4.1. NBS1-Expression und strahleninduzierte Phosphorylierungen in NBSLD-Zelllinien Zur Festlegung des zu untersuchenden Kollektivs habe ich zunächst bei Patienten mit
4.2.2.2. Mutationen im nicht-codierenden Bereich des RINT1 Gens
4.2.3.1.2. Mutationen der Probe A1230
Während der Auswertung dieser Sequenzierungen fiel eine NBSLD-Probe besonders auf (Tabelle 4-1, A1230). Denn bei dieser Probe fand ich 13 der 21 Mutationen, sodass diese NBSLD-Probe in den Mittelpunkt unseres Interesses rückte. Neben einer 123bp-Duplikation waren im Exon entweder Mutationen zu finden, die zu einem Aminosäureaustausch führten oder die entdeckte Mutation blieb eine sogenannte stumme bzw. synonyme Mutationen, bei der die Aminosäure nicht verändert wird.
a) Synonyme Mutationen
Durch Sequenzierung des gesamten kodierenden Bereichs der neun NBS-like-Patienten habe ich eine Mutation im Exon 7 des MDC1 Gens (2310G→C) und eine Mutation in Exon 9 des MDC1 Gens (4203C→T) gefunden. Einen der untersuchten neun Patienten habe ich als heterozygot (A1230) für diese beiden Basenaustausche charakterisiert. Doch ziehen diese Mutationen keinen Aminosäureaustausch nach sich, die Aminosäure Threonin (T770T)
E r g e b n i s s e 75 beziehungsweise die Aminosäure Glycin (G1401G) bleiben erhalten. Es handelt sich also um synonyme Mutationen.
Abbildung 4-8: Mutationen 2310G→C im Exon 7 und 4203C→T im Exon 9 des MDC1 Gens
a) Sequenzierung des Sinnstranges im Exon 7. Die Abbildung zeigt den Basenaustausch G→C an Position 2310 bei einer heterozygoten Probe (unten) im Vergleich zum Wildtyp (oben)
b) Sequenzierung des Sinnstranges im Exon 9. Die Abbildung zeigt die Mutation 4203C→T bei einer heterozygoten Probe (unten) im Vergleich zur Wildtyp-Probe (unten) an der mit Sternchen markierten Position
a) b)
* *
Wildtyp Wildtyp
* Heterozygot
2310G→C * Heterozygot
4203C→T
Bei der Mutation 2310G→C folgte keine weitere Untersuchung und Testung bei einem größeren Kollektiv hinsichtlich der Häufigkeit und Verteilung.
Da die Mutation 4203C→T jedoch eine potentielle Donorspleißsequenz (-G/gtaaga-) erzeugt, wurde der Maximum Entropy Score der neu entstehenden Sequenz mit dem Score der normalerweise genutzten Donorspleißstelle des Introns 9 verglichen. Hierzu wurde die Software MaxEntScan von Yeo und Burge verwendet (Yeo et al. 2005). Interessanterweise bewirkt diese Mutation einen höheren Splicing-Score (9,45), als die im Intron 9 eigentlich verwendete Sequenz (8,41). Die Mutation könnte also zu einem alternativen Spleißprodukt führen. Um mögliche Assoziationen mit anderen Mutationen oder dem Mammakarzinom zu untersuchen, wurden weitere Tests an größeren Kollektiven unternommen.
b) Aminosäuresubstitutionen
Durch Sequenzierung der kodierenden Sequenz der neun NBSLD-Patienten habe ich eine Mutation im Exon 2 des MDC1 Gens gefunden (535C→T). Einen der untersuchten neun Patienten habe ich als heterozygot (A1230) für diesen Basenaustausch charakterisiert. Diese Mutation bewirkt einen Aminosäureaustausch von Arginin zu Cystein (R179C).
Abbildung 4-9: Mutation R179C im Exon 2 des MDC1 Gens
Sequenzierung des Gegenstranges im Exon 2. Die mit Sternchen markierte Position zeigt den Basenaustausch bei einer heterozygoten Probe (unten) im Vergleich zum Wildtyp (oben)
*
*
Wildtyp
Heterozygot R179C
E r g e b n i s s e 76 Zwei weitere Mutationen fand ich in Exon 9 des MDC1 Gens (5234C→G und 5372T→A).
Die Probe A1230 ist wiederum heterozygot für diese Basenaustausche. Die Mutationen führen zu einem Aminosäureaustausch zum einen von Prolin zu Arginin (P1745R), zum anderen von Valin zu Glutamat (V1791E).
Abbildung 4-10: Mutationen P1745R und V1791E im Exon 9 des MDC1 Gens
a) Sequenzierung des Sinnstranges im Exon 9. Hier wird die Mutation P1745R an der mit Sternchen markierten Position bei jeweils einer heterozygoten (Mitte) und einer homozygoten (unten) im Vergleich zur oben dargestellten Wildtyp-Probe gezeigt
b) Sequenzierung des Gegenstranges im Exon 9. Hier wird die Wildtyp-Probe (oben) im Vergleich zu jeweils einer heterozygoten (Mitte) und einer homozygoten (unten) Probe hinsichtlich der Mutation V→E an der mit Sternchen markierten Position 1791 dargestellt
a) b)
Um herauszufinden, ob eine Assoziation dieser Mutationen mit dem gehäuften Auftreten von Mammakarzinomen besteht, wurden weitere Untersuchungen an größeren Kollektiven durchgeführt (Abschnitt 4.3.).
c) Benachbarte synonyme und proteinverändernde Mutationen
Durch Sequenzierung des kodierenden Bereichs der neun NBS-like-Patienten habe ich ferner drei nahe beieinander liegende Mutationen im MDC1 Gen gefunden (3279C→T), (3298C→G) und (3335C→T).
Abbildung 4-11: Mutationen im Exon 9 des MDC1 Gens (I)
Sequenzierung des Sinnstranges im Exon 9. Hier werden die drei Mutationen, die nahe beieinander liegen gezeigt; oben ist die Wildtyp- im Vergleich zur Heterozygoten-Sequenz dargestellt
* *
*
*
* * Wildtyp
Heterozygot (3279C→T), (3298C→G), (3335C→T)
*
*
*
Wildtyp
Heterozygot P1745R
Homozygot P1745R
*
Wildtyp
*
*
Heterozygot V1791E
Homozygot V1791E
E r g e b n i s s e 77 Einen der untersuchten neun Patienten habe ich als heterozygot (A1230) für alle drei Basenveränderungen charakterisiert. Die erstgenannte Veränderung zieht keinen Aminosäureaustausch nach sich, die Aminosäure Prolin bleibt bestehen (P1093P). Die zweite Mutation führt zu einem Aminosäureaustausch von Prolin zu Alanin (P1100A); letztgenannte zu einem Aminosäureaustausch von Serin zu Phenylalanin (S1112F).
Darüber hinaus habe ich durch Sequenzierung des kodierenden Bereichs der neun NBSLD-Patienten weitere vier nahe beieinander liegende Mutationen in Exon 9 des MDC1 Gens gefunden. Die Probe A1230 konnte ich für alle vier Mutationen (3601A→C, 3609G→C, 3620T→C und 3672C→A) als heterozygot identifizieren.
Die erste Mutation führt zu einem Aminosäureaustausch von Threonin zu Prolin (T1201P).
Die zweite zieht keinen Aminosäureaustausch nach sich, die Aminosäure Valin bleibt bestehen (V1203V).
Die dritte Mutation führt zu einem Aminosäureaustausch von Leucin zu Prolin (L1207P).
Die letzte dieser vier Mutationen bringt keinen Aminosäureaustausch mit sich, die Aminosäure Threonin bleibt erhalten (T1224T).
Abbildung 4-12: Mutationen im Exon 9 des MDC1 Gens (II)
Sequenzierung des Sinnstranges im Exon 9. Hier werden vier nahe beieinander liegende Mutationen in Exon 9 gezeigt, oben ist die Wildtyp-, unten die Heterozygoten-Sequenz dargestellt
* * * *
Wildtyp
Heterozygot (3601A→C), (3609G→C), (3620T→C), (3672C→A)
*
* *
*
Bei diesen Mutationen folgte keine weitere Untersuchung und Testung an einem größeren Kollektiv hinsichtlich der Häufigkeit und Verteilung im Rahmen dieser Arbeit, sie treten jedoch vermutlich im Kopplungsungleichgewicht zu den zuvor gefundenen Varianten und zu einer ausführlicher untersuchten Insertion auf (s.u.).
d) Große Insertion im Exon 9
Durch Sequenzierung des kodierenden Bereichs der neun NBSLD-Patienten habe ich außerdem eine Insertion von 123 bp in Exon 9 des MDC1 Gens gefunden (3855ins123bp).
Auch in diesem Fall war nur die Probe A1230 unter den NBSLD-Proben heterozygot für diese Insertion. Vergleichende Sequenzanalysen haben ferner gezeigt, dass die Insertion der 123 bp, also 41 Aminosäuren, in einer Duplikation des „Repeats IV“ besteht (Einzelheiten zu den gefundenen Repeat-Typen in Abschnitt 4.3.).
Bei dieser großen Mutation erfolgten weitere Untersuchungen an größeren Kollektiven, um die Frage nach einem potenziellen Zusammenhang mit dem gehäuften Auftreten von Mammakarzinomen zu beleuchten. Da die in diesem Abschnitt erläuterten Mutationen alle bei derselben Probe identifiziert wurden, sollte ferner durch weitere Untersuchungen geprüft werden, ob die verschiedenen Mutationen generell gemeinsam auftreten (Abschnitt 4.3.).
E r g e b n i s s e 78 Abbildung 4-13: Große Insertion in Exon 9 des MDC1 Gens
Sequenzierung des Sinnstranges im Exon 9. Der obere Teil der Abbildung zeigt die Sequenz ohne Insertion des Repeats IV, der untere Teil verdeutlicht die Veränderungen durch die Insertion
Wildtyp, ohne Insertion des Repeats IV
Heterozygotie für die Duplikation des Repeats IV