Aus dem Institut für Parasitologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
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Bandwürmer (Anoplocephaliden) beim Pferd:
Prävalenz in Norddeutschland sowie Eignung eines serologischen Nachweisverfahrens (ELISA) zur Diagnostik
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Tina Behrens
aus Hannover
Hannover 2001
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. med. vet. T. Schnieder
1. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. T. Schnieder 2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. P. Stadler
Tag der mündlichen Prüfung: 20. November 2001
In Gedenken an meinen Großvater
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis... 8
1. EINLEITUNG
... 112. LITERATURÜBERSICHT
2.1. Zestoden beim Pferd... 122.1.1. Taxonomie und Morphologie...… 12
2.1.2. Entwicklung... 13
2.1.3. Pathogenese und Symptome... 16
2.1.4. Prävalenzen... 18
2.1.5. Direkter Nachweis (Kotuntersuchung)... 24
2.1.6. Behandlung... 27
2.1.7. Weidehygiene... 31
2.2. Indirekte Nachweisverfahren (Serologie)... 31
2.2.1. Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)... 31
2.2.2. Western Blot... 35
3. MATERIAL UND METHODEN
3.1. Bestimmung der Prävalenz anhand von einmaligen Kotuntersuchungen ganzer Betriebe... 363.1.1. Auswahl der Betriebe... 36
3.1.2. Probenauswahl und -entnahme... 36
3.1.3. Erfassung der Daten (Fragebogen)... 37
3.1.4. Durchführung der Kotuntersuchung... 41
3.2. Mehrmalige Kotuntersuchung mit gleichzeitiger Entnahme von Blutproben
bei ausgewählten Betrieben über einen bestimmten Zeitraum... 42
3.2.1. Auswahl der Betriebe... 42
3.2.2. Probenauswahl und -entnahme... 43
3.2.2.1. Kotproben... 43
3.2.2.2. Blutproben... 43
3.2.3. Erfassung der Betriebsdaten... 43
3.2.4. Durchführung der Kotuntersuchung... 44
3.2.5. Konservierung der Blutproben... 44
3.3. Serologische Untersuchung... 44
3.3.1. Referenzseren... 44
3.3.2. Herstellung der Antigene... 45
3.3.2.1. Skolex-Antigen... 45
3.3.2.2. E/S-Antigen... 46
3.3.3. Proteinbestimmung... 46
3.3.4. Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)... 47
3.3.5. Sodium-Dodecylsulphat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE).... 48
3.3.6. Immunoblot... 49
3.3.7. Serologische Untersuchung durch ein externes Labor... 50
3.4. Statistik... 51
4. ERGEBNISSE
4.1. Überprüfung der Kotuntersuchungsmethode... 524.2. Kotuntersuchungen zur Bestimmung der Prävalenz... 54
4.2.1. Allgemeine Daten... 54
4.2.2. Daten auf Einzeltierebene... 57
4.2.3. Daten auf Betriebsebene... 62
4.3. Antigencharakterisierung... 72
4.3.1. Proteinbestimmung... 72
4.3.2. SDS-PAGE... 72
4.3.3. Western Blot... 74
4.4. ELISA... 75
4.4.1. Vorversuche zur Optimierung des ELISA... 75
4.4.1.1. ELISA mit E/S-Antigen... 75
4.4.1.2. ELISA mit Skolex-Antigen... 75
4.4.2. Auswertung der im ELISA ermittelten Ergebnisse... 86
4.4.3. Auswertung der durch ein externes Labor ermittelten Ergebnisse... 92
5. DISKUSSION
5.1. Kotproben... 985.1.1. Auswahl der Proben und Technik der Kotuntersuchung... 98
5.1.2. Ergebnisse der Kotuntersuchungen... 101
5.2. Serologie... 104
5.3. Vergleich von Kotuntersuchung und Serologie... 107
6. ZUSAMMENFASSUNG... 109
SUMMARY... 111
7. LITERATURVERZEICHNIS... 113
8. ANHANG
8.1. Verzeichnis der Reagenzien und Lösungen... 1328.1.1. Reagenzien... 132
8.1.2. Lösungen und Puffer... 133
8.1.3. Gele... 137
8.2. Tabellen... 138
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
Ag-Ktr. Antigen-Kontrolle
Aqua bidest. Aqua bidestillata = zweifach destilliertes Wasser
BSA Bovines Serumalbumin
bzw. beziehungsweise
ca. zirka
cm Zentimeter
d. h. das heißt
E/S-Antigen aus exkretorischen und sekretorischen Produkten des Parasiten
gewonnenes Antigen
ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay EpG Eier pro Gramm Kot
et al. und Mitarbeiter etc. et cetera (und so weiter)
Fa. Firma
g Gramm
Ig Immunglobulin
kDA Kilodalton
Kfz Kraftfahrzeug
kg Kilogramm
KGW Körpergewicht
K-Ktr. Konjugat-Kontrolle
µl Mikroliter
µm Mikrometer
mA Milliampère
MG Molekulargewichstmarker
min. Minute
ml Milliliter
MMP Magermilchpulver
n Anzahl, Menge
nm Nanometer
Nr. Nummer
NS Negativserum
OD optische Dichte
p Irrtumswahrscheinlichkeit bei der Analyse der Ähnlichkeit zweier Datengruppen
PBS Phosphate-Buffered Saline (phosphatgepufferte, physiologische Kochsalzlösung)
PS Positivserum
RIA Radioimmunoassay
SDS-PAGE Sodiumdodecylsulphat-Polyacrylamidgelektrophorese
S-Ktr. Serum-Kontrolle
sp. Spezies
spp. Supspezies
Std. Stunde
St-Ktr. Substrat-Kontrolle
syn. synonym
Tab. Tabelle
U / min. Umdrehung pro Minute
z. B. zum Beispiel
1. EINLEITUNG
Die Rolle des Pferdebandwurms Anoplocephala perfoliata in der Ätiologie der Kolik beim Pferd wird schon seit vielen Jahren debattiert und es gibt viele Fallberichte, in denen Anoplocephala perfoliata als eine Ursache für verschiedene intestinale Schäden beim Pferd angesehen wird. Beim Pferd kommen hauptsächlich drei Arten von Bandwürmern vor:
Anoplocephala perfoliata, Anoplocephala magna sowie Anoplocephaloides mamillana.
Anoplocephala perfoliata ist die weltweit am häufigsten vorkommende Art. Über die Verbreitung des Pferdebandwurms in Deutschland ist bislang wenig bekannt. Neben verschiedenen Studien aus Süddeutschland und Auswertungen von Einsendematerial aus mehreren Bundesländern in der Diagnostik des Instituts für Parasitologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover sind bislang nur wenige Daten über die Prävalenz von Bandwürmern in Norddeutschland bekannt geworden. Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit soll anhand von Kotuntersuchungen ein neuer Beitrag zur Prävalenz des Pferdebandwurms in Norddeutschland geliefert werden. Besonderer Wert wird darauf gelegt, Proben aus verschiedenen Betriebsformen zu untersuchen und einen detaillierten Fragebogen sowohl zum Einzeltier als auch zum Gesamtbetrieb auszuwerten.
Im Allgemeinen gilt die Kotuntersuchung in bezug auf den Pferdebandwurm als nicht sehr zuverlässig. Bedingt durch mehrere Faktoren kommt es zu vielen falsch-negativen Ergebnissen und ein infiziertes Pferd wird somit oftmals nicht als infiziert erkannt. In letzter Zeit wurden serologische Tests mit verschiedenen Antigenen entwickelt. Im Rahmen dieser Arbeit soll ein ELISA (= Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) auf seine Eignung in der Routinediagnostik untersucht werden.
In Betrieben, bei denen im Rahmen der Kotuntersuchungen Bandwürmer festgestellt worden waren, soll dann bei ausgewählten Pferden in etwa vierwöchigen Abständen Blutproben entnommen werden und diese mittels ELISA untersucht werden.
2. LITERATURÜBERSICHT 2.1. Zestoden beim Pferd
2.1.1. Taxonomie und Morphologie
(nach LICHTENFELS 1975):
Als adulte Bandwürmer parasitieren beim Pferd verschiedene Arten aus der Familie der Anoplocephalidae (Klasse: Cestoda). Zur Subfamilie der Anoplocephalinae gehören die Arten Anoplocephala perfoliata, Anoplocephala magna und Anoplocephaloides mamillana (syn.
Paranoplocephala mamillana). Außerdem existieren bei Pferden Vertreter der Subfamilie Monieziinae, zu denen beim Pferd als einzige Art Moniezia pallida gehört. Moniezia pallida ist jedoch nur sehr selten und auch nur in Afrika gefunden worden, so daß sich weitere Ausführungen auf die Subfamilie Anoplocephalinae beziehen.
Weiterhin kommen beim Pferd in inneren Organen Finnen von Echinococcus- und Taenia- Arten (Familie Taeniidae) vor. Für die vorliegende Arbeit sind diese jedoch nicht von Bedeutung und werden daher auch nicht näher erwähnt.
Die Arten aus der Subfamilie Anoplocephalinae haben folgende gemeinsame Merkmale: Sie besitzen einen Skolex mit vier Saugnäpfen ohne Rostellum und Haken, die Proglottiden sind breiter als lang und enthalten nur je einen Genitalapparat. Der Genitalporus befindet sich nur an einer Seite der Proglottis. Die Eier sind dickschalig und etwa 50 - 80 µm im Durchmesser und beinhalten eine hakentragende Onkosphäre in einer besonders geformten Embryophore, dem sogenannten “birnenförmigen Apparat”.
Anoplocephala perfoliata (Goeze, 1782):
Dieser Bandwurm wird etwa 2,5 bis 4 cm (gelegentlich bis 8 cm) lang und 8 bis 14 mm breit.
Zu unterscheiden von den beiden anderen Arten ist er durch vier ohrenähnliche 0,5 bis 1 mm große Lappen, die sich jeweils kaudal der runden Saugnäpfe am Skolex befinden. Die Eier
von A. perfoliata sind polygonal (meist annähernd rund, aber auch D-förmig oder dreieckig) und haben eine Größe von etwa 65 - 80 µm im Durchmesser. Die Onkosphäre ist relativ groß (16 µm) und ist vom birnenförmigen Apparat umgeben, welcher lange, gebogene Hörner aufweist. Im Wirt sitzt A. perfoliata im kaudalen Ileum, an der Ileozäkalklappe, um Zäkum und selten auch im proximalen Kolon.
Anoplocephala magna (Abildgaard, 1789):
Dieser größte beim Pferd vorkommende Bandwurm wird bis zu 80 cm lang und 2,5 cm breit und ist daher gut von den anderen Arten zu unterscheiden. Sein mit 4 - 6 mm im Durchmesser relativ großer Skolex besitzt ebenso wie bei A. perfoliata vier runde Saugnäpfe, jedoch keine Lappen. Die Eier sind 70 - 80 µm groß, besitzen jedoch eine kleinere Onkosphäre (8 µm) und einen birnenförmigen Apparat mit nur sehr kurzen Hörnern. A. magna kommt insgesamt selten vor und ist im Jejunum zu finden.
Anoplocephaloides mamillana ( Mehlis, 1831) (syn. Paranoplocephala mamillana):
Dieser ist mit 1 - 4 cm Länge und 4 - 6 mm Breite etwas kleiner als A. perfoliata, kann aber aufgrund seiner schlitzförmigen Saugnäpfe und der fehlenden Lappen hinter den Saugnäpfen gut von A. perfoliata unterschieden werden. Die Eier sind mit 50 - 60 µm ebenfalls etwas kleiner und der birnenförmige Apparat besitzt keine Hörner. A. mamillana sitzt im proximalen Dünndarm, selten auch im Magen.
2.1.2. Entwicklung
Der Entwicklungszyklus der Anoplocephaliden ist vergleichbar mit dem von Moniezia spp.
bei Rindern und Schafen (SOULSBY 1965), da auch hier freilebende Milben als obligate Zwischenwirte in den Entwicklungszyklus eingeschaltet sind. Es handelt sich hierbei um verschiedene Moosmilbenarten, welche auf den Weiden Deutschlands weit verbreitet sind.
Für A. perfoliata kommen dabei Moosmilben aus den Familien Galumnidae (G. obvius und G.
nervosus), Oribatulidae (Scheloribates laevigatus und S. latipis) und Carabodidae (Carabodes sp.) in Betracht, für A. magna und A. mamillana die Familien Galumnidae und Oribatulidae (ROMERO et al. 1989).
Die Proglottiden werden mit dem Kot ausgeschieden und mazerieren sehr schnell. Meist geschieht die Mazeration der Proglottiden sogar schon im Darmtrakt des Pferdes, so daß in den seltensten Fällen makroskopisch sichtbare Proglottiden im Kot zu finden sind (CARMEL 1988, NILSSON et al. 1995). Die freigewordenen Eier werden von Moosmilben der oben angeführten Arten aufgenommen. Nach der Aufnahme der Eier wird die Onkosphäre frei, dringt in die Leibeshöhle der Milbe ein und entwickelt sich dort innerhalb von ein bis vier Monaten (SOULSBY 1965, SKORSKI et al. 1984) zum infektiösen Stadium, dem Zystizerkoid. Die Pferde infizieren sich durch die Aufnahme von zystizerkoidhaltigen Moosmilben mit dem Weidegras und im Pferd entwickelt sich daraus während einer Präpatenzperiode von sechs bis acht Wochen der adulte Bandwurm (SOULSBY 1965).
SANADA und TSUKADA (1985) stellten in einer Studie Präpatenzzeiten von bis zu 12 Monaten fest. NILSSON et al. (1995) beobachteten, daß das ganze Jahr über (auch während der Stallperiode) juvenile Stadien von A. perfoliata zu finden waren und vermuten, daß die Präpatenz auch länger als acht Wochen betragen kann.
Abb. 1 Entwicklungszyklus von Anoplocephala sp.
(aus ISODA et al. 1966)
Moosmilben sind ubiquitär verbreitet, jedoch sind sie bezüglich ihrer Dichte und der Populationsdynamik abhängig von verschiedenen abiotischen Faktoren wie Feuchtigkeit, Temperatur, Pflanzenzusammensetzung, Nutzungsform der Weiden, Höhen, Düngung, Humusgehalt, pH-Wert und Salzgehalt des Bodens (BARUTZKI und PARWAR 1986).
BARUTZKI und PARWAR (1986) stellten bei Studien zur Überlebensfähigkeit von Moniezia expansa - Eiern fest, daß diese bei Temperaturen von -18°C bei einer Dauer von 3 Monaten abstarben, wohingegen ein Teil der Eier alternierende Temperaturen von -18°C bis 0°C über den gleichen Zeitraum überlebte. In derselben Studie wird festgestellt, daß die als Zwischenwirte für M. expansa fungierenden adulten Oribatiden ganzjährig präsent und für den Endwirt verfügbar sind. SCHUSTER (1988) beobachtete, daß Moosmilben selbst im Winter unter einer Schneedecke der Vegetation anhafteten und bemerkt, daß eine Super- bzw.
Reinfektion während der gesamten Weideperiode prinzipiell möglich sei. Während SCHUSTER (1988) die höchste Milbendichte auf den untersuchten Weiden im April
feststellt, beobachteten BARUTZKI und PARWAR (1986) ein Ansteigen der Milbendichten im Verlauf der wärmeren Jahreszeit mit Erreichen der Jahresgipfel von Juli bis Oktober.
Bezieht man diese Erkenntnisse auf die Anoplocephaliden-Eier, so ist für Pferde mit ganzjährigem Weidegang bei den hiesigen klimatischen Verhältnissen das ganze Jahr über eine Infektionsmöglichkeit vorhanden, wobei von April bis Oktober das Infektionsrisiko aufgrund der höheren Milbenzahlen größer ist.
2.1.3. Pathogenese und Symptome
Die Prädilektionsstelle für die Anheftung von A. perfoliata im Darm des Wirtes ist der Bereich der Ileozäkalklappe, aber sie können sich auch etwas entfernt von der Klappe an der Zäkumschleimhaut befinden. Läsionen entstehen, wenn sich die Bandwürmer an die Schleimhaut heften. Die Stärke der Läsionen steigt proportional zu der Zahl der vorhandenen Würmer. Sie reichen von Verdickung und Ödematisierung der Mukosa über Ulzerationen und Bildung von Granulationsgewebe bis hin zur Perforation der Darmwand (CHRISTL 1971, BAIN und KELLY 1977, BEROZA et al. 1983, PEARSON et al. 1993, FOGARTY et al.
1994, IHLER et al. 1995, NILSSON et al. 1995, WILLIAMSON et al. 1997, RODRIGUEZ- BERTOS et al. 1999). Ein typischer histopathologischer Befund ist die Ulzeration der Mukosa unterschiedlichen Grades. Weiterhin kommt es zu Infiltration der Lamina propria und dem umliegenden Gewebe mit Lymphozyten und eosinophilen Granulozyten (BAIN und KELLY 1977, FOGARTY et al. 1994, WILLIAMSON et al. 1997, RODRIGUEZ-BERTOS et al. 1999). PEARSON et al. (1993) stellten neben den erwähnten Befunden außerdem fest, daß die Darmschleimhaut mit zunehmender Anzahl der Würmer an Dicke zunimmt und ziehen aus ihren Untersuchungen den Schluß, daß A. perfoliata für Pferde pathogen ist. Es gibt auch Autoren, die keine schwerwiegenden Veränderungen bei mit Bandwürmern befallenen Tieren finden konnten (DUNSMORE und JUE SUE 1985, MFITILODZE und HUTCHINSON 1989), in diesen Fällen war jedoch die Zahl der vorhandenen Bandwürmer sehr gering.
Verschiedene Fallberichte dokumentieren, daß A. perfoliata in direktem oder sehr wahrscheinlichem Zusammenhang mit Perforationen des Ileums und des Zäkums steht (CHRISTL 1971, FOERNER 1982, BEROZA et al. 1983, BEROZA et al. 1986). OLIVER et al. (1977) berichten von der Ruptur des Duodenums bei einem 9 Monate alten Fohlen und nennen als Ursache die massenhafte Besiedlung des Duodenums mit A. magna. PLATT (1983) sezierte insgesamt vier Mutterstuten, die während der Geburt eine Darmperforation erlitten und euthanasiert wurden. Bei zwei dieser Stuten wurden Bandwürmer entdeckt. Es wird vermutet, daß der Fötus durch die Drehung bei der Geburt Druck auf das Kolon und den Enddarm ausübt und daß ein Darm, der z.B. durch Bandwürmer vorgeschädigt ist, leichter rupturieren kann. JACH und ALLMELING (1990) beobachteten bei einer Traberstute einen Obturationsileus aufgrund von massenhaftem Bandwurmbefall.
Weiterhin gibt es Autoren, die einen direkten Zusammenhang zwischen Bandwurmbefall und Invaginationen des Darmes sehen. Es sind hierbei sowohl ileo-ileale, ileo-zäkale, zäko-zäkale sowie Invaginationen vom Zäkum in das Kolon beobachtet worden (RODGERS 1966, BARCLAY et al. 1982, BEROZA et al. 1986, COSGROVE et al. 1986, EDWARDS 1986, OWEN et al. 1989, GAUGHAN und HACKETT 1990). Der genaue Zusammenhang zwischen dem Vorhandensein von Bandwürmern und dem Zustandekommen einer Darminvagination ist noch unbekannt, es werden lediglich Vermutungen geäußert.
COSGROVE et al. (1986) nehmen an, daß die Invagination ihre Ursache in einer Obstruktion hat, welche durch die entzündlichen Veränderungen der Schleimhaut entstehen kann.
RODGERS (1966) vermutet, daß eine Irritation durch die Bandwürmer zu Hypermotilität und diese dann zur Invagination führt. BARCLAY et al (1982) berichten, daß bei den festgestellten Darminvaginationen in fünf von neun Fällen A. perfoliata gefunden werden konnte. Als mögliche Ursache werden zwei Vermutungen geäußert. Zum einen könnte nach der Hypothese von ROONEY (1965) eine von dem Parasiten verursachte Gefäßschädigung zu einer lokalen Ischämie führen. Durch den Sauerstoffmangel könnte es zu einer segmentalen Atonie und infolge dessen zur Invagination kommen. Diese Theorie wird auch von RODRIGUEZ-BERTOS et al. (1999) vertreten, da es in deren Studie bei hochgradig infizierten Tieren zur hyalinen Degeneration von Gefäßwänden kam. Als weitere mögliche Gründe für Invaginationen führen BARCLAY et al. (1982) die Theorie von REYMOND
(1972) an, hier werden sowohl eine Veränderung im Durchmesser des Darmlumens sowie der Ausfall von Kontraktionen der Longitudinalmuskeln als mögliche Ursachen für Invaginationen genannt. BAIN und KELLY (1977) vermuten ebenfalls eine lokale Hypomotilität als Auslöser, welche jedoch durch die Störung der parasympathischen Reizübertragung entstehen soll. Sie beziehen sich auf eine Untersuchung von LEE und TATCHELL (1964), hier wurde festgestellt, daß in A. perfoliata das Enzym Acetylcholinesterase in größeren Mengen vorhanden ist. BAIN und KELLY (1977) spekulieren, daß bei Ausschüttung dieser Acetylcholinesterase das synaptische Acetylcholin gespalten wird, wodurch es zu einer lokalen Beeinträchtigung der Darmperistaltik kommen kann. Somit könnte an den Lokalisationen, an denen die Bandwürmer sitzen, die Motilität des Darmes herabgesetzt werden.
Klinisch sind die meisten Pferde mit einem geringgradigen Bandwurmbefall unauffällig. Es kommt nicht zwangsläufig zu Gewichtsverlust und Anämie, auch bei hochgradigem Befall sind akute abdominale Symptome (Kolik) wahrscheinlicher als ein chronischer Prozess. Laut einer epidemiologischen Studie von PROUDMAN und EDWARDS (1993) stellt der Pferdebandwurm ein signifikantes Risiko für das Auftreten von ileo-zäkalen Koliken dar. In einer späteren Untersuchung zeigen PROUDMAN et al. (1998), daß A. perfoliata einen signifikanten Risikofaktor für spastische Koliken und Ileumopstipationen beim Pferd darstellt und daß das Risiko einer spastischen Kolik mit zunehmender Infektionsintensität ansteigt.
2.1.4. Prävalenzen
Die Angaben über Prävalenzen des Pferdebandwurmes variieren sehr stark. Sie sind abhängig vom Untersuchungsort (Land) und von der Untersuchungsart. Bei Prävalenzstudien mittels Kotuntersuchungen werden im Durchschnitt wesentlich niedrigere Prävalenzen beschrieben als bei der pathologischen Untersuchung bzw. der Untersuchung im Schlachthof. Bei direkten Vergleichen wie in der Untersuchung von LYONS et al. (1983) wurden von Februar 1981 bis Februar 1982 363 Pferde pathologisch und 353 dieser Pferde koproskopisch auf das
Vorhandensein von Bandwürmern bzw. Bandwurmeiern untersucht. Die Prävalenz bei der Sektion beträgt 54 %, die bei der Kotuntersuchung lediglich 3 %. Dieser Unterschied wurde ein Jahr später noch einmal bestätigt (LYONS et al. 1984): In der Zeit von März 1982 bis Februar 1983 wurden 394 Pferde pathologisch auf das Vorhandensein von Bandwürmern untersucht. Von 380 dieser Pferde wurde auch eine Kotprobe untersucht. Die Prävalenz bei der pathologischen Untersuchung lag bei 53 %, die der Kotuntersuchung betrug 7 %. Die Ergebnisse der Prävalenzstudien, welche auf Kotuntersuchungen beruhen, sind demnach unter dem Aspekt zu betrachten, daß die tatsächliche Befallsrate höher anzusetzen ist.
In der Mehrzahl der Prävalenzstudien kommt als einzige Bandwurmart A. perfoliata vor.
Einige Autoren differenzieren keine Art, sondern geben die Prävalenzen von
„Bandwürmern“, „Zestoden“ oder „Anoplocephaliden“ an. Es gibt wenige Prävalenzstudien über andere Arten als A. perfoliata. Die Prävalenz von Anoplocephala magna liegt zwischen 2 % und 13 % (MFITILODZE und HUTCHINSON (1989, Australien), TORBERT et al.
(1986, USA), GAWOR (1995, Polen), ÇIRAK et al. (1996, Deutschland), BELLO und ABELL (1999, USA)). Bei Anoplocephaloides mamillana beträgt die Prävalenz 2 % (BORGSTEEDE und VAN BEEK (1996, Niederlande) bzw. 13 % (ÇIRAK et al. (1996, Deutschland)). In allen erwähnten Untersuchungen lag gleichzeitig auch ein Befall mit A.
perfoliata vor.
Tab. 1 zeigt die Ergebnisse einiger Prävalenzstudien in Deutschland, Tab. 2 die Ergebnisse aus dem Ausland.
Tab. 1: Prävalenz von Anoplocephaliden beim Pferd in Deutschland
Autor, Jahr Region Prävalenz Anzahl der Tiere Untersuchungsart BEELITZ et al.
(1996a)
Süddeutschland 16,2 % 37 (Fohlen und Mutterstuten aus 9 Betrieben)
Kotuntersuchung in unregel- mäßigen Abständen BEELITZ et al.
(1996b)
Süddeutschland 0 % bei Pferd 16 % bei Esel
23 Pferde 37 Esel
Kotuntersuchung in 4-wöchigen Abständen BEELITZ und
GOTHE (1997)
Süddeutschland 25 % 127
(aus 5 Betrieben)
Kotuntersuchung in 4-wöchigen Abständen BREM und
WOJTEK (1972) Süddeutschland 0,7 % 6376 (Zeitraum:
15 Jahre)
Kotuntersuchung
ÇIRAK et al.
(1996)
Norddeutschland 75 %
A. magna: 13 %
A. mamillana:13 % 16
(junge Pferde aus 3 Betrieben)
Pathologie
DRÖßIGK und SCHUSTER (1997)
Einsendungen aus 5 Bundes- ländern
3,7 % 1168
(aus 45 Betrieben)
Kotuntersuchung
EPE et al.
(1993)
Einsendematerial vorwiegend Norddeutschland
2,2 % 2599 (Zeitraum:
1984 – 1991)
Kotuntersuchung
EPE et al.
(1998)
Einsendematerial vorwiegend Norddeutschland
2,9 % 3103 (Zeitraum:
1993 - 1997)
Kotuntersuchung
JONAS et al.
(1972)
Süddeutschland 10 % 136 (aus einem Betrieb)
Kotuntersuchung
NEBEL (1976) Norddeutschland 4 % 100 Kotuntersuchung ZEEUW und
HASSLINGER (1997)
Süddeutschland 4 % 47 (2-jährige) Kotuntersuchung
Tab. 2: Prävalenz von Anoplocephaliden beim Pferd in verschiedenen Ländern
Autor, Jahr Land Prävalenz Anzahl der Tiere Untersuchungsart BAIN und
KELLY (1977)
Neuseeland 82 % 65 Schlachthof
BELLO und ABELL (1999)
USA 45 %
A. magna: 7 %
174 Zeitraum:
23 Jahre
Pathologie
BEROZA et al.
(1986)
USA 53 % 100 Kotuntersuchung
BORGSTEEDE und VAN BEEK (1996)
Niederlande 21 % A. mamillana: 2 %
70 Schlachthof
BUCKNELL et al. (1995)
Australien 29 % 150 Pathologie
DUNSMORE und JUE SUE (1985)
Australien 5 % 140 Pathologie
ENGLISH (1979)
Australien 62 % 138 Schlachthof,
Zäkuminhalt FOGARTY et al.
(1994)
Irland 51 % 363 Schlachthof
GAWOR (1995) Polen 4 %
A. magna: 4 %
50 Pathologie HASS (1979) USA 18 % (< 1 Jahr
alte Pferde) 26 % (> 1 Jahr alte Pferde)
150 629
Pathologie Pathologie IHLER et al.
(1995)
Norwegen 20 % 201 Pathologie
IMRIE und JACOBS (1987)
USA 27,5 % 80 Kotuntersuchung
KIVIPELTO et al. (1996)
USA 61,5 % 39 Kotuntersuchung
monatlich über 2 Jahre
LYONS et al.
(1983)
USA 54 %
gleiche Pferde:
3,1 %
363 353
Pathologie Kotuntersuchung LYONS et al.
(1984)
USA 53 %
gleiche Pferde:
7 %
394 380
Pathologie Kotuntersuchung LYONS et al.
(1986)
USA 43 % 70 Pathologie
Fortsetzung von Tab. 2: Prävalenz von Anoplocephaliden beim Pferd in verschiedenen Ländern
Autor, Jahr Land Prävalenz Anzahl der Tiere Untersuchungsart LYONS et al.
(1987)
USA 30 % (Fohlen)
60 % (Jährlinge und ältere)
insgesamt 278 Pathologie
LYONS et al.
(1989)
USA 39 % 59 Pathologie
LYONS et al.
(1992)
USA 54 % 35 Pathologie
LYONS et al.
(1995)
USA 58 % 42 Pathologie
LYONS et al.
(1997a)
USA 35 % (Stuten)
33 % (Jährlinge)
83 Stuten 58 Jährlinge
Kotuntersuchung LYONS et al.
(1997b)
USA 61 % 28 Pathologie
LYONS et al.
(1998)
USA 72 % 50 Pathologie
MFITILODZE und
HUTCHINSON (1989)
Australien 32 %
A. magna: 2 %
57 Pathologie
NILSSON et al.
(1995)
Schweden 65 %
gleiche Pferde:
23 %
470 395
Pathologie Kotuntersuchung OWEN et al.
(1988)
England 69 % 103 Schlachthof
PATRICK et al.
(1995)
Kanada 37 % 162 Kotuntersuchung
(24 -48 Std. nach Behandlung mit dreifach-Dosis Pyrantel) PEARSON et al.
(1993)
Großbritannien 80 % 20 Schlachthof
PROUDMAN und EDWARDS (1993)
England 21,6 % (Pferde mit Kolik) 14,8 % (Pferde ohne Kolik)
116
115
Kotuntersuchung
Kotuntersuchung REINEMEYER
et al. (1984)
USA 18 % 55 Pathologie
Fortsetzung von Tab. 2: Prävalenz von Anoplocephaliden beim Pferd in verschiedenen Ländern
Autor, Jahr Land Prävalenz Anzahl der Tiere Untersuchungsart RODRIGUEZ-
BERTOS et al.
(1999)
Spanien 23 % 121 Schlachthof
SENGUPTA und YADAV (1998)
Indien 2,1 % 141 Kotuntersuchung
SLOCOMBE (1979)
Kanada 13,6 % 580 Kotuntersuchung
TOLLIVER et al.
(1987)
USA 17 %
A. magna: 14 %
513 (Zeitraum:
28 Jahre)
Pathologie
TORBERT et al.
(1986)
USA 46,7 %
A. magna: 13%
37 Pathologie
WILLIAMSON et al. (1997)
Australien 38,5 % 130 Schlachthof
YOSHIHAARA et al. (1993)
Japan 52,2 % 178 Pathologie
Einige Autoren beurteilten die Prävalenz und die Befallsstärke (=Wumbürde,
=Infektionsintensität) auch im Hinblick auf Unterschiede im Geschlecht, Alter und Rasse der Pferde sowie auf das gehäufte Auftreten zu bestimmten Jahreszeiten.
In bezug auf das Geschlecht der Pferde konnte in den meisten Fällen kein Unterschied festgestellt werden, männliche und weibliche Tiere waren gleich oft betroffen bzw. wiesen keine Unterschiede in der Befallsstärke auf (BAIN und KELLY 1977, LYONS et al. 1983, LYONS et al. 1984, BEROZA et al. 1986, IMRIE und JACOBS 1987, LYONS et al. 1987, IHLER et al. 1995, BORGSTEEDE und VAN BEEK 1996). Lediglich BUCKNELL et al.
(1995) und NILSSON et al. (1995) berichten von höheren Befallsstärken bei weiblichen Tieren.
Auch bezüglich der Rasse der Pferde konnten viele Autoren keine Unterschiede feststellen (BEROZA et al. 1986, IMRIE und JACOBS 1987, MFITILODZE und HUTCHINSON 1989,
FOGARTY et al. 1994, IHLER et al. 1995). Signifikant höhere Wurmzahlen fanden jedoch NILSSON et al. (1995) bei Voll- und Kaltblütern im Gegensatz zu Warmblütern.
Im Hinblick auf das Alter der Pferde gab es verschiedene Angaben: BORGSTEEDE und VAN BEEK (1996) fanden heraus, daß bei jüngeren (1,5 bis 3 Jahre alten) Pferden häufiger Bandwürmer diagnostiziert wurden. BUCKNELL et al. (1995) geben die Altersgruppe der am häufigsten betroffenen Pferde mit 2 bis 7 Jahren an, erwähnen jedoch auch, daß die höchsten Befallsstärken bei Tieren unter 2 Jahren zu finden waren. Im Gegensatz dazu berichten NILSSON et al. (1995), daß signifikant höhere Wurmzahlen bei Tieren über 2 Jahren auftraten. Andere Autoren fanden sowohl in der Prävalenz als auch in der Befallsstärke keinen Unterschied im Alter der betroffenen Pferde (BAIN und KELLY 1977, LYONS et al.
1983, BEROZA et al. 1986, LYONS et al. 1987, OWEN et al. 1988, MFITILODZE und HUTCHINSON 1989, FOGARTY et al. 1994, IHLER et al. 1995).
Deutlich übereinstimmende Ergebnisse gab es im Hinblick auf die Häufung zu einer bestimmten Jahreszeit: In der kälteren Jahreszeit wurden sowohl höhere Wurmzahlen (BAIN und KELLY 1977, NILSSON et al. 1995) als auch höhere Prävalenzen (LYONS et al. 1984, BUCKNELL et al. 1995, IHLER et al. 1995, NILSSON et al. 1995) festgestellt. Keine Unterschiede in bezug auf die Jahreszeit konnten LYONS et al. (1987), MFITILODZE und HUTCHINSON (1989), BORGSTEEDE und VAN BEEK (1996) und FOGARTY et al.
(1994) feststellen.
2.1.5. Direkter Nachweis (Kotuntersuchung)
Der koproskopische Nachweis von Pferdebandwürmern wird im allgemeinen als schwierig beschrieben, da er viele falsch-negative Ergebnisse und damit eine geringe Sensitivität aufweist. Deutlich wird dieses an Studien, bei denen sowohl eine Kotuntersuchung als auch eine Sektion durchgeführt wurde. So fanden LYONS et al. (1983) bei 54 % der sezierten Pferde Bandwürmer, jedoch waren nur 3 % der Kotproben positiv. Bei einem anderen
Versuch (LYONS et al. 1984) waren 53 % der sezierten Pferde positiv, aber in nur 7 % der Kotproben wurden Bandwurmeier entdeckt. Ähnliche Ergebnisse gab es bei NILSSON et al (1995), dort waren es 65 % in der Sektion und 23 % bei der Kotuntersuchung sowie bei BELLO und ABELL (1999), dort waren 45 % der sezierten Pferde positiv und bei zweifacher Kotuntersuchung nur 14 % bzw. 18 % positiv. Auch durch die Verwendung verschiedener Techniken und Flotationslösungen konnte die Sensitivität der Kotuntersuchung nicht deutlich gesteigert werden (NEBEL 1976, PATRICK et al. 1995, MEANA et al. 1998, WILLIAMSON et al. 1998).
Eine hohe Sensitivität (16 von 18 Pferden wurden als positiv identifiziert) erreichten BEROZA et al. (1986) mit einer speziellen Zentrifugationstechnik, diese Methode wurde aufgrund der schlechten Reproduzierbarkeit jedoch wieder verworfen (BEROZA et al. 1987).
PROUDMAN und EDWARDS (1992) untersuchten mittels einer Zentrifugations- / Flotations-Technik mit gesättigter Zuckerlösung den Kot von 80 bei der Sektion als Bandwurm-positiv ermittelten Pferden und erhielten eine Sensitivität von 61 %. Bei dieser Methode wird der Kot mit Wasser angemischt und durch ein Sieb in zwei Reagenzgläser gegeben. Nach einer ersten Zentrifugation wird der Überstand abgegossen, mit Wasser aufgefüllt und erneut zentrifugiert. Dann wird der Überstand abgegossen, mit gesättigter Zuckerlösung aufgefüllt und wieder zentrifugiert. Anschließend wird jedes Reagenzglas bis zum Rand mit gesättigter Zuckerlösung gefüllt, ein Deckgläschen aufgelegt und nach zwei Stunden das Deckgläschen auf einen Objektträger verbracht und mikroskopiert.
Es werden verschiedene Gründe für die geringe Sensitivität der Kotuntersuchung genannt.
SCHUSTER (1991) fand heraus, daß sich bei A. perfoliata - im Gegensatz zur Gattung Moniezia - der Uterus nicht unmittelbar nach Abtrennung der reifen Proglottide von der Strobila öffnet, welches die geringe Durchmischung der Bandwurmeier mit den Fäzes erklärt.
Weiterhin fand er in einer morphometrischen Analyse von 440 A. perfoliata - Exemplaren heraus, daß etwa 75% der visuell als adult eingestuften Bandwürmer steril waren. Ein weiterer Grund für die geringe Sensitivität der Kotuntersuchung ist der diskontinuierliche Abgang der Proglottiden (BEROZA et al. 1983, CARMEL 1988, NILSSON et al. 1995). Aus
diesen beiden Gründen kann gefolgert werden, daß zur Optimierung der Ergebnisse eine Sammelkotprobe über mehrere Tage zu nehmen ist und daß für eine ausreichende Durchmischung der Fäzes zu sorgen ist, bzw. Kot aus verschiedenen Stellen des Untersuchungsgutes zur Anwendung kommen sollte (FRENCH und CHAPMAN 1992).
Es besteht keine Korrelation zwischen der Infektionsintensität und der Eizahl im Kot des einzelnen Pferdes (PROUDMAN und EDWARDS 1992, NILSSON et al. 1995, MEANA et al. 1998, WILLIAMSON et al. 1998). Jedoch besteht ein signifikanter Zusammenhang zwischen der Infektionsintensität und der Sensitivität der Kotuntersuchung. Bei Pferden mit höheren Wumzahlen ist die Sensitivität höher als bei Pferden mit nur wenigen Würmern (PROUDMAN und EDWARDS 1992, NILSSON et al. 1995, MEANA et al. 1998, WILLIAMSON et al. 1998). Bei der Untersuchung von PROUDMAN und EDWARDS (1992) steigt die Sensitivität des Testes von 61 % auf 92 %, wenn man die Pferde unberücksichtigt lässt, die weniger als 20 Bandwürmer hatten. In der Studie von WILLIAMSON et al. (1998), bei der der Kot von 40 infizierten und 15 nichtinfizierten Pferden untersucht wurde, hatten fast die Hälfte der infizierten Pferde weniger als 10 Bandwürmer und es wird vermutet, daß diese Tatsache einen signifikanten Einfluß auf die Sensitivität des Tests besitzt. MEANA et al (1998) machten ähnliche Beobachtungen und kamen zu dem Schluß, daß die Wahrscheinlichkeit, eine Bandwurminfektion per Kotuntersuchung nachzuweisen, sehr gering ist, wenn das Pferd weniger als 100 Bandwürmer beherbergt.
Aus den genannten Gründen kann ein Vergleich verschiedener Testmethoden am besten anhand von präpariertem Kot erfolgen. Das Präparieren von naivem Kot mit einer definierten Anzahl an Eiern gibt zuverlässigere Ergebnisse des Tests, da es die Ungenauigkeiten eliminiert, welche bei dem Abgang der Proglottiden und dem Freisetzen der Eier entsehen (WILLIAMSON et al. 1998). BEROZA et al. (1987) präparierten Kot mit zwei verschiedenen Konzentrationen von Bandwurm-Eiern (183 EpG und 91 EpG) und testeten ein Flotations- und ein Zentrifugationsverfahren. Die Flotation ergab eine Wiederfindungsrate von 1 %, die Zentrifugation 10 %. WILLIAMSON et al. (1998) präparierten Kot mit unterschiedlichen
Sedimentations- und zwei verschiedenen Flotationsmethoden. Bei allen drei Untersuchungsverfahren erhöhte sich die Wiederfindungsrate mit abnehmender Eikonzentration. Am sensitivsten sowohl bei präpariertem Kot als auch bei Kot von natürlich infizierten Pferden (Sensitivität 37,5 %) erwies sich eine Flotations-Methode. Hierbei werden 5 g Kot mit 50 ml Wasser vermischt, durch ein Sieb gepreßt und 40 min sedimentiert. Der Überstand wird abgegossen und das Sediment mit 8 ml gesättigter Zuckerlösung vermischt.
Nach 4-minütiger Zentrifugation bei 1200g wird 1 ml der obersten Flüssigkeitsschicht mittels einer Pasteur-Pipette abgenommen und in einem neuen Gefäß mit 9 ml Wasser vermischt.
Nach erneuter Zentrifugation wird der Überstand abgegossen, das Zellmaterial mit 500 µl Wasser vermischt und in 250 µl Aliquots mikroskopisch durchgemustert.
2.1.6. Behandlung
A. perfoliata und A. magnaEine im Original als „modified critical test“ bezeichnete Versuchsreihe wurde von LYONS et al. (1986) entworfen. Hierbei wurden die Pferde jeweils 24 Stunden nach einer anthelminthischen Behandlung euthanasiert und der Darminhalt sowie die Darmschleimhaut auf das Vorhandensein von Bandwürmern untersucht. Der normale Sitz von A. perfoliata ist wie bereits erwähnt das Zäkum, manchmal werden auch Exemplare im Dünndarm und im proximalen Kolon gefunden. Bei der Sektion für den „modified critical test“ wurden alle Bandwurm-Exemplare, die sich im proximalen Kolon oder weiter distal befanden (mit Ausnahme derer, die an die Schleimhaut angeheftet waren), als eliminiert betrachtet. Diese wurden gezählt und in Verbindung zu der Zahl der verbliebenen Exemplare gebracht. Als Verblieben zählten sämtliche Bandwürmer im Dünndarm, im Zäkum sowohl die an die Schleimhaut angehefteten Exemplare im proximalen Kolon. Es wurde dann für jedes Pferd die Elimination in Prozent angegeben und von mehreren Pferden die durchschnittliche Eliminationszahl für das jeweilige Anthelminthikum bestimmt. Mittels dieses „modified
critical tests“ untersuchten LYONS et al. verschiedene Dosierungen von Pyrantel und Praziquantel, die Ergebnisse sind in Tab. 3 aufgeführt.
Die durchschnittlich besten Eliminationen wurden bei der Verabreichung von Praziquantel in der Dosierung von 1 mg / kg KGW erzielt. Mit dem Wirkstoff Pyrantel konnte die beste Wirkung bei der Gabe der zweifachen Dosis (13,2 mg / kg KGW) festgestellt werden.
Tab. 3: Ergebnisse verschiedener Behandlungsversuche mittels modifiziertem kritischem Test
Autor Wirkstoff Darreichungs- form
Dosierung (in mg pro kg KGW)
Anzahl der A. perfoliata positiven Pferde
∅ Elimination (Streuung) pro Pferd LYONS et al.
(1986)
Pyrantel Paste oral 13,2 30 93 %
(13 - 100 %) LYONS et al.
(1989)
Pyrantel Paste oral
Suspension per Nasenschlund- sonde (NSS)
6,6
dto.
18
5
88 % (67 - 100%) 75 % (58 - 100%) LYONS et al.
(1992)
Praziquantel oral per NSS
oral
1,0 1,0
0,75
2 6
11
100 % 98 % (89 - 100 %) 91 % (82 - 100 %) LYONS et al.
(1995)
Praziquantel oral 0,5 24 85 %
(0 - 100 %) LYONS et al.
(1997b)
Pyrantel oral 6,6 17 70 %
(1 - 100 %) LYONS et al.
(1998)
Praziquantel oral 0,25 36 35 %
(0 - 100 %)
SLOCOMBE (1979) überprüfte anhand einer Kombination von viertägiger Kotkontrolle mit anschließender Sektion die Wirksamkeit von Pyrantel, Niclosamid und Mebendazol. Als sehr gut wirksam erwies sich dabei lediglich Pyrantel in zweifacher (13,2 mg / kg KGW) bzw.
dreifacher (19,8 mg / kg KGW) Dosis. Die einfache Dosis Pyrantel sowie Mebendazol und Niclosamid waren nicht bzw. nicht ausreichend wirksam. Die Wirksamkeit der zweifachen Dosierung von Pyrantel (13,2 mg / kg KGW) wurde auch von HASSLINGER und TAUSEND (1989) anhand von mehrfachen Kotuntersuchungen festgestellt. BELLO (1979) sieht hingegen die einmalige Gabe der einfachen Dosierung von Pyrantel als ausreichend an.
Auch für eine niedrigere Dosis Pyrantel (2,6 mg / kg KGW) konnte eine Wirksamkeit nachgewiesen werden (GREINER und LANE 1994, LYONS et al 1997a), allerdings wurde der Wirkstoff hier täglich für die Dauer von 30 Tagen verabreicht. KIVIPELTO et al. (1998) bestätigen die Wirksamkeit einer täglichen Gabe von 2,6 mg / kg KGW anhand von regelmäßigen Kotuntersuchungen, wobei die niedrige Dosis in diesem Versuch täglich über 26 Wochen gegeben wurde. Im direkten Vergleich zur einmaligen Gabe der dreifachen Dosis Pyrantel (19,8 mg / kg KGW) wurde die tägliche Gabe der niedrigen Dosierung sogar als geringfügig wirkungsvoller angesehen.
Die von LYONS et al. (1992, 1995, 1998) erwiesene Wirksamkeit von Praziquantel wurde von SLOCOMBE (1997) bestätigt, in Anlehnung an den „modified critical test“ (LYONS et al. 1986) wurden hier 18 Pferde oral mit unterschiedlichen Konzentrationen (0,5, 1,0, 1,5 oder 2,0 mg / kg KGW) Praziquantel behandelt, 48 Stunden später euthanasiert und der Darm auf das Vorhandensein von Bandwürmern untersucht.
Verschiedene Benzimidazole wurden in bezug auf ihre Wirksamkeit gegen Anoplocephala sp.
getestet. Zwar fanden KELLY und BAIN (1975) heraus, daß Mebendazol in einer Dosierung von 15 mg / kg KGW zu 96 % wirksam ist, dieses wurde jedoch von SLOCOMBE (1979) widerlegt, dort war sogar die vierfache therapeutische Dosis (35,2 mg / kg KGW) ohne Wirkung auf die Bandwürmer. DRUDGE et al. (1975) stellten fest, daß Cambendazol ebenfalls ohne Wirkung auf A. perfoliata und A. magna ist und KINGSBURY und REID (1981) bewiesen diese Tatsache für Oxfendazol.
Die Gruppe der Makrozyklischen Laktone (Avermectine (Ivermectin) und Milbemycine (Moxidectin)) hat keine Wirkung auf Zestoden. Diese Stoffgruppe greift am γ- Aminobuttersäure-System (GABA-System) an, bei Zestoden besitzt GABA keine Bedeutung als Neurotransmitter (LÖSCHER et al. 1994). Die fehlende Wirksamkeit konnte unter anderem von TORBERT et al. (1982) für Ivermectin und von MONAHAN et al. (1995) für Moxidectin nachgewiesen werden.
Sowohl EDWARDS (1986) als auch GEERING und JOHNSON (1990) vermuten, daß das vermehrte Auftreten von Bandwurminfektionen unter anderem durch die weitverbreitete Verwendung von Ivermectin in Entwurmungsprogrammen zustande kommt. Diese Vermutung wird allerdings in einer von FRENCH et al. (1994) veröfftentlichten Studie widerlegt. In dieser Studie wurde die Prävalenz von A. perfoliata über einen Zeitraum von fünf Jahren in zwei Ponyherden bzw. von drei Jahren in einer dritten Ponyherde ermittelt.
Von den drei Herden wurde eine gar nicht entwurmt, die zweite wurde alle zwei Monate ausschließlich mit Ivermectin behandelt und die dritte bekam Ivermectin, Pyrantel, Oxibendazol und Thiabendazol-Piperazin im Rotationsverfahren. In der Gruppe, welche ausschließlich mit Ivermectin behandelt wurde, kam es nicht zu einem Anstieg der Befallsrate mit A. perfoliata. Es wird vermutet, daß aufgrund der Elimination der Nematoden die Kotproben besser zu beurteilen und Eier von A. perfoliata eher zu erkennen sind als bei der unbehandelten Gruppe.
Seit Anfang des Jahres 2000 ist der Wirkstoff Pyrantel in doppelter Dosierung (13,2 mg / kg KGW) für die Bekämpfung von A. perfoliata beim Pferd zugelassen.
A. mamillana
Es gibt wenig Literatur über die Wirksamkeit der Anthelminthika gegen A. mamillana.
PROUDMAN et al. (1995) fanden anhand koproskopischer Kontrolluntersuchungen von drei Pferden heraus, daß trotz der oralen Gabe von Pyrantel in zweifacher Dosierung (13,2 mg / kg KGW) weiterhin Eier ausgeschieden wurden. 15 Tage später wurde Praziquantel (1 mg / kg
KGW) oral verabreicht, in den folgenden drei Tagen wurden viele Eier ausgeschieden, danach konnte für mehrere Monate keine Eiausscheidung mehr beobachtet werden. Daraus kann gefolgert werden, daß bei Befall mit A. mamillana der Wirkstoff Praziquantel vorzuziehen ist.
2.1.7. Weidehygiene
Eine Eliminierung der Zwischenwirte ist nicht möglich. Da Moosmilben jedoch seltener auf kultivierten Böden vorkommen, wird von BAIN und KELLY (1977) regelmäßiges Pflügen der Weiden vorgeschlagen. HASSLINGER und TAUSEND (1989) halten das Entfernen von Kot, Umbruch, Neusaat oder die wechselweise Nutzung durch andere Tierarten für eine sinnvolle Ergänzung zur Gabe von zestodenwirksamen Anthelminthika. Auch GOTHE (1994) empfiehlt das regelmäßige Entfernen von Kot von den Weiden. DRÖßIGK und SCHUSTER (1997) schlagen den Umbruch der Weiden oder eine Beweidung mit wechselnden Tierarten vor.
2.2. Indirekte Nachweisverfahren (Serologie)
2.2.1. Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Der Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) entwickelte sich aus dem Radioimmunoassay (RIA) und wurde zuerst von ENGVALL und PERLMANN für die quantitative Bestimmung von Antigenen (1971) bzw. von Antikörpern (1972) beschrieben.
Das Prinzip des ELISA beruht darauf, daß sich Antigen-Antikörper-Reaktionen durch Markierung einer dieser beiden Komponenten mit einem Enzym sichtbar machen lassen, indem die Enzymaktivität durch eine Farbreaktion gemessen wird. Auf diese Weise können Antigene und Antikörper qualitativ und quantitativ bestimmt werden. Laut RUITENBERG und VAN KNAPEN (1977) ist der ELISA eine geeignete diagnostische Methode, um parasitäre Infektionen (Helminthen und Protozoen) zu erkennen.
Beim Nachweis von Antikörpern durch den ELISA wird zunächst das Antigen an die Festphase (in der Regel Mikrotiterplatten) gebunden. Anschließend werden die freigebliebenen Bindungsstellen „abgesättigt“, d. h. durch nicht-reagierende Proteine besetzt.
Es folgt die Zugabe des zu testenden Serums, vorhandene Antikörper können sich nun an die Antigene anlagern. Wiederum an die gebundenen Antikörper lagert sich das Konjugat an, hierbei handelt es sich um ein enzymmarkiertes Antiserum gegen die Spezies-Antikörper.
Anschließend wird ein Substrat zugegeben, welches durch das gebundene Enzym in ein farbiges Reaktionsprodukt umgesetzt wird. Das Ergebnis kann photometrisch bestimmt werden. Um vergleichbare Farbintensitäten zu erhalten, kann die Reaktion nach einer bestimmten Zeit abgestoppt werden. Bei der hier beschriebenen Methode wird zwischen den einzelnen Reaktionsschritten gründlich gewaschen, um die unspezifischen Reaktionen so gering wie möglich zu halten.
Es gibt Veröffentlichungen, die sich mit der Optimierung dieses Testsystems beschäftigen (BULLOCK und WALLS 1977, McLAREN et al. 1981, GRÄNZER 1989, VENKATESAN und WAKELIN 1993, BOGNER und FORSCHNER 1994). Es wird jedoch darauf hingewiesen, daß die einzelnen Parameter für verschiedene Antikörper und Antigene immer wieder neu zu optimieren sind.
ELISA’s für Zestodeninfektionen beim Hund
Der ELISA wurde für verschiedene Zestodeninfektionen angepasst. GASSER et al. (1988) verglichen Protoscolex-Antigen und Onkosphären-Antigen bei mit Echinococcus granulosus infizierten Hunden. Sie fanden heraus, daß das Protoscolex-Antigen für den Nachweis einer Infektion besser geeignet ist und daß keine Korrelation zwischen den ELISA-Werten und der Infektionsintensität bestand. In einer weiteren Studie verglichen GASSER et al. (1992) das Protoscolex-Antigen mit einem E/S-Antigen (=exkretorisch/sekretorisch, Antigen wird aus den Ausscheidungen des Parasiten gewonnen) und stellten auch hier keine Korrelation zwischen ELISA-Ergebnis und Infektionsintensität fest. Das E/S-Antigen zeigte eine etwas höhere Sensitivität (80,8 %) als das Protoscolex-Antigen (75,6 %), beide können aber für epidemiologische Studien verwendet werden. Auch JENKINS und RICKARD (1986) gelang
ein ELISA mit E/S- und mit Protoscolex-Antigen, wohingegen bei der Verwendung von Onkosphären-Antigen keine Antikörper-Reaktion zu verzeichnen war. Für den Nachweis einer Taenia ovis - Infektion bei Hunden verwendeten HEATH et al. (1985) T. ovis E/S- Antigen und fanden ebenfalls heraus, daß das Ergebnis nicht mit der Infektionsintensität der Hunde korrelierte.
ELISA’s für Infektionen mit A. perfoliata
HÖGLUND et al. (1995) verwendeten somatisches A. perfoliata Antigen und untersuchten damit die Sera von 426 geschlachteten Pferden. Für die Herstellung des Antigens wurden die Skolices der Würmer verwendet (Skolex-Antigen). Diese wurden homogenisiert und zentrifugiert. Bei der Untersuchung der Seren konnte allgemein ein Zusammenhang zwischen dem Antikörper-Gehalt und der Infektionsintensität festgestellt werden, jedoch gab es individuelle Variationen bei Pferden mit gleicher Wurmbürde. Eine Kreuzreaktion mit Strongyliden wurde nicht festgestellt. Es konnte kein Effekt des Alters oder der Entwurmung auf den Antikörper-Gehalt nachgewiesen werden, allerdings wurden signifikante saisonabhängige Unterschiede mit einem kleinen Gipfel im Dezember/Januar und einem größeren Gipfel im Juni festgestellt. Die Autoren bemerken, daß dieser Test nur für epidemiologische Studien und nicht für die Diagnose am Einzeltier geeignet ist, denn es konnte nicht zwischen bereits stattgefundener und neuerworbener Infektion unterschieden werden. Das Skolex-Antigen verwendeten HÖGLUND et al. (1998) für eine epidemiologische Studie an 21 Fohlen, welche über ein Jahr lang auf einer kontaminierten Weide gehalten wurden. In regelmäßigen Abständen wurden das Serum der Fohlen mittels ELISA untersucht, gleichzeitig wurden Kotuntersuchungen durchgeführt. Es konnte ein Ansteigen der Antikörper-Spiegel im Oktober - zwei Monate vor dem Auftreten der ersten Bandwurmeier im Kot - beobachtet werden.
PROUDMAN und TREES (1996a) stellten sowohl ein somatisches Antigen aus ganzen Würmern („Whole Worm Extract“) als auch ein Antigen aus den Ausscheidungsprodukten von A. perfoliata (exkretorisch/sekretorisch = E/S-Antigen) her. Für das somatische Antigen wurden Skolices und nichtgravide Proglottiden homogenisiert, zentrifugiert und filtriert.
Für die Herstellung des E/S-Antigens wurden Bandwürmer aus frisch geschlachteten Würmern gewaschen und fünf Stunden in PBS bei 38°C inkubiert. Die Flüssigkeit wurde abgegossen und ebenfalls filtriert. Im Vergleich dieser beiden Antigene im ELISA ergab das E/S-Antigen höhere Unterschiede zwischen negativen und positiven Seren. Der E/S-ELISA wurde opimiert und an Pferdeseren getestet, bei denen der Bandwurm-Status durch Sektion bekannt war. Es wurde eine Sensitivität von 68 % und eine Spezifität von 95 % ermittelt.
Sowohl das von HÖGLUND et al. (1995) verwendete Skolex-Antigen als auch das von PROUDMAN und TREES (1996a) verwendete E/S-Antigen zeigten eine geringe Sensitivität und beim Einzeltier wenig Korrelation zur Infektionsintensität. In einer folgenden Studie beschreiben PROUDMAN und TREES (1996b) ein Verfahren zur Aufreinigung des E/S- Antigens. Im Immunoblot (siehe Punkt 2.2.5.) zeigte das E/S-Antigen bei 12 und 13 kDa eine Doppelbande, welche nicht im somatischen Antigen vorhanden war. Dieses Protein (12/13 kDa Antigen) wurde extrahiert, zeigte jedoch wie das ursprüngliche E/S-Antigen keine Korrelation zum Parasitenstatus. In einem weiteren Reinigungsschritt wurde in Ratten polyklonales IgG gegen das 12/13 kDa Antigen hergestellt. Per Affinitätschromatographie wurde dann durch das kovalent an die Säulen gebundene Anti 12/13 kDa IgG das gereinigte 12/13 kDa Antigen isoliert. Mittels dieses gereinigten 12/13 kDa Antigens und der spezifischen Bestimmung eines Subtypen des IgG aus dem Pferdeserum, dem IgG(T), gelang es, eine Korrelation zwischen der Höhe der Antikörperantwort und der Infektionsintensität zu finden.
Dieses gereinigte 12/13 kDa Antigen wurde in einer weiteren Studie von PROUDMAN et al.
(1997) verwendet, um einen Zusammenhang zwischen dem Alter der Pferde und der Infektionsintensität zu finden. Von Bedeutung war die Tatsache, daß die Höhe des IgG Subtypen IgG(T) dreiphasisch verläuft: Es gibt einen Gipfel in der Altersgruppe von 6 Monaten bis 2 Jahren, dann ein niedriger gelegenes Plateau und einen erneuten Anstieg ab dem Alter von 15 Jahren. Die Autoren vermuten einen Grund für das Plateau in der Tatsache, dass viele Pferde im Alter von 3 bis 15 Jahre vorwiegend im Stall gehalten werden, wohingegen jüngere und ältere Pferde mehr Weidegang und somit mehr Infektionsmöglichkeiten hätten. Andere in dieser Studie untersuchte IgG Subtypen (IgG(a), IgG(b), IgG(c)) zeigten zwar nicht das deutliche dreiphasige Bild des IgG(T), jedoch stiegen auch sie bei älteren Pferden an.
2.2.2. Western Blot
Für den Western Blot wird das Antigen zuerst mit Hilfe der Elektrophorese (meist SDS- PAGE = Sodium-Dodecylsulphat-Polyacrylamidgelelektrophorese) nach der Größe der vorhandenen Proteine aufgetrennt. Diese Auftrennung kann dann durch Färbung (z..B.
Coomassie Brilliant Blue R 250) sichtbar gemacht werden oder durch den Immunoblot auf eine Membran (z. B. Nitrocellulose) übertragen, mit Antikörpern inkubiert und nach Zugabe von Konjugat und Substrat eine Antigen-Antikörper-Bindung sichtbar gemacht werden (BURNETTE 1981, GERSHONI und PALADE 1983).
HÖGLUND et al. (1995) fanden in dem von Ihnen hergestellten Skolex-Antigen (Antigenpräraration: siehe Punkt 2.2.1.) 14 verschiedene Proteinbanden, wobei die deutlichsten Banden in der Molekulargewichtsgröße von 31 bis 45 kDa und von 66 bis 200 kDa lagen. Bei PROUDMAN und TREES (1996a) lagen die Proteinbanden des somatischen Antigens zwischen 26 und 205 kDa, einige davon waren auch bei dem verwendeten E/S- Antigen zu finden (45, 36, 34 und 26 kDa). Proteine von der Größe 12 und 13 kDa kamen nur bei dem E/S-Antigen vor.
Im Western Blot beobachteten HÖGLUND et al. (1995) im allgemeinen eine sehr heterogene Bandenverteilung, die stärkste Reaktion mit Bandwurm-positiven Seren lag bei Proteinen der Größenordnung von etwa 66 kDa. PROUDMAN und EDWARDS (1996a) verwendeten lediglich das E/S-Antigen und fanden eine Reaktion von Bandwurm-positiven Seren bei den oben erwähnten Proteinbanden von 12 und 13 kDa, in diesem Bereich war keine Reaktion bei den Bandwurm-negativen Seren zu verzeichnen.
3. MATERIAL UND METHODEN
3.1. Bestimmung der Prävalenz anhand von einmaligen Kotuntersuchungen ganzer Betriebe
3.1.1. Auswahl der Betriebe
Für die Untersuchungen zur Prävalenz des Pferdebandwurmes wurden in der Zeit von Oktober 1998 bis Juni 1999 insgesamt 1129 Kotproben (1046 Einzel- sowie 83 Sammelproben) untersucht. Diese stammten aus 54 verschiedenen Betrieben aus Niedersachsen, Bremen und dem südlichen Schleswig-Holstein. Die Adressen dieser Betriebe stammten von persönlichen Kontakten sowie von praktizierenden Tierärzten. Einer Liste der Tierärztekammer folgend, wurden Fachtierärzte für Pferde telefonisch um die Nennung pferdehaltender Betriebe gebeten, dabei wurden kleinere Privathaltungen ebenso berücksichtigt wie auch größere Betriebe (Deckstellen, Gestüte, Reitställe usw.). Mit den Betrieben wurde dann wiederum telefonisch ein Termin vereinbart, um mehrere Bestände im Umkreis am gleichen Tag beproben zu können. Es wurden in erster Linie solche Ställe ausgewählt, in denen die Mehrzahl der Pferde im Sommer Weidegang gehabt hatten.
3.1.2. Probenauswahl und -entnahme
Es wurden Kotproben von möglichst allen Pferden mit Weidegang des jeweiligen Betriebes genommen. Die Entnahme erfolgte in der Mehrzahl der Fälle mit einem Einmalhandschuh vom Boden der individuellen Box. Befanden sich in einer Box mehrere Kothaufen von einem Pferd, so wurde jeweils eine kleine Menge von jedem Haufen genommen. Ebenso wurde in Laufställen mit mehreren Pferden verfahren, diese Proben wurden dann als Sammelproben gekennzeichnet. Die Proben von einzelnen Pferden wurden jeweils mit dem Namen des Pferdes und eventuell einer Gruppenbezeichnung versehen, falls es in dem Betrieb verschiedene Weidegruppen gab (siehe Punkt 3.1.3 Abschnitt B).
3.1.3. Erfassung der Daten (Fragebogen)
Der in Abb. 2 und Abb. 3 dargestellte Fragebogen wurde in vier Abschnitte (A bis D) aufgeteilt, welche im folgenden erläutert werden:
• Abschnitt A: „Allgemeines“ (Daten zum gesamten Betrieb):
zu 1) Notiert wurde die A n z a h l a n P f e r d e n, die sich zu dem Zeitpunkt der Probennahme in diesem Betrieb befand. Es wurden auch die Pferde berücksichtigt, die im Sommer keinen Weidegang gehabt hatten und als „reine Stallpferde“ extra notiert.
zu 2) Unter G a s t p f e r d e n wurden solche Pferde verstanden, die zum Zeitpunkt der Probennahme zwar in dem jeweiligen Betrieb waren, die sich aber während der vorangegangenen Weideperiode an einem anderen Ort aufgehalten hatten.
zu 3) G r u p p e n wurden nur in dem Fall eingeteilt, wenn von einzelnen Pferdegruppen völlig verschiedene Weidestücke benutzt wurden und auch keine Beweidung nacheinander erfolgte.
zu 4) und 5) Mit der Angabe der A n z a h l und der G r ö ß e der insgesamt zur Verfügung stehenden W e i d e f l ä c h e n sollte in Verbindung mit der Gesamtzahl der Pferde eine ungefähre Besatzdichte abgeschätzt werden
zu 6) Als „B r a c h l i e g e n“ wurde nur die Zeitspanne bezeichnet, in der eine oder mehrere Weiden während der Weideperiode nicht genutzt wurden. Es war hierbei nicht die Zeit über den Winter gemeint, in der die Weiden meist sowieso nicht genutzt werden. Zusätzlich wurde notiert, ob es sich bei den Weiden des Betriebes um S t a n d w e i d e n (die gesamte Weideperiode über wird eine Fläche zur Verfügung gestellt) oder U m t r i e b s w e i d e n (durch feste oder versetzbare Zäune abgetrennte Einzelstücke werden nacheinander beweidet) handelte.
zu 7) und 8) Die Frage, ob Kot abgesammelt wird und ob andere Tiere auf der Weide gehalten werden, ist, wie auch Punkt 6, eine Frage der Weidehygiene. In der Literatur (siehe Literaturübersicht, Punkt 2.1.7. Weidehygiene) wird immer wieder auf prophylaktische Maßnahmen wie Kotentfernung oder Mischbeweidung hingewiesen. Es soll hier überprüft
werden, ob auch ein Zusammenhang zwischen Bandwurmbefall und weidehygienischen Maßnahmen besteht.
• Abschnitt B: „Gruppe“ (Daten zu festen Pferdegruppen, sofern unterschiedliche Weideflächen benutzt wurden. Falls keine Gruppen unterschieden wurden, galten diese Fragen für den ganzen Betrieb)
zu 13) bis 15) Die Daten der letzten Behandlungen wurden möglichst weit zurückverfolgt und besonders berücksichtigt, ob auch gegen Bandwürmer behandelt wurde.
• Abschnitt C: „Einzeltier“ (Daten zum Einzeltier)
zu 16) Der Name des Pferdes wurde aufgenommen, da die Besitzer die Ergebnisse der Kotuntersuchungen mitgeteilt bekamen und nur so die Befunde den jeweiligen Pferden zuordnen konnten.
• Abschnitt D: „Kotprobe“ (Daten zu der jeweiligen Kotprobe)
zu 24) Bei der Methode „Standard“ handelt es sich um die in Punkt 3.1.4 beschriebene Untersuchungstechnik.
Name: Anschrift:
A - Allgemeines
1.
Anzahl der Pferde:_______2.
davon Gastpferde:_______3.
Verschiedene Gruppen nein ja (Auflistung extra)4.
Anzahl der Weiden: ______ (Nummern und Skizze extra)5.
Größe je Weide (ca.):_____6.
Liegt die Weide brach? nein ja (ca. _____ Monat(e))7.
Wird Kot abgesammelt? nein ja (ca. _____ pro Woche)8.
Werden andere Tiereauf den Weiden gehalten? nein ja, gleichzeitig ____________
ja, Wechsel mit ___________
9.
Probleme mit Endoparasiten? nein ja ___________________________
B - Gruppe
10a.
Auslauf Sommer: Weide Paddock Führmaschine10b.
Auslauf Winter: Weide Paddock Führmaschine11a.
Weidegang täglich Sommer: stundenweise tagsübertagsüber und nachts kein Weidegang
11b.
Weidegang täglich Winter: stundenweise tagsüberauf Weide Nr.___ tagsüber und nachts kein Weidegang
12.
Misten: täglich Matte13.
Entwurmung: nein ja, bei Bedarf ja, regelmäßig alle ___ Monate ein Präparat mehrere (Rotation)14.
Medikament: Banminth® Ivomec-P® Panacur-P®Rintal® ________ ________
15.
letzte Entwurmung am ______ mit __________Abb. 2: Teil A und Teil B des Fragebogens, der im Rahmen der Kotuntersuchungen mit den Besitzern zusammen ausgefüllt wurde - Erklärungen zu den einzelnen Punkten sind im Text unter Punkt 3.1.3. „Erfassung der Daten“ zu finden
C - Einzeltier
16.
Name: 17. Alter: 18. Rasse (Zuchtgebiet):19.
Geschlecht Stute Hengst Wallach20.
Klinische Symptome: keineVerdauungsstörungen Durchfall Kolik verminderte Freßlust Blässe Abmagerung Leistungsminderung Kümmern ____________
D - Kotprobe
21.
Kotprobe Nr.:22.
Makroskopische Abweichungen: nein ja ________________22.
Entnahme: rektal Uhrzeit:Boden frisch > 1 Std.
23.
Zeitabstand Entnahme - Untersuchung: ___________24.
Methode: Standard ______________25.
Ergebnis der Kotuntersuchung:Positiv
Abb. 3: Teil C und Teil D des Fragebogens, der im Rahmen der Kotuntersuchungen mit den Besitzern zusammen ausgefüllt wurde - Erklärungen zu den einzelnen Punkten sind im Text unter Punkt 3.1.3. „Erfassung der Daten“ zu finden
3.1.4. Durchführung der Kotuntersuchung
Die Untersuchung der Kotproben erfolgte möglichst bald nach der Entnahme, bis zur Untersuchung wurden die Proben kühl gelagert. In Anlehnung an die Methode von ECKERT (1972) wurden jeweils etwa 20 g Kot (kleine Mengen aus verschiedenen Stellen der Probe) mittels eines Wasserstrahls durch ein Sieb in ein Becherglas (200 ml) gespritzt. Nach einstündiger Sedimentation wurde der Überstand aus dem Becherglas abgegossen, etwa 2 ml des Sedimentes in ein Reagenzglas überführt und dieses Reagenzglas bis etwa 1 cm unter den oberen Rand mit Zink-Sulfat-Lösung (ZnSO4) aufgefüllt. Nach 5-minütiger Zentrifugation (Labofuge 6.000, Fa. Heraeus) bei 1.500 U/min wurde die oberste Flüssigkeitsschicht mittels Öse auf einen Objektträger verbracht, ein Deckgläschen aufgelegt und bei mittlerer Vergrößerung (10 x 6,3) durchgemustert. Es erfolgte eine semiquantitative Erfassung aller in der Kotprobe vorkommenden Eier, d. h. es erfolgte eine Einteilung in „vereinzelt“ (ein Ei pro Deckglas), „geringgradig“ (2 bis 5 Eier pro Deckglas), „mittelgradig“ (6 - 10 Eier pro Deckglas), „hochgradig“ (11- 20 Eier pro Deckglas) und „massenhaft“ (über 20 Eier pro Deckglas).
Vor Beginn der Prävalenzstudie wurde nochmals überprüft, ob mit der hier verwendeten Kotuntersuchungsmethode Bandwurm-Eier im Kot entdeckt werden können. Hierfür wurde Kot von einem definitiv Bandwurm-negativen Pferd mit unterschiedlich hohen Eizahlen bestückt. Die Eier wurden gewonnen, indem 10 A. perfoliata-Exemplare vorsichtig gemörsert und mit Leitungswasser durch ein Sieb gegeben wurden. Von dieser Suspension wurde nach 45 min. Sedimentation soviel abgegossen, dass noch etwa 50 ml übrig blieben. Die übriggebliebene Suspension wurde per Magnetrührer ständig in Bewegung gehalten und die Konzentration der vorhandenen Eier bestimmt. Unterschiedliche Mengen dieser Suspension wurden dann auf definierte Mengen Kot gegeben und mit dem oben erläuterten Verfahren untersucht.
Auf diese Art mit Eiern versetzter Kot wurde zusätzlich mit einer anderen Technik untersucht. Ziel hierbei war die Ermittlung einer Wiederfindungsrate. Hierfür wurden jeweils 4 g Kot abgewogen, mit einer definierten Anzahl von Eiern versetzt und in ein Sieb gegeben.
Durch dieses Sieb wurde der Kot mittel gesättigter Zinksulfatlösung (ZnSO4) in einen Meßzylinder gewaschen und 60 ml dieser Flüssigkeit in eine Schliffstopfenflasche gegeben.
Nach gründlichem Durchmischen wurden jeweils beide Kammern einer McMaster- Zählkammer gefüllt. Die Zahl A. perfoliata - Eier beider Kammern multipliziert mit dem Faktor 50 ergab die festgestellten Eier pro Gramm Kot (EpG). Diese Zahl wurde in bezug gesetzt zu der Menge an Eiern, die pro Gramm Kot zugesetzt worden waren und so die Wiederfindungsrate ermittelt.
3.2. Mehrmalige Kotuntersuchung mit gleichzeitiger Entnahme von Blutproben bei ausgewählten Betrieben über einen bestimmten Zeitraum
3.2.1. Auswahl der Betriebe
Bei einigen Betrieben, in denen bei den Prävalenzuntersuchungen ein oder mehrere Bandwurm-positive Kotproben zu finden waren, wurden etwa ab Mai 1999 mehrere Folgeuntersuchungen in etwa 4-wöchigen Abständen durchgeführt. Dabei wurde von möglichst jedem Pferd eine Kot- und eine Blutprobe entnommen. Etwaige Behandlungen mit Anthelminthika wurden schriftlich festgehalten, wobei Zeitpunkt, Medikament und Durchführung dem Besitzer bzw. dem behandelnden Tierarzt oblag. Ferner wurden noch in zwei Betrieben Kot- und Blutproben gesammelt, in denen keine Bandwurm-positiven Kotproben während der Prävalenzstudie vorkamen. Außerdem bestand durch die Diagnostik des Institutes sowie persönlich der Kontakt zu Pferdebesitzern, die -zum Teil nur einmalig - Kot- und Blutproben entnehmen ließen.
3.2.2. Probenauswahl und Entnahme 3.2.2.1. Kotproben
Bei der Auswahl und der Entnahme der Kotproben wurde so verfahren wie in Punkt 3.1.2 für die Prävalenzstudie beschrieben. Die Entnahme erfolgte in einigen Betrieben auch durch die Besitzer bzw. durch einen beauftragten Tierarzt.
3.2.2.1. Blutproben
Es wurde von möglichst allen Pferden, von denen eine Kotprobe vorhanden war, auch eine Blutprobe entnommen. Das Blut wurde aus der Vena jugularis externa mittels Venoject®- Blutentnahmesystem (Fa. Terumo) mit silikonbeschichteten Vakuumröhrchen entnommen. In einigen Fällen erfolgte die Entnahme ebenfalls durch einen beauftragten Tierarzt.
3.2.3. Erfassung der Betriebsdaten
Bei neu hinzugekommenen Betrieben wurden die Daten so erfaßt, wie in Punkt 3.1.3.
(Fragebogen) beschrieben. Veränderungen in der Weidebesetzung wie etwa neue Pferde, Geburten etc. wurden von den Besitzern mitgeteilt. Auch die Gabe von Anthelminthika sowie auffällige klinische Symptome sollten notiert werden.
3.2.4. Durchführung der Kotuntersuchung
Die Kotuntersuchung wurde stets so durchgeführt wie in Punkt 3.1.4. beschrieben.
3.2.5. Konservierung der Blutproben
Nach der Entnahme wurden die Blutproben über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Dann wurden sie 15 min. bei 3000 U / min. zentrifugiert (Omnifuge 2.ORS, Fa.
Heraeus) und anschließend das Serum in 1,5 ml Aliquots bei -20 °C gelagert.
3.3. Serologische Untersuchung 3.3.1. Referenzseren
Die positiven Kontrollseren stammten von Pferden unterschiedlichen Alters, deren parallel zur Blutentnahme untersuchte Kotprobe Bandwurm-Eier aufwies. Zum Teil handelt es sich um Mischinfektionen, vorrangig mit Magen-Darm-Strongyliden, bei einigen Proben wurden nur Bandwurm-Eier nachgewiesen.
Das negative Kontrollserum stammte von einem 2 Jahre alten Ponyhengst aus dem hiesigen Institut. Dieser Ponyhengst wurde bis auf eine künstliche Monoinfektion mit kleinen Strongyliden parasitenfrei aufgezogen.
Weitere negative Kontrollseren zur Überprüfung der serologischen Untersuchungen kamen von Schlachtpferden, bei deren makroskopischer Untersuchung des Darmtraktes keine Bandwürmer festgestellt werden konnten.
3.3.2. Herstellung der Antigene 3.3.2.1. Skolex-Antigen
Die Präparation des Skolex-Antigens erfolgte in Anlehnung nach der Methode von HÖGLUND et al. (1995). A. perfoliata-Exemplare, welche aus dem Darm eines Schlachtpferdes stammten, wurden mehrere Male mit PBS in Petrischalen gewaschen. Unter der Lupe wurden sie von anhaftenden Schleimhautresten befreit und anschließend der Skolex abgetrennt. 100 Skolices wurden dann in mehreren Schritten unter Zugabe von insgesamt 5 ml PBS in einem Glashomogenisator im Eiswasserbad homogenisiert. Anschließend wurde die Flüssigkeit durch erneute Zugabe von 5 ml PBS aus dem Glashomogenisator in ein Becherglas gespült und durch Kanülen verschiedenen Durchmessers mehrmals in eine sterile 20 ml Spritze gezogen (10 x durch eine Kanüle mit 1,2 mm Durchmesser, 10 x durch eine Kanüle mit 0,9 mm Durchmesser und 5 x durch eine Kanüle mit 0,6 mm Durchmesser).
Danach wurden 1 ml dieser Suspension in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß (1,5 ml) abgefüllt und als Charge A bezeichnet. Der Rest der Flüssigkeit wurde in ein 10 ml Falcon-Röhrchen umgefüllt und 10 x 15 s im Eiswasserbad mit Ultraschall behandelt. Davon wurden 4 ml abgenommen und als Charge B bezeichnet. Zu den restlichen 5 ml wurde ein Protease- Inhibitor (Complete®-Mini, Fa. Boehringer) gegeben. Alle 3 Chargen wurden dann 20 min bei 13.000 U / min zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und von jeder Charge der Proteingehalt nach der Methode von Bradford (1976) (siehe Punkt 3.3.3. Proteinbestimmung) bestimmt. Die Konservierung erfolgte in 100 µl-Aliquots bei -80 °C. Es standen also 3 verschiedene Chargen des Skolex-Antigen zur Verfügung:
A) ohne Ultraschall, ohne Protease-Inhibitor B) mit Ultraschall, ohne Protease-Inhibitor C) mit Ultraschall, mit Protease-Inhibitor
