Indirekte Nachweisverfahren (Serologie)

2.2.1. Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Der Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) entwickelte sich aus dem Radioimmunoassay (RIA) und wurde zuerst von ENGVALL und PERLMANN für die quantitative Bestimmung von Antigenen (1971) bzw. von Antikörpern (1972) beschrieben.

Das Prinzip des ELISA beruht darauf, daß sich Antigen-Antikörper-Reaktionen durch Markierung einer dieser beiden Komponenten mit einem Enzym sichtbar machen lassen, indem die Enzymaktivität durch eine Farbreaktion gemessen wird. Auf diese Weise können Antigene und Antikörper qualitativ und quantitativ bestimmt werden. Laut RUITENBERG und VAN KNAPEN (1977) ist der ELISA eine geeignete diagnostische Methode, um parasitäre Infektionen (Helminthen und Protozoen) zu erkennen.

Beim Nachweis von Antikörpern durch den ELISA wird zunächst das Antigen an die Festphase (in der Regel Mikrotiterplatten) gebunden. Anschließend werden die freigebliebenen Bindungsstellen „abgesättigt“, d. h. durch nicht-reagierende Proteine besetzt.

Es folgt die Zugabe des zu testenden Serums, vorhandene Antikörper können sich nun an die Antigene anlagern. Wiederum an die gebundenen Antikörper lagert sich das Konjugat an, hierbei handelt es sich um ein enzymmarkiertes Antiserum gegen die Spezies-Antikörper.

Anschließend wird ein Substrat zugegeben, welches durch das gebundene Enzym in ein farbiges Reaktionsprodukt umgesetzt wird. Das Ergebnis kann photometrisch bestimmt werden. Um vergleichbare Farbintensitäten zu erhalten, kann die Reaktion nach einer bestimmten Zeit abgestoppt werden. Bei der hier beschriebenen Methode wird zwischen den einzelnen Reaktionsschritten gründlich gewaschen, um die unspezifischen Reaktionen so gering wie möglich zu halten.

Es gibt Veröffentlichungen, die sich mit der Optimierung dieses Testsystems beschäftigen (BULLOCK und WALLS 1977, McLAREN et al. 1981, GRÄNZER 1989, VENKATESAN und WAKELIN 1993, BOGNER und FORSCHNER 1994). Es wird jedoch darauf hingewiesen, daß die einzelnen Parameter für verschiedene Antikörper und Antigene immer wieder neu zu optimieren sind.

ELISA’s für Zestodeninfektionen beim Hund

Der ELISA wurde für verschiedene Zestodeninfektionen angepasst. GASSER et al. (1988) verglichen Protoscolex-Antigen und Onkosphären-Antigen bei mit Echinococcus granulosus infizierten Hunden. Sie fanden heraus, daß das Protoscolex-Antigen für den Nachweis einer Infektion besser geeignet ist und daß keine Korrelation zwischen den ELISA-Werten und der Infektionsintensität bestand. In einer weiteren Studie verglichen GASSER et al. (1992) das Protoscolex-Antigen mit einem E/S-Antigen (=exkretorisch/sekretorisch, Antigen wird aus den Ausscheidungen des Parasiten gewonnen) und stellten auch hier keine Korrelation zwischen ELISA-Ergebnis und Infektionsintensität fest. Das E/S-Antigen zeigte eine etwas höhere Sensitivität (80,8 %) als das Protoscolex-Antigen (75,6 %), beide können aber für epidemiologische Studien verwendet werden. Auch JENKINS und RICKARD (1986) gelang

ein ELISA mit E/S- und mit Protoscolex-Antigen, wohingegen bei der Verwendung von Onkosphären-Antigen keine Antikörper-Reaktion zu verzeichnen war. Für den Nachweis einer Taenia ovis - Infektion bei Hunden verwendeten HEATH et al. (1985) T. ovis E/S-Antigen und fanden ebenfalls heraus, daß das Ergebnis nicht mit der Infektionsintensität der Hunde korrelierte.

ELISA’s für Infektionen mit A. perfoliata

HÖGLUND et al. (1995) verwendeten somatisches A. perfoliata Antigen und untersuchten damit die Sera von 426 geschlachteten Pferden. Für die Herstellung des Antigens wurden die Skolices der Würmer verwendet (Skolex-Antigen). Diese wurden homogenisiert und zentrifugiert. Bei der Untersuchung der Seren konnte allgemein ein Zusammenhang zwischen dem Antikörper-Gehalt und der Infektionsintensität festgestellt werden, jedoch gab es individuelle Variationen bei Pferden mit gleicher Wurmbürde. Eine Kreuzreaktion mit Strongyliden wurde nicht festgestellt. Es konnte kein Effekt des Alters oder der Entwurmung auf den Antikörper-Gehalt nachgewiesen werden, allerdings wurden signifikante saisonabhängige Unterschiede mit einem kleinen Gipfel im Dezember/Januar und einem größeren Gipfel im Juni festgestellt. Die Autoren bemerken, daß dieser Test nur für epidemiologische Studien und nicht für die Diagnose am Einzeltier geeignet ist, denn es konnte nicht zwischen bereits stattgefundener und neuerworbener Infektion unterschieden werden. Das Skolex-Antigen verwendeten HÖGLUND et al. (1998) für eine epidemiologische Studie an 21 Fohlen, welche über ein Jahr lang auf einer kontaminierten Weide gehalten wurden. In regelmäßigen Abständen wurden das Serum der Fohlen mittels ELISA untersucht, gleichzeitig wurden Kotuntersuchungen durchgeführt. Es konnte ein Ansteigen der Antikörper-Spiegel im Oktober - zwei Monate vor dem Auftreten der ersten Bandwurmeier im Kot - beobachtet werden.

PROUDMAN und TREES (1996a) stellten sowohl ein somatisches Antigen aus ganzen Würmern („Whole Worm Extract“) als auch ein Antigen aus den Ausscheidungsprodukten von A. perfoliata (exkretorisch/sekretorisch = E/S-Antigen) her. Für das somatische Antigen wurden Skolices und nichtgravide Proglottiden homogenisiert, zentrifugiert und filtriert.

Für die Herstellung des E/S-Antigens wurden Bandwürmer aus frisch geschlachteten Würmern gewaschen und fünf Stunden in PBS bei 38°C inkubiert. Die Flüssigkeit wurde abgegossen und ebenfalls filtriert. Im Vergleich dieser beiden Antigene im ELISA ergab das E/S-Antigen höhere Unterschiede zwischen negativen und positiven Seren. Der E/S-ELISA wurde opimiert und an Pferdeseren getestet, bei denen der Bandwurm-Status durch Sektion bekannt war. Es wurde eine Sensitivität von 68 % und eine Spezifität von 95 % ermittelt.

Sowohl das von HÖGLUND et al. (1995) verwendete Skolex-Antigen als auch das von PROUDMAN und TREES (1996a) verwendete E/S-Antigen zeigten eine geringe Sensitivität und beim Einzeltier wenig Korrelation zur Infektionsintensität. In einer folgenden Studie beschreiben PROUDMAN und TREES (1996b) ein Verfahren zur Aufreinigung des E/S-Antigens. Im Immunoblot (siehe Punkt 2.2.5.) zeigte das E/S-Antigen bei 12 und 13 kDa eine Doppelbande, welche nicht im somatischen Antigen vorhanden war. Dieses Protein (12/13 kDa Antigen) wurde extrahiert, zeigte jedoch wie das ursprüngliche E/S-Antigen keine Korrelation zum Parasitenstatus. In einem weiteren Reinigungsschritt wurde in Ratten polyklonales IgG gegen das 12/13 kDa Antigen hergestellt. Per Affinitätschromatographie wurde dann durch das kovalent an die Säulen gebundene Anti 12/13 kDa IgG das gereinigte 12/13 kDa Antigen isoliert. Mittels dieses gereinigten 12/13 kDa Antigens und der spezifischen Bestimmung eines Subtypen des IgG aus dem Pferdeserum, dem IgG(T), gelang es, eine Korrelation zwischen der Höhe der Antikörperantwort und der Infektionsintensität zu finden.

Dieses gereinigte 12/13 kDa Antigen wurde in einer weiteren Studie von PROUDMAN et al.

(1997) verwendet, um einen Zusammenhang zwischen dem Alter der Pferde und der Infektionsintensität zu finden. Von Bedeutung war die Tatsache, daß die Höhe des IgG Subtypen IgG(T) dreiphasisch verläuft: Es gibt einen Gipfel in der Altersgruppe von 6 Monaten bis 2 Jahren, dann ein niedriger gelegenes Plateau und einen erneuten Anstieg ab dem Alter von 15 Jahren. Die Autoren vermuten einen Grund für das Plateau in der Tatsache, dass viele Pferde im Alter von 3 bis 15 Jahre vorwiegend im Stall gehalten werden, wohingegen jüngere und ältere Pferde mehr Weidegang und somit mehr Infektionsmöglichkeiten hätten. Andere in dieser Studie untersuchte IgG Subtypen (IgG(a), IgG(b), IgG(c)) zeigten zwar nicht das deutliche dreiphasige Bild des IgG(T), jedoch stiegen auch sie bei älteren Pferden an.

2.2.2. Western Blot

Für den Western Blot wird das Antigen zuerst mit Hilfe der Elektrophorese (meist SDS-PAGE = Sodium-Dodecylsulphat-Polyacrylamidgelelektrophorese) nach der Größe der vorhandenen Proteine aufgetrennt. Diese Auftrennung kann dann durch Färbung (z..B.

Coomassie Brilliant Blue R 250) sichtbar gemacht werden oder durch den Immunoblot auf eine Membran (z. B. Nitrocellulose) übertragen, mit Antikörpern inkubiert und nach Zugabe von Konjugat und Substrat eine Antigen-Antikörper-Bindung sichtbar gemacht werden (BURNETTE 1981, GERSHONI und PALADE 1983).

HÖGLUND et al. (1995) fanden in dem von Ihnen hergestellten Skolex-Antigen (Antigenpräraration: siehe Punkt 2.2.1.) 14 verschiedene Proteinbanden, wobei die deutlichsten Banden in der Molekulargewichtsgröße von 31 bis 45 kDa und von 66 bis 200 kDa lagen. Bei PROUDMAN und TREES (1996a) lagen die Proteinbanden des somatischen Antigens zwischen 26 und 205 kDa, einige davon waren auch bei dem verwendeten E/S-Antigen zu finden (45, 36, 34 und 26 kDa). Proteine von der Größe 12 und 13 kDa kamen nur bei dem E/S-Antigen vor.

Im Western Blot beobachteten HÖGLUND et al. (1995) im allgemeinen eine sehr heterogene Bandenverteilung, die stärkste Reaktion mit Bandwurm-positiven Seren lag bei Proteinen der Größenordnung von etwa 66 kDa. PROUDMAN und EDWARDS (1996a) verwendeten lediglich das E/S-Antigen und fanden eine Reaktion von Bandwurm-positiven Seren bei den oben erwähnten Proteinbanden von 12 und 13 kDa, in diesem Bereich war keine Reaktion bei den Bandwurm-negativen Seren zu verzeichnen.