dieser Studie in die Validierung eingegangen:

3.3.1. Selektivität und Spezifität

Unter der Selektivität versteht man deren Fähigkeit, verschiedene Substanzen unterscheiden zu können. Bei der HPLC/MS/MS-Methode ist dies durch unterschiedliche

etentionszeiten der Analyten und ausreichende Trennung von coeluierten Störpeaks im at

ie Spez iges Erfassen und Identifizieren einer Substanz falls in der zu untersuchenden Probe vorkommender Substanzen. Dazu mussten aus dem Product-Ion-Scan einer Substanz

charakteristische Ionenübergänge a onitoring

(MRM) aufgezeichnet und mit den atrixproben

vergli

Zur B ivität und Sp Proben, denen

die Analyten zugesetzt wurden, verglic die Analyten

a- oder Urininhaltstoffen (Spezifität) und mit ausreichender ng

erschiedlichen Mengen der Analyten gespikt. Diese Konzentrationen müssen den a

einer Methode

R

Chrom ogramm gekennzeichnet.

ifität einer Methode ist deren eindeut D

ohne Störung oder Verfälschung anderer, eben

usgewählt und mittels multile Reaction M entsprechenden Ionenspuren von Leerm chen werden.

estimmung der Selekt ezifität wurden Leermatrixproben mit hen. Es konnte festgestellt werden, dass ohne Verfälschung durch Plasm

Trennu und ohne gegenseitige Störung im Chromatogramm darzustellen sind.

3.3.1. Linearität

Die Linearität beschreibt den mathematischen Zusammenhang von Konzentration des Analyten und der Signalstärke/Detektorantwort.

Für die Überprüfung der Linearität wurden an drei unterschiedlichen Tagen Kalibrierreihen sowohl für Plasma als auch für Urin erstellt, wobei jede Konzentration doppelt aufgearbeitet und dann gemessen wurde. Pro Kalibriergerade wurden mindestens fünf Leermatrixproben mit unt

MATERIAL UND METHODE

gesamten Konzentrationsbereich abdecken (DIN 38402 A51, 1986). Da sich der alibrierbereich der Analyten über vier Zehnerpotenzen erstreckte, wurde bei beiden Matrices K

die Linearität im niedrigen, mittleren und im hohen Bereich überprüft. Die gewählten Konzentrationen sind in den Tabellen 6 und 7 aufgeführt.

PLASMA Konzentration von Coffein, Theobromin und Theophyllin in ng/ml

Kalibrationsgerade I 0,20,60,100,300,600,1000 Kalibrationsgerade II 100, 2000, 4000, 6000, 8000, 10000 Kalibr ionsgerade III at 10000, 20000, 30000, 40000, 50000

trationen von Coffein, Theobromin und Theophyllin im Plasma zur eraden

Tab.6: Verwendete Konzen

Erstellung der drei Kalibrationsg

URIN Konzentration von Coffein, Theobromin, Theophyllin und Paraxanthin in ng/ml Kalibratio sg ran e de I 0,25, 50, 100, 250, 500, 1000 Kalibrationsgerade II 1000, 2000, 4000, 6000, 8000, 10000 Kalibrationsgerade III 1000, 2500, 5000, 10000, 20000, 30000

Tab.7: Verwendete Konzentrationen von Coffein, Theobromin, Theophyllin und Paraxanthin im i Kalibrationsgeraden

in nd des Internen Standards (D3-Coffein, 1,3-¹⁵N2-Theophyllin rde visuell auf Ausreißer und inearität untersucht (U.S. DERPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES, nte Einbezug der Geradensteigung wurde auf die gemessende Konzentration zurückgerechnet. Diese sogenannte „back calculation“ durfte dabei um maximal 15%, an der

maximal 20% vom theoretischen Wert abweichen (EHSLC Urin zur Erstellung der dre

Aus dem Integral der erhaltenen Peakflächen der Analyten (Coffein, Theophyllin, Theobromin und Paraxanth ) u

und D6-Theobromin) wurde der Quotient gebildet und gegen die Konzentration der Kalibratoren aufgetragen. Die entstandene Kalibiergerade wu

L

1999). U r

unteren Bestimmungsgrenze um 2002).

MATERIAL UND METHODE

3.3.3. Nachweisgrenze

Die Nachweisgrenze (Detektionsgrenze, limit of detection, LOD) stellt die niedrigste Konzentration dar, bei der sich der Analyt noch qualitativ bestimmen lässt, indem ein sicher vom Untergrundrauschen der Blankproben abzugrenzendes Instrumentensignal zu erkennen

xO =

ist. Die Ermittlung dieser Nachweisgrenze wird anhand der Kalibrierkurvenmethode nach DIN 32645 durchgeführt. Dazu wird aus den Residuen der linearen Regression zuerst die Reststandardabweichung SxO aus der Summe der Abweichungsquadrate Qx und den Freiheitsgeraden der linearen Kalibration f berechnet:

f

Mit Hilfe dieser Standardabweichung SxO und dem Mittelwert x aller Kalibrationskonzentrationen kann das Konfidenzintervall für den Merkmalswert Null errechnet werden.

t f,α wurde aus statistischen Tabellen entnommen und errechnet:

α t f,α ^{= TINV ( ; f )}

INV = t-Wert der t-Verteilung unter den Bedingungen der Freiheitsgeraden (f) sowie der T

Fehlerwahrscheinlichkeit (α ).

Mit Hilfe der Steigung a der linearen Regressionsgeraden wurde die Nachweisgrenze (LOD) mit einer Fehlerwahrscheinlichkeit von α wie folgt errechnet:

LOD =

α = Fehlerw rscheinlichkeah it

MATERIAL UND METHODE

3.3.4. Bestimmungsgrenze

Die Best e (Quantifizierungsgrenz fication, LOQ) ist die iedrigste Konzentration, bei der eine quantitative Aussage über den Analyten noch möglich

en dem mittleren essergebnis und dem erwarteten Referenzwert dürfen dabei nicht mehr als 20 % betragen HSLC, 2002).

Zur Bestimmung der LOQ wurden fünf Plasmap onzentration 100 ng/ml Coffein, Theobromin und Theophyllin an drei unter en Tagen aufgearbeitet und chromatographisch-massenspektometrisch quantifizier ung der LOQ im Urin wurde mit Urinproben der Konzentrationen 50 ng/m offein, Theophyllin und Paraxanthin und 100 ng/ml der Substanz Theobrom

ie Richtigkeit gibt die Abweichung des gemessenen Mittelwertes von dem erwarteten eferenzwert an. Um diese zu überprüfen, wurden jeweils fünf Blankproben beider Matrices

n (low quality control standard, LQC), einer mittleren (midrange quality ontral standard, MQC) und mit einer hohen (high quality control standard, HQC)

lwert aller fünf Konzentrationen eines Konzentrationsbereiches (A) und die

immungsgrenz e, limit of quanti

n

ist (DIN 32645, 1994). Die Abweichungen der Konzentration zwisch M

(E

roben mit der K schiedlich t. Bei Bestimm l der Substanzen C

in ebenso verfahren.

3.3.5. Richtigkeit

D R

mit einer niedrige c

Konzentration innerhalb des Konzentrationsbereiches des jeweiligen Analyten gespikt, aufgearbeitet und quantifiziert (EHSLC, 2002).

Zur Errechnung der relativen Abweichung des gemessenen Wertes von dem erwarteten Wert wird der Mitte

theoretische Konzentration (B) zueinander in Beziehung gesetzt und wie folgt berechnet:

RE (%)=

( )

Im niedrigen Konzentrationsbereich sind Abweichungen von den zu erwarten Ergebnissen von maximal 20 % und in den mittleren und hohen Konzentrationsbereichen von maximal

5% zulässig.

ie gewählten Konzentrationen sind in den Tabellen 8 und 9 aufgeführt:

1 D

MATERIAL UND METHODE

Substanz Konzentration

[ng/ml]

Coffein 100, 1000, 10000

Theobromin 100, 1000, 10000

Theophyllin 100, 1000, 10000

Tab.8: Eingesetzte Konzentrationen zur Überprüfung asma

Substanz

der Richtigkeit im Pl

Konzentration

[ng/ml]

Coffein 50, 100, 2000

Theobromin 100, 2500, 20000

Theophyllin 50, 2500, 20000

Paraxanthin 50, 250, 1000

Tab.9: Eingesetzte Konzentrationen zur Überprüfung der Richtigkeit im

ie Präzision beschreibt die Übereinstimmung von wiederholten Messungen von Proben leicher Konzentration. Man unterscheidet die Wiederholpräzision (SW) (Tagespräzision, bility) und die Zwischenpräzision (Sb) (totale Präzision, interday epeatability).

MITT, 2000):

Urin

3.3.6. Präzision

D g

intraday repeata r

Zur Bestimmung der Präzision wurden pro Analyt in beiden Matrices je 5 LQCs, 5 MQCs und 5 HQCs an drei unterschiedlichen Tagen aufgearbeitet, gemessen und chromatographisch-massenspektrometrisch quantifiziert. Die Variation durfte im niedrigen Konzentrationsbereich maximal 20% und im mittleren und hohen Konzentrationsbereich maximal 15% betragen (EHSLC 2002).

Die Wiederholpräzision (SW) und der Zwischenpräzision (Sb) wurden anhand folgender Funktion berechnet (HERBOLD und SCH

MATERIAL UND METHODE

( )

∑

^fTagesserie

∑

^{⋅STagesserie2}

SW =

Tagesserie

f

Sb =

( )

fTage

gesamt Tagesserie X

∑

X ^{− 2}

Substanz Konzentration

[ng/ml]

Coffein 100, 1000, 10000

Theobromin 100, 1000, 10000

Theophyllin 100, 1000, 10000

Paraxanthin 100, 1000

Tab.10: Eingesetzte Konzentrationen zur Überprüfung der Präzision im Plasma

Substanz Konzentration

[ng/ml]

Coffein 50, 100, 2000

Theobromin 100, 2500, 20000

Theophyllin 50, 2500, 20000

Paraxanthin 50, 250, 1000

Tab.11: Eingesetzte Konzentrationen zur Überprüfung der Präzision im Urin

.3.7. Stabilität

m die Stabilität der Analyten in der jeweiligen Matrix für den gesamten Zeitraum des

Proben des Hauptversuches 3

U

Versuches, der Probenlagerung und des Probentransportes sowie des Zeitraumes der Analyse zu beweisen, wurden pro Matrix jeweils zwölf LQCs und zwölf HQCs hergestellt. Davon wurden jeweils sechs sofort im Anschluss aufgearbeitet und quantifiziert. Die jeweils anderen sechs Proben wurden unter den gleichen Bedingungen wie die

MATERIAL UND METHODE

über einen Zeitraum von 12 Wochen bei –20°C gelagert. Nach Ablauf dieser Zeit wurden sie benfalls aufgearbeitet und quantifiziert.

Die gewählten Konzentrationen sind in Tabelle 12 aufgeführt:

Matrix

Tab.12: Konzentrationen von Coffein, Theobromin, Theophyllin und Paraxanthin in den Matrices Urin und Plasma für den Stabilitätstest

3.3.8. Wiederfindung

Die Wiederfindung beschreibt den prozentualen Anteil des Analyten, der nach allen Aufarbeitungsschritten noch wiedergefunden werden kann.

Zur Bestimmung der Wiederfindung wurden pro Matrix jeweils zweimal sechs Proben aufgearbeitet und gemessen. Bei der Sequenz der ersten sechs Proben wurde der Analyt wie gewohnt am Anfang dazu gegeben und der Interne Standard erst nach dem Rotationsverdampfer bei der Überführung in die Vials. Bei der Sequenz der zweiten sechs Proben wurde sowohl der Analyt als auch der Interne Standard erst bei der Überführung in die Vials dazu gegeben.

Die Berechung der Wiederfindung erfolgte nach folgender Funktion:

Wiederfindung [%] =

( )

MATERIAL UND METHODE

3.4. Pharmakokinetische Auswertung

ie pharmakokinetischen Berechnungen erfolgten bei intravenöser Applikation von nem Zwei-Kompartiment-Modell und nach oraler erabreichung von Theophyllin nach einem Ein-Kompartment-Modell mit dem Programm

inNonlin^® 4.1 (Pharsight, Mountain View California, USA).

D

Theophyllin und Theobromin nach ei V

W

ERGEBNISSE

4 ERGEBNISSE

4.1. Ergebnisse der Analysemethoden

.1.1. Massenspektren der zu analysierenden Substanzen und ihrer internen Standards

nalyten ach folgenden Retentionszeiten mit dem charakteristischen Produktion registriert:

.1.1.1. Massenspektrum von Theophyllin und 1,3-¹⁵N2- Theophyllin

heophyllin hat, wie Abb. 11 zeigt, unter den beschriebenen Bedingungen eine Retentionszeit die Quantifizierung ufgezeichnet.

4

Unter den im Kapitel 3.2. beschriebenen Gerätebedingungen werden die einzelnen A n

4

T

von 3,28 Minuten und wird mit dem Produktion m/z 181.0 → 124.0 für a

60 80 100 120 140 160 180

m/z, amu 20%

40%

60%

80%

100%

Rel. Int. (%)

181

124

69 96

54 94

Abb. 11: ESI-Produktionenspektrum und Strukturformel von Theophyllin

ERGEBNISSE

Die Retentionszeit von 1,3-¹⁵N2-Theophyllin bei 3,29 Minuten und das charakteristische Produktion m/z 183.0 → 125.0 sind in Abb. 12 dargestellt.

60 80 100 120 140 160 180

m/z, amu 20%

40%

60%

80%

100%

Rel. Int. (%)

183

125

70 97

1,3-¹⁵N2-Theophyllin wurde als interner Standard sowohl für die Bestimmung von

1,3-¹⁵N2-Theophyllin wurde als interner Standard sowohl für die Bestimmung von

Im Dokument Untersuchungen zur Pharmakokinetik der Methylxanthine Theophyllin und Theobromin hinsichtlich der Dopingrelevanz beim Pferd (Seite 51-0)