Probe Konzentration pro ml Probe in ng/ml
1 Validierung der Analysenmethode
Abbildungen 5 und 6 zeigen die Massenspektren von Romifidin und Clonidin, die nach der Ionisation und Aufreinigung im Massenspektrum zur Aufzeichnung gelangten. Unter den in Kapitel III.2.7 angegebenen Bedingungen der HPLC hat Romifidin eine Retentionszeit von 2,5 Minuten und wird im Massenspektrometer mit M+ m/z = 258 und einem Hauptfragment m/z = 178 registriert. Die in die Chromatogramme integrierten Strukturformeln zeigen Romifidin beziehungsweise Clonidin. Beispielhaft für eine Abspaltung aus dem Molekül ist jeweils die Abspaltung eines Fragmentes mit der Masse 43 mol dargestellt. Aus dem Romifidin entsteht dadurch ein Fragment mit der Masse 215 mol und vom Clonidin bleibt ein Fragment mit der Masse 187 mol.
60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260
Abb. 5: Massenspektrum und Strukturformel mit Fragmentbeispiel von Romifidin N
Clonidin zeigt unter den in Kapitel III.2.7 angegebenen Bedingungen eine Retentionszeit von 2,65 Minuten und wird im Massenspektrometer mit M+ m/z = 230 und einem Hauptfragment m/z = 160 aufgezeichnet.
Abb. 6: Massenspektrum und Strukturformel mit Fragmentbeispiel von Clonidin
Neben der beispielhaft aufgezeigten Spaltung der Moleküle entstehen mit der Hilfe von Stickstoffmolekülen in der Kollisionskammer noch viele weitere Fragmente. Diese sind für eine Substanz charakteristisch wie man beim Vergleich der Massenspektren von Romifidin und Clonidin bereits erahnen kann.
Cl
Die nachfolgende Abbildung 7 zeigt ein Chromatogramm von Romifidin sowie des internen Standards, das mit der bereits beschriebenen Aufarbeitungsmethode und mit der oben dargestellten HPLC/MS/MS analysiert und quantifiziert wurde.
Abb. 7: HPLC-MS/MS Chromatogramm einer Plasmaprobe, die mit 250 ng/ml Romifidin und 500ng/ml Clonidin dotiert wurde
1.1 Selektivität
Da in den Chromatogrammen von Romifidin in Plasma und Urin keine Störpeaks im Bereich der Retentionszeit des Analyten vorlagen, wurde die Selektivität der Methode für Plasma und Urin mittels Kalibrationskurvenmethode, wie sie unter dem Punkt Nachweis- und Quantifizierungsgrenze beschrieben ist, ermittelt. Die in Abbildung 8 bis 10 enthaltenen Chromatogramme sind Ausschnitte von Gesamtchromatogrammen (Zeitpunkt der Retention von Romifidin beziehungsweise Clonidin). Sie zeigen die Substanzen Romifidin und Clonidin im Plasma mit einer Konzentration von Romifidin an seiner Quantifizierungsgrenze, eine Leerplasmaprobe sowie eine Plasmaprobe der Ausscheidungsstudie.
Abb. 8: Plasmaprobe mit 10 ng/ml Romifidin (LOQ) und 500 ng/ml Clonidin sowie die jeweilige Retentionszeit
Abb. 9: Leerplasmaprobe aufgenommen zum Zeitpunkt der Retention von Romifidin und Clonidin
Abb. 10: Plasmaprobe (p1) von Pferd 1, die zwei Minuten nach Behandlung mit Romifidin gewonnen wurde
1.2 Linearität
Für die Kalibrationskurve wurde an allen drei Tagen für Plasma im Bereich von 10 bis 250 ng/ml und für Urin von 10 bis 1000 ng/ml visuell eine Linearität festgestellt und zur Analyse der Kalibrationspunkte eine lineare Regression gewählt. Die erhaltenen Quotienten der Flächen von Romifidin und Clonidin aus Plasma und Urin sind gegen die zu erwartenden Konzentrationen der Kalibration in einem Graphen aufgetragen worden (siehe Abbildungen 11 und 12). Die Kalibrationsgleichung wurde nach dem Prinzip der kleinsten Abweichungsquadrate aus den ermittelten Quotienten relativ zu den erwarteten Konzentrationen errechnet. Die Gleichung (y = mx + b) und der entsprechende Korrelationskoeffizient (R²) werden im Graphen angezeigt.
y = 0,0109x - 0,0045
Abb. 11: Kalibrationskurve für Romifidin im Plasma inklusive Geradengleichung und Korrelationskoeffizient
Abb. 12: Kalibrationskurve für Romifidin im Urin inklusive Geradengleichung und Korrelationskoeffizient
Das Bestimmtheitsmaß der linearen Regression erreicht in allen Kalibrationskurven einen Wert R2 > 0,99.
1.3 Nachweis- und Quantifizierungsgrenze
Für die in dieser Studie eingesetzte Analysemethode mittels HPLC/MS/MS unter den in III.3.3 aufgeführten Messbedingungen beträgt die mittels Kalibrationskurvenmethode berechnete Nachweisgrenze für Romifidin im Plasma 8 ng/ml und im Urin 20 ng/ml.
Die Quantifizierungsgrenze für Romifidin beträgt nach den in III.3.3 beschriebenen Anforderungen im Plasma 10 ng/ml und im Urin 25 ng/ml.
1.4 Richtigkeit
Tabelle 8 zeigt die im Plasma an den drei Messtagen ermittelte Richtigkeit als relativer Fehler (RE) in Prozent. Die Ergebnisse liegen alle unterhalb der höchstmöglichen Abweichung der ermittelten von der theoretischen Konzentration von 15 % im oberen und 20 % im mittleren und niedrigen Bereich der Kalibration.
Tab.8: Richtigkeit von Romifidin im Plasma
Konzentration
In Tabelle 9 sind die Abweichungen der ermittelten von der theoretischen Konzentration als relativer Fehler der Messungen für Urin aufgeführt. Für Tag 1 der Messung im Urin weicht die Richtigkeit der Konzentration von 10 ng/ml entscheidend von der vorgegebenen Höchstabweichung von 20 % ab.
Tab 9: Richtigkeit von Romifidin im Urin
Die nachfolgenden Tabellen 10 und 11 zeigen die berechneten Werte der Präzision für Plasma und Urin. Für die Interday Präzision von 10 ng/ml im Urin kann die vorgeschriebene Abweichungsgrenze von 20 % nicht eingehalten werden. Die Ergebnisse im Plasma und die Intraday Präzision für Urin überschreiten die vorgegebenen Grenzwerte (15 beziehungsweise 20 %) nicht.
Tab. 10: Intraday und Interday Präzision im Plasma
Konzentration in ng/ml Intraday Präzision in % Interday Präzision in %
10 9,7 3,8
25 8,9 7,6
100 6,6 3,0
250 3,7 2,7
Tab. 11: Intraday und Interday Präzision im Urin
Konzentration in ng/ml Intraday Präzision in % Interday Präzision in %
10 18,6 35,6
25 8,2 8,4
100 4,8 2,9
500 4,7 11,8
1.6 Stabilität
In den folgenden Tabellen 12 bis 15 sind unter den jeweiligen Konzentrationen für Plasma und Urin die Ergebnisse der ersten (Tag 0) und zweiten Messung (Tag 28) zur Überprüfung der Stabilität aufgeführt.
Tab. 12: Ergebnisse der ersten Plasmamessung (Tag 0) für die Stabilität von Romifidin
Konzentration in ng/ml
Anzahl der
Messungen Mittelwert Standardab-weichung [%]
Variations-koeffizient [%]
25 6 25 2,2 8,7
250 6 256 6,1 2,4
Tab. 13: Ergebnisse der ersten Urinmessung (Tag 0) für die Stabilität von Romifidin
Konzentration in ng/ml
Anzahl der
Messungen Mittelwert Standardab-weichung [%]
Variations-koeffizient [%]
50 6 49 3,0 6,1
500 6 500 17,2 3,4
Tab. 14: Ergebnisse der zweiten Plasmamessung (Tag 28) für die Stabilität von Romifidin
Konzentration in ng/ml
Anzahl der
Messungen Mittelwert Standardab-weichung [%]
Variations-koeffizient [%]
25 6 24 1,5 6,2
250 6 236 5,8 2,3
Tab. 15: Ergebnisse der zweiten Urinmessung (Tag 28) für die Stabilität von Romifidin
Konzentration in ng/ml
Anzahl der
Messungen Mittelwert Standardab-weichung [%]
Variations-koeffizient [%]
50 6 51 4,5 9,0
500 6 514 8,1 1,6
Anhand der Ergebnisse und unter Zuhilfenahme der unter III.3.6 aufgeführten Formeln konnten statistisch keine signifikanten Unterschiede zwischen den Messreihen gezeigt werden. Der Analyt gilt als stabil.
1.7 Wiederfindung
Die Ergebnisse der Prüfung der Wiederfindung von Romifidin in Plasma und Urin sind in der Tabelle 16 aufgeführt. Im Plasma wird Romifidin zu 60,3 % und im Urin zu 80,0 % wiedergefunden.
Tab. 16: Wiederfindung von Romifidin in Plasma und Urin