1 EINLEITUNG
3.1. Aufbau des Experiments und Vers uchsplanung
3.1.3. Vorversuch
Zur Überprüfung der Durchführbarkeit, zur Ermittlung sinnvoller Probenentnahmezeitpunkte sowie der nötigen Probenentnahmedauer und Feststellung der zu erwartenden
die Substanz einem jeweils zufällig ausgewähltem Pferd verabreicht und im nschluss daran Blut- und Urinproben entnommen. Der genaue Ablauf der Probenentnahme
ird unter 3.1.4. b ieser kompl tversuch üb de.
ediglich der Zei in dem en entnommen wurden, wurde im Hauptversuch von 60 Stunden auf 108 Stunden nach pplik n The und Stund
intravenöser Gabe von Theobrom verlänger 3.1.4. auptversu
Eine Viertelstunde vor Versuchbeginn wurd
Desinfektion mit 70%igem Alkohol im Punktionsbereich, in die Vena jugularis sinister ein Venenverweilkatheter (Braunüle MT®, Firma Braun, Melsungen) gelegt. Über diesen
Kath wurde vo pplikation Testsubs eine Lee in
beschichteten Monovetten® (Sa t) entnom n. Danach urde der K heter mit einem Mandrin (Vasofix erschlosse Ebenso w n Leer-U roben du Auffange n Spontanurin nach Hereinführen in den Laufstall genommen.
Um eine Verschleppung der Testsubstanz durch Nutzung des gleichen Venenverweilkatheters zur Substanzapplikation und Probenentnahme zu verhindern, wurde den Pferden, denen die Testsubstanz intravenös verabreicht werden sollte, auch in die Vena jugularis dexter ein
ene rwei atheter gele
uhewerte der Herz- und temfrequenz erfasst.
vor in sterile Einwegspritzen aufgezogene, nach dem jeweiligen Körpergewicht nn intravenös über den dafür gelegten enenverweilkatheter appliziert. Hierbei wurden genau wie bei der oralen Verabreichung Konzentrationsbereiche der Analyten sowie zur Entwicklung einer geeigneten Untersuchungsmethode im Labor wurde ein Vorversuch durchgeführt.
Dafür wurde A
w eschrieben, da d ett für den Haup ernommen wur
L traum, Prob
oraler A ation vo ophyllin auf 168 en nach in t.
H ch
e den Pferden, nach Rasur und mehrfacher
eter r A der tanz r-Blutprobe mit Lithium-Hepar
rsted me w at
®) v n. urde rinp rch n vo
V nve lk gt.
Vor Verabreichung der Substanzen wurden bei den Pferden die R A
Die kurz zu
berechnete Testsubstanzmenge, wurde zu Versuchsbegi V
Einmalhandschuhe getragen, um eine Verschleppung zu verhindern.
MATERIAL UND METHODE
Die Blutproben innerhalb der ersten drei Stunden wurden über den Venenverweilkatheter entnommen, danach wurde dieser zur Schonung der Vene entfernt und die weiteren Proben durch Venenpunktion mit einer Einmalkanüle (1,2 x 40mm/ 18 G1,5“) gewonnen.
THEOPHYLLIN THEOPHYLLIN THEOBROMIN
Die Entnahmezeitpunkte der Blut- und Urinproben nach intravenöser und oraler Theophyllinverabreichung sowie nach intravenöser Gabe von Theobromin sind Tab.5 zu entnehmen.
intravenöse Applikation orale Applikation intravenöse Applikation
Blut Urin Blut Urin Blut Urin
Tab. 5: Entnahmezeitpunkte von Blut- und Urinproben im Hauptversuch
36 m ® entnommen. Dies
0 Minuten zentrifugiert (Zentrifuge Rotana IS, Hettich). Anschließend wurde das Plasma gleichmäßig auf zwei 10ml 3.1.5. Aufbereitung der Proben und Aufbewahrung
Pro Entnahmezeitpunkt wurden jeweils l Blut mit vier Monovetten wurde innerhalb einer halben Stunde nach Entnahme bei 1000g 1
MATERIAL UND METHODE
fassende, deutlich gekennzeichnete Glasgefäße mit Plastikschraubdeckel verteilt. Diese
im ühls rank bei –20°C
eingefroren.
astikbeche aufg l fassende
Plastikbecher mit Schraubverschluss überfü Urinproben wurden umgehend bei
°C im Kühlschrank gekühlt und anschließend bei –20°C eingefroren, um zusammen mit den orenen Zustand nach Köln transportiert zu werden.
Coffein, wasserfrei, M % Sigma- Aldrich Chemie, Steinheim n, w sserfr
Sigma- Aldrich Chemie, Steinheim nheim D3-Coffein
Köln 1993
Laborsynthese des Institutes für Biochemie,
Köln 2003
,3-15N2-Theophyllin Cambridge Isotope Laboratories Inc.,
Andover, USA
aborchemie- Handels GmbH, St. Augustin
lland dt
li-Q- ass emie, Köln
isessig, p.a. Merck, Darmstadt
wurden sofort bei 4ºC K ch gelagert und spätestens am Abend
Die in sauberen Pl rn efangenen Urinproben wurden direkt in 100 m hrt. Auch die
4
Plasmaproben im gefr
3.2. Analytik
Die Analytik wurde im Institut für Biochemie an der Deutschen Sporthochschule Köln durchgeführt.
3.2.1. Chemikalien
inimum 99
Theobromi a ei, Minimum 99% Sigma- Aldrich Chemie, Steinheim Theophyllin, wasserfrei, Minimum 99%
Paraxanthin, wasserfrei, Minimum 99% Sigma- Aldrich Chemie, Stei
Laborsynthese des Institutes für Biochemie, Ammoniumacetat Merck, Darmsta
Wasser, reinst (Mil W er) Institut für Bioch E
MATERIAL UND METHODE
Methanol, destilliert Institut für Biochemie, Köln
atriumhydroxid, p.a. KMF, Laborchemie- Handels GmbH, St. Augustin
rotease aus Rinderpancreas, Typ1 Sigma- Aldrich Chemie, Steinheim N
P
Salzsäure, 32%ig KMF, Laborchemie- Handels GmbH, St. Augustin
3.2.2. Instrumente
Die Quantifizierung der Proben des Vor- und Hauptversuches und die Validierung wurden mittels Flüssigkeitschromatographie und Tandem-Massenspektrometrie durchgeführt. Hierfür wurde eine HPLC der Agilent Technologies LC 1100 Serie gewählt, gekoppelt mit einem Perkin Elmar Sciex API 3200 LC/MS/MS-System und unter folgenden Bedingungen angewendet:
HPLC Agilent Series 1100 LC:
Säule: Nucleodur C18 Pyramid, (70 x 4 mm; Partikelgröße 5µm), Machery und Nagel
Eluenten: A : Ammoniumacetat (5mM) in H2O und 0,1% Essigsäure,
B : Acetonitril
Gradienten: 5% Acetonitril → 50% Acetonitril in 5 Minuten, 50% Acetonitril → 100% Acetonitril in 6 Minuten;
Reinigung mit 100% Acetonitril für 1 Minute, Reequilibrierung mit 5%
Acetonitril für 2 Minuten Flussrate: 800µl/min
Injektionsvolumen: 10 µl Massenspektrometer:
Ionenquelle: ESI bei 550 °C Ionisationseinstellung: positiv
Aquistionseinstellung: Multiple Reaction Monitoring (MRM) senergie: optimiert für jedes Produktion
Kollisionsgas: Stickstoff (N2), 2,5x 10-5 torr Kollision
MATERIAL UND METHODE
3.2.3. Methodenentwicklung
Herstellung der Standardlösungen:
Vor der Aufarbeitung wurden die zur quantitativen Bestimmung notwendigen Standard-Lösungen hergestellt. Mit den Internen Standards wurde anschließend ebenso verfahren. Zur Ermittlung des geeigneten Lösungsmittels wurden die Methylxanthine in den verschiedenen Lösungsmitteln 0,06 molare Salzsäure, destillierter Methanol, Milli-Q-Wasser und 0,05
olare Natronlauge gelöst: Zuerst wurde eine Lösung in Methanol versucht. Sie gelang nur
wurde als Mischstandard aus stickstoffmarkiertem Theophyllin ,3-15N2-Theophyllin), deuteriertem Coffein (D3-Coffein) und deuteriertem Theobromin (D6 -heobromin) hergestellt. Als Interner Standard für Paraxanthin wurde ebenfalls das markierte
6-Theobromin ca.
alb so groß war wie die Intensitäten der anderen internen Standards, wurde bei der m
unvollständig. Erst nach Zugabe von 32%iger HCl und Verbringung in ein 50°C warmes Ultraschallwasserbad lösten sich die Analyten rückstandsfrei. Jedoch kristallisierte die Lösung bei Erreichen der Raumtemperatur wieder. Die beste Löslichkeit bestand bei 0,05 molarer Natronlauge, jedoch war die Stabilität der Analyten in diesem Lösungsmittel nicht ausreichend. Als am besten geeignet erwies sich schließlich die Lösung in Milli-Q-Wasser.
Die Standardlösung wurde als Mischstandard mit den Methylxanthinen Theophyllin, Coffein, Theobromin und dem möglichen Metaboliten Paraxanthin hergestellt. Dazu wurden jeweils 10 mg dieser Substanzen per Feinwaage eingewogen und in Milli-Q-Wasser gelöst und so eine 0,1%ige Stammlösung hergestellt. Aus dieser 100µg/ml Stammlösung wurde durch 1:10 Verdünnung die Arbeitslösung mit der Konzentration von 10 µg/ml hergestellt.
Auch der Interne Standard (1
T
Theophyllin genutzt. Da die massenspektrometrische Signalintensität für D h
Herstellung des internen Mischstandards die Konzentration von D6-Theobromin verdoppelt.
Es wurden also je 10 mg des D3-Coffeins und des markierten Theophyllins und 20 mg des D6 -Theobromins per Feinwaage eingewogen und ebenfalls in 100 ml Milli-Q-Wasser gelöst. Aus dieser Stammlösung wurden dann durch Verdünnungen Arbeitslösungen mit der Konzentration von 10 µg bzw. 20µg/ml hergestellt.
Beide Lösungen wurden sowohl zur Quantifizierung der Urin- als auch der Plasmaproben genutzt.
MATERIAL UND METHODE
Überprüfung der Messmethode:
Zur Überprüfung der Messmethode des LC/MS/MS-Systems musste als erstes das sogenannte Tuning des HPLC-Gerätes erfolgen. Dabei werden die Substanzen anhand ihrer spezifischen Ionenübergänge in die einzelnen Ionenfragmente identifiziert und konnten anhand dieser im Computersystem des Gerätes gespeichert werden. Per Direkteinlass wurden anschließend die
n aus beiden Stoffen handelte. Um dieses Problem zu lösen, wurden alle weiteren nenübergänge der beiden Stoffe verglichen. Als einziger Unterschied erwies sich der
erhält man die
1 ml Methanol konditioniert und mit 1 ml Milli-Q-Wasser equilibriert, bevor 50 µl des Internen Mischstandards per Hamilton-Spritze auf die Säule Kollisionsenergie und die Linsensysteme des Massenspektrometers für jeden einzelnen Analyten optimiert.
Im Rahmen dieser Untersuchungen wurde festgestellt, dass der Ionenübergang in die beiden Hauptfragmente, der die substanzspezifische Identifikation ermöglichen soll, bei Theophyllin und Paraxanthin identisch ist. Somit ließ sich bei einer Probe anhand dieses Ionenüberganges 181.0/124.0 nicht eindeutig ersehen, ob es sich um Theophyllin, Paraxanthin oder eine Kombinatio
Io
Ionenübergang 181.0/55.0, welcher nur beim Paraxanthin auftrat. Also konnte Paraxanthin anhand dieser Fragmentierung identifiziert und quantifiziert werden. Theophyllin musste deshalb durch die Differenzmethode quantifiziert werden. Das bedeutet, dass man die Intensität des gemeinsamen Ionenübergangs als Summe der beiden Analyten betrachtet. Von der errechneten Summenkonzentration subtrahiert man die Paraxanthinkonzentration, welche aus der Intensität des einzelnen Ionenübergangs errechnet wurde. Somit
Theophyllinkonzentration.
Ermittlung der geeigneten Urinaufarbeitung:
Zur Optimierung der Analytenausbeute wurden bei der Methodenentwicklung der Urinaufarbeitung zunächst verschiedene Festphasenextraktionen angewandt und deren Ergebnisse miteinander verglichen. Aus verschiedenen vorangegangenen Untersuchungen war bereits bekannt, dass eine Flüssig-Flüssig-Extraktion bei Methylxanthinen wenig ergiebig ist. Zum Vergleich wurden Oasis® HBL 3cc (60mg) Extraction Cartridges der Firma Waters, C 18-Ionentauschersäulen Chromabond® 6ml/ 500mg, octadecyl- modifiziertes Kieselgel und selbsthergestellte PAD-Säulen eingesetzt.
Beide C 18 Säulen wurden mit
MATERIAL UND METHODE
aufgetragen wurde. Im Anschluss daran wurden die 2 ml mit unterschiedlichen Mengen der Standardlösung versetzten Urinproben zugegeben. Die Säulen wurden anschließend mit einem Wasser-Methanol-Gemisch (95:5) gewaschen und mit 1 ml Methanol eluiert. Das Eluat wurde am Rotationsverdampfer eingeengt, anschließend mit 100µl LC-Puffer (80%
Ammoniumacetat, 20% Acetonitril und 0,1% Eisessig) angelöst und in die Messgefäße für die HPLC überführt.
Die PAD-Säulen wurden durch Einhängen von Pasteurpipetten in eine Halterung, Einlegen einer kleinen Glaskugel in die Pipettenmündung und anschließendem Aufbringen von ca. 2ml uilibriert und konditioniert wurde durch weimaliges Waschen mit Milli-Q-Wasser. Der Interne Standard und die 2 ml Urinproben
1 ml Aceton, das Eluat benfalls am Rotationsverdampfer eingeengt und in 100 µl LC-Puffer gelöst in Messgefäße
xtraktionsergebnis zeigten die Oasis®-Säulen, aber da die Ausbeute und das
viel besseren Ausbeute, reduzierte aber die Störpeaks noch nicht
etzte Messschwankungen konnten durch Intensivierung der Reagenzgläserwaschschritte
1 ml 6-molare Salzsäure zugegeben und wiederum fünfmal mit Wasser nd zum Schluss zweimal mit einem Methanol-Aceton-Gemisch gespült. Die
LC-MS-hromatogramme zeigten weniger Störpeaks, so dass die Interpretation der Analytenpeaks produzierbar und präzise war.
einer Polystyrolharzlösung selbsthergestellt. Eq z
wurden wie bei den anderen Säulen aufgetragen und anschließend mit ca. 2 ml Milli-Q-Wasser gewaschen. Eluiert wurde bei diesen Säulen zweimal mit
e
überführt.
Das beste E
deutliche Vorhandensein von Störpeaks noch nicht zufriedenstellend waren, wurde die Methode weiter modifiziert. Die Konditionierung und Equilibrierung wurden auf jeweils 2 ml erhöht, das Urinprobenvolumen auf 2,5 ml erhöht, der Waschschritt nach Aufbringen der Probe auf zweimal 1 ml Methanol-Wasser-Gemisch verdoppelt und anstatt mit Methanol wurde dreimal mit 0,5 ml Aceton eluiert und in 120 µl LC- Puffer angelöst.
Dies führte zu einer sehr
ausreichend. Dies gelang erst durch mehrfaches Zentrifugieren der Urinprobe während der Aufarbeitung: Einmal 10 Minuten bei 1800 U/min vor Auftragen der Probe auf die Säule und noch ein zweites Mal nach dem Anlösen in LC-Puffer, so dass nur der Überstand in das Messgefäß überführt wurde.
L
deutlich reduziert werden. Die Reagenzgläser wurden nach Gebrauch einmal mit der Bürste und viermal ohne Bürste mit heißem Wasser gewaschen, dann mit je 1 ml 6-molarer Natronlauge für eine Stunde bei 100°C gekocht. Anschließend wieder fünfmal mit Wasser gespült, danach wurde
u C re
MATERIAL UND METHODE
Der Einfluss von unterschiedlichen pH-Werten wurde wie folgt untersucht: Von sechs rinproben der gleichen Konzentration wurden zwei mit 1-molarer Salzsäure auf einen sauren
von 12 eingestellt. Zwei Proben blieben unverändert bei dem hysiologischen pH-Wert von ca. 8. Danach wurden alle Proben nach oben aufgezeigtem
n wurden vor Aufbringen auf die Säulen mit 500µg einer Proteaselösung (aus inderpancreas, Typ 1, 5mg/ml) versetzt, eine Stunde im 50°C -warmen Wasserbad inkubiert
rstand wurde nschließend auf die Oasis®-Säule überführt. Die weitere Aufarbeitung verlief genau wie bei
ich zwischen der Festphasenextraktion und der von BEAUDRY et al. (2006) ublizierten Direktinjektion von Pferdeplasma nach Proteinfällung mit Methanol und
entrifugation in die HPLC zeigte eine wesentlich bessere Empfindlichkeit bei der estphasenextraktion.
U
pH-Wert von 2,5 und zwei Proben durch 1-molare Kaliumhydroxidlösung auf einen alkalischen pH-Wert
p
Schema aufgearbeitet und gemessen. Es zeigten sich keine gravierenden Unterschiede, weder bei der Ausbeute noch beim biologischen Untergrundrauschen in den einzelnen Ionenspuren.
Ermittlung der geeigneten Plasmaaufarbeitung
Für die Plasmaprobenaufarbeitung wurde zunächst die Aufarbeitung der Urinproben übernommen und zur Optimierung der Ausbeute weiter modifiziert.
Um den Einfluss von Proteinbindungen der Methylxanthine im Plasma auf die Substanzausbeute bei der Aufarbeitung zu untersuchen, wurden folgende Versuchsreihen verglichen:
Die ersten zwölf Proben wurden genau wie die Urinproben aufgearbeitet, und die zweiten zwölf Probe
R
und anschließend 10 Minuten bei 1800 U/min zentrifugiert. Nur der Übe a
den ersten zwölf Proben.
Die Auswertung zeigte eine fast doppelt so hohe Theophyllin-, Theobromin- und Paraxanthinausbeute bei den Proben mit Proteindenaturierung im Gegensatz zu der Probenreihe ohne Proteolyse. Somit wurde die Proteindenaturierung in die Plasmaprobenaufarbeitung übernommen.
Ein Vergle p
Z F
MATERIAL UND METHODE
3.2.4. Aufbereitung d
Für die Aufarbei enextraktion dienten Oasis®- Säulen 3cc (60mg) als Absorbens.
Die Urinproben wurden aufgetaut und pro Probe wurden 2,5 ml per Pipette entnommen und in ein Reagenzspitzglas überführt. Ansch
(10µg/ml) d h wurde die Probe 10 Minuten bei
1800 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Die Oasis®- Säulen 3cc (60mg) wurden mit 2
ml Me i Der Überstand der
zentrifugierten P liquotiert und zweimal mit 1 ml eines
Meth wurden Spitzgläser in die
Reagenzgla um das Probeneluat aufzufangen.
Eluiert wurde dreim Anschluss wurde das Eluat am
Rotationsverda be wurde schließlich mit 120µl
Ammoniumac bei 1800 Umdrehungen pro Minute
zentrifugiert, der Überstand in HPLC-Probengefäße überführt und zur Messung in die HPLC verbrach
Die Aufarbeitu enfassend dargestellt.
Die beschriebene Aufarbeitung wurde zur Quantifizierung von Proben mit Konzentrationen bis zu 10.000ng er analytischen Säule und des Detektors ei Konzentrationen über 10.000 ng/ml zu vermeiden, wurde die Aufarbeitung wie folgt
terner ischstandard wurde von 50 µl auf 100 µl erhöht und anstatt in 120 µl wurde das eingeengte luat in 250µl Ammoniumacetatpuffer gelöst. Ebenso wurde mit der Kalibrationsreihe erfahren.
er Urinproben
tung der Urinproben mittels Festphas
ließend wurde 50 µl Interner Mischstandard azugegeben und die Probe gevortext. Danac
thanol kondit oniert und mit 2 ml Milli-Q-Wasser equilibriert.
robe wurde nun auf die Säulen a
anol-Milli-Q-Wasser-Gemisches (10:90) gespült. Hiernach shalterung der Unterdruckkammer gestellt,
al mit jeweils 0,5 ml Aceton. Im mpfer eingeengt. Die trockene Pro etatpuffer angelöst, erneut 10 Minuten t.
ng der Urinproben wird in Abb.9 zusamm
/ml angewendet. Um eine Sättigung d b
modifiziert: Es wurden lediglich 1 ml statt 2,5 ml der Probe aufgearbeitet, die Menge in M
E v
MATERIAL UND METHODE
Probenvorbereitung
(Konzentrationsbereich bis 10.000ng/ml)
↓
2,5 ml Urin in ein Reagenzspitzglas
↓
+ 50 µl Interner Mischstandard [10µl/ml]
mittels Hamiltonspritze, schütteln (Vortex)
↓
Zentrifugation : 10 min bei 1800 U/min Überstand dekantieren, Sediment verwerfen
↓
Waters Oasis HLB 3cc (60mg) Extraction Cartridges: ®
mit 2 ml Methanol konditionieren mit 2 ml Milli-Q-W sser equilibrieren a
2,5 ml des Urinprobenüberstandes auf die Säule überführen mit 2 x 1 ml Methanol/Wasser (10/90)spülen
mit 3 x 0,5 ml Aceton eluieren Eluat in Reagenzspitzgläsern auffangen
↓
Eluat am Rotationsverdampfer einengen
↓
Substrat in 120 µl Ammoniumacetatpuffer anlösen, schütteln (Vortex)
↓
Zentrifugation : 10 min bei 1800U/min
↓
Überstand mit Pasteurpipetten in Autosamplervials überführen 10µl in das HPLC/MS/MS injizieren
Abb.9: Pferdeurin mittels
H is 10.000 ng/ml
.2.5. Aufbereitung der Plasmaproben
lasmaproben erfolgte wie die der Urinproben mit der Modifikation der roteindenaturierung:
Probenaufarbeitung zum Nachweis von Methylxanthinen im PLC/MS/MS im Konzentrationsbereich b
3
Die Aufarbeitung der P P
MATERIAL UND METHODE
Probenvorbereitung
(Konzentrationsbereich bis 10.000ng/ml)
↓
2,5 ml Plasma in ein Reagenzspitzglas
↓
+ 50 µl Interner Mischstandard [10 µl/ml]
mittels Hamiltonspritze, schütteln (Vortex)
↓
+ 100µl einer 0,5%igen Proteaselösung (P 4630 Typ 1)
↓
Inkubation für 60 Min. bei 50 °C im Wasserbad
↓
Zentrifugation : 10 min bei 1800 U/min Überstand dekantieren, Sediment verwerfen
↓
Waters Oasis®HLB 3cc (60mg) Extraction Cartridges:
mit 2 ml Methanol konditionieren mit 2 ml Milli-Q-Wasser equilibrieren
2,5 ml des Plasmaprobenüberstandes auf die Säule überführen mit 2 x 1 ml Methanol/Wasser (10/90)spülen
mit 3 x 0,5 ml Aceton eluieren Eluat in Reagenzspitzgläsern auffangen
↓
am Rotationsverdampfer einengen Eluat
↓
Substrat in 120 µl Ammoniumacetatpuffer anlösen, schütteln (Vortex)
↓
Zentrifugation : 10 min bei 1800U/min
↓
Überstand mit Pasteurpipetten in Autosamplervials überführen 10µl in das HPLC/MS/MS injizieren
ich bis 10.000 ng/ml
Abb.10: Probenaufarbeitung zum Nachweis von Methylxanthinen im Pferdeplasma mittels HPLC/MS/MS im Konzentrationsbere
Auch diese Aufarbeitung wurde im Konzentationsbereich über 10.000ng/ml entsprechend der Urinproben verändert.
MATERIAL UND METHODE
3.3. Validierung der Methode
Da jede experimentelle Messung mit Fehlern behaftet ist, soll mit der Validierung der Eignungsnachweis einer Methode für den vorgesehenen Zweck erbracht werden. Nachfolgend
ufgeführte Kriterien sind in dieser Studie in die Validierung eingegangen:
3.3.1. Selektivität und Spezifität
Unter der Selektivität versteht man deren Fähigkeit, verschiedene Substanzen unterscheiden zu können. Bei der HPLC/MS/MS-Methode ist dies durch unterschiedliche
etentionszeiten der Analyten und ausreichende Trennung von coeluierten Störpeaks im at
ie Spez iges Erfassen und Identifizieren einer Substanz falls in der zu untersuchenden Probe vorkommender Substanzen. Dazu mussten aus dem Product-Ion-Scan einer Substanz
charakteristische Ionenübergänge a onitoring
(MRM) aufgezeichnet und mit den atrixproben
vergli
Zur B ivität und Sp Proben, denen
die Analyten zugesetzt wurden, verglic die Analyten
a- oder Urininhaltstoffen (Spezifität) und mit ausreichender ng
erschiedlichen Mengen der Analyten gespikt. Diese Konzentrationen müssen den a
einer Methode
R
Chrom ogramm gekennzeichnet.
ifität einer Methode ist deren eindeut D
ohne Störung oder Verfälschung anderer, eben
usgewählt und mittels multile Reaction M entsprechenden Ionenspuren von Leerm chen werden.
estimmung der Selekt ezifität wurden Leermatrixproben mit hen. Es konnte festgestellt werden, dass ohne Verfälschung durch Plasm
Trennu und ohne gegenseitige Störung im Chromatogramm darzustellen sind.
3.3.1. Linearität
Die Linearität beschreibt den mathematischen Zusammenhang von Konzentration des Analyten und der Signalstärke/Detektorantwort.
Für die Überprüfung der Linearität wurden an drei unterschiedlichen Tagen Kalibrierreihen sowohl für Plasma als auch für Urin erstellt, wobei jede Konzentration doppelt aufgearbeitet und dann gemessen wurde. Pro Kalibriergerade wurden mindestens fünf Leermatrixproben mit unt
MATERIAL UND METHODE
gesamten Konzentrationsbereich abdecken (DIN 38402 A51, 1986). Da sich der alibrierbereich der Analyten über vier Zehnerpotenzen erstreckte, wurde bei beiden Matrices K
die Linearität im niedrigen, mittleren und im hohen Bereich überprüft. Die gewählten Konzentrationen sind in den Tabellen 6 und 7 aufgeführt.
PLASMA Konzentration von Coffein, Theobromin und Theophyllin in ng/ml
Kalibrationsgerade I 0,20,60,100,300,600,1000 Kalibrationsgerade II 100, 2000, 4000, 6000, 8000, 10000 Kalibr ionsgerade III at 10000, 20000, 30000, 40000, 50000
trationen von Coffein, Theobromin und Theophyllin im Plasma zur eraden
Tab.6: Verwendete Konzen
Erstellung der drei Kalibrationsg
URIN Konzentration von Coffein, Theobromin, Theophyllin und Paraxanthin in ng/ml Kalibratio sg ran e de I 0,25, 50, 100, 250, 500, 1000 Kalibrationsgerade II 1000, 2000, 4000, 6000, 8000, 10000 Kalibrationsgerade III 1000, 2500, 5000, 10000, 20000, 30000
Tab.7: Verwendete Konzentrationen von Coffein, Theobromin, Theophyllin und Paraxanthin im i Kalibrationsgeraden
in nd des Internen Standards (D3-Coffein, 1,3-15N2-Theophyllin rde visuell auf Ausreißer und inearität untersucht (U.S. DERPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES, nte Einbezug der Geradensteigung wurde auf die gemessende Konzentration zurückgerechnet. Diese sogenannte „back calculation“ durfte dabei um maximal 15%, an der
maximal 20% vom theoretischen Wert abweichen (EHSLC Urin zur Erstellung der dre
Aus dem Integral der erhaltenen Peakflächen der Analyten (Coffein, Theophyllin, Theobromin und Paraxanth ) u
und D6-Theobromin) wurde der Quotient gebildet und gegen die Konzentration der Kalibratoren aufgetragen. Die entstandene Kalibiergerade wu
L
1999). U r
unteren Bestimmungsgrenze um 2002).
MATERIAL UND METHODE
3.3.3. Nachweisgrenze
Die Nachweisgrenze (Detektionsgrenze, limit of detection, LOD) stellt die niedrigste Konzentration dar, bei der sich der Analyt noch qualitativ bestimmen lässt, indem ein sicher vom Untergrundrauschen der Blankproben abzugrenzendes Instrumentensignal zu erkennen
xO =
ist. Die Ermittlung dieser Nachweisgrenze wird anhand der Kalibrierkurvenmethode nach DIN 32645 durchgeführt. Dazu wird aus den Residuen der linearen Regression zuerst die Reststandardabweichung SxO aus der Summe der Abweichungsquadrate Qx und den Freiheitsgeraden der linearen Kalibration f berechnet:
f
Mit Hilfe dieser Standardabweichung SxO und dem Mittelwert x aller Kalibrationskonzentrationen kann das Konfidenzintervall für den Merkmalswert Null errechnet werden.
t f,α wurde aus statistischen Tabellen entnommen und errechnet:
α t f,α = TINV ( ; f )
INV = t-Wert der t-Verteilung unter den Bedingungen der Freiheitsgeraden (f) sowie der T
Fehlerwahrscheinlichkeit (α ).
Mit Hilfe der Steigung a der linearen Regressionsgeraden wurde die Nachweisgrenze (LOD) mit einer Fehlerwahrscheinlichkeit von α wie folgt errechnet:
LOD =
α = Fehlerw rscheinlichkeah it
MATERIAL UND METHODE
3.3.4. Bestimmungsgrenze
Die Best e (Quantifizierungsgrenz fication, LOQ) ist die iedrigste Konzentration, bei der eine quantitative Aussage über den Analyten noch möglich
en dem mittleren essergebnis und dem erwarteten Referenzwert dürfen dabei nicht mehr als 20 % betragen
en dem mittleren essergebnis und dem erwarteten Referenzwert dürfen dabei nicht mehr als 20 % betragen