Synonyme Mutation im kodierenden Bereich

Wildtyp

Heterozygot

*

Q1545R

Bei dieser Mutation folgte im Rahmen meiner Arbeit keine weitere Untersuchung und Testung bei einem größeren Kollektiv hinsichtlich der Häufigkeit und Verteilung.

4.2.3.1.4. Synonyme Mutation im kodierenden Bereich

Durch Sequenzierung des kodierenden Bereichs des MDC1 Gens der neun NBSLD-Patienten habe ich eine Mutation in Exon 9 gefunden (3705C→T). Einen der untersuchten neun Patienten habe ich als heterozygot (A1235) für diesen Basenaustausch charakterisiert. Doch zieht diese Mutation keinen Aminosäureaustausch nach sich, die Aminosäure Serin bleibt erhalten (S1235S).

Abbildung 4-16: Mutation 3705C→T im Exon 9 des MDC1 Gens

Dargestellt ist der Basenaustausch 3705C→T (Sternchen) bei einer heterozygoten Probe im Vergleich zur Wildtyp-Probe

* _Wildtyp

Heterozygot 3705C→T

*

Bei dieser Mutation folgte im Rahmen meiner Arbeit keine weitere Untersuchung und Testung bei einem größeren Kollektiv hinsichtlich der Häufigkeit und Verteilung, da sie das kodogene Potenzial nicht verändert und keine neue Spleißstelle erzeugt.

E r g e b n i s s e 80 4.2.3.1.5. Sequenzänderungen im kodierenden Bereich des MDC1 Gens

Durch die PCR und Sequenzierung des kodierenden Bereichs der NBSLD-Proben habe ich fünf Sequenzänderungen aufgedeckt, die bisher anscheinend fehlerhaft in der Literatur veröffentlicht wurden. Für jede der fünf Veränderungen sind alle der untersuchten neun NBSLD-Patienten als homozygot identifiziert.

Tabelle 4-2: Sequenzänderungen im MDC1-Gen:

Exon Position Sequenzänderung Aminosäuren NBSLD-Proben

gefunden durch 4 751 AAA zu GAA Lysin zu Glutamat A1228-A1236 Sequenzierung 4 1080 GGC zu GGT Glycin zu Glycin A1228-A1236 Sequenzierung

4 1756 GCC zu TCC Alanin zu Serin A1228-A1236 Sequenzierung

9 4527 GAT zu GAG Aspartat zu Glutamat A1228- A1236 Sequenzierung 9 4618 CCC zu TCC Prolin zu Serin A1228- A1236 Sequenzierung

Es handelt sich zum einen um drei Sequenzänderungen im Exon 4, von denen zwei zu einem Aminosäureaustausch führen. Zunächst wäre die Änderung (751A→G) zu nennen, die zu einem Aminosäureaustausch von Lysin zu Glutamat (K251E) führt. Ferner fand ich die Sequenzänderung (1080C→T), diese führt allerdings zu keinem

Aminosäureaustausch, die Aminosäure Glycin bleibt erhalten (G360G). Außerdem konnte ich die Sequenzänderung (1756G→T) identifizieren, die einen Aminosäureaustausch von Alanin zu Serin (A586S) nach sich zieht. Des weiteren konnte ich zwei Sequenzänderungen in Exon 9 des MDC1-Gens identifizieren, die beide Aminosäuresubstitutionen nach sich zogen.

Zunächst wäre die Veränderung (4527T→G) zu nennen, diese Sequenzänderung führt zu einem Aminosäureaustausch von Aspartat zu Glutamat (D1509E). Ferner konnte ich die Sequenzänderung (4618C→T) identifizieren, die zu einem Aminosäureaustausch von Prolin zu Serin (P1540S) führt.

Abbildung 4-17: Sequenzänderungen in Exon 4 und Exon 9 des MDC1 Gens

a) Darstellung der homozygoten Sequenzänderungen in Exon 4, entsprechende Positionen sind jeweils mit Sternchen markiert. Der obere Abschnitt zeigt die Veränderung K→E an Position 251, in der Mitte wird 1080C→T gezeigt, im unteren Abschnitt wird A586S angeführt

b) Hier werden die zwei Sequenzänderungen in Exon 9 gezeigt, im oberen Abschnitt ist die Veränderung D1509E zu sehen, im unteren Abschnitt wird die Änderung P1540S gezeigt. Die jeweilige Position ist durch ein Sterchen markiert

a) b)

*

*

*

Homozygot

K251E * Homozygot

D1509E

Homozygot P1540S Homozygot *

1080C→T

Homozygot A586S

E r g e b n i s s e 81 4.2.3.1.6. Intronständige Mutationen des MDC1 Gens

Durch die Sequenzierung der neun NBSLD-Patienten konnte ich vier Mutationen im exonnahen Intronbereich des MDC1 Gens finden. Die Probe A1230 war heterozygot für alle vier Veränderungen. Zwei Mutationen befanden sich im Intron 5 des MDC1 Gens (2129-52A→G und 2129-8C→G), zwei im Intron 14 (6270+16T→C und 6270+83G→A).

Die übrigen acht getesteten NBSLD-Proben waren unauffällig.

Abbildung 4-18: Mutationen im Intron 5 des MDC1 Gens

Dargestellt ist im oberen Abschnitt die Wildtyp-Sequenz des Intron 5 im Vergleich zur unten gezeigten heterozygoten Sequenz mit den Mutationen 2129-52A→G und 2129-8C→G (Positionen sind durch Sternchen markiert)

* *

Wildtyp

* * Heterozygot

(2129-52A→G), (2129-8C→G)

Bezüglich der Mutationen im Intron 5 fanden weitere Untersuchungen hinsichtlich der Auswirkungen auf das entstehende Genprodukt statt. Diese werden in Abschnitt 4.2.3.2.

ausführlich erläutert.

Abbildung 4-19: Mutationen im Intron 14 des MDC1 Gens

Hier wird im oberen Abschnitt die Wildtyp-Sequenz, im unteren die heterozygote Sequenz mit den Mutationen 6270+16T→C und 6270+83G→A (Sternchen) im exonnahen Intronbereich verbildlicht

Wildtyp

*

* *

Heterozygot

(6270+16T→C), (6270+83G→A)

*

Im folgenden habe ich weitere Untersuchungen der Mutationen des Introns 14 durchgeführt.

Dazu habe ich zunächst die cDNA der Proben mittels Primern amplifiziert, die die Exons 12 und 14 einschlossen (siehe Tabelle 3-7), und die RT-PCR-Produkte anschließend sequenziert.

Diese zeigte jedoch keine Auffälligkeiten.

E r g e b n i s s e 82 4.2.3.2. Alternatives Spleißen der MDC1-mRNA

Bezüglich der zwei Mutationen im Intron 5 (2129-52A→G und 2129-8C→G, Kapitel 4.2.3.1.4.) fanden weitere Untersuchungen hinsichtlich der Auswirkungen auf das entstehende Genprodukt statt. Dazu habe ich die cDNA der Proben mit einem Primerpaar amplifiziert, das die Exons 4 bis 7 umfasst und die RT-PCR-Produkte sequenziert. Hierbei stellte sich heraus, dass diese ein alternatives Spleißprodukt enthielten, welches drei Basen kürzer ist.

Abbildung 4-20: Alternatives Spleißen

Dargestellt wird die cDNA des MDC1 Gens im Bereich des Exon 5 bis Exon 6. Hierbei ist zu erkennen, dass ein alternatives Spleißprodukt besteht, welches drei Basen kürzer ist als die Wildtyp-Sequenz

Exon 5 ↓ Exon 6 cDNA mit alternativem

Splicing-Produkt

Zur Erklärung des alternativen Spleißvorgangs untersuchte ich mittels des Programms von Yeo und Burge die reguläre und die alternative Akzeptorstelle:

reguläre Akzeptorstelle: intron 5….ag/CAGTCC…exon 6 MaxEntScore: 7.16 alternative Akzeptorstelle: intron 5….agcag/TCC… exon 6 MaxEntScore: 3.70

Die Werte ergeben eine relativ hohe Akzeptanz der alternativen zur regulären Akzeptorstelle, wenngleich die reguläre Stelle einen deutlich höheren Score aufweist.

Zur besseren relativen Quantifizierung der beiden Speißprodukte amplifizierte ich den Bereich nochmals mit fluoreszenzmarkierten Primern (Abschnitt 3.3. und 3.4.). Es folgte eine restriktionsenzymatische Spaltung der RT-PCR-Produkte mit dem Enzym Rsa I (Abschnitt 3.8.), um die Größe der Fragmente in den optimalen Bereich von maximal 350 Bp für die weitere Untersuchung mittels Fragmentlängenanalyse zu bringen. Es entstanden Fragmente von 304 Bp und 219 Bp. Parallel zu den Patientenzellproben amplifizierte ich auch cDNA ausgewählter Gewebeproben (Tabelle 4-4). Danach unterzog ich sowohl die Patientenproben, als auch die Gewebeproben der Fragmentlängenanalyse mittels Kapillarelektrophorese (Abschnitt 3.9.).

Abbildung 4-21: Fragmentlängenanalyse bei den Patientenproben

Die Abbildung zeigt das Ergebnis der Fragmentlängenanalyse exemplarisch bei zwei Patientenproben der NBSLD-Patienten. Deutlich zu erkennen ist ein kleineres alternatives Spleißprodukt neben dem größeren normal langen Spleißprodukt des MDC1. Das kleinere Produkt macht etwa einVierteldes Wildtyp-Produktes aus.

Zwei Patientenproben mit alternativem Spleißprodukt Alternatives

Spleißprodukt

Altern

Normal langes Spleißprodukt

Normal langes Spleißprodukt atives

Spleißprodukt

E r g e b n i s s e 83 Zu erkennen sind einzelne Auffälligkeiten bestimmter Proben. Das um ein Codon kürzere Fragment stellte bei den sechs Patientenproben im Mittel 22% der Gesamtmenge (von 27%

bei A1229 bis 18% bei A1235) dar. Das alternative Spleißen bei der Probe A1230, welche die beiden intronständigen Varianten birgt, unterschied sich nicht signifikant von den anderen Proben. Diese Ergebnisse wurden einmal wiederholt und waren reproduzierbar.

Tabelle 4-3: Fragmentlängenanalyse bei den Patientenproben

Die Tabelle zeigt das Ergebnis der Fragmentlängenanalyse der Patientenproben. Hierbei gab es keinen signifikanten Unterschied der Probe A1230 zu den anderen Proben. Es gab lediglich einzelne Auffälligkeiten bestimmter Proben (siehe Text)

RT-Nummer A-Nummer L-Nummer Kurzes Fragment (% von 100%)

Langes Fragment (% von 100%)

Verhältnis

kurzes/langes Fragment

502 1228 248 22 78 27,8

503 1229 261 27 73 36,3

504 1230 262 21 79 27,3

505 1231 263 21 79 25,9

506 1232 264 23 77 29,4

507 1235 268 18 82 22,3

Mittelwert 22 78 28,2

Standardabweichung 3,0 3,0 4,7

Es bestehen nicht von allen neun NBSLD-Patienten Zelllinien oder cDNA-Proben; die Patientenproben A1233, A1234 und A1236 waren lediglich als genomische DNA-Proben verfügbar. Aufgrund dessen konnte ich die Fragmentlängenanalyse bei diesen drei Patienten nicht vornehmen.

Abbildung 4-22: Fragmentlängenanalyse bei den Gewebeproben

Diese Abbildung zeigt exemplarisch zwei der getesteten Gewebeproben. Hierbei sind sowohl bei der Probe Milz, als auch Magen ein alternatives Spleißprodukt zu erkennen, welches etwa ein Drittel des normal langen Spleißproduktes beträgt

Alternatives Spleißprodukt

Normal langes Spleißprodukt

Alternatives Spleißprodukt

Normal langes Spleißprodukt

Gewebeprobe Milz mit alternativem Spleißprodukt

Gewebeprobe Magen mit alternativem Spleißprodukt

E r g e b n i s s e 84 Bei den Gewebeproben zeigte sich das alternative Spleißen in jedem Gewebe. Das um ein Codon kürzere Fragment stellte bei den Gewebeproben im Mittel 20% der Gesamtmenge dar, wobei zum einen die Proben aus Testis und Thymus nach oben (24% und 23%), zum anderen die Proben aus Milz und Magen nach unten (16% und 15%) abwichen. Diese Ergebnisse ließen sich ebenfalls wiederholt reproduzieren.

Tabelle 4-4: Fragmentlängenanalyse bei den Gewebeproben

Die Tabelle stellt die Ergebnisse der Fragmentlängenanalyse bei den Gewebeproben dar. Hierbei gab es keine signifikanten Auffälligkeiten.

Probe (Abkürzung) Gewebeprobe Kurzes Fragment (% )

Langes Fragment (%)

Verhältnis

kurzes/langes Fragment (%)

Ni Niere 18 82 21,5

Lu Lunge 21 79 25,8

Te Testis 24 76 31,9

Th Thymus 23 77 30,7

Thy Thymus 21 79 26,2

Mi Milz 16 84 18,4

Ma Magen 15 85 17,2

Mittelwert 19,7 80,3 24,5

Standardabweichung 3,5 3,5 5,7

Wie aus Tabelle 4-3 und 4-4 ersichtlich, lässt sich kein signifikanter Unterschied der Mittelwerte zwischen den Patientenproben (22%) und den Normalgewebsproben (19,7%) finden.

Anzumerken seien noch zwei Auffälligkeiten:

1. Die Amplifizierung der vorhandenen cDNA-Proben aus Herzgewebe, von denen mir drei verschiedene zur Verfügung standen, gelang auch nach mehrmaligen Wiederholungen in keinem Fall. Um auszuschließen, dass die cDNA der Herzproben fehlerhaft ist, habe ich eine Kontroll-PCR der Proben mit Actin-Primern vorgenommen. Diese zeigte starke Signale der betreffenden Proben. Es ist also zu vermuten, dass dieses Fragment (eventuell das gesamte MDC1 Transkript) im Herzgewebe nur sehr gering exprimiert wird. Diese Hypothese könnte in späteren Versuchen mittels Real-Time PCR geprüft werden.

Abbildung 4-23: Actinkontrolle der Herzproben

Hier werden die drei getesteten Herzproben gezeigt, wobei die Actinkontrolle bei allen positiv ist. Actin lässt sich also bei allen drei Proben nachweisen.

Herzproben

1 2 3

H2O KB-

Actin→

Leiter

E r g e b n i s s e 85 2. Bei der MDC1-PCR der cDNA-Proben war im Ethidiumbromid-gefärbten Agarosegel noch eine zusätzliche kleinere Bande von etwa 70 Basen Größe zu sehen. Um diese Bande genauer charakterisieren zu können, habe ich sie mittels CutPrep- und Freeze&Squeeze-Verfahren isoliert und anschließend mittels PCR reamplifiziert (Abschnitt 3.6.).

Abbildung 4-24: Isolierung und Reamplifizierung der „kleinen Bande“

Die Abbildung zeigt eine Bande von ca. 70 Bp sowohl in den Patienten- und Gewebeproben, als auch im Leerwert

1 2 3

KB- Leiter ca. 70 Bp→

1: H2O

2: Patientenprobe 3:Gewebeprobe Thymus

Die Sequenzierung dieses Fragmentes hat gezeigt, dass es sich lediglich um die zusammengelagerten Primerpaare handelt ("Primerdimere"). Aufgrund dessen ist auch in der H2O-Probe (siehe Abbildung 4-28) die Bande zu sehen.

Zusammenfassend zeigte die Analyse der Exons 4 bis 7 demnach einen alternativen Spleiß-Vorgang auf, durch den eine um eine einzelne Aminosäure verkürzte Isoform des MDC1-Proteins zu erwarten ist. Dieses alternative Spleißen ist scheinbar ubiquitär und findet, zumindest in den lymphoblastoiden Zellen, unabhängig von dem Vorliegen der beiden in Abschnitt 4.2.3.1.4. beschriebenen intronständigen Mutationen statt.

E r g e b n i s s e 86 4.2.3.3. Westernblotanalysen des MDC1-Proteins

Nach den oben beschriebenen Untersuchungen auf Genebene, die deskriptiver Natur sind, folgte die gezielte Betrachtung des Proteins MDC1 nach Bestrahlung bei den NBSLD-Zelllinien. Dieses hatte zum Ziel, die Expression des MDC1 Proteins bei NBSLD-Patienten zu überprüfen und seine Regulation nach Bestrahlung der Zell-Linien mit 10 bzw. 20 Gy zu untersuchen. Hierzu habe ich sechs von neun (genaueres siehe unter 4.2.3.2.) lymphoblastoide Zell-Linien der NBSLD-Patienten nach sechswöchiger Führung geteilt und unbestrahlt bzw.

nach 10 Gy und 20 Gy Bestrahlung aufgearbeitet und untersucht (Abschnitt 3.10. und 3.11.).

Da bis zu diesem Zeitpunkt noch keine Untersuchung des MDC1 auf Proteinebene in den Forschungslaboratorien der Abteilung Gynäkologie und Geburtshilfe vorgenommen worden war, galt es zunächst, den geeigneten Antikörper zu finden und diesen dann entsprechend zu optimieren.

Als erstes wurde der MDC1-Antikörper der Firma Serotec getestet, der zum Bestellzeitpunkt der erste und einzige kommerziell vertriebene Antikörper zum behandelten Protein war.

Jedoch erbrachte dieser auch nach wiederholten Rücksprachen mit der Firma nicht die gewünschten Resultate. Es zeigte sich starker Hintergrund, sodass die Blots vielfach schwer quantitativ auswertbar waren. Ferner waren die drei für das MDC1-Protein spezifischen Banden nicht gut voneinander abzugrenzen (Abbildung 4-29).

Abbildung 4-25: MDC1 Proteinnachweis (Serotec)

In der Abbildung ist in der Mitte der MDC1-Blot mit dem getesteten Antikörper der Firma Serotec zu sehen.

Dieser ist kaum auswertbar. Im oberen Abschnitt ist die DNA-PK als Ladekontrolle abgebildet.

+ : Bestrahlungmit10 Gy

WT

NBSLD-Patient

Da die Ergebnisse auf diese Weise also keineswegs zufrieden stellend waren, entschied ich mich, erneut nach einem MDC1-Antikörper zu suchen. Mittlerweile bot zusätzlich die Firma Abcam einen Antikörper zu dem zu untersuchenden Protein an, sodass ich mich nach Rücksprache mit dem Betreuer meiner Doktorarbeit Dr. Thilo Dörk dazu entschied, diesen zu testen. Es stellte sich heraus, dass die einzelnen Banden bei sehr geringem Hintergrund sehr viel besser voneinander abzugrenzen waren (Abbildung 4-30). Durch die mit den NBSLD-Zelllinien, zwei Wildtyp-Proben und einer AT-Zelllinie anschließend durchgeführten Western Blots ließen sich folgende Auffälligkeiten finden und präzisieren:

• Bei allen untersuchten Proben werden drei gut abgrenzbare Banden detektiert, deren mittlere die relativ schwächste Intensität zeigt. Dies entspricht dem Triplettmuster in früheren Publikationen (Stewart et al. 2003).

• Die Intensität aller drei detektierten Banden nahm nach Bestrahlung stark ab, wobei insbesondere die obere und untere an Intensität verlieren. Hierbei ist zum einen eine Intensitätsabnahme vom unbestrahlten zum mit 10 Gy bestrahlten (mit 10 Gy bestrahlte Proben betrugen zwischen 12 und 30% der Intensität der unbestrahlten), als

E r g e b n i s s e 87 auch weiterhin zum mit 20 Gy bestrahlten Material (mit 20 Gy bestrahlte Proben betrugen zwischen 10 und 17% der Intensität der unbestrahlten und 58 bis 86% der mit 10 Gy bestrahlten) nachweisbar. Dieses war sowohl bei allen untersuchten NBSLD-, als auch bei den WT-Proben nachzuweisen, jedoch nicht bei der ATM-negativen Probe.

• Nach Bestrahlung kam es im Vergleich zu den unbestrahlten Proben der jeweils gleichen Zell-Linie zu einer Mobilitätsverschiebung nach oben, also einer Vergrößerung des Proteins. Auch dieser "Shift" war bei allen untersuchten Proben mit Ausnahme der ATM-negativen Probe zu erkennen.

Abbildung 4-26: MDC1 (abcam) mit DNA-PK-Kontrolle I

Diese Abbildung zeigt einen MDC1-Western Blot mit dem Antikörper der Firma abcam. Die drei einzelnen Banden sind gut voneinander abgrenzbar, der Shift nach Bestrahlung ist bei den NBSLD- und der Wildtyp-Probe zu erkennen, nicht jedoch bei der AT-Probe

L261 - + ++

L256

- + ++

L70 - + 450 kDa→

250 kDa→

←^DNA-PKcs

←^MDC1

NBSLD-Patient

WT

AT-Patient L248

- + ++

NBSLD-Patient

- : unbestrahlt + : mit 10 Gy bestrahlt + : mit 20 Gy bestrahlt

Unter den NBSLD-Patienten stellte sich lediglich die Probe L262 als auffällig heraus. Diese Probe entspricht der oben untersuchten DNA-Probe A1230, bei der ich die Insertion von 123 bp, also 41 Aminosäuren, nachweisen konnte. Im Western Blot zeigte sich, dass die Intensität der unteren Bande der Probe verhältnismäßig stärker und breiter, war, als die der NBSLD- oder der WT-Proben. Möglicherweise besteht diese aus zwei dicht beieinander liegenden Banden, diese Doppelbande könnte durch die heterozygote 41 Aminosäuren-Insertion erklärbar sein. Dieser Unterschied war besonders gut im unbestrahlten Zustand zu erkennen, bestand aber auch nach Bestrahlung (Abbildungen 4-27 und 4-28).

Bei der Linie L262 betrug die relative Intensität der unteren Bande ca. 47%, diese Intensität änderte sich nach Bestrahlung mit 10 Gy (ebenfalls 47%) bzw. 20 Gy (45,5%) kaum. Sowohl bei den WT-, als auch bei den anderen NBS-like-, sowie der ATM-negativen Probe betrugen die Intensitäten der unteren Bande vor Bestrahlung lediglich zwischen 36 bis 39%, nach Bestrahlung mit 10 Gy (zwischen 34 und 39%) bzw. mit 20 Gy (zwischen 36 und 39%) änderte die die relative Intensität auch bei diesen Proben kaum (Abbildungen 4-27 und 4-28).

E r g e b n i s s e 88 Abbildung 4-27: MDC1 (abcam) mit DNA-PK-Kontrolle II

Diese Abbildung zeigt einen Western Blot mit der Probe L262 (entspricht der A1230, die bei den Analysen auf der Ebene der genomischen DNA durch ein polyvariantes Allel und die 41as-Insertion aufgefallen war) im Vergleich mit einer Wildtyp- und einer AT-Patienten-Probe

Abbildung 4-28: MDC1 (abcam) mit DNA-PK-Kontrolle III

In dieser Abbildung ist die Probe L262 im Vergleich zu einer weiteren NBSLD- und einer AT-Probe dargestellt.

Hierbei wird die intensivere und breitere untere Bande der Probe L262 deutlich. Ferner ist hier gut zu erkennen, dass der "Shift" bei der AT-Probe nach Bestrahlung ausbleibt. Die MDC1-Expression bei der AT-Probe ist deutlich schwächer als bei den beiden NBSLD-Proben

←^MDC1

←^MDC1

←^DNA-PKcs

←^DNA-PKcs

450 kDa→

450 kDa→

250 kDa→

250 kDa→

L169

- + ++

WT NBSLD-Patient

L262

- + ++

AT-Patient L70 - +

L262

- + ++

NBSLD-Patient

L70

- +

AT-Patient NBSLD-Patient

L248

- + ++

Eine weitere Auffälligkeit zeigte sich bei näherer Betrachtung der mittleren Bande, die in unbestrahltem Zustand bei allen Proben etwa mittig zwischen den beiden äußeren zu sehen war. Nach Bestrahlung jedoch befindet sich die mittlere Bande bei allen Proben außer der Linie L262 (und der AT-Linie) in relativ geringerem Abstand zur oberen Bande und somit größerem Abstand zur unteren. Dagegen bleibt im Zuge des bereits beschriebenen "Shifts" der Abstand der oberen zur unteren Bande vor und nach Bestrahlung gleich bzw. unverändert.

Zusammenfassend zeigte die Westernblot-Analyse eine umfassende Regulation der elektrophoretischen Mobilität und Immunreaktivität des MDC1-Proteins nach Bestrahlung in ATM-positiven Zelllinien. Die Probe L262 mit der aufgrund der 123bp Duplikation erwarteten Insertion von 41 Aminosäuren war bei den Westernblot-Analysen die einzige auffällige NBSLD-Probe.

E r g e b n i s s e 89 4.3. Assoziationsstudien ausgewählter Mutationen der Gene LIG4, RINT1 und MDC1 beim Mammakarzinom

4.3.1. Mutationsscreening

Im folgenden habe ich mittels restriktionsenzymatischer Spaltung bei ausgewählten Mutationen ein Mutationsscreening bei 399 Patienten durchgeführt. Dieses Kollektiv bestand aus Proben von jeweils 133 Patienten mit unilateralem, 133 Patienten mit bilateralem Mammakarzinom und 133 Proben der Durchschnittsbevölkerung.

Die aufgeführte Tabelle 4-5 zeigt eine Übersicht der Assoziationsstudien.

Tabelle 4-5: Übersicht zu den Assoziationsstudien

In der Tabelle werden die Mutationen der untersuchten Gene LIG4, RINT1 und MDC1 in Zusammenhang mit dem Odds Ratio, den P-Werten und den errechneten 95%-Konfidenzinterallen aufgeführt. (A = Patienten mit unilateralem Mammakarzinom, B = Patienten mit bilateralem Mammakarzinom, C = Kontrollen)

Gen Exon Mutation Amino-säure

NBSLD- Proben

p-Werte Odds Ratio Konfidenzintervall Wild-typ

Hetero-zygot

Homo-zygot LIG4 - 1503T→C Aspartat,

synonym

Untere Grenze: 0,502 Obere Grenze: 1,443 B vs. C

Untere Grenze: 0,405 Obere Grenze: 1,189

A: 86

Untere Grenze: 0,516 Obere Grenze: 1,494 B vs. C

Untere Grenze: 0,481 Obere Grenze: 1,401

A: 87

Untere Grenze: 0,638 (A+B: 0,631) Obere Grenze: 9,296 (A+B: 7,467) B vs. C

Untere Grenze: 0,457 Obere Grenze: 7,487

A: 124

Untere Grenze: 0,470 (A+B: 0,425) Obere Grenze: 5,945 (A+B: 4,328) B vs. C

Untere Grenze: 0,244 Obere Grenze: 4,098

A: 125

Untere Grenze: 0,442 Obere Grenze: 1,419 B vs. C

Untere Grenze: 0,568 Obere Grenze: 1,762

A: 101

Untere Grenze: 0,061 Obere Grenze: 3,190 B vs. C

Untere Grenze: 0,924 Obere Grenze: 12,124

A: 131

Zunächst habe ich eine PCR mit anschließender restriktionsenzymatischer Spaltung mit dem Enzym Nla III bei dem Kollektiv der 399 Probanden durchgeführt.

E r g e b n i s s e 90 Abbildung 4-29: Restriktionsenzymatische Spaltung mit Nla III

Die Abbildung zeigt eine heterozygote und eine homozygote Probe für die synonyme Mutation 1503T→C im Vergleich zum Wildtyp

KB-Leiter 1-1 1-2 2-2

Bei diesem Screening konnte kein signifikanter Unterschied zwischen Patienten mit uni- oder bilateralem Mammakarzinom und Probanden aus der Durchschnittsbevölkerung festgestellt werden (χ²-Test, p = 0,609).

Tabelle 4-6: Ergebnisse des Screenings der synonymen Mutation 1503T→C

Die Tabelle zeigt die Ergebnisse des Mutationsscreenings, wobei kein signifikanter Unterschied zwischen den verschiedenen Kollektiven festzustellen war

Lig IV (1503T→C)

Kontrollkollektiv C

Trägerfrequenz 60,9% 35,3% 3,8% 100,0%

Träger 259 126 14 399

gesamt

Trägerfrequenz 64,9% 31,6% 3,5% 100,0%

Bezüglich einiger klinischer Parameter und möglicher Zusammenhänge mit der Mutation folgten weitere Tests (siehe hierzu Kapitel 4.3.2.).

Zudem erfolgte eine Berechnung der zu erwartenden Genotyphäufigkeiten nach der Hardy Weinberg-Regel. Hierbei zeigten sich bei dieser Mutation keine signifikanten Abweichungen der beobachteten Genotyphäufigkeiten von den erwarteten Frequenzen (Tabelle 4-7).

Tabelle 4-7: Allelhäufigkeiten der Mutation 1503T→C

Die Tabelle zeigt die erwarteten Allelfrequenzen im Vergleich zur aufgetretenen Häufigkeit der Genotypen. In der ersten Spalte sind die drei untersuchten Kollektive zusammengefasst, die darunter aufgeführten Spalten zeigen die Ergebnisse der einzelnen Kollektive.

Kollektiv Allelhäufigkeiten:

1503T→C (D501D)

Häufigkeit des Genotyps

Erwartete Frequenz A, B, C Frequenz des Allels ohne Mutation:

644/798 = 0,81

Frequenz des Allels mit Mutation:

154/798 = 0,19

A Frequenz des Allels ohne Mutation:

213/266 = 0,80

TT: 86/133 = 0,65 TC: 41/133 = 0,31

TT: 0,80² = 0,64

TC: 2x 0,80x 0,20 = 0,32

E r g e b n i s s e 91 Frequenz des Allels mit Mutation:

53/266 = 0,20

CC: 6/133 = 0,05 CC: 0,20² = 0,04 B Frequenz des Allels ohne Mutation:

222/266 = 0,83

Frequenz des Allels mit Mutation:

44/266 = 0,17

C Frequenz des Allels ohne Mutation:

209/266 = 0,79

Frequenz des Allels mit Mutation:

57/266 = 0,21

Zunächst habe ich mittels PCR das Exon 2 des RINT1 Gens amplifiziert, anschließend folgte eine restriktionsenzymatische Spaltung mit dem Enzym TspRI bei 399 Patienten.

Abbildung 4-30: Restriktionsenzymatische Spaltung mit TspRI

Abbildung 4-30: Restriktionsenzymatische Spaltung mit TspRI

Im Dokument Strahlensensibilitätsgenvarianten als potenzielle Ursache des Nijmegen Breakage Syndroms und bei Patientinnen mit bilateralem Mammakarzinom (Seite 87-118)