M Membran Hybond™-C extra
3.1. Zellkultur 1. Hintergrund
3.3.4. Verwendete Ansätze Tabelle 3-3: PCR-Ansatz
Die Tabelle zeigt die verwendeten PCR-Ansätze.
Agenzien 10 mM 2-Mercaptoethanol
500 mM KCl
Tabelle 3-4: Primer für das DNA-Ligase IV-Gen
Hier werden die verwendeten Primer zur Amplifikation des DNA-Ligase IV-Gens unter Angabe der Länge des PCR-Produkts und der Annealingtemperatur, sowie weiteren Angaben zu den Sequenzierbedingungen gezeigt.
Exon/
Sequenz in 5´Æ3`-Richtung -forward
TD62H 232 7-1 TAGCTGAGGGAGTGTCTCATG
M e t h o d e n 48 Tabelle 3-5: Primer für das RINT1-Gen
Hier werden die entworfenen Primer zur Amplifikation des RINT1-Gens unter Angabe der Länge des PCR-Produkts und der Annealingtemperatur, sowie weiteren Angaben zu den Sequenzierbedingungen gezeigt.
Exon Primer -forward -reverse
Sequenz in 5´Æ3`-Richtung -forward
TD63H 317 2F GGGCTGAGAGGAAGAAACC
3 3F 3R
GGAACCTCTCTTGCCTCCAG GTGCAGAAAACGGTACTGCATC
TD63H 262 3F GGAACCTCTCTTGCCTCCAG
4 4F 4R
CTTTTGAAGGCAGATAAACTG GACTATTTGTCACGTTCTATATC
TD55H 393 4F CTTTTGAAGGCAGATAAACTG
5 5F
TD59H 287 8F2 GCATCATAATTAACTCTACTGAG 9/10 9F
TD59H 257 11F GTTGAATAATTAGGAACGACTG 12 12F
12R
GCACTGAAGCAGGACAGTAG GGCACTATGGTTCTGTCTAGC
TD63H 371 12F GCACTGAAGCAGGACAGTAG
13 13F2 13R2
CCTCCCAAAGTGCTGGGATTAC CTAGACACCTTGAAAATCTGACC
TD61H 444 13R2 CTAGACACCTTGAAAATCTGACC 14/15 14F
TD59H 338 16F GAGAAGCTGTTTAGGATTCTC
Tabelle 3-6: Primer für das MDC1-Gen
Hier werden die entworfenen Primer zur Amplifikation des MDC1-Gens unter Angabe der Länge des PCR-Produkts und der Annealingtemperatur, sowie weiteren Angaben zu den Sequenzierbedingungen gezeigt.
Exon Primer -forward -reverse
Sequenz in 5´Æ3`-Richtung -forward
TD59H 339 1F TCAACGTTCATAATGATCCAG
2/3 2F
TD59H 465 12F GAGCTCTCTCTAAATGCTAG
14 14F 14R
AGACTGGTTAGTGGGTCCTG CCATGTTCCAGGACAAGT
TD59H 358 14F AGACTGGTTAGTGGGTCCTG
M e t h o d e n 49 Tabelle 3-7: Primer für cDNA-Analysen des MDC1-Gens
Hier werden die entworfenen Primer für die cDNA-Analysen des MDC1-Gens unter Angabe der Länge des PCR-Produkts und der Annealingtemperatur, sowie weiteren Angaben zu den Sequenzierbedingungen gezeigt.
Exon Primer -forward -reverse
Sequenz in 5´Æ3`-Richtung -forward
-reverse
Temp./
Programm
Länge des Produkts
Sequenzier-primer -Name
Sequenzierprimer -Sequenz 4/5/6/7 4cDF
7cDR
CAAGAGAGAACCTCACAGATC CCCATGACTTTATCCACAGTC
TD63(55-63)H 523 4cDF 7cDR
CAAGAGAGAACCTCACAGATC CCCATGACTTTATCCACAGTC 4/5/6/7 4cDF6FAM
7cDR
CAAGAGAGAACCTCACAGATC CCCATGACTTTATCCACAGTC
TD59(56-62)H 523 Fragment-längenanalyse
- 12/13/14 12cDF
14R
CTTTAGCCTTCAAGACGCAC CCATGTTCCAGGACAAGT
TD59H 445 12cDF 14R
CTTTAGCCTTCAAGACGCAC CCATGTTCCAGGACAAGT
M e t h o d e n 50 3.4. Reverse Transkription (RT)
3.4.1. Hintergrund
Das enzymvermittelte Umschreiben von RNA in die komplementäre cDNA wird als Reverse Transkription (RT) bezeichnet und ermöglicht die anschließende PCR-Amplifikation mit den gewohnten DNA-abhängigen Polymerasen. Hierfür werden Enzyme genutzt, die als Reverse Transkriptasen oder RNA-abhängige Polymerasen bezeichnet und aus Retroviren gewonnen werden, die diesen Prozess in ihren Insertions-/Amplifikations-Lebenslauf integriert haben.
Hierzu wird der „First-Strand cDNA Synthesis Kit“ (Fa. Pharmacia) verwendet. Bei diesem Verfahren wird die Einzelstrang-cDNA-Synthese durch die Reverse Transkriptase des Moloney Murinen Leukämie Virus katalysiert. Für die Synthese werden Hexamer (N)6 -Primer eingesetzt, ein Gemisch aus Hexanukleotiden unterschiedlicher Sequenz, welche zu einem Pool unterschiedlich langer cDNAs führen und somit den gesamten RNA-Bereich abdecken. Zudem dient DTT bei der RT-Reaktion als Oxidationsschutz.
3.4.2. Vorgehensweise
Wie bei der RNA-Isolierung wurden auch hier nur mit DEPC behandelte Materialien und Lösungen verwendet. Für die RT-Reaktion wurden zunächst in 0,5 ml Eppendorfgefäße 1,5 µl der Proben-RNA vorgelegt und mit 6,5 µl DEPC-Wasser auf 8 µl aufgefüllt. Die Proben wurden nun für 10 Minuten bei 68°C denaturiert, um die Sekundärstruktur der RNA zu zerstören. Anschließend wurden die Proben auf Eis gekühlt. Jeder Probe wurde 1 µl DTT, 1 µl Hexamer-Primer und 5 µl des Bulk First-Strand cDNA Reaktionsmixes zugesetzt. Sodann erfolgte eine einminütige Inkubation bei 42°C und anschließend die Elongation der cDNA-Produkte für 1 Stunde bei 37°C. Nach der RT-Reaktion wird das Enzym für 5 Minuten bei 95°C inaktiviert.
Zum Schluss wurden die Proben anzentrifugiert (4 Sekunden) und bei -20°C gelagert.
Diese cDNA-Proben dienten als Ausgangsmaterial für PCR-Analysen mit exonübergreifenden Primerpaaren.
3.4.2.1. Verwendete Enzyme und Lösungen Tabelle 3-8: Chemikalien für die RT
Hier werden die nötigen Chemikalien für die RT dargestellt.
Bulk First-Strand cDNA Reaktionsmix
FPLCpure® MMLV Reverse Transkriptase, RNase/DNase-freies BSA, dATP, dCTP, dGTP, dTTP
DTT 200 mM
(N)6-Primer Random Hexadesoxyribonukleotide in wässriger Lösung (0,2 µg/µl)
DEPC-H2O RNase-freies Wasser
Tabelle 3-9: Primer für die RT-PCR-Analyse der MDC1-Spleißprodukte
Hier werden die entworfenen Primer für die RT-PCR-Analysen des MDC1-Gens unter Angabe der Länge des PCR-Produkts und der Annealingtemperatur, sowie weiteren Angaben zu den Sequenzierbedingungen gezeigt.
Exon Primer -forward -reverse
Sequenz in 5´Æ3`-Richtung -forward
M e t h o d e n 51 3.5. Elektrophoretische Auftrennung von Nukleinsäurefragmenten im Agarosegel
3.5.1. Hintergrund
1.) Eigenschaften, die bei der Elektrophorese der verwendeten Gele eine Rolle spielen
Der größenabhängigen Separation von Makromolekülen wie RNA und DNA durch Gelelektrophorese liegt das elektrokinetische Phänomen zugrunde, demnach ein geladenes Teilchen durch elektrostatische Kräfte in Bewegung gesetzt wird. Eine Größentrennung erfolgt durch die Kopplung des Systems an eine porenhaltige Polymeren-Gelmatrix. Die elektrische Mobilität, d. h. die Wanderungsgeschwindigkeit der Nukleinsäurefragmente, ist abhängig von der Ladungsdichte sowie dem Reibungskoeffizienten. Die Reibungskraft wirkt der elektrischen Kraft, die das Molekül zur entgegengesetzten Elektrode treibt entgegen. Der dabei entscheidende Reibungskoeffizient wird durch die Konformation und das Molekulargewicht des Moleküls und durch die Viskosität des Mediums bestimmt. Weitere Parameter für das Wanderungsverhalten sind somit die Größe des elektrischen Feldes, die Dichte der Gelmatrix und die Pufferbedingungen.
2.) Prinzipien der verwendeten Gele
In der vorliegenden Arbeit wurden Agarosegele, die eine Trennung größerer Fragmente erlauben, verwendet. Die Matrix dieser Gele wird aus Agarose, einem linearen Polymer, das sich alternierend aus D-Galaktose und 3,6-Anhydro-L-Galaktose aufgebaut, gebildet. Lineare doppelsträngige DNA-Moleküle bewegen sich durch die Agarose-Matrix mit einer Geschwindigkeit, die umgekehrt proportional zum Logarithmus ihrer Größe ist (Knippers, 1990).
Durch Variation der Polymerkonzentration ist es möglich, die Porengröße zu verändern.
Diese sollte mit dem entsprechenden Trennbereich und der Fragmentgröße abgestimmt werden. Zur Feinauftrennung bei Nukleinsäurefragmentgrößen unter 1000 Bp wurde 3%-iges NuSieve-Gel verwendet. Als Puffersystem diente jeweils1x TBE.
Tabelle 3-10: Verwendete Konzentrationen und der entsprechende Trennbereich
Hier werden die Konzentrationen der verwendeten Gele unter Angabe des entsprechenden Trennbereichs dargestellt.
Konzentration (%) Trennbereich für lineare DNA (Kb) 1,5 0,2-4
2,0 0,1-3 3,0 0,05-0,7 3.) Prinzip der Anfärbung mit Ethidiumbromid
Die Lage der unterschiedlichen Gelbanden lässt sich durch die Interkalation des fluoreszierenden polycyclischen Farbstoffs Ethidiumbromid (EtBr) zwischen den gestapelten Basenpaaren bestimmen, wobei die Banden durch Anregung mit UV-Licht sichtbar werden.
3.5.2. Vorgehensweise