Probe Konzentration pro ml Probe in ng/ml
1 Eignung der erstellten Analysemethode (HPLC-MS/MS) für den Nachweis von Romifidin in Plasma und Urin
Romifidin wurde bislang in Plasma und Urin im Institut für Biochemie der Sporthochschule Köln gaschromatographisch mit nachfolgender Massenspektrometrie analysiert (SOP, Institut für Biochemie, Köln, Juni 2000). Die dafür verwendete basische Extraktion unterscheidet sich nur in einigen Teilen der Aufarbeitung von der oben aufgeführten Extraktion für die Messung über die HPLC. So variieren die Mengen an benötigter Matrix und an zugefügtem Puffer;
schließlich erfolgt die Aufnahme der eingeengten Etherphase in Methanol. Mit der bisher verwendeten Analysemethode war keine ausreichend empfindliche Methode vorhanden. Eine Schwierigkeit lag weiterhin in einer wenig prägnanten Ausbildung der Peaks im Chromatogramm, was eine mangelhafte Integration nach sich zog. Eine Quantifizierung des Wirkstoffes erfolgte nicht. Grund für die Einführung einer HPLC-Methode zur Analyse von Romifidin war somit das Interesse an der Erstellung einer empfindlicheren Analyse. Die Entscheidung für die HPLC war darin begründet, dass für polare Substanzen wie
beispielsweise Romifidin eine schärfere Darstellung der Peaks sowie eine empfindlichere Detektion erreicht werden sollte. Die bislang verwendete Methode, die auf bestehenden Routineverfahren des Instituts für Biochemie der Deutschen Sporthochschule Köln basierte, beruht auf der Erkenntnis, dass Ether für basische Verbindungen wie Romifidin in Pferdeplasma und -urin ein besonders gutes organisches Extraktionsmittel darstellt. Aber auch andere Verbindungen und Bestandteile von Plasma und Urin lassen sich in Ether lösen, die beispielsweise auch störende Auswirkungen auf eine Analyse von Romifidin haben können.
Mit der Einstellung des pH-Wertes im deutlich basischen Bereich (pH 14) wurde daher der Übergang von sauren und neutralen Verbindungen aus dem Urin in die Etherphase minimiert.
Die HPLC erwies sich letztlich als eine etwa um den Faktor 10 empfindlichere Methode gegenüber der bislang eingesetzten GC/MS.
Auch die in den eigenen Untersuchungen verwendete Methode zur Hydrolyse etwaiger an Urinbestandteile gebundener Romifidinmoleküle beruhte auf einem Routineverfahren des Institutes. Die Hydrolyse der Urinproben mit Glucuronidase von Escherichia coli, -Glucuronidase/Arylsulfatase von Helix pomatia sowie Cystein bewirkte keine Verbesserung der Extraktionsausbeute gegenüber der Aufarbeitung von Urinproben ohne Hydrolyse. Da der Literatur keine Angaben über das Ausmaß des Vorkommens von glucuronidiertem Romifidin zu entnehmen waren, wurden Urinproben von 5 Pferden repräsentativ einer enzymatischen Behandlung ( -Glucuronidase/Arylsulfatase von Helix pomatia) vor der eigentlichen Extraktionsbehandlung unterzogen. Da sich so keine Erhöhung der Extraktionsausbeute ergab, wie den Abbildungen 14 und 15 sowie der Tabelle 20 zu entnehmen ist, kann festgehalten werden, dass Romifidin im Urin nahezu vollständig ungebunden vorliegt und als nicht glucuronidierte Substanz frei ausgeschieden wird.
Die Bildung von Metaboliten des Romifidin, 4-Hydroxy Romifidin und 1-(2-Guanidino)-2-Bromo-6-Fluorobenzen (SARKAR et al., 1997; DUMASIA, 1999) und von STH 2337 und ESR 1235 wurde in der Literatur mehrfach beschrieben (INTERNER BERICHT BOEHRINGER INGELHEIM, 1991), so dass in der eigenen Studie auf eine weitere Untersuchung zur Metabolisierung verzichtet wurde. Für die Analytik kam somit lediglich Romifidin als Markersubstanz zum Einsatz. Zudem ist für die Berechnungen nach dem PK/PD-Modell von TOUTAIN und LASSOURD (2002) das Vorhandensein der
pharmakokinetischen Daten der Wirksubstanz Romifidin wichtig, während die Metaboliten nicht in die Berechnungen einbezogen werden.
Mit der ausgewählten Aufarbeitungsmethode beliefen sich die Wiederfindungsraten für Romifidin auf 60,3 % im Plasma und 80,0 % im Urin. Dennoch sind die Extraktionsausbeuten als ausreichend zu bezeichnen.
Die Eignung der Analysemethode für den Nachweis von Romifidin in Pferdeplasma und -urin wurde mittels Validierung überprüft. Dabei verdeutlicht die Selektivität, dass in den Chromatogrammen im Bereich der Retentionszeit des Analyten und des internen Standards keine Störpeaks zu bestimmen sind. Die Linearität wurde im Plasma in einem Konzentrationsbereich von 10 bis 250 ng/ml und von 10 bis 1000 ng/ml im Urin geprüft. Es konnte für jede Kalibrationskurve das Bestimmtheitsmaß der linearen Regression als R² > 0,99 erreicht werden. Die in der eigenen Studie ermittelte Nachweisgrenze für Romifidin im Plasma liegt mit 8 ng/ml relativ weit unterhalb der bislang geltenden Nachweisgrenze.
Eine Quantifizierungsgrenze im Plasma (10 ng/ml) konnte mit Hilfe der HPLC-Methode etabliert werden. Für die gaschromatographische Messung war bislang keine Quantifizierungsgrenze angegeben. Mit Hilfe der HPLC/MS/MS konnte für Urin eine Bestimmungsgrenze von 25 ng/ml und Nachweisgrenze von 20 ng/ml etabliert werden. In der Literatur sind hingegen keinerlei Angaben über Quantifizierungs- und Nachweisgrenze zu finden (vgl. SARKAR et al., 1996; DUMASIA, 1999).
Die Kriterien der Richtigkeit und Präzision wurden an drei Messtagen geprüft und bestätigt.
Die Abweichungen der ermittelten von den theoretischen Konzentrationen, ausgedrückt als relativer Fehler, blieben sowohl für die Richtigkeit als auch für die Präzision für die Matrices Plasma und Urin im Rahmen der zulässigen Abweichung von 15 % im oberen und 20 % im mittleren und niedrigen Konzentrationsbereich.
Für die Überprüfung der Stabilität von Romifidin in Plasma und Urin wurden mit Romifidin und internem Standard dotierte Proben unter den Bedingungen eingefroren (-20 °C), unter denen ebenfalls die Proben des Ausscheidungsversuches gelagert wurden. Da eine Aufarbeitung der Proben innerhalb von mindestens 30 Tagen erfolgte, wurde die Stabilität nur
für diesen Zeitraum geprüft. Es konnte gezeigt werden, dass Romifidin in Plasma und Urin über einen Zeitraum von 30 Tagen unter Tiefgefrierbedingungen (-20 °C) stabil ist.
Die entwickelte Methode für die Analyse von Romifidin in Plasma und Urin von Pferden beinhaltet somit eine einfache und schnelle Aufarbeitung zur Extraktion. Es konnte in der eigenen Studie gezeigt werden, dass eine aufwendige Extraktion nicht gleichzeitig eine bessere Extraktionsausbeute bewirkt. Zudem bietet eine einfache Aufarbeitung den Vorteil, dass die Prozedur in die Routineaufarbeitungen integriert werden kann. Mit einer basischen Extraktion und der Verwendung von tertiärem Butylmethylether konnten die höchsten Extraktionsausbeuten erreicht werden. Die von DUMASIA (1999) beschriebene Methode erscheint demgegenüber eher aufwendig und ist lediglich für die Aufarbeitung von Urin bestimmt. Zur Extraktion wird enzymatisch gespalten, die Probe über eine spezielle Cartridge geführt und für eine Messung über einen Gaschromatographen zusätzlich derivatisiert.
SARKAR et al. (1996) führen aus Urin eine saure Extraktion (pH 3) mit Salzsäure durch, die in dieser Studie im Rahmen der Analysenentwicklung gegenüber einer basischen Extraktion nicht als vorteilhaft gewertet werden konnte. Somit ergibt sich, dass sich die hier beschriebene Methode durch gute Extraktionseigenschaften, eine hohe Präzision und Reproduzierbarkeit sowie eine einfache Aufarbeitung auszeichnet. Zudem ist sie für die Matrices Plasma und Urin gleichermaßen anwendbar.