Verwendete Lösungen und Puffer

Lyse-Puffer mit Proteinase K (sollte frisch angesetzt werden) 40 µl 10x STE

190 µl H₂O 20 µl 10% SDS

150 µl Proteinase K (10 mg/ml) 10x STE-Puffer

0,5 M Tris-HCl 1 M NaCl 0,01 M EDTA

→ ad 1l Aqua bidest., auf pH 7,5 einstellen

M e t h o d e n 41 3.2.2. Extraktion von RNA

3.2.2.1. Hintergrund

Die Ribonukleinsäure ist im Gegensatz zur Desoxyribonukleinsäure (DNA) nicht Träger der Erbinformation, sondern an der Realisierung der genetischen Information beteiligt. Dieses gilt allerdings nicht für Viren, die ihre RNA als Träger der Erbinformation benutzen.

Die Bausteine der RNA unterscheiden sich von denen der DNA zum einen dadurch, dass ihr Zuckerbestandteil statt Desoxyribose die Ribose darstellt, zum anderen besitzt sie als Pyrimidin-Base statt Thymin Uracil. Durch die Art der Verknüpfung der einzelnen Bausteine über Phosphatbrücken entsteht eine definierte Richtung des RNA-Moleküls mit einem freien 5´-Ende und einem freien 3´-Ende.

Es werden verschiedene RNA-Arten mit unterschiedlichen Funktionen differenziert. Neben den in Tabelle 3-1 aufgeführten RNA-Arten sind gegenwärtig weitere RNAs, z. B. miRNA (microRNA), ncRNA (non-coding RNA) und siRNA (small inhibitory RNA) Gegenstand der aktuellen Forschung.

Tabelle 3-1: Überblick über die verschiedenen RNA-Arten (Auswahl) (aus: modifiziert nach Löffler Basiswissen Biochemie, 2001)

Die Tabelle zeigt eine Auswahl bekannter RNA-Arten im Vergleich hinsichtlich der Größe, Struktur und Funktion.

RNA-Art Größe Struktur Funktion

hnRNA

Einzelstrang Entsteht aus hnRNA und dient als Matrize bei der

Proteinbiosynthese

Strukturelement bei der Bildung der großen und der kleinen ribosomalen

Untereinheit tRNA

(Transfer RNA)

~110 Viele Basenpaarungen innerhalb eines

Einzelstranges

Bindung von Aminosäuren, Positionierung für

Proteinbiosynthese snRNA

(small nuclear RNA;

kleine nukleäre RNA)

~300 als U1-U6 snRNA

Assoziiert an Proteine Bestandteil des Spleißosoms

scRNA

(small cytoplasmic RNA; kleine cytoplasmatische RNA)

Assoziiert an Proteine Bestandteil des Signals recognition particles (SRP)

Aufgrund ihrer chemischen Struktur ist die RNA im Gegensatz zur DNA durch basenkatalysierte Hydrolyse spaltbar und daher sehr empfindlich. Die Deprotonierung der 2´-OH-Gruppe ermöglicht einen nukleophilen Angriff auf das benachbarte Phosphoratom, wodurch die folgende Hydrolyse erleichtert wird. Ebenso stellt die durch RNase katalysierte Hydrolyse ein weiteres Problem bei der RNA-Isolierung dar. Wegen der hohen Instabilität der RNA wurde die RNA-Isolierung mit Diethylpyrocarbonat (DEPC)-behandelten Materialien

M e t h o d e n 42 und Lösungen durchgeführt. Für die Behandlung wurde 0,1% DEPC verwendet, die Inkubation erfolgte für 1 Stunde unter dem Abzug mit anschließender Inaktivierung im Autoklav. Die Inhibierung der RNase-katalysierten Hydrolyse durch DEPC erfolgt durch Ethylierung der Aminogruppen.

3.2.2.2. Vorgehensweise

3.2.2.2.1. Vorbereitung der Proben

Die Isolierung von Gesamt-RNA aus lymphoblastoiden Zell-Linien erfolgte mit einer modifizierten Methode nach Chomczynski und Sacchi (1987).

Zunächst wurden 5-10 ml Zellsuspension aus der Zellkulturflasche entnommen und in ein 15 ml Falcongefäß überführt. Nach zehnminütiger Zentrifugation bei 4°C wurde der Überstand dekantiert und das Zellpellet auf Eis gelagert. Zum Waschen der Zellpellets wurden 500 µl BSA zugegeben und die Zellsuspension in 1,5 ml Eppendorfgefäße überführt. Diese wurden für 3 Minuten bei 13000 rpm im Kühlraum zentrifugiert und das Pellet anschließend in 100 µl BSA resuspendiert.

3.2.2.2.2. Lyse und Extraktion

Im folgenden wurden 1 ml GTC-Phenol-Gemisch zugegeben, mit einer Pipette vorsichtig gemischt und 5 Minuten bei 4°C inkubiert. Hierbei bewirkt das GTC die Auflösung der Zellmembran und die RNA-Extraktion durch Ausschütteln erfolgt durch das Phenol. Nun wurden 200 µl CHCl₃ zupipettiert, durchmischt und erneut bei 4°C für 5 Minuten inkubiert.

In der phenolischen Phase befanden sich Proteinreste und andere lösliche Substanzen, außerdem löste sich auch DNA schlecht in der sauren wässrigen Phase (der pH hier beträgt 4,5; zur DNA-Isolation werden 8,0 benötigt), sodass gleichwohl ein Reinigungseffekt erfolgt.

Im folgenden wurde für 15 Minuten bei 13000 rpm zentrifugiert, wodurch die Phasentrennung in eine wässrige und eine organische Phase erfolgte. Die durch Phenol und Chloroform denaturierten Proteine lagen zum Teil in der Interphase vor. Das Chloroform stabilisierte zusätzlich die Phasengrenze zwischen der wässrigen RNA-Lösung und der Phenolphase.

Die wässrige Phase wurde in ein neues Eppendorfgefäß überführt und die RNA durch Zugabe von 1 Vol Isopropanol über 10 Minuten bei 4°C gefällt. Bei der Präzipitation mit dem Alkohol bildete die RNA in Gegenwart monovalenter Kationen einen unlöslichen Niederschlag.

Weiterführend wurde für 15 Minuten bei 13000 rpm zentrifugiert und der Überstand dekantiert. Das Pellet wurde danach zweimal mit 500 µl kaltem 75% EtOH gewaschen, bei 13000 rpm für 15 Minuten im Kühlraum zentrifugiert und der Überstand jeweils mit der Pipette abgenommen.

Abschließend wurde das Pellet in ~30 µl DEPC-H₂O aufgenommen und gelöst.

Zur Kontrolle wurden 2 µl RNA-Lösung mit 2 µl Auftragspuffer versehen und in einem 1,5%

Agarosegel mit Ethidiumbromid elektrophoretisch aufgetrennt und unter UV-Licht sichtbar gemacht. Bei erfolgreicher Präparation ergaben sich die dominierenden Banden der 16S- und 28S-rRNA.

Zur Konzentrationsbestimmung ist es möglich eine 1:50-Verdünnung herzustellen und sie photometrisch zu messen.

M e t h o d e n 43 3.2.2.3. Verwendete Lösungen und Puffer

Lysepuffer:

BSS Lösung A 0,1% D-Glukose

0,0074 g CaCl₂ x 2H₂O (5x 10^-5M) 0,1992 g MgCl2 x 6H2O (9,8x 10^-6M)

0,4026 g KCl (5,4x 10^-3M) 17,565 g Tris (0,145M; pH 7,6) Lösung B 8,19 g NaCl (0,14M)

Lösung A und B im Verhältnis 1:10 mischen Lysemittel:

GTC 14,16 g 4M Guanidiniumthiocyanat 0,22 g 25mM Natriumcitrat, pH 7,0 0,15 g 0,5% Lauroylsarkosin 216 µl 0,1M 2-Mercaptoethanol

→ ad 30 ml DEPC-Wasser Extraktionsmittel

Natriumacetatlösung 3M in DEPC-H₂O, pH 4,2

Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Gemisch (pH 4,2) Phenol/Chloroform/Isoamyl-Alkohol 5 : 1 : 0,1

M e t h o d e n 44 3.2.3. Photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren

Die Konzentrationsbestimmung von RNA und DNA basiert auf dem Absorptionsmaximum der Nukleinsäuren bei 260 nm. Die photometrische Messung der Extinktion gegen eine Referenz erfolgte in Quarzküvetten, da diese das Licht nicht absorbieren.

DNA der Konzentration 50 µg/ml hat, empirisch bestimmt, bei 260 nm einen Extinktionswert von ca. 1,0. Daraus ergibt sich die Bestimmungsformel für DNA-(RNA-) Lösungen mit dem Verdünnungsfaktor f, gemessen in Küvetten der Schichtdicke 1 cm.

∆E260-320 x 50 (40) x f = µg DNA (RNA) / ml

Das verwendete Photometer erlaubte gleichzeitig eine Einschätzung der Qualität der vorliegenden Nukleinsäuren, indem vier wichtige Kennwellenlängen des Spektrums mitbestimmt wurden:

230 nm (Absorption von Salzen und Kohlenhydraten)

260 nm (Absorptionsmaximum der aromatischen Ringe der Basen der Nukleinsäuren) 280 nm (Absorptionsmaximum von Proteinen)

320 nm (Basislinie des Absorptionsspektrums der Nukleinsäuren)

Richtwerte für eine Nukleinsäurepräparation guter Qualität sind ein 230 nm Wert <50% und ein 280 nm Wert <60% des 260 nm Wertes. Der Quotient aus der Extinktion bei 260 nm und 280 nm sollte daher einen Wert von ~1,8 haben.

M e t h o d e n 45 3.3. Polymerasekettenreaktion (PCR)

3.3.1. Hintergrund

Die Polymerasekettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR) wurde im Jahre 1985 von Mullis et al. entwickelt. Es handelt sich hierbei um eine in vitro Technik, die die exponenzielle Amplifikation einer Vorlagesequenz (template) ermöglicht. Als "template"

können genomische DNA oder cDNA Anwendung finden.

3.3.1.1. Prinzipien der verwendeten Reagenzien

Zur Vervielfältigung wird die thermostabile Taq DNA-Polymerase aus dem Archaeum Thermus aquaticus benötigt, dessen natürlicher Lebensraum sich in warmen vulkanischen Quellen befindet. Das Temperaturoptimum des Enzyms beträgt 72°C, ferner ist es stabil bis nahe 100°C, weshalb es bereits vor Beginn der PCR dem Ansatz zugefügt werden kann, im Gegensatz zu früher genutzten, thermolabileren DNA-Polymerasen wie z.B. dem Klenow-Fragment der E.coli DNA-Polymerase I (Saiki et al., 1985; Saiki et al., 1986; Mullis et al., 1986; Mullis und Falcoona, 1987; Mullis 1990). Mittlerweile wird sogar eine sogenannte HotStarTaq-Polymerase verwendet, die erst durch die Erhöhung der Temperatur auf 95°C aktiviert werden muss. Der Vorteil hierfür liegt darin, dass die erwünschte Reaktion erst einsetzt, wenn die optimale Temperatur erreicht ist und dadurch weniger Nebenprodukt entsteht.

Als Starthilfe werden einzelsträngige DNA-Moleküle, die komplementär zu den Enden der gewünschten Sequenz sind, benötigt. Diese sogenannten Oligonukleotidprimer sind in der Regel zwischen 20 und 30 Nukleotide lang und erlauben deshalb eine recht hohe Hybridisierungstemperatur.

3.3.1.2. Prinzipien des Ablaufs der Methode

Die PCR ist ein automatisiertes Verfahren, bei der die exponenzielle Vervielfältung durch ein zyklisches Temperaturprofil erreicht wird. Zunächst wird die template DNA durch fünfzehnminütiges Erhitzen auf 95°C denaturiert, d.h. in die beiden komplementären Einzelstränge zerlegt. Um die beiden Vorlagestränge zu verdoppeln, benötigt die Taq DNA-Polymerase die ebenfalls im Reaktionsansatz vorhandenen Desoxyribonukleosidtriphosphate (dNTPs). Diese werden durch das Enzym an die vorgegebenen Startmoleküle, die Oligodesoxyribonukleotidprimer, angefügt. Die Primer binden an ihren jeweiligen komplementären DNA-Strang so, dass sich ihre 3´OH-Enden gegenüberstehen. Notwendig sind die Primer deshalb, weil die Taq Polymerase nur an der 3´-Hydroxylgruppe eines bereits vorhandenen Nukleotids ansetzen kann. Zumeist werden sie so ausgewählt, dass sie jeweils auf dem zu amplifizierenden Strang ein kleines Stückchen vor der gewünschten Sequenz binden. Auf diese Weise wird die gewünschte Sequenz vervielfältigt.

Nach der Denaturierung erfolgt die Anlagerung der Primer an den jeweiligen template Strang, dieser Vorgang wird auch Annealing genannt. Die Annealing-Temperatur ist für jedes Primerpaar unterschiedlich und muss vor der ersten Anwendung durch eine Optimierung, d.h.

eine Amplifizierung bei verschiedenen Annealing-Temperaturen, bestimmt werden. Für die meisten Primerpaare liegt sie zwischen 48 und 65°C. Die Annealing-Zeit betrug 1-2 Minuten.

Nach dem Annealing folgte die Elongation bei 72°C, dem Temperaturoptimum der Taq Polymerase. Je nach Länge des zu amplifizierenden DNA-Abschnittes wurde eine Elongationszeit zwischen 1 und 2 Minuten gewählt. Dabei wird angenommen, dass die Polymerase die Sequenz pro Sekunde um 10-20 Basenpaare verlängern kann.

M e t h o d e n 46 Durch erneutes Denaturieren schließt sich der Zyklus. Nachdem zu Beginn der Reaktion eine Denaturierungszeit von 15 Minuten gewählt wurde (Vordenaturierung zur Aktivierung der HotStarTaq Polymerase), war während der PCR nur 1 Minute zum Denaturieren ausreichend.

Nach der dritten Wiederholung des Zyklus wird hauptsächlich die gewünschte Sequenz als template DNA amplifiziert. Der Zyklus wird in der Regel 20-40 Mal wiederholt. Jeder Zyklus führt zu einer Verdopplung der neu synthetisierten Doppelstränge, die Zahl der Moleküle wächst also theoretisch mit 2ⁿ.

Als abschließende Elongation wird eine fünfminütige Phase bezeichnet, in der die Taq Polymerase alle bis dahin noch unvollständig duplizierten Stränge vervollständigen kann.

Die exakte Dauer der einzelnen Zyklusphasen sowie die Konzentrationen der einzelnen Komponenten sind von der Art des verwendeten templates abhängig.

Um Siedeverzüge und Verdampfen der Lösungen in den Reaktionsgefäßen aufgrund der hohen Temperaturen zu vermeiden, wurden PCR-Maschinen mit heizbarem Deckel verwendet.

3.3.2. Vorgehensweise

3.3.2.1. Allgemeine Grundsätze

Bei der Durchführung einer PCR ist sauberes Arbeiten und Pipettieren unabdingbare Voraussetzung, da auch kleinste Mengen an DNA als Vorlagesequenz dienen können. Es ist daher notwendig, ausschließlich autoklavierte Agenzien und Werkzeuge zu benutzen; hierbei ist insbesondere auf frisches HPLC-Wasser, saubere Pipetten und Pipettenspitzen zu achten.

Ferner ist bei jeder PCR ein Leerwert, d.h. ein Ansatz ohne template DNA, zur Kontrolle für eventuelle Verunreinigungen mitzuführen.

3.3.2.2. PCR-Ansatz

In frisch autoklavierten Reagiergefäßen, die auf Eis gekühlt werden, wurde die Proben-DNA vorgelegt. Im folgenden wurden die Agenzien (siehe Tabelle) in einem sogenannten Mastermix zusammenpipettiert. Hierbei wurde ein spezieller Puffer verwendet, welcher die Aktivierung der Polymerase optimiert. Außerdem wurde zur Stabilisierung der negativen Ladungen der DNA und dNTPs die Zugabe von zweiwertigem Magnesium nötig. Diese Konzentration musste optimiert sein, da die Polymerase sonst irreversibel inaktiviert werden kann. Da die Taq Polymerase temperatur- und magnesiumempfindlich ist, wurde sie ständig bei -20°C gelagert bzw. in einem Kühlblock, der außerhalb des Gefrierschranks etwa 20 Minuten die gewünschte Temperatur beibehält, aufbewahrt und zudem dem Reaktionsansatz als letztes zugefügt. Auf diese Weise war ebenfalls eine irreversible Inaktivierung des Enzyms durch zu hohe zweiwertige Magnesiumkonzentrationen ausgeschlossen, wenn im Ansatz bei richtiger Berechnung der Konzentrationsverhältnisse nach Zugabe aller Komponenten die optimale Mg²⁺-Konzentration vorlag. Empfehlenswert war weiterhin eine Kühlung der amplifizierten DNA nach Beendigung der PCR, entweder durch Programmieren eines sich anschließenden Kühlzyklus bei 10°C oder das Lagern im Kühlschrank.

M e t h o d e n 47 3.3.3. Verwendete Programme

Tabelle 3-2: Standard-PCR-Programm

Die Tabelle zeigt das bei der Arbeit verwendete Standard-PCR-Programm.

Temperatur

(°C)

Zeit (m)

Anzahl der Zyklen

Vordenaturierung 95 15:00 1

Amplifizierung Annealing Elongation

3.3.4. Verwendete Ansätze

Im Dokument Strahlensensibilitätsgenvarianten als potenzielle Ursache des Nijmegen Breakage Syndroms und bei Patientinnen mit bilateralem Mammakarzinom (Seite 48-55)