1 EINLEITUNG
3.3. Validierung der Methode
3.3.1. Selektivität und Spezifität
3.3. Validierung der Methode
Da jede experimentelle Messung mit Fehlern behaftet ist, soll mit der Validierung der Eignungsnachweis einer Methode für den vorgesehenen Zweck erbracht werden. Nachfolgend
ufgeführte Kriterien sind in dieser Studie in die Validierung eingegangen:
3.3.1. Selektivität und Spezifität
Unter der Selektivität versteht man deren Fähigkeit, verschiedene Substanzen unterscheiden zu können. Bei der HPLC/MS/MS-Methode ist dies durch unterschiedliche
etentionszeiten der Analyten und ausreichende Trennung von coeluierten Störpeaks im at
ie Spez iges Erfassen und Identifizieren einer Substanz falls in der zu untersuchenden Probe vorkommender Substanzen. Dazu mussten aus dem Product-Ion-Scan einer Substanz
charakteristische Ionenübergänge a onitoring
(MRM) aufgezeichnet und mit den atrixproben
vergli
Zur B ivität und Sp Proben, denen
die Analyten zugesetzt wurden, verglic die Analyten
a- oder Urininhaltstoffen (Spezifität) und mit ausreichender ng
erschiedlichen Mengen der Analyten gespikt. Diese Konzentrationen müssen den a
einer Methode
R
Chrom ogramm gekennzeichnet.
ifität einer Methode ist deren eindeut D
ohne Störung oder Verfälschung anderer, eben
usgewählt und mittels multile Reaction M entsprechenden Ionenspuren von Leerm chen werden.
estimmung der Selekt ezifität wurden Leermatrixproben mit hen. Es konnte festgestellt werden, dass ohne Verfälschung durch Plasm
Trennu und ohne gegenseitige Störung im Chromatogramm darzustellen sind.
3.3.1. Linearität
Die Linearität beschreibt den mathematischen Zusammenhang von Konzentration des Analyten und der Signalstärke/Detektorantwort.
Für die Überprüfung der Linearität wurden an drei unterschiedlichen Tagen Kalibrierreihen sowohl für Plasma als auch für Urin erstellt, wobei jede Konzentration doppelt aufgearbeitet und dann gemessen wurde. Pro Kalibriergerade wurden mindestens fünf Leermatrixproben mit unt
MATERIAL UND METHODE
gesamten Konzentrationsbereich abdecken (DIN 38402 A51, 1986). Da sich der alibrierbereich der Analyten über vier Zehnerpotenzen erstreckte, wurde bei beiden Matrices K
die Linearität im niedrigen, mittleren und im hohen Bereich überprüft. Die gewählten Konzentrationen sind in den Tabellen 6 und 7 aufgeführt.
PLASMA Konzentration von Coffein, Theobromin und Theophyllin in ng/ml
Kalibrationsgerade I 0,20,60,100,300,600,1000 Kalibrationsgerade II 100, 2000, 4000, 6000, 8000, 10000 Kalibr ionsgerade III at 10000, 20000, 30000, 40000, 50000
trationen von Coffein, Theobromin und Theophyllin im Plasma zur eraden
Tab.6: Verwendete Konzen
Erstellung der drei Kalibrationsg
URIN Konzentration von Coffein, Theobromin, Theophyllin und Paraxanthin in ng/ml Kalibratio sg ran e de I 0,25, 50, 100, 250, 500, 1000 Kalibrationsgerade II 1000, 2000, 4000, 6000, 8000, 10000 Kalibrationsgerade III 1000, 2500, 5000, 10000, 20000, 30000
Tab.7: Verwendete Konzentrationen von Coffein, Theobromin, Theophyllin und Paraxanthin im i Kalibrationsgeraden
in nd des Internen Standards (D3-Coffein, 1,3-15N2-Theophyllin rde visuell auf Ausreißer und inearität untersucht (U.S. DERPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES, nte Einbezug der Geradensteigung wurde auf die gemessende Konzentration zurückgerechnet. Diese sogenannte „back calculation“ durfte dabei um maximal 15%, an der
maximal 20% vom theoretischen Wert abweichen (EHSLC Urin zur Erstellung der dre
Aus dem Integral der erhaltenen Peakflächen der Analyten (Coffein, Theophyllin, Theobromin und Paraxanth ) u
und D6-Theobromin) wurde der Quotient gebildet und gegen die Konzentration der Kalibratoren aufgetragen. Die entstandene Kalibiergerade wu
L
1999). U r
unteren Bestimmungsgrenze um 2002).
MATERIAL UND METHODE
3.3.3. Nachweisgrenze
Die Nachweisgrenze (Detektionsgrenze, limit of detection, LOD) stellt die niedrigste Konzentration dar, bei der sich der Analyt noch qualitativ bestimmen lässt, indem ein sicher vom Untergrundrauschen der Blankproben abzugrenzendes Instrumentensignal zu erkennen
xO =
ist. Die Ermittlung dieser Nachweisgrenze wird anhand der Kalibrierkurvenmethode nach DIN 32645 durchgeführt. Dazu wird aus den Residuen der linearen Regression zuerst die Reststandardabweichung SxO aus der Summe der Abweichungsquadrate Qx und den Freiheitsgeraden der linearen Kalibration f berechnet:
f
Mit Hilfe dieser Standardabweichung SxO und dem Mittelwert x aller Kalibrationskonzentrationen kann das Konfidenzintervall für den Merkmalswert Null errechnet werden.
t f,α wurde aus statistischen Tabellen entnommen und errechnet:
α t f,α = TINV ( ; f )
INV = t-Wert der t-Verteilung unter den Bedingungen der Freiheitsgeraden (f) sowie der T
Fehlerwahrscheinlichkeit (α ).
Mit Hilfe der Steigung a der linearen Regressionsgeraden wurde die Nachweisgrenze (LOD) mit einer Fehlerwahrscheinlichkeit von α wie folgt errechnet:
LOD =
α = Fehlerw rscheinlichkeah it
MATERIAL UND METHODE
3.3.4. Bestimmungsgrenze
Die Best e (Quantifizierungsgrenz fication, LOQ) ist die iedrigste Konzentration, bei der eine quantitative Aussage über den Analyten noch möglich
en dem mittleren essergebnis und dem erwarteten Referenzwert dürfen dabei nicht mehr als 20 % betragen HSLC, 2002).
Zur Bestimmung der LOQ wurden fünf Plasmap onzentration 100 ng/ml Coffein, Theobromin und Theophyllin an drei unter en Tagen aufgearbeitet und chromatographisch-massenspektometrisch quantifizier ung der LOQ im Urin wurde mit Urinproben der Konzentrationen 50 ng/m offein, Theophyllin und Paraxanthin und 100 ng/ml der Substanz Theobrom
ie Richtigkeit gibt die Abweichung des gemessenen Mittelwertes von dem erwarteten eferenzwert an. Um diese zu überprüfen, wurden jeweils fünf Blankproben beider Matrices
n (low quality control standard, LQC), einer mittleren (midrange quality ontral standard, MQC) und mit einer hohen (high quality control standard, HQC)
lwert aller fünf Konzentrationen eines Konzentrationsbereiches (A) und die
immungsgrenz e, limit of quanti
n
ist (DIN 32645, 1994). Die Abweichungen der Konzentration zwisch M
(E
roben mit der K schiedlich t. Bei Bestimm l der Substanzen C
in ebenso verfahren.
3.3.5. Richtigkeit
D R
mit einer niedrige c
Konzentration innerhalb des Konzentrationsbereiches des jeweiligen Analyten gespikt, aufgearbeitet und quantifiziert (EHSLC, 2002).
Zur Errechnung der relativen Abweichung des gemessenen Wertes von dem erwarteten Wert wird der Mitte
theoretische Konzentration (B) zueinander in Beziehung gesetzt und wie folgt berechnet:
RE (%)=
( )
Im niedrigen Konzentrationsbereich sind Abweichungen von den zu erwarten Ergebnissen von maximal 20 % und in den mittleren und hohen Konzentrationsbereichen von maximal
5% zulässig.
ie gewählten Konzentrationen sind in den Tabellen 8 und 9 aufgeführt:
1 D
MATERIAL UND METHODE
Substanz Konzentration
[ng/ml]
Coffein 100, 1000, 10000
Theobromin 100, 1000, 10000
Theophyllin 100, 1000, 10000
Tab.8: Eingesetzte Konzentrationen zur Überprüfung asma
Substanz
der Richtigkeit im Pl
Konzentration
[ng/ml]
Coffein 50, 100, 2000
Theobromin 100, 2500, 20000
Theophyllin 50, 2500, 20000
Paraxanthin 50, 250, 1000
Tab.9: Eingesetzte Konzentrationen zur Überprüfung der Richtigkeit im
ie Präzision beschreibt die Übereinstimmung von wiederholten Messungen von Proben leicher Konzentration. Man unterscheidet die Wiederholpräzision (SW) (Tagespräzision, bility) und die Zwischenpräzision (Sb) (totale Präzision, interday epeatability).
MITT, 2000):
Urin
3.3.6. Präzision
D g
intraday repeata r
Zur Bestimmung der Präzision wurden pro Analyt in beiden Matrices je 5 LQCs, 5 MQCs und 5 HQCs an drei unterschiedlichen Tagen aufgearbeitet, gemessen und chromatographisch-massenspektrometrisch quantifiziert. Die Variation durfte im niedrigen Konzentrationsbereich maximal 20% und im mittleren und hohen Konzentrationsbereich maximal 15% betragen (EHSLC 2002).
Die Wiederholpräzision (SW) und der Zwischenpräzision (Sb) wurden anhand folgender Funktion berechnet (HERBOLD und SCH
MATERIAL UND METHODE
( )
∑
fTagesserie∑
⋅STagesserie2SW =
Tagesserie
f
Sb =
( )
fTage
gesamt Tagesserie X
∑
X − 2Substanz Konzentration
[ng/ml]
Coffein 100, 1000, 10000
Theobromin 100, 1000, 10000
Theophyllin 100, 1000, 10000
Paraxanthin 100, 1000
Tab.10: Eingesetzte Konzentrationen zur Überprüfung der Präzision im Plasma
Substanz Konzentration
[ng/ml]
Coffein 50, 100, 2000
Theobromin 100, 2500, 20000
Theophyllin 50, 2500, 20000
Paraxanthin 50, 250, 1000
Tab.11: Eingesetzte Konzentrationen zur Überprüfung der Präzision im Urin
.3.7. Stabilität
m die Stabilität der Analyten in der jeweiligen Matrix für den gesamten Zeitraum des
Proben des Hauptversuches 3
U
Versuches, der Probenlagerung und des Probentransportes sowie des Zeitraumes der Analyse zu beweisen, wurden pro Matrix jeweils zwölf LQCs und zwölf HQCs hergestellt. Davon wurden jeweils sechs sofort im Anschluss aufgearbeitet und quantifiziert. Die jeweils anderen sechs Proben wurden unter den gleichen Bedingungen wie die
MATERIAL UND METHODE
über einen Zeitraum von 12 Wochen bei –20°C gelagert. Nach Ablauf dieser Zeit wurden sie benfalls aufgearbeitet und quantifiziert.
Die gewählten Konzentrationen sind in Tabelle 12 aufgeführt:
Matrix
Tab.12: Konzentrationen von Coffein, Theobromin, Theophyllin und Paraxanthin in den Matrices Urin und Plasma für den Stabilitätstest
3.3.8. Wiederfindung
Die Wiederfindung beschreibt den prozentualen Anteil des Analyten, der nach allen Aufarbeitungsschritten noch wiedergefunden werden kann.
Zur Bestimmung der Wiederfindung wurden pro Matrix jeweils zweimal sechs Proben aufgearbeitet und gemessen. Bei der Sequenz der ersten sechs Proben wurde der Analyt wie gewohnt am Anfang dazu gegeben und der Interne Standard erst nach dem Rotationsverdampfer bei der Überführung in die Vials. Bei der Sequenz der zweiten sechs Proben wurde sowohl der Analyt als auch der Interne Standard erst bei der Überführung in die Vials dazu gegeben.
Die Berechung der Wiederfindung erfolgte nach folgender Funktion:
Wiederfindung [%] =
( )
MATERIAL UND METHODE
3.4. Pharmakokinetische Auswertung
ie pharmakokinetischen Berechnungen erfolgten bei intravenöser Applikation von nem Zwei-Kompartiment-Modell und nach oraler erabreichung von Theophyllin nach einem Ein-Kompartment-Modell mit dem Programm
inNonlin® 4.1 (Pharsight, Mountain View California, USA).
D
Theophyllin und Theobromin nach ei V
W
ERGEBNISSE
4 ERGEBNISSE
4.1. Ergebnisse der Analysemethoden
.1.1. Massenspektren der zu analysierenden Substanzen und ihrer internen Standards
nalyten ach folgenden Retentionszeiten mit dem charakteristischen Produktion registriert:
.1.1.1. Massenspektrum von Theophyllin und 1,3-15N2- Theophyllin
heophyllin hat, wie Abb. 11 zeigt, unter den beschriebenen Bedingungen eine Retentionszeit die Quantifizierung ufgezeichnet.
4
Unter den im Kapitel 3.2. beschriebenen Gerätebedingungen werden die einzelnen A n
4
T
von 3,28 Minuten und wird mit dem Produktion m/z 181.0 → 124.0 für a
60 80 100 120 140 160 180
m/z, amu 20%
40%
60%
80%
100%
Rel. Int. (%)
181
124
69 96
54 94
Abb. 11: ESI-Produktionenspektrum und Strukturformel von Theophyllin
ERGEBNISSE
Die Retentionszeit von 1,3-15N2-Theophyllin bei 3,29 Minuten und das charakteristische Produktion m/z 183.0 → 125.0 sind in Abb. 12 dargestellt.
60 80 100 120 140 160 180
m/z, amu 20%
40%
60%
80%
100%
Rel. Int. (%)
183
125
70 97
1,3-15N2-Theophyllin wurde als interner Standard sowohl für die Bestimmung von Theophyllin als auch für den Metaboliten Paraxanthin im Urin und Plasma eingesetzt.
4.1.1.2. Massenspektrum von Theobromin und D6- Theobromin
Theobromin wird mit einer Retentionszeit von 2,91 Minuten und dem charakteristischen Produktion m/z 181.0 → 138.0 unter den genannten Bedingungen detektiert. Das ESI-Produktionenspektrum und die Strukturformel von Theobromin sind in Abb. 13 aufgeführt.
54
Abb. 12: ESI-Produktionenspektrum von 1,3-15N2-Theophyllin
ERGEBNISSE
108110 122 163
69
53 83
Abb.13: ESI-Produktionenspektrum und Strukturformel von Theobromin
bb. 14 zeigt D6-Theobromin, den internen Standard zu Theobromin im Urin und Plasma, elches nach einer Retentionszeit von 2,86 Minuten mittels des Produktions m/z 187.0 → 44.0 registriert wird.
A
Abb.14: ESI-Produktionenspektrum von D6-Theobromin
ERGEBNISSE
4.1.1.3. Massenspektrum von Coffein und D3- Coffein
Coffein weist unter den entsprechenden Bedingungen eine Retentionszeit von 3,80 Minuten auf und wird im Massenspektrometer mit dem Produktion m/z 195.0 → 138.0 registriert. Abb.
15 zeigt das ESI-Produktionenspektrum und die Strukturformel.
60 80 100 120 140 160 180 200
m/z, amu 20%
40%
60%
80%
100%
Rel. Int. (%)
195
138
110
123
ESI-Produktionenspektrum und Strukturformel von Coffein
69 83
Abb. 15:
D3-Coffein, welches als interner Standard für Coffein im Plasma und Urin eingesetzt wurde, weist eine Retentionszeit von 3,78 Minuten auf. Seine Registrierung erfolgt massenspektrometrisch über das Produktion m/z 198.0 → 141.0, wie in Abb. 16 dargestellt wird.
ERGEBNISSE ERGEBNISSE
60 80 100 120 140 160 180 200
m/z, amu 20%
40%
60%
80%
100% 198
141
el. I
86 113 69
53 126
Rnt. (%
Abb.16: ESI-Produktionenspektrum von D3-Coffein
4.1.1.4. Massenspektrum von Paraxanthin
Paraxanthin zeigt eine Retentionszeit von 3,29 Minuten und wird im Massenspektrometer mit dem Produktion m/z 181.0 → 55.0 aufgezeichnet, wie Abb. 17 zeigt.
)
60 80 100 120 140 160 180
m/z, amu 20%
60%
80%
100% 181
67 138
96 163 55 122
40%
Rel. Int. (%)
69 94
83
124
uktionenspektrum und Strukturformel von Paraxanthin Abb.17: ESI-Prod
ERGEBNISSE
4.2. Ergebnisse der Validierung
4.2.1. Selektivität
Die Analyten konnten bei ausreichender Trennung und ohne Verfälschung von fremden, in der Probe vorkommenden Matrixinhaltstoffen erfasst werden.
Lediglich die Unterscheidung von Theophyllin und Paraxanthin gelang zunächst nicht, da sie eine nahezu identische Retentionszeit und beide das Produktion m/z 181.0→ 124.0 aufwiesen.
Nach weiteren Untersuchungen fand sich als einziges Unterscheidungsmerkmal das Produktion m/z 181.0→ 55.0, welches nur bei Paraxanthin dedektierbar war. Somit mu
llin und Paraxanthin angesehen werden, und die Quantifizierung über die Differenzmethode erfolgen.
as bedeutet, dass wenn in Proben das Produktion m/z 181.0→ 55.0 keinen Peak zeigt, davon usgegangen werden kann, dass der Peak des Produktions m/z 181.0→ 124.0 allein durch
hervorgerufen wird. Ist jedoch ein Peak des Produktions m/z 181.0→ 55.0 orhanden, muss hierüber die Paraxanthinkonzentration quantifiziert werden und von der über en Peak des Produktions m/z 181.0→ 124.0 als Summenkonzentration von Theophyllin und araxanthin ermittelten Wertes abgezogen werden.
den Abbildungen 18 und 19 sind beispielhaft Chromatogramme von Theobromin und araxanthin im Urin dargestellt. Es wird jeweils ein Chromatogramm einer Leerurinprobe und
iner Pro onzentration von 100 ng Analyt pro 1ml Urin gezeigt.
sste der Peak des Produktions m/z 181.0→ 124.0 als ein Summenpeak von Theophy
D a
Theophyllin v
d P In P
eines e be mit der K
ERGEBNISSE
Abb.18: HPLC/MS/MS- Chromatogramme von Leerwerturinproben zu den entsprechenden Retentionszeiten von Theobromin und Paraxanthin.
Abb.19: HPLC/MS/MS-Chromatogramme von Urinproben, denen 100 ng Theobromin respektive Paraxanthin pro ml Urin zugesetzt wurden, zu den entsprechenden Retentionszeiten.
Die Abbildungen 20 und 21 zeigen Chromatogramme von Plasmaproben. Hier werden zunächst Chromatogramme von Leerplasmaproben und anschließend Chromatogramme von jeweils mit 100 ng/ml Plasma dotierten Coffein- bzw. Theophyllinproben dargestellt.
ERGEBNISSE
Abb.20: HPLC/MS/MS- Chromatogramme von Leerwertplasmaproben zu den entsprechenden Retentionszeiten von Coffein und Theophyllin
Abb.21: HPLC/MS/MS–Chromatogramme von Plasmaproben, denen 100 ng Coffein respektive Theophyllin pro ml Plasma zugesetzt wurden, zu den entsprechenden Retentionszeiten.
ERGEBNISSE
4.2.2. Linearität
lasma:
a wurden Theophyllin, Theobromin und Coffein in den Bereichen von 20 bis 1000
its in den Vorversuchen zeigte, dass mit keiner höheren Plasmakonzentration ieses Metaboliten zu rechnen ist.
Die Abweichungen der geme ten Konzentrationen der Analyten betrug an allen Messtagen im niedrigsten trationsbereich weniger als 20% und in den höheren Konzen
Als Beispiel für die Linearität der Analyten im Plasma sind in Abbildung 22 und 23 jeweils eine Kalibrationsgerade von Coffein und Theobromin im Konzentrationsbereich von 20 bis
l Plasm tellt.
P
Im Plasm
ng/ml, von 1000 bis 10000ng/ml sowie von 10000 bis 50000 ng/ml überprüft. Die Linearität von Paraxanthin im Plasma wurde lediglich in dem Bereich von 20 bis 1000 ng/ml untersucht, da sich bere
d
ssenen von den erwarte Konzen trationsbereichen weniger als 15%.
1000 ng/m a darges
y = 0.0058x - 0.0126
bb.22: Kalibrationskurve mit Angabe der Kalibrationsgleichung und des Messpunkte vor
Konzentration [ng/ml]
A
Korrelationskoeffizienten für Coffein im Plasma; je Konzentrationsstufe liegen zwei
ERGEBNISSE
4 4.5
y = 0.0040x + 0.0087 R2 = 0.9987
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
0 200 400 600 800 1000
Konzentration [ng/ml]
Quotient (Subst./IS)
: Kalibrationskurve mit Angabe der Kalibrationsgleichung und des
Korrelationskoeffizienten für Theobromin im Plasma; je Konzentrationsstufe
Urin:
Bei der Prüfung der Kalibrationskurven konnte für Coffein im Konzentrationsbereich von 25 bis 1000 ng/ml ohl im reich von 25 bis 1000 ng/ml, als auch von 1000 bis 30000 ng/m raxanthin im zentrationsbereich von 25 bis 1000 ng/ml die Linearität angenommen werden. Die Linearität von Theobromin konnte weder in den
iedrigen noch in den hohen Konzentrationsbereichen bestätigt werden, so dass in diesem Fall
erdeutlichten anhand des F- Tests, dass diese signifikant kleinere Varianzen beim uadratischen Regressionsmodell aufwiesen, als es bei der linearen Regression der Fall war.
bbildung 24 und 25 zeigen beispielhaft je eine Kalibrationskurve von Theophyllin und heobromin eines Messtages.
Abb.23
liegen zwei Messpunkte vor
, für Theophyllin sow Be
l und für Pa Kon
n
das quadratische Regressionsmodell gewählt wurde. Die Untersuchungen der Residuen v
q A T
ERGEBNISSE
0 200 400 600 800 1000 1200
n ation [ng/ml]
Konze tr
Abb rve der Kalibrationsgleichung und des
Korrelationskoeffizienten für Theophyl in; je Konzentrationsstufe liegen zwei Messpunkte vor
.24: Kalibrationsku mit Angabe
lin im Ur
0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000
Konzentration [ng/ml]
Quotient (t./IS)
bb.25: Kalibrationskurve mit Angabe der Kalibrationsgleichung und des
Korrelationskoeffizienten für Theobromin im Urin; je Konzentrationsstufe liegen zwei Messpunkte vor
20 2
Subs
A
ERGEBNISSE
Die Abweichungen der gemess en er onzentrationen betrugen auch im Urin an allen Messtagen bei Coffein, Theobr Theophyllin und Paraxanthin im niedrigsten Konzentrationsbereich weniger als 20% und in den höheren Konzentrationsbereichen weniger als 15%.
4.2.3. Na isgrenze (L
lasma:
LOD) für heophyllin, Theobromin, Coffein und Paraxanthin im Plasma werden in Tabelle 13 aufgeführt.
N (LOD
enen von d warteten K omin,
chwe OD)
P
Die nach Kapitel 3.3.3. ermittelten Nachweisgrenzen (limit of detection, T
achweisgrenze )
[ng/ml]
Theophyllin 13
Theobromin 15
Paraxanthin 29
Coffein 14
Tab.13: Nachweisgrenzen von Theophyllin, Theobromin, Coffein und Paraxanthin im Plasma
rin:
Die ittelten Nachweisgrenzen für Theophyllin, Theobromin, Coffein und Paraxanthin im rin sind T elle 14 zu entnehme
Nach enze (LOD) U
erm
U ab n.
weisgr
[ng/ml]
Theophyllin 20
Theobromin 26
Paraxanthin 32
Coffein 33
Tab.14: Nachweisgrenzen von Theophyllin, Theobromin, Coffein und Paraxanthin im Urin
ERGEBNISSE
4.2.4. Bestimmungs-/Quantifizierungsgrenze (LOQ)
Plasma:
Die nach Kapitel 3.3.4. ermittelten Bestimmungs- bzw. Quantifizierungsgrenzen (limit of
B r ze (LOQ)
quantification, LOQ) für Theophyllin, Theobromin, Coffein und Paraxanthin im Plasma werden in Tabelle 15 aufgeführt.
estimmungsg en
[ng/ml]
Theophyllin 100
Theobromin 100
Paraxanthin 100
Coffein 100
Tab.1 eophyllin, Theobromin, Coffein und Paraxanthin im
Pla
rin:
ttelten Paraxanthin
Urin sind Tabelle 16 zu entnehmen.
Besti ze
5: Bestimmungsgrenzen von Th sma
U
Die ermi Bestimmungsgrenzen für Theophyllin, Theobromin, Coffein und im
mmungsgren (LOQ)
[ng/ml]
Theophyllin 50
Theobromin 100
Paraxanthin 50
Coffein 50
Tab.16: Bestimmungsgrenzen von Theophyllin, Theobromin, Coffein und Paraxanthin im Urin
ERGEBNISSE
4.2.5. Richtigk
lasma
Die Tabellen 17, 18, 19 und 20 enthalten die Ergebnisse der Überprüfung der Methode auf Richtigkeit. In den Tabellen ist jew er Mittelwert der gemessenen Konzentrationen aus 5 Einzelbestimmungen und die relative Abweichung aufgelistet.
Die ative Abw ng betrug i eren Konzentrationsbereich weniger als 20% und in den oberen Konzentrationsbereich eniger als 1 . Allerdings waren am dritten Tag sowohl bei Coffein als auch bei Theobromin bei einer Konzentration von 100 ng/ml relative
bweichungen knapp oberhalb von 20% erkennbar.
eit
P
eils d
rel eichu m unt
en w 5%
A
Mittelwert der
erwartete gemessenen Relative
Tag Konzentrationen Theophyllin- Abweichung [ng/ml] Konzentrationen RA [%]
Tab.17: Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Theophyllin im Plasma
ERGEBNISSE
Mittelwert der
erwartete gemessenen Relative
Tag Konzentrationen Theobromin- Abweichung [ng/ml] Konzentrationen RA [%]
Tab.1 Ergebnisse der Überprüfung der R igkeit vo eobromin im Plasma
M ert der
8: icht n Th
ittelw
erwartete gemessenen Relative Tag Konzentrationen Paraxanthin- Abweichung
[ng/ml] Konzentrationen RA [%]
Tab.1 Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Paraxanthin im Plasma
M ert der
9:
ittelw
erwartete gemessenen Relative Tag Konzentrationen Coffein- Abweichung
[ng/ml] Konzentrationen RA [%]
Tab.20: Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Coffein im Plasma
ERGEBNISSE
Urin:
Die Überprüfung der Methode auf Richtigkeit im Urin wurde für die Konzentrationen 50, 2500 und 20000 ng/ml Urin bei Theophyllin, Theobromin, Paraxanthin und Coffein bestätigt.
ie entsprechenden Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen 21, 22, 23 und 24 aufgeführt.
Im lag lativ eich i allen Substanzen im niedrigen
Konzentrationsbereich unter 20% und in höheren Konzentrationsbereichen unter 15%.
M ert der
D
Urin die re e Abw ung be
ittelw
erwartete gemessenen elative R Tag Konzentrationen Theophyllin- Abweichung
[ng/ml] Konzentrationen RA [%]
Tab.21: Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Theophyllin im Urin
Mittelwert der
erwartete gemessenen Relative
Tag Konzentrationen Theobromin- Abweichung [ng/ml] Konzentrationen RA [%]
ab.22: Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Theobromin im Urin T
ERGEBNISSE
Mittelwert der
erwartete gemessenen Relative
Tag Konzentrationen Paraxanthin- Abweichung [ng/ml] Konzentrationen RA [%]
[ng/ml]
50 55,1 10,3
1 250 228,4 -8,7
1000 935,0 -6,5
50 41,9 -16,2
2 250 248,2 -0,7
1000 1021,2 2,1
50 54,4 8,8
3 250 246,9 -1,3
1000 1040,0 4,0
Tab.23: Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Paraxanthin im Urin
Mittelwert der
erwartete gemessenen Relative Tag Konzentrationen Coffein- Abweichung
[ng/ml] Konzentrationen RA [%]
[ng/ml]
50 58,1 16,2
1 100 103,1 3,1
20000 19758,4 -1,3
50 55,8 11,7
2 100 87,9 -12,1
20000 19739,6 -1,2
50 44,8 -10,3
3 100 98,2 -1,8
20000 19051,0 -4,8
Tab.24: Ergebnisse der Überprüfung der Richtigkeit von Coffein im Urin
ERGEBNISSE
4.2.6. Präzision
Plasma
e Ergebnisse der Präzisionsberechnung der traday- und der Präzi A ma aufgeführt. Sowohl die Intra ls a day lagen bei allen Substanzen innerhalb der
bweichungsgrenze vo 20% im 1 nzentrationsbereich.
ophyllin Theobromin
In den folgenden Tabellen 25 und 26 sind di
In Interday- sion der vier nalyten im Plas day- a uch die Inter -Präzision
A n niedrigen und 5% im hohen Ko
The
erwartete Intraday Interday Intraday Interday Konzentrationen Präzision Präzision Präzision Präzision
[ng/ml] [%] [%] [%] [%]
100 15,5 7,5 9,8 19,3
1000 9,0 2,7 6,8 3,2
10000 8,0 1,8 3,8 4,4
Tab.25: Intraday- und Interdaypräzision von Theophyllin und Theobromin im Plasma
Coffein Paraxanthin
erwartete Intraday Interday Intraday Interday Konzentrationen Präzision Präzision Präzision Präzision
[ng/ml] [%] [%] [%] [%]
100 15,8 11,7 14.79 10.58
1000 7,3 5,0 5.4 1.8
10000 10,8 8,4 n.m. n.m.
Tab.26: Intraday- und Interdaypräzision von Coffein und Paraxanthin im Plasma
ERGEBNISSE
Urin:
Die Ergebnisse der Präzision für die Quantifizierung von Theophyllin und Theobromin sowie anthin und Coffein im Urin sind den unten aufgeführten Tabellen 27 und 28 zu
Theophyllin Theobromin
von Parax entnehmen.
erwartete Intraday Interday erwartete Intraday Interday Konzentrationen Präzision Präzision Konzentrationen Präzision Präzision
[ng/ml] [%] [%] [ng/ml] [%] [%]
50 8,2 4,6 100 3,2 9,7
2500 8,3 5,9 2500 6,9 3,5
20000 14,9 5,2 20000 16,8 5,2
Intraday- und Interdaypräzision von Theophyllin und Theobromin im Urin
Paraxanthin Coffein
Tab.27:
erwartete Intraday Interday erwartete Intraday Interday Konzentrationen Präzision Präzision Konzentrationen Präzision Präzision
[ng/ml] [%] [%] [ng/ml] [%] [%]
50 9,1 14,8 50 14,2 13,3
250 7,4 4,6 100 13,3 13,0
1000 14,9 5,6 20000 8,1 2,1
Tab.28: Intraday- und Interdaypräzision von Coffein und Paraxanthin im Urin
ERGEBNISSE
, Theobromin und Paraxanthin sind innerhalb des Zeitraums von 28 Tagen stabil.
on geltenden Abweichung 15% im hohen Konzentrationsbereich liegt.
it den jeweiligen Konzentrationen am Tag 0 und am Tag 28 sind in der folgenden Tabelle 4.2.7. Stabilität
Plasma:
Theophyllin
Die Ergebnisse und der Vergleich der Messdaten mit Hilfe des U-Tests lassen darauf schließen, dass Coffein zwar nach einem Zeitraum von 28 Tagen einen Substanzverlust aufweist, dieser jedoch innerhalb der für die Richtigkeit und Präzisi
von 20% im niedrigen Konzentrationsbereich und
Die Ergebnisse der Stabilitätsprüfung von Theophyllin, Theobromin, Paraxanthin und Coffein m
29 dargestellt.
Tag 0 Tag 28
erwartete Mittelwert der Mittelwert der
Analyt Konzentrationen gemessenen gemessenen Abweichung Konzentrationen Konzentrationen
[ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [%]
100 100,0 98,5 -1,5
Theophyllin 1000 977,5 970,8 -0,7
100 97,3 97,4 0,1
Theobromin 1000 1066,3 984,8 -7,6 100 82.62 79.94 -3.2 Paraxanthin 1000 996.36 907.92 -8,9
100 95,4 78,8 -17,2
Coffein 1000 953,9 901,7 -5,5
Tab.29: Stabilitätsdaten von Theophyllin, Theobromin, Paraxanthin und Coffein im Plasma
Urin:
ERGEBNISSE
Die Ergebnisse der Stabilitätsuntersuchungen der Substanzen im Urin sind in der folgenden Tabelle 30 aufgeführt.
Tag 0 Tag 28
erwartete Mittelwert der Mittelwert der
Analyt Konzentrationen gemessenen gemessenen Abweichung Konzentrationen Konzentrationen
[ng/ml] [ng/ml] [ng/ml] [%]
100 96,7 100,7 -3,9
Theophyllin 1000 1051,0 1001,5 -4,7
100 100,3 98,0 -2,3
Theobromin 1000 1134,2 982,7 -13,6
100 104,3 103,3 -1,0
Paraxanthin 1000 946,9 896,6 -5,3
100 89,0 92,1 3,4
Coffein 1000 943,2 1134,2 4,7
Tab.30: Stabilitätsdaten von Theophyllin, T min, Paraxanthin und Coffein im Urin
Diese Ergebnisse verdeutlichen unter Berücksi ng des U-Tests, dass sowohl Coffein und Theobromin, als auch Theophyllin und Par in in einem Zeitraum von 28 Tagen geringgradige Konzentrationsveränderungen aufweisen. Diese Abweichungen liegen jedoch innerhalb der Messungenauigkeit, so dass tabilität dieser Substanzen für diesen
Diese Ergebnisse verdeutlichen unter Berücksi ng des U-Tests, dass sowohl Coffein und Theobromin, als auch Theophyllin und Par in in einem Zeitraum von 28 Tagen geringgradige Konzentrationsveränderungen aufweisen. Diese Abweichungen liegen jedoch innerhalb der Messungenauigkeit, so dass tabilität dieser Substanzen für diesen