Serologische Untersuchung

Die positiven Kontrollseren stammten von Pferden unterschiedlichen Alters, deren parallel zur Blutentnahme untersuchte Kotprobe Bandwurm-Eier aufwies. Zum Teil handelt es sich um Mischinfektionen, vorrangig mit Magen-Darm-Strongyliden, bei einigen Proben wurden nur Bandwurm-Eier nachgewiesen.

Das negative Kontrollserum stammte von einem 2 Jahre alten Ponyhengst aus dem hiesigen Institut. Dieser Ponyhengst wurde bis auf eine künstliche Monoinfektion mit kleinen Strongyliden parasitenfrei aufgezogen.

Weitere negative Kontrollseren zur Überprüfung der serologischen Untersuchungen kamen von Schlachtpferden, bei deren makroskopischer Untersuchung des Darmtraktes keine Bandwürmer festgestellt werden konnten.

3.3.2. Herstellung der Antigene 3.3.2.1. Skolex-Antigen

Die Präparation des Skolex-Antigens erfolgte in Anlehnung nach der Methode von HÖGLUND et al. (1995). A. perfoliata-Exemplare, welche aus dem Darm eines Schlachtpferdes stammten, wurden mehrere Male mit PBS in Petrischalen gewaschen. Unter der Lupe wurden sie von anhaftenden Schleimhautresten befreit und anschließend der Skolex abgetrennt. 100 Skolices wurden dann in mehreren Schritten unter Zugabe von insgesamt 5 ml PBS in einem Glashomogenisator im Eiswasserbad homogenisiert. Anschließend wurde die Flüssigkeit durch erneute Zugabe von 5 ml PBS aus dem Glashomogenisator in ein Becherglas gespült und durch Kanülen verschiedenen Durchmessers mehrmals in eine sterile 20 ml Spritze gezogen (10 x durch eine Kanüle mit 1,2 mm Durchmesser, 10 x durch eine Kanüle mit 0,9 mm Durchmesser und 5 x durch eine Kanüle mit 0,6 mm Durchmesser).

Danach wurden 1 ml dieser Suspension in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß (1,5 ml) abgefüllt und als Charge A bezeichnet. Der Rest der Flüssigkeit wurde in ein 10 ml Falcon-Röhrchen umgefüllt und 10 x 15 s im Eiswasserbad mit Ultraschall behandelt. Davon wurden 4 ml abgenommen und als Charge B bezeichnet. Zu den restlichen 5 ml wurde ein Protease-Inhibitor (Complete^®-Mini, Fa. Boehringer) gegeben. Alle 3 Chargen wurden dann 20 min bei 13.000 U / min zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und von jeder Charge der Proteingehalt nach der Methode von Bradford (1976) (siehe Punkt 3.3.3. Proteinbestimmung) bestimmt. Die Konservierung erfolgte in 100 µl-Aliquots bei -80 °C. Es standen also 3 verschiedene Chargen des Skolex-Antigen zur Verfügung:

A) ohne Ultraschall, ohne Protease-Inhibitor B) mit Ultraschall, ohne Protease-Inhibitor C) mit Ultraschall, mit Protease-Inhibitor

3.3.2.2. E/S-Antigen

Die Herstellung des E/S-Antigens erfolgte nach der Methode von PROUDMAN und TREES (1996a). Die verwendeten A. perfoliata - Exemplare stammten ebenfalls von einem Schlachtpferd. Das terminale Ileum und ein Teil des Zäkums mit anhaftenden Bandwürmern wurden abgetrennt und sofort zum Labor transportiert. Hier wurden die Bandwürmer von ihrer Anheftungsstelle gelöst und in einer 38 °C warmen Natrium-Glukose-Antibiotika-Lösung über 10 min. gewaschen, wobei die Waschlösung mehrmals gewechselt wurde.

Anschließend wurden 60 Bandwürmer in 100 ml 38 °C warme PBS (pH 7,2) überführt und bei 37 °C über 5 Stunden inkubiert. Danach wurde die Flüssigkeit 20 min lang bei 3.500 U / min. zentrifugiert (Omnifuge 2.OHRS, Fa. Heraeus) und der Überstand durch einen 0,2 µm-Sterilfilter gegeben. Nachdem der Proteingehalt in der filtrierten E/S-Antigen-Suspension bestimmt worden war (siehe Punkt 3.3.3. Proteinbestimmung) erfolgte eine Konzentration der Proteine. Dafür wurde die Suspension mehrmals bei 3.000 U / min. in Zentrifugal-Filtrationseinheiten (Centrisart-C30^® - Durchlässigkeit kleiner als 10 kDa - Fa. Sartorius, Göttingen) zentrifugiert (Omnifuge 2.OHRS, Fa. Heraeus). Anschließend wurde erneut der Proteingehalt bestimmt und das E/S-Antigen-Konzentrat in 100 µl Aliquots bei -80 °C eingefroren.

3.3.3. Proteinbestimmung

Die Proteinbestimmung der verschiedenen Antigen-Aufbereitungen wurde durchgeführt, um bei erneuter Herstellung des Antigens eine bessere Reproduzierbarkeit zu erreichen und um die einzelnen Antigenpräparationen besser miteinander vergleichen zu können. Die Proteinkonzentrationen wurden unter Verwendung des Bio-Rad Protein-Assay^® (Bio-Rad Laboratories GmbH, München) mit der Methode nach BRADFORD (1976) bestimmt. Das Prinzip beruht darauf, daß nach Bindung mit den Proteinen in Abhängigkeit von der Proteinkonzentration ein Farbumschlag des eingesetzten Indikatorfarbstoffes (Coomassie Brillant Blau G-250) erfolgt. Die Intensität des Farbumschlages von rot nach blau ist

photometrisch (595 nm) meßbar. Als Standards wurden unterschiedliche Verdünnungen von bovinem Serumalbumin (BSA, Fa. Sigma Nr. A-2153) mit bekanntem Proteingehalt mitgeführt.

3.3.4. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Die Durchführung des ELISA erfolgte in Anlehnung an die Vorgehensweise von PROUDMAN und TREES (1996a) und HÖGLUND et al. (1995). Verschiedene Mikrotiter-Platten, Absättigungsmedien sowie Konzentrationen der Reagenzien wurden in Vorversuchen getestet (siehe Punkt 4.4.1. Vorversuche zur Optimierung des ELISA). Das letztendlich zur Anwendung gekommene Verfahren zeigte die größtmöglichen Extinktionsunterschiede zwischen positiven und negativen Seren bei gleichzeitig möglichst geringer Hintergrundreaktion.

Als Festphase dienten 96-Loch-Mikrotiterplatten mit mittlerer Bindungskapazität (F-Form, Fa. Greiner, Nr. 655001). Das Antigen wurde in Karbonat/Bikarbonatpuffer (pH 9,6) verdünnt, die optimale Konzentration lag bei dem verwendeten Skolex-Antigen bei 0,6 µg pro Vertiefung. Jeweils 100 µl des 1:500 verdünnten Antigens wurde in die Vertiefungen aufgetragen und über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach einmaligem 5 minütigem Waschen mit destilliertem Wasser (200 µl / Vertiefung) erfolgte eine Absättigung der unspezifischen Bindungsstellen mit 5 %-iger BSA-PBS-Lösung (60 min bei 37 °C). Anschließend wurden die Platten 3 x 5 min. mit PBS-0,05%Tween^®20 (200 µl / Vertiefung) gewaschen und jeweils nach dem Ausschütten letzte Flüssigkeitsreste durch Ausklopfen der mit der Oberseite nach unten gekehrten Platte auf ein sauberes Tuch entfernt. Anschließend wurden die 1:100 in PBS-0,05%Tween^®20 + 2 % BSA verdünnten Seren im Doppelansatz (jeweils 100 µl pro Vertiefung) aufgetragen und 60 min. bei 37 °C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen und Ausklopfen folgte die Inkubation mit Peroxidase-konjugiertem Ziege-anti-Pferd IgG (Fa.

Dianova, 1:1000 verdünnt in PBS-0,05%Tween^®20 + 2 % BSA). Nach erneutem Waschen und Ausklopfen der Platten wurde in alle Vertiefungen 50 µl Substrat (o-Phenylenediamin (OPD)) in einem Phosphat-Zitrat-Puffer, siehe Anhang) einpipettiert und bei Raumtemperatur

im Dunkeln stehengelassen. Nach 10 min. wurde die Reaktion mittels 2-molarer Schwefelsäure (50 µl / Vertiefung) abgestoppt. Die Auswertung der Ergebnisse erfolgte mittels eines Photometers (Titertek^® II Multiskan, Fa. Flow Lab.) bei 492 nm mit automatischem Ausdruck der Ergebnisse. Während der einzelnen Inkubationsschritte wurden die Platten jeweils durch eine luftdichte Folie verschlossen.

Um unspezifische Reaktionen festzustellen, liefen bei den Vorversuchen unterschiedliche Kontrollen mit:

1. Antigenkontrolle: ohne Serum 2. Serumkontrolle: ohne Antigen

3. Konjugatkontrolle: ohne Antigen, ohne Serum

4. Substratkontrolle: ohne Antigen, ohne Serum, ohne Konjugat

Da die Extinktionen bei der Konjugat- und der Substratkontrolle immer sehr gering blieben, wurden nur Antigen- und Serumkontrolle in den Hauptversuchen durchgeführt.

3.3.5. Sodium-Dodecylsulphat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)

Skolex- und E/S-Antigen wurden in 10 bzw. 12 oder 15 %iger SDS-PAGE (LAEMMLI 1970) entsprechend ihrem Molekulargewicht aufgetrennt und anschließend in einer Coomassie-Brillantblau-Färbung dargestellt. Es wurde eine vertikale Elektrophorese mit dem Modell Mini-Protean II^® der Fa. Bio-Rad durchgeführt. Die genaue Zusammensetzung der Trenn- und Sammelgele ist im Anhang aufgelistet. Das Trenngel wurde nach Zugabe von Ammoniumpersulfat und TEMED® (siehe Anhang) zwischen die Glasplatten gegossen und mit ca. 1 ml Aqua bidest. überschichtet. Die Polymerisation betrug 60 min. bei Raumtemperatur, bei sehr hohen Raumtemperaturen wurde der Gelständer in eine mit Eis befüllte Styroporschachtel verbracht. Vor dem Gießen des Sammelgels wurde das Aqua bidest. abgenommen, der Probenkamm mit Zinken eingesetzt und das Sammelgel so auf das Trenngel gegossen, daß die Taschen für die Proben ausgespart blieben. Die Polymerisation

betrug 30 min. bei Raumtemperatur. Das Antigen wurde je nach Präparation und nach Größe bzw. Dicke des Geles in PBS verdünnt und 1:2 mit einem Probenpuffer nach LÄMMLI (1970) (siehe Anhang) versetzt. Parallel wurden die verwendeten Molekulargewichtsmarker (Nr. HEW407, 14,3 - 200 Molecular Weight Range, Fa. Life Technologies) ebenfalls im Verhältnis 1:2 mit dem Probenpuffer vermischt. Marker und zu testendes Antigen wurden 5 min. bei 100 °C gekocht. Der Probenkamm wurde entfernt und Gelreste in den Taschen mittels einer Einmalkanüle und fusselfreiem Tuch (Kimwipes^®Lite, Fa. Kimberly-Clark) beseitigt. Dann wurden zwei Gelkassetten in einen Vertikalelektrophoreseständer gespannt und in die durch die beiden Gelkassetten entstandene Kammer Elektrophoreselaufpuffer (Zusammensetzung siehe Anhang) bis knapp über die Kante der kleineren Glasplatte gefüllt.

Marker und jeweils eine bestimmte Menge des zu testenden Antigens wurden in die Vertiefungen des Sammelgels eingefüllt. Die Gelkassetten wurden in den mit Elektrophoreselaufpuffer gefüllten Puffertank gestellt und durch einen Deckel an den Stromkreis angeschlossen. Als Stromquelle diente das Modell „2303 Multidrive XL“ der Fa.

Pharmacia LKB. Der Vorlauf betrug 20 min. bei 70 Volt, der Lauf durch das Trenngel 60 bis 90 min. bei 120 Volt. Die im Gel aufgetrennten Proteine wurden mit Coomassie-Brillantblau-Färbung sichtbar gemacht.

Coomassie Brillantblau-Färbung:

Die Gele wurden 30 min. in Coomassie-Brillantblau-Färbelösung (Zusammensetzung siehe Anhang) gefärbt, anschließend in farbstofffreier Entfärbelösung über Nacht entfärbt, wobei die Lösung auf dem Wipptisch (Rocky®, Fa. Fröbel Labortechnik) ständig in Bewegung gehalten und die Entfärbelösung mehrmals gewechselt wurde.

3.3.6. Immunoblot

Die in der SDS-PAGE aufgetrennten Proteine wurden auf eine Nitrocellulose-Membran Hybond®-C extra, Fa. Amersham Life Science) transferiert. Die Membran wurde 10 min. vor dem Transfer in Blotpuffer (Zusammensetzung siehe Anhang) getränkt. Die unterste Lage der Elektroblotkammer bildeten drei in Blotpuffer getränkte Filterpapiere (14 x 16 cm, Nr. TE76-1416, Fa. Hoefer), darauf befanden sich die auf die Größe des Gels geschnittenen

Nitrocellulose-Membranen. Auf die Membran wurde luftblasenfrei das Polyacrylamidgel gelegt und darauf wiederum 2 in Blotpuffer getränkte Filterpapiere. Der Blot erfolgte bei einer Stromstärke von 100 mA über 45 min. Nach dem Transfer wurde das Gel gekennzeichnet und die einzelnen Markerbanden markiert. Dann erfolgte die Absättigung der Membran mittels 1%iger BSA-PBS-Lösung über eine Stunde in einer Plastikschale abgesättigt. Nach dem anschließenden Waschgang mit PBS-0,05 %Tween^®20 (3 x 10 min.) wurde die Membran den Laufspuren der Proteine entsprechend in einzelne Streifen geschnitten, gekennzeichnet und in eine Schale verbracht, in der die einzelnen Streifen getrennt voneinander liegen konnten (Fa. Hoefer Scientific Instruments). Dort erfolgte die Inkubation mit den in PBS-0,05 %Tween^®20 + 1 (bzw. 2 oder 5)% BSA verdünnten Seren.

Der Verdünnungsgrad der Seren war abhängig von der Art des verwendeten Antigens und betrug meist 1:100 oder 1:50. Anschließend wurden die Streifen 3 x 5 min. mit PBS-0,05

%Tween^®20 gewaschen und mit 1:1000 in PBS-0,05%Tween^®20 + 1 (bzw. 2 oder 5)% BSA verdünntem Konjugat (mit alkalischer Phosphatase konjugiertes Anti-Horse IgG, Fa.

Dianova) über eine Stunde inkubiert. Dann wurden die Streifen 2 x 10 min. mit PBS-0,05%Tween^®20 und anschließend 1 x 10 min. mit PBS gewaschen. Nach der Zugabe des Substrates (NBT + BCIP in AP-Puffer, Zusammensetzung siehe Anhang) erfolgte die Entwicklung so lange, bis deutlich erkennbare Banden zu sehen waren. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von Aqua bidest. abgestoppt und die einzelnen Streifen zum Trocknen zwischen zwei Löschpapierseiten gelegt. Sämtliche Inkubations- und Waschschritte erfolgten bei Raumtemperatur in ständiger Bewegung auf einem Wipptisch (Rocky®, Fa. Fröbel).

3.3.7. Serologische Untersuchung durch ein externes Labor

91 Seren wurden zur Untersuchung an das Institut für Veterinary Parasitology der Liverpool School of Tropical Medicine and Faculty of Veterinary Science in Liverpool, England geschickt. In diesem Labor wird die serologische Untersuchung von Pferdeseren auf Befall mit A. perfoliata angeboten, wobei als Antigen ein speziell aufgereinigtes 12 / 13 kDa-Antigen verwendet wird (siehe Punkt 2.2.1).