M Membran Hybond™-C extra
3.1. Zellkultur 1. Hintergrund
3.5.2. Vorgehensweise 1.) Gelansatz
3.5.2.1. Verwendete Lösungen und Puffer Tabelle 3-11: Agarose-Gele
Die Tabelle zeigt die Rezepte der verwendeten Agarose-Gele.
1% Agarose 0,3 g Agarose, ad 30 ml 1x TBE 1,5% Agarose 0.45 g Agarose,
ad 30 ml 1x TBE 2% Agarose 0,6 g Agarose,
ad 30 ml 1x TBE 3% Agarose 0,9 g Agarose,
ad 30 ml 1x TBE 3% NuSieve-Agarose 0,9 g NuSieve-Agarose,
0,3 g SeaKem-Agarose, ad 30 ml 1x TBE Tabelle 3-12: Puffer
Die Tabelle stellt die verwendeten Puffer dar.
10x TBE 108 g 54 g 7,2 g
→ Tris Borsäure EDTA
ad 1l Aqua bidest.
auf pH 8,3 einstellen Auftragpuffer 15%
10 mM 0,1-0,3%
→
Ficoll (oder 40% Sucrose) EDTA
Bromphenolblau ad Aqua bidest.
Kb-Leiter 50 µl 200 µl 750 µl
1x Kb-Leiter (1µg/µl) 5x Auftragpuffer Aqua bidest.
M e t h o d e n 53 3.6. “Cut Prep” oder „Freeze and Squeeze“
3.6.1. Hintergrund
Dieses Verfahren dient dazu, sehr gering konzentrierte Mengen an Nukleinsäurefragmenten zu isolieren, um sie (erneut) amplifizieren zu können.
3.6.2. Vorgehensweise
1.) Präparation auf dem UV-Tisch
Hierzu wurden die nach 3.5. bearbeiteten Agarose- oder NuSieve-Gele auf einem UV-Tisch bei 254 nm begutachtet und die zu isolierenden Banden identifiziert. Nun wurden unter Augen- und Hautschutz mit einem Skalpell die entscheidenden Banden im Gel ausgeschnitten.
Nach Kontrolle des ausgeschnittenen Bereichs konnte das Gelstück auf zwei verschiedene Arten weiter verarbeitet werden.
Zum einen konnte es direkt in Parafilm gehüllt und für 30 Minuten bei -20°C eingefroren werden. Anschließend konnte es unter leichtem Druck auf den Parafilm aufgetaut und in ein 0,5 ml Eppendorfgefäß Tropfen für Tropfen überführt werden („Freeze and Squeeze“, aus Laborjournal, Heft 5, 2004).
Die zweite Möglichkeit bestand darin, das Gelstück in ein 0,5 ml Eppendorfgefäß zu geben und mit 100 µl HPLC-Wasser zu überschichten und über Nacht bei 30-35°C zu inkubieren („Cut Prep“).
2.) Mögliche Weiterverarbeitung
Die aus beiden Methoden erhaltenen Suspensionen konnten nun erneut als Template in einer PCR reamplifiziert werden. Hierbei sollten sie allerdings mindestens entsprechend der Höhe der eigentlichen H2O-Menge in der Reaktion eingesetzt werden, wobei das Wasser sodann weggelassen wurde.
M e t h o d e n 54 3.7. Sequenzierung mit dem ABI PRISM™ 310 Genetic Analyzer
3.7.1. Hintergrund
Die Sequenzierung von PCR-Produkten wird in aller Regel nach der Kettenabbruchmethode von Sanger (Sanger et al. 1977, 1992) durchgeführt.
1.) Prinzipien der Kettenabbruchmethode
Die Methode beruht auf dem Prinzip, die Synthese des Tochterstranges des zu sequenzierenden DNA-Abschnittes basenspezifisch abzubrechen. Im Gegensatz zu der PCR wird nur ein sequenzspezifischer Primer zur linearen Amplifikation eingesetzt. Die Besonderheit besteht darin, dass dem Ansatz neben den Desoxyribonukleosidtriphosphaten (dNTP) auch Didesoxyribonukleosidtriphosphate (ddNTP) zugegeben werden. Diese unterscheiden sich von den dNTP dadurch, dass ihnen nicht nur am 2´-Kohlenstoff, sondern auch am 3´-Kohlenstoff eine Hydroxylgruppe fehlt. Durch das Fehlen der 3´-Hydroxylgruppe kann keine Phosphodiesterbindung ausgebildet werden, und es kommt somit zum Kettenabbruch der wachsenden DNA. Die ddNTP werden während der Amplifizierung ebenfalls eingebaut und erzeugen auf diese Weise von der DNA-Matrize eine Population von DNA-Fragmenten verschiedener Größe, die ein identisches 5´-Ende (wird durch den Primer festgelegt) und ein variables 3´-Ende (festgelegt durch ddNTP) besitzen.
Die Sequenzierung erfolgt nur in 5´-3´-Richtung. Meistens werden beide Stränge des zu sequenzierenden Abschnittes mit einem Forward- und einem Reverse-Primer sequenziert.
In meiner Arbeit erfolgte die Sequenzierung unter Verwendung des Kapillarsequenzierers
„ABI PRISM™ 310 Genetic Analyser“ mit Hilfe des „ABI PRISM™ Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kits“ (Applied Biosystems), wobei die Detektion über Fluoreszenz erfolgte.
3.7.2. Vorgehensweise
1.) Polyethylenglykol-Fällung (PEG)
Vor der Sequenzierung wurden die PCR-Produkte mit der Polyethylenglykolfällung gereinigt (siehe 3.4.), da verbliebene Primer und dNTP-Überschss die folgende Reaktion stören würden.
Hierbei wurden gleiche Volumenanteile PCR-Produkt und PEG-Lösung in einem 1,5 ml Eppendorfgefäß gemischt und für mindestens 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Danach wurde bei 4°C für 20 Minuten bei 13200 rpm zentrifugiert und anschließend wurde der Überstand äußerst vorsichtig mit einer Pipette abgenommen. Nun wurde das Pellet mit 100 µl absolutem Ethanol gewaschen, hierzu wird der reine Alkohol langsam am Gefäßrand herunter laufen gelassen. Nach wiederholter zwanzigminütiger Zentrifugation bei 13200 rpm wurde der Überstand möglichst vollstängig abgenommen und das Pellet in offenen Eppendorfgefäßen bei 50°C im Heizblock getrocknet. Dieser Vorgang dauerte ca. 5 Minuten.
Abschließend wurde das getrocknete Pellet in 25 µl HPLC-H2O aufgenommen und mittels Vortexer gut gemischt.
Die gereinigten PCR-Produkte wurden vor weiteren Arbeitsschritten erneut auf ein Agarosegel mit Ethidiumbromidzusatz aufgetragen und über UV-Licht kontrolliert.
PEG-Lösung:
262 g Polyethylenglykol 8000 1,2 g Magnesiumchloridhexahydrat
M e t h o d e n 55 4,2 g Natriumacetat
→ ad 1l Aqua bidest.
2.) Sequenzierreaktion
Anschließend wurde der Reaktionsansatz für die Sequenzierreaktion angesetzt. Hierzu wurden zunächst 1-7,5 µl gereinigtes PCR-Produkt (je nach Bandenstärke der PEG-Produkte im Agarosegel) in 0,5 ml Eppendorfgefäße auf Eis vorgelegt. Nun wurde pro Probe mit HPLC-Wasser auf 7,5 µl aufgefüllt, dazu wurden 1 µl Primer (forward oder revervse) und 1,5 µl Big Dye-Mix pipettiert. Das Gemisch sollte gut gemischt und danach aufgrund der geringen Menge des Ansatzes kurz anzentrifugiert (für ca. 4 Sekunden) werden. Die Proben wurden im Thermocycler der Sequenzierreaktion unterzogen.
Tabelle 3-13: 10 µl-Ansatz für die Sequenzierreaktion
Die Tabelle zeigt ein Rezept für einen Sequenzieransatz.
1-7,5 µl PEG-Produkt 6,5-0 µl HPLC-Wasser 1 µl Primer
1,5 µl Big Dye-Mix
Tabelle 3-14: Sequenzierprogramm
Die Tabelle stellt das verwendete Sequenzierprogramm dar.
Temperatur (°C) Zeit (m) Anzahl der Zyklen
Vordenaturierung 95 5:00 1
Amplifizierung Annealing Elongation Denaturierung
50 60 95
0:15 4:00 0:30
26
Kühlzyklus 10 beliebig
3.) Ethanol-Salz-Fällung
Nach der Sequenzierreaktion wurden die Proben mit 3 Volumenanteilen absolutem Ethanol (30 µl) und 1/10 Volumenanteil Natriumacetatlösung (1µl; 3 M) gemischt und für ca. eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Nach 30-40-minütiger Zentrifugation bei 13200 rpm im Kühlraum wurde vorsichtig der Überstand abgenommen und verworfen.
Anschließend wurde das Pellet mit 300 µl 70% Ethanol gewaschen und 20 Minuten bei 13200 rpm zentrifugiert. Erneut wurde der Überstand mit einer Pipette vorsichtig abgenommen und verworfen. Das Pellet wurde bei 50°C bei geöffnetem Deckel getrocknet (ca. 15 Minuten) und mit 25 µl 95% Formamid überschichtet, gut gemischt und für 4 Sekunden anzentrifugiert.
Das Gemisch sollte wiederum mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur oder besser über Nacht im Kühlschrank dunkel stehen.
4.) Elektrophoretische Trennung mittels ABI PRISM™ 310 Genetic Analyzer
Vor der kapillarelektrophoretischen Trennung wurden die Proben bei 93°C mit geschlossenem Deckel für 2 Minuten denaturiert und danach auf Eis abgekühlt.
Die Elektrophorese erfolgte nach Angaben des Herstellers Applied Biosystems bei 50°C und 7,5 kV im POP-6-Polymer. Die Basenabfolge wurde mittels der "Sequence Analysis Software" (Applied Biosystems) ausgewertet. Die Überprüfung erfolgte nach Ausdruck der Sequenzen manuell. Die verwendeten Sequenzierprimer sind unter 3.3 aufgeführt.
M e t h o d e n 56 3.8. Restriktionsenzymatische Spaltung
3.8.1. Hintergrund
Restriktionsenzyme, die auch als Restriktionsendonukleasen bezeichnet werden, sind Enzyme, die den bakteriellen Organismus vor eingedrungener Fremd-DNA schützen. Sie haben die Fähigkeit, spezifische Basensequenzen in einer DNA-Doppelhelix zu erkennen und beide Stränge der Helix an spezifischen Stellen zu schneiden (Pingoud und Jeltsch, 2001). Die zelleigene DNA ist vor der Spaltung durch Methylierung der jeweiligen Erkennungssequenzen geschützt.
1.) Prinzipien der verwendeten Restriktionsenzyme
Zahlreiche Restriktionsenzyme erkennen spezifische Sequenzen aus 4 bis 8 Basenpaaren und spalten dort in jedem Strang eine Phophodiesterbindung. Die erkannten Sequenzen stellen häufig Palindrome dar, d. h. sie sind zu sich selbst komplementär. Die Schnittstellen sind somit punktsymmetrisch angeordnet.
Liegt die Schnittstelle exakt am Symmetriepunkt, entstehen Restriktionsfragmente mit glatten Enden, liegt die Schnittstelle nicht am Symmetriepunkt, entstehen Restriktionsfragmente mit 5´- oder 3´-überhängenden Enden. Mittlerweile sind zahlreiche Restriktionsenzyme und ihre Schnittstellen bekannt und im Handel erhältlich.
Stumpfe Enden (blunt ends):
Beispiel: Erkennungssequenz von Alu I 5´…AG↓CT…3´
3´…TC↑GA…5´
Kohäsive Enden (sticky ends):
Beispiel: Erkennungssequenz von Nla III 5´…CATG↓…3´
3´...↑GTAC…5´
3.8.2. Vorgehensweise
Im Rahmen dieser Arbeit sind Restriktionsenzyme für verschiedene Anwendungen zum Einsatz gekommen.
1.) Direkter Nachweis einer Mutation oder eines Polymorphismus:
Durch Anwendung der Restriktionsenzyme konnten Mutationen und Polymorphismen nachgewiesen werden, wenn die auftretende Mutation eine neue Spaltstelle entfernt oder erzeugt. Nach dem Verdau der entsprechenden PCR-Produkte waren die entscheidenen Banden auf einem Agarosegel oder einem NuSieve-Agarosegel unter Zugabe von Ethidiumbromid über UV-Licht sichtbar.
M e t h o d e n 57 Tabelle 3-15: Mittels restriktionsenzymatischer Spaltung getestete Mutationen und
Polymorphismen
Hier werden die entworfenen Primer für die mittels restriktionsenzymatischer Spaltung getesteter Analysen des MDC1-Gens unter Angabe der Länge des PCR-Produkts und der Annealingtemperatur, sowie weiteren Angaben zu den Restriktionsbedingungen gezeigt.
Exon Primer -forward -reverse
Sequenz in 5´Æ3´-Richtung -forward
2.) Nachweis einer Mutation durch eine primerinduzierte Spaltstelle:
War keine natürliche Erkennungsstelle verfügbar, so konnte sie artifiziell durch einen sogenannten Mutageneseprimer erzeugt werden. Vor dem restriktionsenzymatischen Spaltung wurde dann eine PCR durchgeführt, bei der ein Primer verwendet wurde, der bis kurz vor der Mutation bindet und zur "template"-DNA nicht exakt komplementär ist. Durch diese Fehlpaarungsstelle entstehen von der ursprünglichen DNA abweichende Kopien, deren Sequenz aber in Verbindung mit der Mutation entweder eine neue Spaltstelle ergibt oder eine vorhandene wegfallen lässt.
Tabelle 3-16: Mutationen und Polymorphismen, die durch eine primerinduzierte Spaltstelle mittels restriktionsenzymatischer Spaltung getestet wurden
Hier werden die entworfenen Primer für die mittels primerinduzierter Spaltstelle mit restriktionsenzymatischer Spaltung getesteter Analysen des MDC1-Gens unter Angabe der Länge des PCR-Produkts und der
Annealingtemperatur, sowie weiteren Angaben zu den Restriktionsbedingungen gezeigt.
Exon Primer -forward -reverse
Sequenz in 5´Æ3´-Richtung -forward
3.) Spaltung eines PCR-Produktes (>300bp) in kleinere Produkte (~300bp) für die Fragmentlängenanalyse mit dem ABI PRISM™ 310 Genetic Analyzer:
Bei der Fragmentlängenanalyse mit dem ABI PRISM™ 310 Genetic Analyzer sollten PCR-Produkte bis maximal 350bp eingesetzt werden. Aufgrunddessen wurde vor der Fragmentlängenanalyse eine restriktionsenzymatische Spaltung durchgeführt.
Tabelle 3-17: PCR-Produkte, die zur Verwendung bei der Fragmentlängenanalyse gespalten wurden
Hier werden die entworfenen Primer für die Fragmentlängenanalysen des MDC1-Gens unter Angabe der Länge des PCR-Produkts und der Annealingtemperatur, sowie weiteren Angaben zu den Restriktionsbedingungen gezeigt.
Exon Primer -forward -reverse
Sequenz in 5´Æ3´-Richtung -forward
523 2129-52AÆG 4cDF 7cDR
523 2129-52AÆG Fragment-längenanalyse
-
M e t h o d e n 58 3.8.3. Verwendete Enzyme und Puffer
Tabelle 3-18: Zusammensetzung der Probenpuffer
Die Tabelle zeigt die Zusammensetzung der verwendeten Probenpuffer.
Puffer Dithiothreitol
pH-Wert
Tabelle 3-19: Enzyme und die verwendeten Bedingungen
Die Tabelle stellt die verwendeten Enzyme und die entsprechenden Bedingungen zur restriktionsenzymatischen Spaltung dar.
3´↑NNGTG/CACNN5´
MDC1,
Tabelle 3-20: Allgemeiner Ansatz (wird auf Eis pipettiert)
Die Tabelle zeigt das Rezept für einen Ansatz zur restriktionsenzymatischen Spaltung.
7,5 µl HPLC-Wasser
1,5 µl Enzymspezifischer 10x Puffer 0,15 µl BSA (nicht bei allen Enzymen) 6 µl PCR-Produkt
x µl Enzym
Bei der restriktionsenzymatischen Spaltung zur Verwendung zur Fragmentlängenanalyse wurde das gesamte PCR-Produkt eingesetzt.
M e t h o d e n 59 3.9. Fragmentanalyse
3.9.1. Hintergrund
Das Verfahren der Fragmentanalyse ermöglicht die vergleichende Untersuchung der quantitativen Expression von Genprodukten. Hierbei kann bei einem bestimmten Abschnitt der DNA- oder cDNA-Sequenz durch einen fluoreszenzmarkierten 6-FAM-Primer bis auf eine Base die genaue Länge der untersuchten Nukleinsäure ermittelt werden. Hierdurch ist es möglich, sogar kleinste Deletionen oder Spleißvarianten genau zu identifizieren.
Um die Größe fehlerfrei ausdrücken zu können, wird ein interner Längenstandard mitgeführt.
Dieser ermöglicht bei jeder Auftrennung ein individuelles und reproduzierbares „Sizing“ der Fragmente und eine Kompensation der Laufvariation. In der vorliegenden Arbeit fand der
„Genescan-500 ROX“-Längenstandard (Firma Applied Biosystems) Anwendung.
Dieser gibt folgende Längen (in bp) vor:
35, 50, 75, 100, 139, 150, 160, 200, 250, 300, 340, 350, 400, 450, 490, 500
Da die Auftrennung bis zu 350 bp optimal ist, sollte das eingesetzte Nukleinsäurefragment diese Größe nicht überschreiten.
Die gewählten PCR-Produkte sind zunächst größer gewählt worden, um zum einen eine genaue Spleiß-Analyse zu gewährleisten, da zu diesem Zeitpunkt die genaue Anzahl der fehlenden Basen noch unbekannt war, und zum anderen um beispielsweise den Verlust eines kompletten Exons nicht zu übersehen..
Zur quantitativen Berechnung dient die Angabe „Peak Area“, also jene Fläche, die sich unter der zu analysierenden Kurve befindet. Diese Daten werden bereits durch die Auswertesoftware geliefert und bedürfen lediglich einer vergleichenden Beurteilung bzw.
Berechnung zueinander.
3.9.2. Vorgehensweise
1.) Amplifizierung mittels PCR
Zunächst wurde eine PCR des gewünschten Sequenzabschnittes mit einem 6-FAM-Primer vollzogen.
Tabelle 3-21: Bedingungen für fluoreszenzmarkierte Primer zum Einsatz in der PCR
Hier werden die entworfenen floureszenzmarkierten Primer für Analysen des MDC1-Gens unter Angabe der Länge des PCR-Produkts und der Annealingtemperatur, sowie weiteren Angaben zu den
Restriktionsbedingungen gezeigt.
523 2129-52AÆG Fragment-längenanalyse
2.) Restriktionsenzymatische Spaltung
Da das hierbei entstehende PCR-Produkt möglichst die Größe von 350 bp nicht überschreiten sollte, war in dem vorliegenden Fall eine restriktionsenzymatische Spaltung mit dem Enzym Rsa I notwendig. Die hierfür nötigen Bedingungen sind unter 3.9.3. aufgeführt. Durch die restriktionsenzymatische Spaltung verkleinerte sich der zu untersuchende Sequenzabschnitt von 523 Basen auf 304 Basen bei dem größeren Spleißprodukt und von 520 Basen auf 301 Basen bei dem kleineren. Insofern lagen beide im optimal zu trennenden Bereich.
M e t h o d e n 60 3.) Ethanol-Salz-Fällung
Nach der restriktionsenzymatischen Spaltung werden die Banden auf einem 2%-Agarosegel kontrolliert. Anschließend erfolgte eine Ethanol-Salzfällung (siehe 3.8.2.), um noch verbliebene Detergenzien- und Primerreste zu entfernen.
Anschließend wurden jedem getrockneten Pellet ½ µl ROX-Standard und 25 µl Formamid zugesetzt. Diese Suspension sollte gut gemischt und für ca. 1 Stunde in den Kühlschrank dunkel gestellt werden. Daraufhin wurden die Proben für 2-5 Minuten bei 93°C denaturiert und auf Eis gekühlt.
4.) Elektrophoretische Trennung im ABI PRISM™ 310 Genetic Analyzer
Die Trennung erfolgte im ABI PRISM™ 310 Genetic Analyzer bei 60°C. Abschließend erfolgte eine Auswertung der ausgedruckten Fragmentanalysen, bei der die relativen Verhältnisse der einzelnen Signale zueinander in Verbindung gesetzt werden.
M e t h o d e n 61 3.10. Extraktion von Proteinen
3.10.1. Hintergrund
Nachdem die Zell-Linien, wie unter 3.1. beschrieben, behandelt wurden, wurde unter einem speziellen Lysepuffer die Proteinextraktion vorgenommen. Die folgenden Arbeitsschritte zur Proteinextraktion müssen nicht mehr unter der Sterilwerkbank durchgeführt werden.
3.10.2. Vorgehensweise
1.) Vorbereitung und Waschen der Proben
Zunächst wurden etwa 10 ml Zellsuspension in 15 ml Falconröhrchen überführt und bei 1300 rpm bei 7°C für 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und das Pellet mit 10 ml kaltem 1x PBS überschichtet und durch leichtes Anschnipsen der Falconröhrchen gemischt. Wiederum wurde für 5 Minuten bei 1300 rpm bei 7°C zentrifugiert und im Anschluss der Überstand dekantiert. Vorsichtig wurde nun auch der noch verbliebene Rest über dem Pellet mittels Pipette abgenommen. Das Pellet wurde dann in 1 ml kaltem PBS aufgenommen und in 1,5 ml Eppendorfgefäße überführt. Nach diesem Waschvorgang wurde bei 3000 rpm für 5-10 Minuten zentrifugiert.
2.) Lyse und Extraktion
Danach wurde erneut der Überstand abgenommen und das verbliebene Pellet mit Lysepuffer im Verhältnis 1:2-3 versetzt, gemischt und auf Eis für 30 Minuten inkubiert. Danach wurde für 30 Minuten bei 13200 rpm im Kühlraum zentrifugiert, anschließend wurde der Überstand in ein anderes Eppendorfgefäß überführt. Es folgte die Proteinbestimmung nach Bradford unter Anwendung des Protein Assay Dye (Biorad) am Photometer.
Die Proteinextrakte wurden bei -80°C eingefroren und gelagert. Den zuvor bearbeiteten Pellets wurde abschließend erneut 1 ml Lysepuffer zugesetzt und diese dann ebenfalls bei -80°C tiefgefroren, um diese gegebenenfalls erneut einer Proteinextraktion zu unterziehen.
3.10.3. Verwendete Lösungen und Puffer