Aus der Abteilung
Frauenheilkunde und Geburtshilfe der Medizinischen Hochschule Hannover
Strahlensensibilitätsgenvarianten als potenzielle Ursache des Nijmegen Breakage Syndroms und
bei Patientinnen mit bilateralem Mammakarzinom
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Sandra Beußel aus Bremen
Hannover 2008
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover Präsident:
Betreuer der Arbeit:
Referent:
Korreferentin:
Tag der mündlichen Prüfung:
Promotionsausschussmitglieder:
18.12.2008
Prof. Dr. Michael Bremer Prof. Dr. Dorothea Gadzicki Prof. Dr. Hans Heinrich Gnter 18.12.2008
Prof. Dr. Dieter Bitter-Suermann Prof. Dr. Peter Hillemanns
PD Dr. Rainer Lck PD Dr. Heike Bantel
Meinen Eltern gewidmet
E i n l e i t u n g I Inhaltsverzeichnis
Kapitel Titel Seite
1. Einleitung 1
1.1. Einführung 1
1.2. Das hereditäre Mammakarzinom 3
1.3. Strahlensensibilitätssyndrome 4
1.3.1. Das Nijmegen Breakage Syndrom (NBS) 4
1.3.2. NBS im Vergleich mit anderen ausgewählten Strahlensensibilitätssyndromen
5
1.4. Wichtige DNA-Reparaturwege 9
1.4.1. Nichthomologer Endverknüpfungsweg (Non-Homologous-End-Joining = NHEJ)
9
1.4.1.1. Allgemeine Einführung zum NHEJ 9
1.4.1.2. D-NHEJ 10
1.4.1.3. B-NHEJ 11
1.4.1.4. V(D)J-Rekombination 12
1.4.2. Homologe Rekombination (HR) 14
1.4.3. Zeitliche Abfolge der Doppelstrangbruch-Reparatur 15
1.5. Ausgewählte DNA-Reparaturgene 18
1.5.1. DNA-Ligase IV 18
1.5.2. RINT1 20
1.5.3. KIAA-0170/NFBD1/MDC1 22
1.6. Zielsetzung 26
2. Material 27
2.1. Chemikalien 27
2.1.1. Allgemeine Chemikalien 27
2.1.2. Spezielle Chemikalien 29
2.1.2.1. Enzyme und biologische Substanzen 29
2.1.2.2. Antikörper 29
2.1.2.3. DNA- und Protein-Marker 29
2.1.2.4. Zellkulturmedien und –zubehör 30
2.1.2.5. Besondere Chemikalien 30
2.2. Material und Geräte 31
2.2.1. Filme 31
2.2.2. Geräte 31
2.2.3. Klein- und Verbrauchsmaterialien 33
2.3. Rezepte für Medien, Puffer und Lösungen 35
E i n l e i t u n g II 2.4. Zellkulturmedium für lymphoblastoide Zelllinien 35
3. Methoden 36
3.1. Zellkultur 36
3.1.1. Hintergrund 36
3.1.2. Vorgehensweise 36
3.1.2.1. Transformation der lymphoblastoiden Zell-Linien durch EBV 36 3.1.2.2. Kultivierung und Lagerung der Zell-Linien 36
3.1.2.3. Bestrahlung der Zell-Linien 37
3.1.2.4. Einfrieren von Zell-Linien 37
3.1.2.5. Auftauen von Zell-Linien 37
3.2. Extraktion von Nukleinsäuren 38
3.2.1. Extraktion von DNA 38
3.2.1.1. Extraktion von DNA aus Blut 38
3.2.1.1.1. Hintergrund 38
3.2.1.1.2. Vorgehensweise 38
3.2.1.1.2.1. Leukozytenisolierung 38
3.2.1.1.2.2. Proteinase-K Verdau 38
3.2.1.1.2.3. Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol Behandlung 38
3.2.1.1.2.4. Extraktion 38
3.2.1.1.3. Verwendete Lösungen und Puffer 39
3.2.1.2. Extraktion von genomischer DNA aus lymphoblastoiden Zell-Linien 39
3.2.1.2.1. Hintergrund 39
3.2.1.2.2. Vorgehensweise 40
3.2.1.2.2.1. Vorbereitung und Proteasebehandlung der Proben 40
3.2.1.2.2.2. Phenol/Chloroform-Behandlung 40
3.2.1.2.2.3. Extraktion 40
3.2.1.2.3 Verwendete Lösungen und Puffer 40
3.2.2. Extraktion von RNA 41
3.2.2.1. Hintergrund 41
3.2.2.2. Vorgehensweise 42
3.2.2.2.1. Vorbereitung und Waschen der Proben 42
3.2.2.2.2. Lyse und Extraktion 42
3.2.2.2.3. Verwendete Lösungen und Puffer 43
3.2.3. Photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 44
3.3. Polymerasekettenreaktion (PCR) 45
3.3.1. Hintergrund 45
3.3.1.1. Prinzipien der verwendeten Reagenzien 45
3.3.1.2. Prinzipien des Ablaufs der Methode 45
3.3.2. Vorgehensweise 46
3.3.2.1. Allgemeine Grundsätze 46
3.3.2.2. PCR-Ansätze 46
3.3.3. Verwendete Programme 47
3.3.4. Verwendete Ansätze 47
3.4. Reverse Transkription (RT) 50
E i n l e i t u n g III
3.4.1. Hintergrund 50
3.4.2. Vorgehensweise 50
3.4.2.1. Verwendete Enzyme und Lösungen 50
3.5. Elektrophoretische Trennung von Nukleinsäurefragmenten im Agarosegel
51
3.5.1. Hintergrund 51
3.5.2. Vorgehensweise 51
3.5.2.1. Verwendete Lösungen und Puffer 52
3.6. "Cut Prep" oder "Freeze and Squeeze" 53
3.6.1. Hintergrund 53
3.6.2. Vorgehensweise 53
3.7. Sequenzierung mit dem ABI PRISM™ 310 Genetic Analyzer 54
3.7.1. Hintergrund 54
3.7.2. Vorgehensweise 54
3.8. Restriktionsenzymatische Spaltung 56
3.8.1. Hintergrund 56
3.8.2. Vorgehensweise 56
3.8.3. Verwendete Enzyme und Puffer 58
3.9. Fragmentanalyse 59
3.9.1. Hintergrund 59
3.9.2. Vorgehensweise 59
3.10. Extraktion von Proteinen 61
3.10.1. Hintergrund 61
3.10.2. Vorgehensweise 61
3.10.3. Verwendete Lösungen und Puffer 61
3.10.4. Proteinbestimmung nach Bradford 62
3.11. Westernblot 63
3.11.1. Hintergrund 63
3.11.2. Vorgehensweise 64
3.11.2.1. Verwendete Lösungen und Puffer 65
4. Ergebnisse 68
4.1. NBS1-Expression und strahleninduzierte Phosphorylierungen in NBSLD- Zelllinien
68
4.2. Mutationsanalyse der Gene Ligase IV, RINT-1 und MDC1 in NBSLD- Proben
70
4.2.1. Ligase IV 70
4.2.2. RINT1 71
4.2.2.1. Aminosäuresubstitutionen 71
4.2.2.2. Mutationen im nicht-codierenden Bereich des RINT1 Gens 72
4.2.3. MDC1 73
E i n l e i t u n g IV
4.2.3.1. Mutationen 73
4.2.3.1.1. Primerdesign zur Mutationsanalyse genomischer DNA 73
4.2.3.1.2. Mutationen der Probe A1230 74
4.2.3.1.3 Weitere Aminosäuresubstitutionen 78
4.2.3.1.4. Synonyme Mutation im kodierenden Bereich 79 4.2.3.1.5. Sequenzänderungen im kodierenden Bereich des MDC1-Gens 80 4.2.3.1.6. Intronständige Mutationen des MDC1-Gens 81
4.2.3.2. Alternatives Spleißen der MDC1-mRNA 82
4.2.3.3. Westernblotanalysen des MDC1-Proteins 86
4.3. Assoziationsstudien ausgewählter Mutationen der Gene Ligase IV, RINT- 1 und MDC1 beim Mammakarzinom
89
4.3.1. Mutationsscreening 89
4.3.2. Klinische Auswertung 101
4.3.3. Bioinformatische Analysen der Aminosäuresubstitutionen 105
4.3.3.1. SIFT 105
4.3.3.2. PSORT, NetPhos, MotifScan 105
4.4. Zusammenfassung der Ergebnisse 108
5. Diskussion 110
5.1. NBS1-Expression und strahleninduzierte Phosphorylierungen in NBSLD- Zelllinien
110 5.2. Mutationsanalyse und Assoziationsstudien der Gene Ligase IV, RINT1
und MDC1 in NBSLD-Proben
112
5.2.1. Ligase IV 112
5.2.2. RINT1 112
5.2.3. MDC1 113
5.2.3.1. Mutationen 113
5.2.3.1.1. Primerdesign zur Mutationsanalyse genomischer DNA 113
5.2.3.1.2. Mutationen der Probe A1230 114
5.2.3.1.3. Aminosäuresubstitutionen 116
5.2.3.1.4. Sequenzänderungen im kodierenden Bereich des MDC1-Gens 117 5.2.3.2. Isoformen und Regulation des MDC1-Proteins 117 5.2.3.3. Westernblotanalysen des MDC1-Proteins 118
5.4. Zusammenfassung 120
6. Literaturverzeichnis 132
7. Abbildungsverzeichnis 135
8. Tabellenverzeichnis 138
9. Danksagung 141
10. Anhang 142
10.1. Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen 142
E i n l e i t u n g V
10.2. Lebenslauf 145
10.3. Wissenschaftliche Veröffentlichungen 147
10.4. Übersichtstabellen des Mutationsscreenings 148
10.5. Zusätzliche Abbildungen 150
10.6. Eidesstattliche Erklärung 154
E i n l e i t u n g 1 1. Einleitung
1.1. Einführung
Maligne Erkrankungen gehören mit den Herz-Kreislauferkrankungen zu den häufigsten Todesursachen. Noch im Jahre 1975 sind ca. 98 Patienten pro 100 000 Einwohner unter 65 Jahren an Herz-Kreislauferkrankungen, etwa 84 an Krebs gestorben. Im Jahre 2000 nun stellen die Krebserkrankungen mit ca. 77 Patienten pro 100 000 Einwohner in einem Alter unter 65 Jahren die führende Todesursache, wobei die Herz-Kreislauferkrankungen noch 48 ausmachen. Bei Patienten über 65 Jahre sind die Herz-Kreislauferkrankungen sowohl im Jahre 1975 mit ca. 2750, als auch im Jahre 2000 mit 1750 führend mit abnehmender Tendenz.
Die Todesursache Krebs nimmt in dieser Bevölkerungsgruppe aber zu; von ca. 1000 im Jahre 1975 auf 1200 im Jahre 2000 (Jemal et al. 2004).
Bei genauerer Betrachtung der verschiedenen malignen Tumoren ist zu erkennen, dass im Jahr 2004 die Zahl der erwarteten Neuerkrankungen bei Männern durch das Prostatakarzinom (33% der malignen Neuerkrankungen), gefolgt von Lungen- und Bronchialkarzinomen (13%), sowie Kolon- und Rektumkarzinomen (11%) angeführt wird. Bei Frauen ist das Mammakarzinom mit 32% der malignen Erkrankungen führend, ebenso gefolgt von Lungen- und Bronchialkarzinomen (12%), sowie mit 11% den Kolon- und Rektumkarzinomen (Jemal et al. 2004). Die Inzidenzraten haben sowohl bei den Männern, als auch bei den Frauen jeweils steigende Tendenz seit 1975 (Jemal et al. 2004).
Des weiteren bleibt zu erläutern, dass das Lungen- bzw. Bronchialkarzinom sowohl bei den Männern, als auch bei den Frauen im Jahre 2004 die häufigste Todesursache unter den malignen Erkrankungen darstellt (32% bei den Männern, 25% bei den Frauen). Bei den Männern folgen Prostatakarzinome (10%) und Kolon- und Rektumkarzinome (10%). Das Mammakarzinom stellt bei den Frauen mit 15% die zweithäufigste erwartete Todesursache unter den malignen Erkrankungen 2004 dar, gefolgt von Kolon- und Rektumkarzinomen mit 10% (Jemal et al. 2004).
Angesichts dieser Zahlen, die die Zunahme maligner Erkrankungen dokumentieren, insbesondere auch die Zunahme des Mammakarzinoms, wird die enorme Relevanz weiterer Forschungsarbeiten zu diesem Thema deutlich. Das Ziel solcher Forschungsarbeiten muss zunächst sein, die Risikofaktoren und Zusammenhänge besser zu verstehen und sodann therapeutisch gezielt, eventuell sogar präventiv tätig werden zu können.
Malignome sind genetisch bedingt. Letztlich sind sie das Resultat gehäuft aufgetretener Basenveränderungen, die durch verschiedene DNA-schädigende Substanzen oder Strahlung ausgelöst werden können. Diese Mutationen können entweder zu der Aktivierung von Protoonkogenen zu Onkogenen oder zur Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen führen.
Die Onkogene kodieren für wachstumsfördernde Proteine, die die Zelle zu übermäßiger Teilung befähigen und somit krebsfördernd sind. Die Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen hebt die regulierende Unterdrückung der ungebremsten Teilung der Zelle auf. Zu diesen Tumorsuppressorgenen gehören beispielsweise BRCA 1 und BRCA 2 (BRCA = breast cancer gene = Brustkrebsgen). Selbstverständlich spielen bei der Entstehung von Krebs neben den Mutationen eine Reihe weiterer Faktoren eine wichtige Rolle. Hierzu sind Umwelteinflüsse (Strahlung als DNA-schädigendes Agens, Ernährungs- und "Life-Style- Einflüsse" uvm.) und hormonelle Einflüsse zu rechnen. In Bezug auf die Exposition durch ionisierende Strahlung sorgen fortgeschrittenes Alter und die Dosis der Exposition bei der familiären Häufung von Brustkrebs unter Blutsverwandten 1. und 2. Grades für eine erhöhte Erkrankungswahrscheinlichkeit (Dörk et al. 2001; Goss et al. 1998; Nathanson et al. 2001;
Phillips et al. 1999; Rebbeck et al. 1999). Es wird vermutet, dass diese Risikofaktoren eventuell eine gemeinsame genetische Grundlage haben könnten (Dörk et al. 2002). Diese
E i n l e i t u n g 2 Vermutung wird dadurch unterstrichen, dass unter Brustkrebspatientinnen ein signifikant höherer Anteil mit geerbter erhöhter zellulärer Strahlensensibilität gefunden wurde (Dörk et al.2002). Dieser Zusammenhang ist in epidemiologischen Studien belegt worden: Es wurden die Daten von zwei verschiedenen Personengruppen ausgewertet. Die erste Gruppe bestand aus Frauen, die einer erhöhten Strahlenexposition ausgesetzt waren, beispielsweise durch Atombomben (Dörk et al. 2002; Tokunaga et al. 1987), aber auch durch diagnostische und therapeutische Strahlenanwendung in jungen Jahren bei Tuberkulose, Thymusaplasie oder Hodgkin-Lymphom (Dörk et al. 2002; Bhatia et al. 1996; Hildreth et al. 1989; Hrubec et al.
1989; Wolden et al. 1998), und später an Brustkrebs erkrankten (Dörk et al. 2002; Goss et al.
1998). Hierbei wurde ein bis zu 75fach erhöhtes Brustkrebsrisiko im Bestrahlungsfeld gefunden (Dörk et al. 2002; Bhatia et al. 1996). Die zweite Gruppe bestand aus Patientinnen mit seltenen Strahlensensibilitätssyndromen, insbesondere Ataxia teleangiectatica (AT) und Nijmegen Breakage Syndrom (NBS), und ihren blutsverwandten Familienmitgliedern. Die Untersuchungen ergaben, dass bei Genträgerinnen in den Familien eine erhöhte Krebsinzidenz, das Mammakarzinom eingeschlossen, besteht (Dörk et al. 2002; Seemanova 1990; Swift et al. 1991; Swift et al. 1987). In einer Studie konnten Roberts et al. durch Familienuntersuchungen einen kodominanten Erbgang für die erhöhte Strahlensensibilität nachweisen (2000). Nach der Charakterisierung der Strahlensensibilität als Erbmerkmal bleibt die Frage nach den zugrunde liegenden Genen zu klären (Dörk et al. 2002).
Es hat sich herausgestellt, dass viele Genprodukte, deren Mutationen das familiäre Mammakarzinom verursachen, funktionell gemeinsam in die Reparatur von Chromosomenbrüchen eingebunden sind (Dörk et al 2002).
Als Reaktion auf DNA-Schädigungen und zum Erhalt der genetischen Stabilität des Genoms haben Säugerzellen DNA-Reparaturwege entwickelt. Komplexe Signaltransduktionswege können zum Arrest des Zellzyklus und zur Aktivierung von bestimmten Zellreparaturproteinen führen, die die Integrität des geschädigten DNA-Abschnittes wieder herstellen sollen; ist dieses nicht möglich, kann der programmierte Zelltod (Apoptose) eingeleitet werden. Sollten nun diese Reparaturwege nicht mehr funktionieren und die Zellen DNA-Schäden nicht mehr ausmerzen können, resultiert eine erhöhte genetische Instabilität, die ebenfalls mit einem erhöhten Krebsrisiko einher geht. Allerdings ist gegenwärtig noch nicht geklärt, warum Störungen der Doppelstrangbruchreparatur gerade für das Brustdrüsenepithel besonders wichtig sind (Dörk et al. 2002).
E i n l e i t u n g 3 1.2. Das hereditäre Mammakarzinom
Das Mammakarzinom stellt derzeit den häufigsten Tumor der Frau (24% aller Malignome) dar, etwa jede neunte Frau (11%) erkrankt im Laufe ihres Lebens daran. Die Inzidenzkurve steigt vom 20.-40. Lebensjahr etwa kontinuierlich an und bildet dann einen Plateau-Wert. Ein zweiter Anstieg ist in der Postmenopause zu verzeichnen. Außerdem ist das Mammakarzinom die häufigste Todesursache bei Frauen zwischen 40 und 50 Jahren (Goerke 2003).
Bisher bekannte Risikofaktoren für das Mammakarzinom sind in der Familienanamnese, Einsetzen der Menarche und Menopause, Kinderzahl, Stillzeit, Gewicht, weiteren Krebserkrankungen oder Vorstufen eines Karzinoms und genetischen Faktoren zu finden. In der Tabelle 1-1 sind die genannten Risikofaktoren und das jeweils entsprechende relative Risiko aufgeführt.
Tabelle 1-1: Wichtige bekannte Risikofaktoren für das Mammakarzinom (Goerke et al. 2003)
Die Tabelle zeigt bekannte Risikofaktoren und die entsprechenden relativen Risiken bei Vorliegen eines Risikos, an Brustkrebs zu erkranken.
Durch diese Tabelle wird deutlich, dass insbesondere genetische Veränderungen das Brustkrebsrisiko maximal beeinflussen können, denn BRCA 1- und BRCA 2-Genmutationen gehören zu den stärksten bekannten Risikofaktoren. In jüngerer Zeit sind weitere Risikofaktoren erkannt und diskutiert worden, darunter die Dichte des Brustdrüsengewebes und eine vorausgegangene Strahlenexposition.
Obwohl in den meisten Brustkrebsfällen keine vererbliche genetische Prädisposition zugrunde liegt (Pharoah et al. 2002), sind nur 5-10% aller Fälle auf einzelne Mutationen zurückzuführen, die die Erkrankungswahrscheinlichkeit erheblich erhöhen (Thull et al. 2004).
Neben den Tumorsuppressorgenen BRCA1 und BRCA2, die zusammen über 30% der streng familiären Brustkrebserkrankungen ausmachen, und für die Frauen eine 50-90%
Erkrankungswahrscheinlichkeit bergen (Pfleiderer et al. 2002, Easton 1999), werden gegenwärtig auch genetische Dispositionen mit weitaus geringerer Penetranz im Hinblick auf mögliche Zusammenhänge mit dem Mammakarzinom genauer betrachtet. Insbesondere sind in den vergangenen Jahren die sogenannten Strahlensensibilitätssyndrome Ataxia teleangiectatica (AT) und das Nijmegen Breakage Syndrom (NBS) näher untersucht worden.
Diese Syndrome zeichnen sich durch erhöhte Strahlensensibilität bei therapeutischen Strahlendosen und durch ein erhöhtes Krebsrisiko (häufig Leukämien und Lymphome) aus (Shiloh 1997). Zeigt das klinische Bild doch einige Unterschiede zwischen diesen Syndromen, so sind aus zellbiologischer Sicht viele Übereinstimmungen beispielsweise in ihrer genetischen Instabilität, zu erkennen. Grundlegend hierfür ist die Tatsache, dass die Produkte der jeweiligen Gene miteinander in Zellzykuskontroll- wie auch in Zellreparaturprozessen interagieren. Diese Proteine sind wesentlich an den Proteinkomplexen der Signaltransduktionswege zur Erkennung und Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen beteiligt.
E i n l e i t u n g 4 1.3. Strahlensensibilitätssyndrome
1.3.1. Das Nijmegen Breakage Syndrom (NBS)
Das Nijmegen Breakage Syndrom (NBS) ist eine seltene, autosomal-rezessiv vererbbare Erkrankung, die zu einer Gruppe von erblichen Syndromen mit genetisch-chromosomaler Instabilität gehört. Hierzu zählen ebenso das Bloom Syndrom, die Fanconi-Anämie und die Ataxia teleangiectatica (AT) (Varon et al. 1998).
NBS ist gekennzeichnet durch Mikrozephalie, Wachstumsretardierung, chromosomale Instabilität und Immundefizienz, mentale Retardierung sowie gehäuft auftretende Infektionen und eine hohe Prädisposition für Malignome. Das Syndrom tritt häufiger bei der ost- sowie mitteleuropäischen Bevölkerung auf, insbesondere in Polen und Tschechien (van der Burgt et al. 1996; van den Bosch 2003).
Abbildung 1-1: Patienten mit NBS
(Digweed und Sperling 2004; van den Burgt et al.1996)
Die Abbildung zeigt Patienten mit den typischen äußeren Merkmalen des Nijmegen-Breakage-Syndromes.
NBS wurde im Jahre 1981 zum ersten Mal bei zwei Brüdern mit Mikrozephalie, mentaler Retardierung, Gesichtserythemen, Café-au-lait-Flecken, IgA-Immundefizienz und chromosomaler Instabilität beschrieben (Weemaes et al. 1981). Die chromosomalen Translokationen, Chromosomen 7 und 14 eingeschlossen, erinnerten an jene, die zuvor bei
E i n l e i t u n g 5 AT-Patienten beobachtet wurden (Shiloh 1997). Strahlensensibilität und strahlenresistente DNA-Synthese (RDS), die bei NBS-Zell-Linien dokumentiert werden, unterstreichen die Gemeinsamkeiten der beiden Syndrome AT und NBS hinsichtlich des zellulären Phänotyps (Shiloh 1997; Barbi et al. 1991; Taalman et al. 1989).
Im Jahr 1998 haben Varon et al. das NBS1-Gen isoliert und seine Mutationen bei NBS- Patienten charakterisiert. Das NBS1-Gen, auch NBN genannt, ist auf 8q21.13-q21.3 lokalisiert und setzt sich aus 16 Exons zusammen. Es kodiert für ein Protein (Nibrin) mit 754 Aminosäuren und einer Molekularen Masse von 95 kDa.
Weiterhin wurde festgestellt, dass das Primärtranskript alternativ gespleißt wird; es entstehen sowohl ein 4.4 kb, als auch ein 2.4 kb Transkript, welche beide in allen getesteten Geweben vorkommen. Das 4.4 kb-Transkript kommt in allen Geweben außer Testis häufiger vor als das 2.4-Transkript. Außerdem sind beide Transkripte in den Organen Milz, Testis und Ovarien etwa doppelt so stark exprimiert (Varon et al. 1998).
Das Protein Nibrin weist zwei Module auf, die häufig bei im Zellzyklus involvierten Proteinen auftreten. Zum einen beinhaltet das Protein eine „fork-head-assoziierte Domäne“ (FHA-Domäne) am aminoterminalen Ende, zum anderen eine „breast cancer carboxyterminale Domäne“ (BRCT). Im NBS1-Gen fanden Varon et al. eine Deletion von 5 Basenpaaren (657del5), die bei über 90% der NBS-Patienten nachgewiesen werden konnte.
Darüberhinaus gibt es Patienten mit Symptomen jedoch ohne nachgewiesene Mutation im NBS1-Gen, die Symptomen bei Patienten mit nachgewiesener Mutation im NBS1-Gen gleichen. Diese werden fortan als "NBSLD" (NBS like disease) Patienten geführt. Hier besteht Klärungsbedarf hinsichtlich der verantwortlichen Gene und Faktoren.
1.3.2. NBS im Vergleich mit anderen ausgewählten Strahlensensibilitätssyndromen Neben NBS existieren weitere Strahlensensibilitätssyndrome, die hinsichtlich der genetischen Instabilität große Gemeinsamkeiten aufweisen, sich jedoch bei Betrachtung der klinischen Symptomatik unterscheiden lassen. Zu nennen wären AT (Ataxia teleangiectatica) und ATLD (AT-like disorder). Mittlerweile konnten für die verschiedenen Syndrome einige der verantwortlichen Gene identifiziert werden. Da sowohl NBS als auch ATLD auf Mutationen in Genen des Mre11-Komplexes zurückzuführen sind erklärt dieses auch die Ähnlichkeit hinsichtlich der zellulären Symptome dieser beiden Syndrome (Stewart et al. 1999).
Das ATM-Gen (AT-mutated) ist das bei AT-Patienten mutierte Gen. Ataxia teleangiectatica ist gekennzeichnet durch zerebelläre Degeneration vor allem der Purkinje-Zellen, die zu ernsthaften neuromotorischen Dysfunktionen führt, sowie durch Immundefizienz, Thymus- und Keimdrüsen-Atrophie, erhöhtes Krebsrisiko (insbesondere für Lymphome und Leukämien) und Strahlensensibilität gegen ionisierende Strahlung (ionizing radiation = IR).
Zellen von Patienten mit AT weisen chromosomale Instabilität, Telomerverkürzung, RDS ("radioresistant replicative DNA synthesis" = strahlungsresistente DNA-Synthese) und Defekte bei allen Reaktionen auf IR und radiomimetisch wirkenden Chemikalien auf. Dieses verdeutlicht, dass der Fehler in der zentralen Kontrollfunktion dieser Signalwege liegt (Shiloh 2001; Lavin et al. 1997; Rotman et al. 1999, van den Bosch et al. 2003).
Des weiteren ist es gelungen, Mutationen des Mre11-Gens als verantwortlich für das ATLD- Syndrom zu identifizieren (Stewart et al. 1999). ATLD-Patienten entwickeln Symptome wie AT-Patienten, jedoch in späteren Stadien und bei langsamerem Fortschreiten (van den Bosch et al. 2003).
Es ist also ersichtlich, dass einige der bei den verschiedenen Syndromen auftretenden Symptome bei NBS-Patienten ebenfalls zu finden sind. Wichtiger Unterschied zwischen NBS-, ATLD- und AT-Patienten stellt allerdings die Tatsache dar, dass bei NBS keine Kleinhirn-Degenerationen und somit Ataxie festzustellen sind (van den Bosch et al. 2003).
E i n l e i t u n g 6 Tabelle 1-2: Vergleich von NBS mit AT und ATLD
(modifiziert nach Tauchi et al. 2002)
Die Tabelle stellt die Gemeinsamkeiten und Unterschiede der Syndrome NBS, AT und ATLD dar.
Klinische Symptome NBS AT ATLD
Mikrozephalus + - -
„Vogel-ähnliches“ Gesicht + - -
Wachstumsretardierung + - -
Ovarielle Dysfunktion + + ND
Zerebelläre Degeneration - + +
Teleangiektasie - + -
Erhöhtes α-FP - + +
Immundefizienz + + -
Erhöhtes Krebsrisiko + + ND
Zellulärer Phenotyp NBS AT ATLD
Strahlensensibilität + + +
Chromosomale Instabilität + + + Abnormaler S-Phasen-Kontrollpunkt + + +
Verminderte HR + + ND
Zugrunde liegende Gene NBS1 ATM MRE11
Das sogenannte LIG4-Syndrom ist durch Mutationen im DNA-Ligase IV-Gen gekennzeichnet. Die Symptome der Erkrankung äußern sich in Panzytopenie, Entwicklungs- und Wachstumsrückständen, sowie dysmorphen Gesichtsmerkmalen (O´Driscoll et al. 2004).
Hierzu liegen detaillierte Beschreibungen von vier Patienten mit verschiedenen Mutationen im LIG4-Gen vor. Der klinische Phänotyp der Patienten gleicht dem des NBS. Einige der Mutationen, die bei den vier Patienten identifiziert werden konnten, beeinträchtigen direkt die Ligase-Domäne, während andere die Interaktion zwischen DNA-Ligase IV und XRCC4 abschwächen. Die Zellen der Patienten reagieren mit einer ausgeprägten Strahlensensibilität (siehe weiter unten).
Tabelle 1-3: Klinische Merkmale von DNA-Ligase IV-defizienten Patienten (O´Driscoll et al. 2001)
Die folgende Übersichtstabelle zeigt die Merkmale von den vier DNA-Ligase IV-defizienten Patienten.
Merkmale Patient 411BR Patient 2303 Patient 2304 Patient 99P0149
Alter 9 46 48 9
Gesichts- merkmale
„Vogel-ähnlich“ Seckel-ähnlich Seckel-ähnlich Seckel-ähnlich Mikrozephalie Mikrozephalie bei der
Geburt; im Alter von 9 Jahren nicht mehr nachweisbar
Mikrozephalie Mikrozephalie Mikrozephalie
Entwicklungs- /Wachstums- störungen
Generelle
Entwicklungsstörungen
Wachstumsstörungen Wachstumsstörungen Primordialer Zwergwuchs, Entwicklungs- /mentale Störungen Immun-
defizienz
Panzytopenie (Anämie, Lymphozytopenie, Thrombozytopenie)
Panzytopenie, Myelodysplasie, Sinusitis
Chronisch- Respiratorische Infektionen
Panzytopenie
Haut-
erscheinungen
Zahlreiche plantar lokalisierte Warzen
Chronische
Hauterscheinungen,
Photosensibilität, Psoriasis
Multiple psoriasiforme,
E i n l e i t u n g 7
Photosensibilität, Teleangiektasien
erythroderme, squamöse Hautflecken
Malignome keine keine keine keine
Andere Erkrankungen
- Hypothyroidie, Typ
II-Diabetes, Hypogonadismus
Hypothyroidie, Amenorrhoe
Atypische Knochenreife LIG4-Genotyp 8C>T (A3V); 26C>T
(T9I); 833G>A (R278H)
alle Veränderungen homozygot
1738C/T (R/X580);
2440C/T (R/X814)
"compound"- heterozygot
1738C/T (R/X580);
2440C/T (R/X814)
"compound"- heterozygot
2440C/T (R/X814);
1406G/A (G/E469)
"compound"- heterozygot
Weiterführend wurde die Mre11/Rad50/Nibrin-Foci-Bildung bei den vier Patienten näher analysiert. Hierbei stellte sich heraus, dass es in den untersuchten Ligase IV-defizienten Fibroblasten zu einer normalen nukleären Lokalisation der Proteine Mre11 und Nibrin und einer normalen Induktion der Foci nach γ-Bestrahlung mit 12 Gy kommt.
Daraufhin wurden bei Patienten mit LIG4-Syndrom (411BR-Zellen) die Kontrollpunkte G1/S, S und G2/M näher betrachtet, wobei diese Zellen einen normalen DNA-Synthese-Arrest nach IR zeigen. Da sowohl bei AT-, als auch bei NBS-Zellen typische Defekte hierbei beobachtet werden können, bietet die radioresistente DNA-Synthese eine einfache Möglichkeit, das LIG4- von dem NBS1-Syndrom zu unterscheiden. Ferner konnte gezeigt werden, dass 411BR-Zellen ebenfalls einen normalen G1/S-Kontrollpunkt aufweisen. Darüber hinaus waren sowohl die Stabilisierung des p53, als auch die Induktion des p21 unauffällig. 411BR- Zellen zeigen gleich den Kontrollzellen einen verspäteten Eintritt in die Mitosephase nach Exposition der Zellen mit 2 Gy.
Chromosomenbrüche werden bei 411BR-Patienten signifikant häufiger als bei Kontrollen nach IR mit 1 Gy (p < 0,001), sowie bei Lymphozyten der 99P0149-Patienten nach Behandlung mit Bleomycin identifiziert. Dieses unterstreicht, dass Mutationen im LIG4 für eine ausgeprägte Strahlensensibilität sorgen. Bemerkenswert ist darüber hinaus die Tatsache, dass primäre periphere Blutlymphozyten des Patienten 2303 eine ca. zehnfache Erhöhung spontaner Chromosomenbrüche im Vergleich zu Kontrolllymphozyten aufweisen (O´Driscoll et al. 2001).
Desweiteren wurde bei Patient 411BR die Doppelstrangbruch-Verknüpfung näher untersucht.
Hierbei wurde ein ausgeprägter Abfall sowohl in der anfänglichen Verknüpfungsrate als auch im Ausmaß der Doppelstrangbruch-Verknüpfungen beobachtet. Dieser Effekt ist bei AT- und NBS-Zellen sehr viel geringer ausgeprägt (O´Driscoll et al. 2001; Foray et al. 1997; Girard et al. 2000)
Im Gegensatz zu NBS-Zellen zeigen die Zellen der Patienten mit LIG4-Syndrom also unauffällige Zellzyklus-Kontrolle, jedoch ist die DNA-Doppelstrangbruch-Verknüpfung abgeschwächt. Darüber hinaus konnte ein V(D)J-Rekominations-Phenotyp beobachtet werden, der einen geringen Abfall der Verknüpfungsfrequenz sowie eine erhöhte Ungenauigkeit an Signalknotenpunkten zeigt (O´Driscoll et al. 2001).
Darüber hinaus hat meine Kollegin Dr. Bendix-Waltes auf dem European Congress of Human Genetics ESHG im Mai 2005 in Prag in ihrem Vortrag eine Patientin mit Rad50-Defizienz vorgestellt. Die Symptome der mittlerweile 19-jährigen sind denen des Nijmegen-Breakage- Syndroms sehr ähnlich: Wachstumsretardierung, Mikrozephalie, milde geistige Retardierung, Hypo- und Hyperpigmentation, Weitsichtigkeit und chromosomale Instabilität. Aus diesem Grund diagnostizierten Barbi et al. sie zunächst als Patientin mit Nijmegen Breakage Syndrom (Barbi et al. 1991).
E i n l e i t u n g 8 Abbildung 1-2: Patientin mit Rad50-Defizienz
(Rad 50 study group 2005)
Hier wird eine Patientin mit typischen äußeren Merkmalen mit Rad50-Defizienz dargestellt.
Jedoch sind bei ihr weder rezidivierende Infektionen, noch eine Immundefizienz zu finden.
Außerdem konnten im NBS1-Gen keine Mutationen nachgewiesen werden. In den Western Blots lässt sich Nibrin als normal großes Protein allerdings im Vergleich zur Wildtyp- Kontrolle zu etwa 30-50% reduziert detektieren. Der typische "Shift" des phosphorylierten Nibrins nach Bestrahlung ist nur bei den Wiltyp-Kontrollen zu erkennen. Mre11 ließ sich im Western Blot als unauffällig detektieren. Im Gegensatz dazu ist die Immunreaktivität von Rad50 bei der Patientin auf ca. ein Zehntel im Vergleich zu Wildtyp-Kontrollen reduziert.
Sequenzierungen des RAD50-Genes zeigten eine Nonsense-Mutation in Exon 21 (R1099X), sowie eine Stopkodon-Substitution in Exon 25 (X1319Y). Diese Substitution führt zu einem Tyrosin anstelle des Stopkodons, welches die 5 kDa längere Isoform erklären könnte, die in den Western Blots zu sehen ist.
Weitere Untersuchungen wiesen in Rad50-defizienten Fibroblasten der Patientin zwar Nibrin und Mre11, aber keine Focibildung nach Bestrahlung auf. Außerdem fand sich Mre11 eher diffus und hauptsächlich zytoplasmatisch und nicht nukleär wie bei den Kontrollen. Rad50 konnte erwartungsgemäß nicht detektiert werden. Offenbar ist Rad50 für die Focibildung notwendig (Bendix-Waltes et al. 2005). Die Untersuchungen etablieren RAD50 als ein alternatives Gen für das Nijmegen Breakage Syndrom.
E i n l e i t u n g 9 1.4. Wichtige DNA-Reparaturwege
1.4.1. Nichthomologer Endverknüpfungsweg (Non-Homologous-End-Joining = NHEJ) 1.4.1.1. Allgemeine Einführung zum NHEJ
Zellen höherer Eukaryonten sind in der Lage, binnen weniger Minuten Doppelstrangbrüche in ihrem Genom mittels Nichthomologer Endverknüpfung (NHEJ) zu reparieren (Wang et al.
2003). Es handelt sich um eine einfache Ligation ohne Ersatz verloren gegangener Sequenzinformation. Auf diese Weise werden Doppelstrangbrüche hauptsächlich in der G1- und der frühen S-Phase bearbeitet (Dasika et al. 1999).
Dieser Vorgang bedarf der Proteine DNA-PKcs, Ku 70/80, DNA-Ligase IV, XRCC4 und einiger weiterer bisher noch nicht identifizierter Faktoren. Obwohl die chemische Hemmung oder Mutation einer dieser Faktoren den Reparaturvorgang verzögert, können die betroffenen Zellen doch die Mehrheit der Doppelstrangbrüche durch alternative Signalwege, die allerdings eine langsamere Kinetik (2-10 Stunden) aufweisen, entfernen. Dieser alternative langsamere Signalweg bleibt aktiv bei Mutanten, denen Gene der Rad52-Epistasis-Gruppe mangeln, er führt häufig zu inkorrekten Enden. Aufgrund dessen wurde angenommen, dass er eine alternative Form des NHEJ darstellt, der als Ausweichmöglichkeit ("backup" = B-NHEJ) zu dem DNA-PK-abhängigen Weg (D-NHEJ) dient. Dieses scheint eher der Fall zu sein, als der Homologe Rekombinationsweg als Alternative (Wang et al. 2003), jedoch ist auch der B- NHEJ-Weg potenziell rekombinogen (Abbildung 1-3).
Abbildung 1-3: D-NHEJ und B-NHEJ im Vergleich (Iliakis et al. 2004)
Die Abbildung zeigt die im Text erläuterten Schritte des D-NHEJ und B-NHEJ im Vergleich.
E i n l e i t u n g 10 1.4.1.2. D-NHEJ
D-NHEJ ist der bei weitem dominierende NHEJ-Reparaturweg in vivo, sofern die wichtigen Faktoren des Weges nicht durch genetische Mutationen oder chemische Hemmung beeinträchtigt sind. Dieses würde beinhalten, dass DNA-Enden, die entweder endogen oder durch exogene Agenzien (IR und andere DNA-schädigende Substanzen) verändert wurden, schnell durch die entsprechenden Faktoren des D-NHEJ gebunden und prozessiert werden.
Tatsächlich scheint dieses sowohl für Ku als auch für DNA-PKcs in in vitro-Studien der Fall zu sein (Wang et al. 2003; Doerty et al. 2001; Featherstone et al. 1999).
Der DNA-PK-abhängige Weg führt innerhalb kürzester Zeit zu einer Verknüpfung der DNA- Doppelstrangbrüche und stellt deshalb einen Reparaturweg mit schneller Kinetik dar.
Imfolgenden sollen die einzelnen Schritte des D-NHEJ genauer beschrieben werden (vgl.
dazu die Abbildung 1-4):
Schritt 1: Doppelstrangbrüche können im Genom durch DNA-Schädigung oder als Konsequenz der V(D)J-Rekombination (1.4.1.4.) hervorgerufen werden.
Schritt 2: Das Ku70/80-Heterodimer erkennt die entstandenen Doppelstrangbrüche und bindet an die DNA-Enden. Ku bindet so an die DNA, dass sich Ku80 distal und Ku70 proximal zum DNA-Doppelstrangbruch befindet (Lees-Miller et al. 2003;
Walker et al. 2001). Dieser Vorgang scheint für das Rekrutieren des Faktors DNA-PKcs an die DNA-Enden entscheidend zu sein (Lees-Miller et al. 2003;
Yoo et al. 1999).
Schritt 3: DNA-PKcs wird an den DNA-gebundenen Ku-Komplex rekrutiert, um die aktive DNA-PK-Proteinkinase zu bilden. Das Protein Artemis, welches mit DNA-PKcs interagiert, scheint bei diesem Prozess beteiligt zu sein und prozessiert die Bruchstellen.
Schritt 4: Die Verbindung wird vollzogen, wenn die zwei gebrochenen DNA-Enden durch zwei DNA-PKcs-Moleküle mit den jeweils gegenüberliegenden DNA- Enden zusammengebracht werden (Lees-Miller et al. 2003; DeFazio et al.
2002).
Schritt 5: Die weitere Prozessierung der DNA-Enden muss die Ligation vorbereiten, da IR-induzierte Doppelstrangbrüche häufiger 3´ und 5´ -Überhänge aufweisen, als stumpfe Enden, die angeglichen werden müssen. Ebenso müssen 3´- Phosphate oder 3´-Phosphoglykolgruppen verändert oder abgetrennt werden.
Außerdem verursachen IR in der Nähe der Doppelstrangbrüche Schäden an Basen- und/oder Riboseeinheiten, die so genannten gehäuften (="clustered") DNA-Schäden (Lees-Miller et al. 2003; Sutherland et al. 2002; Nikjoo et al.
2001), die ebenfalls repariert werden müssen. Diese Vorgänge scheinen Artemis, PNK (= Polynukleotidkinase; ein Enzym mit 5´-Kinase- und 3´ DNA- Phosphatase-Aktivität), WRN (= Werner-Syndrom-Protein; besitzt ATP- abhängige Helikase- und 3´-5´-Exonuklease-Aktivität), MRN (Mre11, Rad50, NBS1), hTDP1 (= humane Tyrosyl-DNA-Phosphodiesterase 1; hat die Fähigkeit sowohl Proteinanteile von Camptothecin-induzierten Topoisomerase- I-DNA-Strukturen, als auch 3´-Phosphoglykolgruppen von dsDNA zu entfernen) und eventuell weitere bislang nicht näher bekannte Faktoren zu involvieren.
Schritt 6: Der XRCC4/DNA-Ligase IV-Komplex wird nun zu dem DNA-PK-Komplex rekrutiert (Lees-Miller et al. 2003; Lee et al. 2003).
Schritt 7: Im folgenden muss nun die NHEJ-Protein-Maschinerie von der DNA entfernt werden, um die Religation der Doppelstrangbrüche zu gewährleisten.
Möglicherweise sorgen hierbei die Autophosphorylierung der DNA-PKcs
E i n l e i t u n g 11 und/oder die DNA-PK-abhängige Phosphorylierung von zusätzlichen Faktoren für die Dissoziation von DNA-PKcs und Ku.
Schritt 8: Letztlich ist der Doppelstrangbruch repariert, obwohl es häufig geschieht, dass es zu einem Verlust von Nukleotiden kommt, die sodann zu einer ungenauen Reparatur führen (Lees-Miller et al. 2003).
Abbildung 1-4: D-NHEJ (Lees-Miller et al. 2003)
Hier werden die Schritte 1 bis 8 des D-NHEJ, die im Text genauer beschrieben werden, bildlich dargestellt.
Neuere Forschungsarbeiten zeigten, dass XRCC4-like Faktor (XLF), auch als Cernunnos bekannt, am NHEJ beteiligt ist. Durch XLF wird XRCC4- und Ligase IV-vermittelt die Effektivität des NHEJs gesteigert. XLF gehört zu den frühen Faktoren bei der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen und wird mit Hilfe von Ku rekrutiert (Yano et al. 2007).
1.4.1.3. B-NHEJ
Dieser Alternativweg ("backup-pathway") zum D-NHEJ weist eine langsamere Kinetik auf und ist in der Lage, unabhängig von DNA-PK zu agieren. Allerdings konnte festgestellt werden, dass die Affinität von Ku zu DNA-Enden, insbesondere in Kooperation mit DNA- PKcs, den B-NHEJ unterdrückt. Dieses geschieht durch schnelles und effizientes Binden an DNA-Enden und das Steuern in die Richtung des D-NHEJ, um eine schnelle Verknüpfung zu gewährleisten. Ist das Protein Ku nicht vorhanden oder fehlerhaft, werden zwar ebenfalls Doppelstrangbrüche durch IR mit ähnlicher Effizienz induziert, diese werden jedoch nicht durch den D-NHEJ repariert. Unter diesen Bedingungen werden Doppelstrangbrüche durch noch nicht bekannte Komponenten des B-NHEJ, die auch außerhalb des Chromatinkontextes wirksam werden können, erkannt und verändert.
Obwohl der B-NHEJ in der Lage ist, die Mehrheit der IR-induzierten DNA- Doppelstrangbrüche zu bearbeiten, so geschieht dies mit einer weitaus langsameren Kinetik als beim D-NHEJ. Dieses scheint an einer ineffizienten Verbindung der DNA-Enden zu liegen. Aufgrund dessen bleiben die DNA-Enden für vergleichsweise lange Zeit offen und
E i n l e i t u n g 12 können somit teilweise degradiert werden, mit anderen DNA-Doppelstrangbrüchen durch Nähern der Schleifen zufällig interagieren oder durch die Replikation der geschädigten DNA zu einem späteren Zeitpunkt vertauscht werden. Außerdem können derartige Vertauschungen durch Interaktionen zwischen zwei IR-induzierten Brüchen zustande kommen, die einander durch Veränderungen der Chromatin-Konformation nach IR in unmittelbare Nähe gerückt sind. Ein Austausch zwischen Schleifen verschiedener Chromosomen kann entweder zu reziprokem Austausch (Abbildung 1-5), oder zu der Bildung von dizentrischen Chromosomen und einem azentrischen Fragment führen (Wang et al. 2003).
Abbildung 1-5: B-NHEJ (Wang et al. 2003)
Die Abbildung zeigt die im Text beschriebenen Schritte des B-NHEJ in schematischer Weise.
1.4.1.4. V(D)J-Rekombination
Die V(D)J-Rekombination stellt einen speziellen NHEJ-Prozess dar, in dem Segmente der Gene der Immunglobuline und des T-Zell-Rezeptors während der Entwicklung des Immunsystems bei Wirbeltieren rearrangiert werden. Hierbei spielen, ebenso wie bei dem NHEJ-Reparaturweg, DNA-PKcs, Ku, XRCC4 und DNA-Ligase IV die entscheidende Rolle.
V(D)J-Rekombination wird durch die gezielte Einführung von DNA-Einzelstrangbrüchen an spezifischen Stellen der DNA durch den RAG1/RAG2-Protein-Komplex ausgelöst. Dieser Einzelstrangbruch wird dann zu einem Doppelstrangbruch konvertiert, welcher während des Prozesses der V(D)J-Rekombination durch die NHEJ-Vorgänge repariert wird (Lees-Miller et al. 2003; Gellert 2002; Bassing et al. 2002).
Im folgenden sollen die einzelnen Schritte der V(D)J-Rekombination genauer beschrieben werden (vgl. dazu Abbildung 1-6):
E i n l e i t u n g 13 Schritt 1: Die V(D)J-Rekombination wird durch Lymphoid-spezifische Rekombinase- aktivierende Faktoren, RAG1 und RAG2 initiiert, die spezifische Regionen der T-Zell-Rezeptor-Gene und der Immunglobulin-Gene an zwei Rekombinationssignalsequenzen (RSS) spalten. Die Spaltungen an RSS- Stellen resultieren in der Bildung von DNA-kodierenden Enden, jedes dieser Enden weist eine terminale DNA-Haarnadelstruktur auf, und einem Signal- Verbindungsfragment mit stumpfen 5`-phosphorylierten DNA-Enden.
Schritt 2: Eine Endonuklease (sehr wahrscheinlich Artemis in einem Komplex mit DNA- PKcs) mit der Fähigkeit, DNA-Haarnadelstrukturen zu öffnen, öffnet die kodierenden Enden, um 3´-überhängende Enden zu schaffen (Lees-Miller et al.
2003; Mansilla-Soto et al. 2003).
Schritt 3: DNA-PKcs, Ku, DNA-Ligase IV und XRCC4 werden für die Komplettierung der kodierenden Enden benötigt. Zellen, deren DNA- PKcs Mutationen zu Alanin in der Autophosphorylierungsstelle aufweisen, können zwar noch DNA-Haarnadelstrukturen öffnen, jedoch haben diese die Fähigkeit verloren, korrekte kodierende Verknüpfungen zu prozessieren (Lees-Miler et al. 2003;
Ding et al. 2003). Für die Bildung von kompletten Signal-Verknüpfungen werden Ku, DNA-Ligase IV und in einigen Zelltypen auch DNA-PKcs benötigt (Lees-Miller et al. 2003).
Abbildung 1-6: V(D)J-Rekombination (Lees-Miller et al. 2003)
Die Abbildung zeigt ein Schema der V(D)J-Rekombination (genaueres im Text).
Obwohl Mutationen der DNA-PKcs bei Pferden und Hunden für SCID (=severe combined immunodeficiency = schweres kombiniertes Immundefizienzsyndrom) verantwortlich sind, scheint dies bei Menschen nicht der Fall zu sein (Lees-Miller et al. 2003; Wiler et al. 1995;
Shin et al. 2000; Meek et al. 2001; Ding et al. 2002). Jedoch konnte festgestellt werden, dass das Fehlen des ebenfalls wichtigen Faktors Artemis zu SCID beim Menschen führt (Lees- Miller et al. 2003; Moshous et al. 2001; Li et al. 2002; Kobayashi et al. 2003). Die Artemis- Defizienz geht mit einer erhöhten Strahlensensibilität einher ("radiosensitive SCID"). Fehlt der Faktor Ku, so ist gleichwohl mit Defekten bei der V(D)J-Rekombination zu rechnen, doch werden in diesem Fall weder kodierende Enden, noch Signalenden erkannt und prozessiert;
diese Defekte sind ernster als bei DNA-PKcs-Defizienz. Ebenso wie das Fehlen des Faktors Ku, so sorgen auch die XRCC4- und Ligase IV-Defizienz für Defekte in sowohl den kodierenden, als auch den Signalverknüpfungen. Außerdem bleibt anzuführen, dass XRCC4-
E i n l e i t u n g 14 und DNA-Ligase IV-Defekte zu ernsteren Verknüpfungsdefekten führen, als Ku-Defizienz (Lees-Miller et al. 2003).
1.4.2. Homologe Rekombination (HR)
Dieser Reparaturweg findet in der späten S- und der G2-Phase des Zellzyklus statt.
Auch hier liegen initial Doppelstrangbrüche vor, doch werden diese durch den Mre11/Rad50/NBS1-Nuklease-Komplex so verändert, dass 3´-Einzelstrangüberhänge entstehen. Im folgenden besitzt Rad52 die Fähigkeit, die DNA-Enden zu schützen und außerdem die Bildung von Heteroduplex-DNA zu bewirken. Zur Reparatur sind darüber hinaus Rad51 und einige weitere Proteine erforderlich (siehe Abbildung 1-7), darunter auch BRCA 2 (Xia et al. 2001). Die intakte DNA des Schwesterchromatids oder des homologen Chromosomes dient als Ausgangsmaterial ("template"), um die im Zuge des nukleolytischen Prozesses verloren gegangene genetische Information zu ersetzen.
Um die Rekombinationsreparatur abzuschließen werden zunächst so genannte Holliday- Strukturen gebildet, wodurch sodann die Heteroduplex-Regionen durch Strangextension dieser Verbindungen verlängert werden können. Durch die sich anschließende Lösung der Holliday-Verbindungen kommt es nach der Ligation zu den fertigen Rekombinanten mit oder ohne Austausch von Allel-Informationen ("crossover") (Dasika et al. 1999).
Abbildung 1-7: HR und NHEJ im Vergleich (Lisby et al. 2004, Dasika et al. 1999)
Die linke Abbildung (a) zeigt eine schematische Verdeutlichung des HR; die rechte (b) stellt den HR im Vergleich zur NHEJ dar.
a) b)
E i n l e i t u n g 15 1.4.3. Zeitliche Abfolge der Doppelstrangbruch-Reparatur
Der MRE11-RAD50-NBS1 (MRN)-Protein-Komplex steht in Verbindung mit DNA- Doppelstrangbrüchen. In Wirbeltierzellen werden alle drei Komponenten von essenziellen Genen kodiert, wobei hypomorphe Mutationen in jedem dieser Gene in Syndromen mit genomischer Instabilität münden können.
MRN ist einer der frühesten Komplexe, welche an den DNA-Läsionen lokalisiert werden können, wo er scheinbar initial eine strukturelle Rolle spielt und die gebrochenen Chromosomen zusammenfügt und stabilisiert. Dieses legt nahe, dass MRN eine Funktion als
"läsionsspezifischer Sensor" übernimmt. Neben der Fähigkeit an DNA zu binden, erfüllt MRN noch weitere Aufgaben in der Rekrutierung von großen makromolekularen Komplexen, den Foci, die eine effiziente Doppelstrangbruch-Erkennung ermöglichen. Hierbei ist ebenfalls das MDC1-Protein involviert; es wird koimmunpräzipiert mit dem MRN-Komplex und reguliert die Bildung der MRN-Foci. Allerdings ist weiterhin unklar ob die initiale Rekrutierung von MRN an Doppelstrangbrüche die Präsenz von MDC1 voraussetzt (van den Bosch et al. 2003).
Die Abbildung 1-8 zeigt die Proteine MRE11, RAD50 und NBS1 jeweils mit ihren bekannten strukturellen Domänen (A). Im Abschnitt B des Bildes wird die Struktur des MRE11-RAD50- NBS1 (MRN)-Komplexes modellhaft dargestellt. Dieser Komplex bindet an DNA-Enden durch das Protein MRE11. Mit Hilfe der "gewundenen Spiralstruktur" des RAD50 wird dieser Vorgang nach außen verlängert und ist in der Lage, mit einem MRN-Komplex der anderen Seite des DNA-Doppelstrangbruchs zu interagieren. Dieses geschieht über Cys-X-X-Cys (CXXC)-Motive unter Bindung von Zn2+-Ionen. Um diese Interaktion zu verdeutlichen, sind in der Abbildung lediglich zwei MRN-Moleküle dargestellt, doch sind es stets mehrere MRN- Moleküle, die an diesem Prozess teilhaben und an die Doppelstrangbrüche lokalisiert werden.
Jene Interaktionen zwischen den RAD50-Armen werden auch als "molekulare Velcro" (=
"Klettband") bezeichnet (van den Bosch et al. 2003; de Jager et al. 2001).
Abbildung 1-8: Der humane MRE11-RAD50-NBS1-Komplex (van den Bosch et al. 2003)
Abbildung A zeigt die funktionellen Gruppen der Proteine MRE11, RAD50 und NBS1; Abbildung B die räumliche Interaktion dieser Proteine.
E i n l e i t u n g 16 Um die Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen zu gewährleisten, sind weitere Proteine notwendig. Hierzu gehören ATM, γ-H2AX und weitere Mediatorproteine. In der Abbildung 1-9 sind die bekannten strukturellen Domänen jedes dieser Proteine dargestellt (van den Bosch et al. 2003).
Abbildung 1-9: Das ATM, γ-H2AX und weitere Mediatorproteine beim Menschen (van den Bosch et al. 2003)
Die Abbildung zeigt die funktionellen Gruppen der Proteine ATM, γ-H2AX, MDC1, 53BP1 und BRCA1.
Im Folgenden soll im Detail auf den potentiellen Ablauf des DNA-Doppelstrangbruch- Reparaturzyklus eingegangen werden. Abbildung 1-10 veranschaulicht den zeitlichen Ablauf.
Abbildung 1-10: Modell des Doppelstrangbruch-Reparaturzyklus (van den Bosch et al. 2003)
Hier werden die im Text genauer beschriebenen Schritte A bis F des Doppelstrangbruch-Reparaturzyklus bildlich dargestellt.
E i n l e i t u n g 17 Teil A: Die Abbildung zeigt einen unbeschadeten Chromosomenbereich mit zwei
Chromatinschleifen und einem inaktiven ATM-Dimer.
Teil B und C: Hier werden zum einen die Induktion von DNA-Doppelstrangbrüchen mit folgender Modifikation des Chromatins (dünne schwarze Linie) dargestellt und die Aktivierung des ATM-Proteins über Autophsphorylierung an Serin 1989 mit folgender Dissoziation zum akiven ATM-Monomer. Zum anderen die Rekrutierung sowohl von ATM, als auch von MRN (MRE11/RAD50/NBS1).
Mre11 bindet an ATM und unterstützt ATM auf diese Weise bei der Rekrutierung zu den zu phosphorylierenden ATM-abhängigen Substraten.
Teil D und E: Die Schemata stellen eine Welle von H2AX-Phosphorylierungen dar. Diese wird von der Rekrutierung weiterer Mediatoren begleitet. MDC1, 53BP1 (p53- binding protein 1 = p53-bindendes Protein 1) sowie BRCA1 werden in der Folge zu dem wachsenden Focus lokalisiert und ATM-abhängig phosphoryliert.
Die genaue molekulare Architektur dieser Foci ist derzeit noch nicht näher bekannt; sie unterliegt vermutlich je nach Reparaturanforderungen einem dynamischen Wechselspiel. Weiterhin werden NBS1 und weitere hier nicht näher aufgeführte Reparaturproteine ATM-abhängig phosphoryliert.
Teil F: Die Abbildung zeigt die Dissoziation des Focus nach erfolgter Doppelstrangbruch-Reparatur, die Inaktivierung des Proteins ATM, sowie die Zurückbildung des zuvor modifizierten Chromatins.
Dieses Modell legt nahe, dass es mindestens zwei verschiedene Formen des ATM-Proteins gibt: Zum einen ein inaktives Oligomer, zum anderen ein aktives Monomer. Hinzu kommen vermutlich verschieden aktive "unlösliche" Formen: direkt an der Läsion bzw. im wachsenden Focus (van den Bosch et al. 2003; Kastan et al. 2004).
Die Ausführungen verdeutlichen die komplexen Wechselbeziehungen zwischen den einzelnen Proteinen, um eine optimale Reparatur von induzierten bzw. entstandenen DNA- Doppelstrangbrüchen zu gewährleisten. Dieses hoch entwickelte und komplizierte System dient letztlich auch der Verhinderung der Entstehung von Krebs und bedarf auch in Zukunft noch eines hohen Aufwandes an wissenschaftlicher Forschung, um gegenwärtig noch nicht bekannte Zusammenhänge und Vorgänge zu verstehen und dieses Wissen in Diagnostik und Therapie in der klinischen Medizin optimal umsetzen zu können.
E i n l e i t u n g 18 1.5. Ausgewählte DNA-Reparaturgene
1.5.1. DNA-Ligase IV
DNA-Ligasen stellen eine große Familie von evolutionär konservierten Proteinen dar, die Ligationen bei zahlreichen DNA-abhängigen Prozessen durchführen. Hierzu zählen chromosomale DNA-Replikation, sowie DNA-Reparatur und –Rekombination (Martin et al.
2002; Timson et al. 2000). Die Ligasen lassen sich in zwei Subfamilien unterteilen, gestützt auf die Notwendigkeit bestimmter Kofaktoren. Die meisten eubakteriellen Enzyme nutzen NAD+ als Kofaktor. Im Gegensatz dazu fallen die meisten eukaryotischen DNA-Ligasen, gemeinsam mit Enzymen der Archaea und von Bakteriophagen, unter die zweite Subfamilie, deren Enzyme ATP als Kofaktor nutzen (Martin et al. 2002).
Wirbeltierzellen weisen drei mittlerweile gut charakterisierte DNA-Ligasen auf, die DNA- Ligasen I, III und IV, die sich wahrscheinlich aus einem archetypischen Nukleotidyltransferase-Enzym entwickelt haben (siehe Abbildung 1-11).
Die DNA-Ligase I ist scheinbar in allen eukaryotischen Organismen vorhanden: Orthologe Enzyme konnten bei zahlreichen Organismen, Hefe und Säugetiere inbegriffen, nachgewiesen werden und spielen eine wichtige Rolle bei der nukleären DNA-Replikation, -Reparatur und – Rekombination. In Hefezellen fungiert eine Form der DNA-Ligase I darüber hinaus bei der mitochondrialen DNA-Replikation und –Reparatur, diese Funktion wird bei höheren eukaryotischen Zellen von der DNA-Ligase III übernommen. Dieses Enzym konnte bisher nur in Wirbeltierzellen nachgewiesen werden, ist neben den Mitochondrien ebenfalls im Zellkern präsent und ist an der DNA-Einzelstrangbruch-Reparatur und scheinbar auch an meiotischen Rekombinationsprozessen beteiligt. Wie bei der DNA-Ligase I ist es ebenso bei der DNA-Ligase IV wahrscheinlich, dass das Enzym bei allen eukaryotischen Organismen konserviert ist, da orthologe Enzyme der DNA-Ligase IV bei Hefen, höheren Pflanzen und Wirbeltieren identifiziert werden konnten. Diese Studien lassen ferner die lebenswichtige Rolle dieses Enzyms bei nukleären DNA-Reparaturmechanismen nahe liegen (Martin et al.
2002).
Die DNA-Ligase IV ist eine ATP-abhängige DNA-Ligase, die ausschließlich kernständig vorkommt. Das Protein besitzt aminoterminal eine Katalytische Domäne und carboxyterminal zwei BRCT-(BRCA1 carboxy-terminal domain = BRCA carboxy-terminale Domäne)- Domänen (Martin et al. 2002; Wei et al. 1995; Wilson et al. 1997). BRCT-Domänen sind sich autonom faltende Proteinmodule von etwa 95 Aminosäuren, die zum ersten Mal in der carboxy-terminalen Region des Tumorsuppressorproteins BRCA1 identifiziert wurden, seitdem jedoch bei zahlreichen Proteinen nachgewiesen konnten, die bei der DNA- Replikation, DNA-Reparatur und Kontrollpunktsteuerung beteiligt sind (Martin et al. 2002;
Bork et al. 1997). Die beiden im DNA-Ligase IV-Protein vorhandenen BRCT-Domänen werden durch eine kürzere Verbindungssequenz, die aus etwa 100 Aminosäuren besteht, unterbrochen. Diese beinhaltet den konservierten Bindungsort der DNA-Ligase IV für den Bindungspartner (BX), das Protein XRCC4 (Martin et al. 2002; Grawunder et al. 1998;
Sibanda et al. 2001).
Die Katalytische Domäne (catalytic domain = CD) beinhaltet sechs konservierte Sequenzmotive (I, III, IIIa, IV, V-VI), die eine Familie von verwandten Nukleotidyl- Transferasen definieren. Hierzu gehören auch eukaryotische GTP-abhängige Ligasen für bekappte mRNA-Enzyme, sowie eubakterielle NAD+-abhängige Ligasen (Martin et al. 2002;
Shuman et al. 1995). Motiv I beinhaltet ein Lysin, welches während des ersten Schrittes der Ligation adenyliert wird.
E i n l e i t u n g 19 Des weiteren weist die DNA-Ligase IV eine nicht-katalytische Domäne (non-catalytic domain
= NCD) auf, die bei verschiedenen Proteinfamilienmitgliedern zu unterschiedlichem Grade konserviert ist. Allerdings ist die Funktion der Domäne gegenwärtig noch nicht geklärt (Martin et al. 2002).
Abbildung 1-11: DNA-Ligase IV und die „Urligase“/archetypische Ligase (Martin et al. 2002)
Die Abbildung stellt die DNA-Ligase IV im Vergleich zur archetypischen Ligase inclusive der entsprechenden funktionellen Gruppen dar.
BX
Mittlerweile konnte die Struktur der DNA-Ligase IV im Komplex mit einem XRCC4- Homodimer genauer charakterisiert werden (Martin et al. 2002; Sibanda et al. 2001). Das XRCC4-Protein besitzt aminoterminal eine globuläre Domäne ("Head"), gefolgt von langen helikalen Domänen ("Tail"). Ein Polypeptid der DNA-Ligase IV, das 36 Aminosäuren zwischen den carboxy-terminalen BRCT-Domänen entspricht, interagiert simultan mit den Schwanzdomänen beider XRCC4-Monomere (Abbildung 1-12), allerdings in asymmetrischer Weise. Das Peptid faltet sich zu einem Scheiben-ähnlichen Motiv, hierin sind eine β- Haarnadelstruktur und daran anschließend eine kurze α-Helix enthalten. Dieses liegt quer über den XRCC4-Carboxytermini (Martin et al. 2002).
Abbildung 1-12: DNA-Ligase IV/XRCC4-Komplex (Martin et al. 2002)
Hier wird die räumliche Interaktion des DNA-Ligase IV/XRCC4-Komplexes schematisch dargestellt.
Forschungsarbeiten mit Säugetier- und Hefezellen haben gezeigt, dass XRCC4 das DNA- Ligase IV-Protein stabilisiert und darüber hinaus die Aktivität der Ligase stimuliert. Dieses wird dadurch verdeutlicht, dass Zellen, denen das Protein XRCC4 fehlt, ebenso wie Zellen, die XRCC4-defizient sind, niedrige Level an DNA-Ligase IV beinhalten (Lees-Miller et al.
E i n l e i t u n g 20 2003; Grawunder et al. 1997; Frank et al. 1998). Ferner sorgt XRCC4 dafür, dass die DNA- Ligase IV an den entsprechenden Orten der DNA-Doppelstrangbrüche lokalisiert wird.
DNA-Ligase IV ist ein ausschließlich nukleär zu findendes Protein. Es übernimmt wichtige Aufgaben im NHEJ-Reparaturweg (Martin et al. 2002; Timson et al. 2000; Featherstone et al.
1999; zu NHEJ siehe auch Kapitel 1.4.). Interessanterweise zeigen Mäuse, denen DNA- Ligase IV fehlt, embryonale Lethalität. Es konnte gezeigt werden, dass der Verlust von DNA- Ligase IV zu massiver neuronaler Apoptose führt, die den Tod während der Embryogenese nach sich zieht (Lees Miller et al. 2003; Barnes et al. 1998; Frank et al. 1998). Diese Resultate lassen vermuten, dass das Enzym auch eine essentielle Funktion in der frühen Entwicklung übernimmt.
1.5.2. RINT1
RINT1 ist ein mit Rad50 interagierendes Protein ("Rad50-interacting protein") und wurde als Bindungspartner von Rad50 identifiziert.
Rad50 wiederum ist ein Bestandteil des Mre11/Rad50/NBS1-Komplexes (siehe 1.4.3.).
Das Protein RINT1 weist 87 kDa auf, und seine cDNA umfasst 2,855 Nukleotide. Sie beinhaltet ein Translations-Initiationskodon, das erste Methionin an Position 111, welches einen offenen Leserahmen von 792 Aminosäuren einleitet. Bisher sind neben einigen Leucin- Heptat-Repeats im Bereich des N-Terminus keine funktionellen Domänen innerhalb des Proteins identifiziert worden.
Interessanterweise kodiert RINT1 für ein menschliches Protein (hsRINT1), welches signifikante Homologien mit dem Genprodukt CG8605 der Fruchtfliege Drosophila melanogaster, auch als dmRINT1 bezeichnet, besitzt. Gegenwärtig ist die biologische Funktion des dmRINT1 nicht bekannt (Xiao et al. 2001; Adams et al. 2000). Beide Sequenzen besitzen die gleichen Leucin-Heptat-Repeats innerhalb ihrer N-terminalen Region (siehe Abbildung 1-13, Box A). Zwei weitere Regionen, zum einen die in der Abbildung 1-13 als Box B gekennzeichnete, die die Aminosäuren 220-565 des hsRINT1 umfasst, und zum anderen Box D, die sich über die Aminosäuren 659-751 des hsRINT1 erstreckt, weisen 35- 39% Homologie mit den entsprechenden Regionen des dmRINT1 auf. Darüberhinaus besitzt das hsRINT1 eine zusätzliche Sequenz, die zwischen den konservierten Regionen gelegen ist und in der Abbildung 1-13 als Box C gekennzeichnet ist (Xiao et al. 2001).
Abbildung 1-13: Sequenzvergleich zwischen hsRINT1 und dmRINT1 (Xiao et al. 2001)
Hier werden die funktionellen Strukturen des hsRINT1 und dmRINT1 verglichen.
Weitere Forschungen haben gezeigt, dass das hsRINT1-Gen auf dem Chromosom 7q22.1, zwischen den Markern D7S2545 und D7S2420, lokalisiert ist. Eine Deletion dieser Region ist häufig mit Akuter Myeloischer Leukämie (AML), dem Myelodysplastischen Syndrom, Brust- und Ovarialadenokarzinomen, sowie weiteren Malignomen verbunden (Xiao et al. 2001, Mitelman 1991).
E i n l e i t u n g 21 Zur Interaktion mit Rad50 nutzt RINT1 dessen zweites Leucin-Heptat-Repeat. Ebenfalls konnte gezeigt werden, dass für das RINT1-Protein die Regionen B, C und D zur Interaktion wichtig sind. Diese bezeichnen insbesondere die Aminosäuren 257-792 (Xiao et al. 2001).
Desweiteren konnten zwei im SDS-Polyacrylamidgel unterschiedlich schnell wandernde Formen des RINT1-Proteins identifiziert werden. Die schnellere Form entspricht wohl der, die durch eine Translations-Initiation am ersten Methioninkodon entsteht. Im Gegensatz dazu wurde zunächst angenommen, dass die langsamere Form das Produkt posttranslationaler Modifikationen darstellt, eine Phosphorylierung konnte in Experimenten mit Alkalischer Phosphatase jedoch nicht bestätigt werden. Aufgrunddessen werden nun andere zelluläre Vorgänge hierfür verantwortlich gemacht. Eine Möglichkeit stellt eine alternative Translations-Initiation dar, die nicht die typische AUG-Startkodonkonstellation nutzt.
Tatsächlich ist eine längere RINT1-cDNA, die bereits vor dem ersten AUG-Kodon beginnt, in vitro transkribiert und translatiert worden. Diese Resultate zeigen, dass die langsamere Form einem Polypeptid entspricht, dessen Translation bereits an einem früheren nicht-AUG-Kodon beginnt. Weitere Analysen der 5´-Sequenz der RINT1-cDNA nach nicht-AUG-Start-Kodons (Xiao et al 2001; Boeck et al. 1994) haben zwei potenzielle CUG-Startregionen identifiziert.
Beide dieser Kodons sind durch Purine an den Positionen -3 und +4 flankiert, welches eines oder sogar beide Kodons als Translations-Initiationsstellen qualifiziert. Insgesamt konnte jedoch festgestellt werden, dass die schnellere Form die dominierende darstellt. Letzlich wird also bei der Immunpräzipitation des RINT1 ein Doublet detektiert, welches in allen bisher untersuchten humanen Zellen exprimiert wird (Xiao et al. 2001).
Nach Ergebnissen von Xiao et al. wird RINT1 während des gesamten Zellzyklus exprimiert, eine Interaktion mit Rad50 findet jedoch lediglich in der späten S-, der G2/M- und der M- Phase statt. Beide Banden des Doublets werden mit Rad50 koimmunpräzipitiert, obgleich die größere RINT1-Isoform wahrscheinlich bevorzugt an Rad50 bindet. In jedem Fall lässt die spezifische Interaktion zwischen den beiden Proteinen in bestimmten Phasen des Zellzyklus vermuten, dass RINT1 während dieses Zeitfensters eine Rolle im Zellzykus spielt (Xiao et al.
2001).
Weiterführend konnte gezeigt werden, dass ein verkürztes RINT1-Protein, dessen N- terminale Region inaktiviert bzw. abgetrennt wurde, zu Fehlern der G2M-Kontrolle führt.
Möglicherweise könnte das Protein mit Verlust der N-terminalen Region zu einer Störung der biologischen Funktion des RINT1 bezüglich der Bindung mit Rad50 führen. Untersuchungen haben zunächst gezeigt, dass die Expression des N-terminal-verkürzten RINT1-Proteins, welches die Rad50-bindende Region beinhaltet, zu einer unmittelbaren Verzögerung des strahleninduzierten G2/M-Kontrollpunktes nach DNA-Schädigung führt. Aufgrunddessen scheint es nahe liegend, dass der RINT1/Rad50-Komplex eine wichtige Rolle in der Steuerung und Kontrolle des G2/M-Kontrollpunktes in der Antwort auf DNA-Schäden spielt (Xiao et al. 2001).
Interessanterweise kann BRCA1, ein mit familiärem Brust- und Ovarialkrebs verbundener Tumorsuppressor (siehe 1.4.3.), mit Rad50 assoziiert sein (Zhong et al. 1999, Wang et al.
2000, Xiao et al. 2001). Zusätzlich zu Prozessen wie Trankriptioneller Regulation, Zellwachstum und –differenzierung und DNA-Reparaturvorgängen ist BRCA1 außerdem an der Zellzykluskontrolle beteiligt. Deletionen des Exons 11 von BRCA1 führen zu fehlerhafter G2/M-Kontrolle nach IR und Methylmethansulfonat-Zugabe (Xiao et al. 2001, Xu et al. 1999).
Es ist entweder möglich, dass RINT1 unabhängig von oder gemeinsam mit dem Rad50- BRCA1-Komplex fungiert, um eine angemessene G2/M-Kontrolle zu gewährleisten (Xiao et al. 2001). Dieses ist jedoch gegenwärtig ungeklärt. Doch wird die weitere Erforschung dieses Proteins sicherlich zu einem besseren Verständnis der Vorgänge bei der Zellzykluskontrolle führen.
Weitere Forschungsarbeiten identifizierten RINT1 kürzlich als Tumorsupressor mit
besonderer Rolle in der frühen Mitose, welches die dynamische Integrität des Golgi-Aparates
E i n l e i t u n g 22 und der Centrosomen als Vorbedingung für die Koordination während der Zellteilung sichert (Lin et al. 2007).
1.5.3. KIAA-0170/NFBD1/MDC1
Das MDC1-Gen wurde zunächst als anonymes Gen KIAA-0170 bei Sequenzierungen der cDNA von humanen myeloischen Zell-Linien entdeckt (Shang et al. 2003; Nagase et al.
1996). Es ist lokalisiert auf dem kurzen Arm von Chromosom 6 (6pter-p21.31, www.ensembl.org oder www.gene.ucl.ac.uk). Das Protein hat eine relative Molekulare Masse von 250 kDa (Mr 250K; p250) und besteht aus 2089 Aminosäuren mit einer Mr von etwa 226,5 KDa (Goldberg et al. 2003; Shang et al 2003). Das Protein weist N-terminal ein FHA- Motiv und C-terminal zwei BRCT-Domänen auf (Goldberg et al. 2003; Shang et al. 2003;
Hofmann et al. 1995). Aufgrunddessen wurde KIAA-0170 auch der Name NFBD1 (nuclear factor with BRCT domains = nukleärer Faktor mit BRCT-Domänen) zugeschrieben (Goldberg et al. 2003; Shang et al. 2003; Ozaki et al. 2000). BRCT-Domänen sind häufig bei Proteinen zu finden, die entweder in die Zellzykluskontrolle oder die Antwort auf DNA- Schäden involviert sind (Goldberg et al. 2003), beispielsweise BRCA1, NBS1 oder DNA- Ligase IV.
Angelehnt an die zum gegenwärtigen Zeitpunkt bekannten Funktionen und Aufgaben des Proteins hat sich der Name MDC1 (mediator of DNA damage checkpoint protein 1) für das Protein durchgesetzt (Goldberg et al. 2003).
Ungewöhnlicherweise weist MDC1 einen Bereich von 13 internen Wiederholungssequenz- Abschnitten auf, wobei jeder dieser "Repeats" aus 41 Aminosäuren besteht und außerordentlich reich an Serin, Threonin und Prolin ist. Potenzielle ATM/ATR- und CDK- Phosphorylierungsstellen sind über das Protein verteilt (Abbildung 1-14).
Abbildung 1-14: Proteinstruktur des Proteins MDC1 (Stewart et al. 2003)
Abbildung a zeigt die funktionellen Gruppen des MDC1; Abbildung b verdeutlicht den hoch repetitiven Bereich in Exon 9 des MDC1, jeweils mit Position der Aminosäuren der 13 dargestellten Repeats.
Beginnende Aminosäure des nächsten Repeats
E i n l e i t u n g 23 In Immunoblotanalysen werden mittels Anti-MDC1-Antikörper drei Banden von Mr > 210 KDa und maximal 250 KDa detektiert, die wahrscheinlich alternativ-gespleißte Formen des Proteins MDC1 repräsentieren (Stewart et al. 2003). In der Tat hat die Erforschung der humanen exprimierten Sequenz die Existenz von alternativen Spleißprodukten des MDC1- Proteins belegt (Goldberg et al. 2003). Ferner konnte gezeigt werden, dass IR-exponierte Zellen zu einer reduzierten Mobilität aller drei Formen des MDC1 in SDS- Polyacrylamidgelen führt. Dieser "Shift" ist durch Phosphatasebehandlung eliminierbar, dieses belegt die durch IR-induzierte Hyperphosphorylierung des MDC1-Poteins. Dieser Vorgang ist ATM-abhängig (Goldberg et al. 2003).
Proteine, die an der Reparatur von DNA-Schäden beteiligt sind, formieren sich nach DNA- Schädigung zu kernständigen Foci, so beispielsweise auch NBS1, Rad50, Mre11, BRCA1 und 53BP1 (Shang et al. 2003; Schultz et al. 2000; Rappold et al. 2001; Zhong et al. 1999;
siehe Kapitel 1.4.3.; siehe Abbildung 1-15).
Neuere Forschungsarbeiten haben gezeigt, dass MDC1 ebenfalls Foci nach Behandlung mit IR bildet. Daraufhin wurden andere Agenzien hinsichtlich der Focusbildung von MDC1 getestet. Diese Untersuchungen haben ergeben, dass sowohl Camptothecin, ein DNA- Topoisomerase I-Inhibitor, als auch Etoposid, ein Topoisomerase II-Inhibitor, die beide Einzel- und Doppelstrangbrüche der DNA bewirken, zur Bildung von MDC1-Foci führen.
Diese Resultate konnten ferner bei Zellen beobachtet werden, die mit dem alkylierenden Agens Methylmethansulfonat oder dem kreuzvernetzenden Agens Mitomycin C behandelt wurden (beide verursachen synthetische Strangbrüche). Zellen, die UV-Licht ausgesetzt wurden, welches Thymidindimere, nicht aber Doppelstrangbrüche bewirkt, zeigten hingegen nur wenige MDC1-Foci. Diese Ergebnisse unterstreichen die schadenspezifische Rekrutierung des Proteins MDC1 zu Reparaturfoci während der zellulären Antwort auf DNA- Schäden (Shang et al. 2003).
MDC1-Foci formieren sich bereits sehr früh (< 5 Minuten) nach γ-Bestrahlung. Die Zahl der MDC1-positiven Foci pro Zelle nimmt mit der Zeit zu und erreicht ihren Spitzenwert 30 Minuten nach der Bestrahlung; innerhalb von vier Stunden nimmt sie wieder bis auf Hintergrundwerte ab. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Zellen, ungeachtet der Zellzyklusphase, mit IR-induzierter Bildung von MDC1-Foci antworten. Offenbar wird MDC1 zu DNA-Strangbrüchen transloziert und nimmt an der frühen Antwort auf DNA- Schäden teil (Shang et al. 2003). Goldberg et al. kamen zu hiervon leicht differierenden Ergebnissen. Bei ihnen bildeten sich die MDC1-Foci erst 15 Minuten nach IR, waren nach 12 Stunden noch immer präsent und erst allmählich nach 24 Stunden verschwunden (2003).
Die oben beschriebene Kinetik der MDC1-positiven Focusbildung entspricht auch der des γ- H2AX (Shang et al. 2003; Rogakou et al. 1998; Paull et al. 2000). Es konnte außerdem gezeigt werden, dass Chk2T68P und MDC1 für die Zeit von 15 Minuten bis 4 Stunden nach IR in den IR-induzierten Foci kolokalisiert sind.
Zusammengenommen ergeben diese Resultate, dass MDC1, ebenso wie γ-H2AX und Chk2T68P, an DNA-Doppelstrangbruch-Stellen in der frühen Phase nach dem DNA-Schaden rekrutiert werden (Shang et al. 2003). Weitere Untersuchungen konnten zeigen, dass MDC1 sowohl für die Rekrutierung des γ-H2AX, als auch des Chk2T68P zu DNA- Strangbruchstellen wichtig ist (Shang et al. 2003). Bemerkenswert ist jedoch, dass Chk2 hierbei sowohl phosphorylierungsabhängige, als auch -unabhängige Interaktionen bewirkt (Goldberg et al. 2003).
