Serologie

Ein häufiges und auch hier vorhandenes Problem bei ELISA’s ist die große Variabilität zwischen den einzelnen Mikrotiterplatten, und zwar zwischen den einzelnen Chargen sowie auch innerhalb einer Charge (VENKATESAN und WAKELIN 1993, siehe auch Ergebnisteil Abb. 45). Zusätzlich beobachtete ich noch eine Variabilität, die durch den Einsatz einer neuen Charge an BSA (zum Blocken der freien Bindungsstellen) entstand. Laut VENKATESAN und WAKELIN (1993) müssen diese Variabilitäten dadurch kontrolliert werden, daß auf jeder Platte geeignete Standards mitgeführt werden. Bei den von mir durchgeführten Untersuchungen wurde auf jeder Platte ein negatives sowie zwei positive Seren (ein jüngeres und ein älteres Tier) mitgeführt. Die positiven Seren sind sogenannte „koproskopisch positive Seren“, d. h. Seren von Pferden, bei denen die gleichzeitig zur Blutentnahme untersuchte Kotprobe Bandwurm-positiv war. Der Unterschied zwischen positiven und negativen Seren auf den verschiedenen Platten war jedoch unterschiedlich hoch (Ergebnisteil Abb. 45).

Außerdem hatte das hier verwendete negative Referenzserum schon eine sehr hohe optische Dichte. Weiterhin wurden zum Teil auch bei der Serumkontrolle (d. h. ohne die Beschichtung mit Antigen) gewisse optische Dichten erreicht. Insgesamt läßt alles auf einen hohen Anteil von unspezifischen Bindungen in diesem ELISA-System schließen. Die unspezifischen Bindungen bestehen entweder an offenen Stellen der Mikrotiterplatte oder an dem Antigen selbst („Kreuzreaktionen“). Um Anlagerung an offene Stellen zu verhindern, wurde in diesem ELISA mit einer relativ hohen BSA-Konzentration geblockt (5%), weiterhin wurden Serum und Konjugat in PBS verdünnt, dem BSA zugesetzt war. Außerdem wurde dieser Verdünnungslösung sowie der Waschlösung das Detergens Tween^®20 zugesetzt. Diese Maßnahmen sowie die Auswahl einer geeigneten Mikrotiterplatte führten zwar zu einer Verringerung des OD-Wertes der Serumkontrolle sowie zu einem höheren Unterschied zwischen positiven und negativen Seren, jedoch war die optische Dichte des Negativserums immer noch relativ hoch und bei der Verwendung von Platten und Reagenzien einer anderen Charge waren wieder eine Erhöhung der Hintergrundreaktion sowie geringere Unterschiede zwischen den Referenzseren zu beobachten. Weiterhin ist zu bemerken, daß bei der Untersuchung der beiden aus dem Schlachthof gewonnenen negativen Referenzseren (d. h.

auf eine Infektion mit Bandwürmern ergab) immer optische Dichten festgestellt wurden, die an der Grenze bzw. deutlich im positiven Bereich lagen. Höchstwahrscheinlich haben auch andere als die gesuchten Antikörper mit dem hier verwendeten Antigen reagiert. Es ist damit zu vermuten, daß die hergestellte Antigenpräparation (Skolex-Antigen) für die Durchführung des ELISA nicht geeignet war. Bestätigt wird diese Vermutung durch die Tatsache, daß auch im Immunoblot negative und positive Seren nicht deutlich zu unterscheiden waren.

Durch einen ebenfalls mit Skolex-Antigen durchgeführten ELISA von HÖGLUND et al.

(1995) soll man A. perfoliata Infektionen in Herden erkennen können. Die Autoren weisen jedoch darauf hin, daß bei Pferden mit gleicher Infektionsintensität sehr große Variationen in der ELISA-Antwort zu beobachten waren. Sie gehen davon aus, daß dieser Test nicht zwischen älteren und aktuellen Infektionen unterscheiden kann. Laut einer persönlichen Mitteilung wird der von Höglund et al (1995) entwickelte Test nicht für die Routinediagnostik eingesetzt.

Der ELISA, mit dem ein Teil der hier gesammelten Proben untersucht wurde (von PROUDMAN und TREES (1996b) entwickelt, siehe Kapitel 4.4.3.), wird nicht mit dem von mir verwendeten Skolex-Antigen durchgeführt. Bei dem Test kommt das 12/13 kDa-Antigen (eine speziell aufgereinigte Komponente des E/S-Antigens, siehe Kapitel 2.2.1.) zur Anwendung. Nachgewiesen wird ein bestimmter Antikörper-Subtyp, das IgG(T). Dieses Verfahren hat den Vorteil, das eine Korrelation zur Infektionsintensität besteht, d. h. je mehr Würmer ein Pferd hat, desto höhere Werte zeigt der ELISA an. Dementsprechend sind die Ergebnisse in drei verschiedene Stufen aufgeteilt, es gibt die Stufe “keine Infektion oder Infektion mit geringgradiger Infektionsintensität“, „Infektion mit mittelgradiger Infektionsintensität“ oder „Infektion mit hochgradiger Infektionsintensität“. Für die Einzeltierdiagnostik ist eine solche Ergebnispalette sinnvoll, da - wie bereits erwähnt - die Wahrscheinlichkeit einer klinischen Erkrankung mit der ansteigenden Zahl von Würmern zunimmt. Allerdings kann man nicht mit Bestimmtheit sagen, daß ein Pferd negativ ist, selbst mit einem OD-Wert von 0,0 befindet es sich in dem Bereich „Keine Infektion oder Infektion mit geringer Infektionsintensität“. Für epidemiologische Studien und für die Untersuchung ganzer Betriebe auf ein vorhandenes Bandwurmrisiko ist der ELISA von PROUDMAN und

TREES (1996b) im positiven Fall sicher von Nutzen und wird auch dafür verwendet (PROUDMAN und HOLDSTOCK 1998). Man muß jedoch bedenken, daß für diesen Test keine Spezifität angegeben wurde und dadurch die Möglichkeit einer falsch-positiven Aussage schlecht einzuschätzen ist. Es kann somit nicht mit Sicherheit gesagt werden, ob die Tiere des Bestandes frei von Bandwürmern sind, da ja immer auch eine Infektion mit geringer Infektionsintensität bestehen kann.

Es wurden Negativ- und Positivseren (siehe Kapitel 3.3.1.) sowie Verlaufsseren von ausgewählten Pferden aus vier verschiedenen Ställen an das Institut in Liverpool geschickt.

Die Negativseren liegen alle im Bereich „keine Infektion oder Infektion mit geringer Infektionsintensität“. Von den 16 eingesandten Positivseren wurden 5 Seren (>30%) ebenfalls in die Sparte „keine Infektion oder Infektion mit geringer Infektionsintensität“ eingeordnet.

Das Problem einer Beurteilung auf Betriebsebene wird deutlich, wenn man z. B. die Ergebnisse der Verlaufsseren aus Stall I betrachtet (Abb. 47 in Kapitel 4.4.3.). Beide Pferde aus der Gruppe A sowie ein anderes Pferd aus der Gruppe B waren während der Untersuchungsperiode mehrmals koproskopisch Bandwurm-positiv. Hätte man zur Beurteilung des Betriebsstatus nur die Blutuntersuchung von Pferd Nr. 2 aus Gruppe A und Pferd Nr. 2 aus Gruppe B herangezogen, so hätten die Werte zu jedem Untersuchungszeitpunkt in dem Bereich „keine Infektion oder Infektion mit geringer Infektionsintensität“ gelegen. An diesem Beispiel kann man deutlich ersehen, daß im Vergleich zur Kotuntersuchung auch für die augenscheinlich sensitivere Methode der serologischen Untersuchung von PROUDMAN und EDWARDS (1996b) eine gewisse Menge an Stichproben notwendig ist, um zu korrekten Ergebnissen zu gelangen.

Bei den Verlaufsseren wurde ebenfalls eine eventuell stattgefundene Entwurmung mit Praziquantel berücksichtigt. In zwei der Ställe (Stall II und Stall III) erfolgte die Behandlung jeweils zu Beginn des Untersuchungszeitraumes. Die Antikörperspiegel scheinen nach der Behandlung mit Praziquantel auf ein für jedes Pferd individuelles Level herabzusinken und dort für eine gewisse Zeit (mind. 2 - 3 Monate) zu bleiben.