Aus dem Institut für Humangenetik
der Medizinischen Fakultät der Charité – Universitätsmedizin Berlin
DISSERTATION
Untersuchungen zur Apoptoseinduktion in lymphoblastoiden Zellen von Patienten mit Nijmegen-Breakage-Syndrom
Zur Erlangung des akademischen Grades Doctor medicinae (Dr. med.)
vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité – Universitätsmedizin Berlin
von
Nadja Thierfelder aus Bremen
Dekan: Prof. Dr. med. Martin Paul
Gutachter: 1. Prof. Dr. M. Digweed 2. Prof. Dr. D. Schindler 3. Prof. Dr. B. Kaina
Datum der Promotion: 28.04.2006
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis...I Abkürzungsverzeichnis ...III
1 Einleitung ...1
1.1 Entstehung von DNA-Schäden ...1
1.2 Konsequenzen von DNA-Schäden und Störungen in deren Reparatur...1
1.2.1 DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur...3
1.2.2 Zellzykluskontrolle und Apoptose...4
1.3 Das Nijmegen-Breakage-Syndrom ...9
1.3.1 Klinisches Bild des Nijmegen-Breakage-Syndroms...11
1.3.2 Zellulärer NBS-Phänotyp...13
1.3.3 Molekulare Grundlagen ...14
1.4 Zielsetzung der Arbeit ...18
2 Material ...20
2.1 Zelllinien ...20
2.2 Zellkulturmedien...21
2.3 Chemikalien...21
2.4 Enzyme ...22
2.5 Lösungen und Puffer...22
2.6 Geräte ...23
2.7 Fertige Kits ...24
2.8 Verbrauchsmaterialien ...24
2.9 Computeranwendungen...24
3 Methoden ...26
3.1 Kultivieren und Passagieren von Zellen...26
3.2 Zellzahlbestimmung ...27
3.3 Chromosomenanalyse ...28
3.4 DNA-Extraktion aus lymphoblastoiden Zellen ...29
3.5 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)...29
3.5.1 Nachweis der Zellgleichheit...30
3.5.2 Gelelektrophorese der PCR-Produkte ...30
3.5.3 Mycoplasmentest...31
3.6 Mutationsnachweis durch Sequenzierung ...32
3.6.1 Reinigung der PCR-Produkte...32
3.6.2 Ansatz der Sequenzierreaktion ...33
3.7 Wachstumsexperimente...34
3.8 Mutagene ...35
3.8.1 Bleomycin ...35
3.8.2 Cyclophosphamid...36
3.8.3 Methotrexat...36
3.9 Wachstumsinhibitions-Experimente...36
3.10 Induktion der Apoptose in NBS-Zellen...37
3.10.1 Bleomycinbehandlung ...37
Inhalt - II -
3.10.2 Apoptosenachweis mit der sub-G1-peak-Methode ...38
3.10.3 Apoptosenachweis mittels Annexin-V-Färbung ...39
3.11 Grundlagen der Durchflusszytometrie ...40
3.11.1 Aufbau und Funktionsweise des Durchflusszytometers ...40
3.11.2 Probenmessung und Datenauswertung...41
3.12 Statistik...42
4 Ergebnisse ...43
4.1 Mutationsnachweis durch Sequenzierung ...43
4.2 Wachstumscharakteristika von NBS-Zellen...44
4.2.1 Ermittlung der Ausgangszellzahl für die Apoptoseversuche...44
4.2.2 Wachstum von NBS-Zellen ...45
4.3 Wachstumsinhibition von NBS-Zellen...47
4.4 Induktion der Apoptose in NBS-Zellen...50
4.4.1 Etablierung der Standardbedingungen für die Apoptoseversuche ..50
4.4.2 Apoptosenachweis mit der sub-G1-Peak-Methode ...53
4.4.3 Apoptosenachweis mit der Annexin-V-Färbung...57
4.5 Zusammenfassung der Ergebnisse ...61
5 Diskussion...63
5.1 In-vitro Untersuchungen an Patientenzellen...63
5.2 Wachstum von NBS-Zellen...64
5.3 Wachstumsinhibition von NBS-Zellen...66
5.4 Apoptoseinduktion in NBS-Zellen ...68
5.4.1 Nachweisverfahren...68
5.4.2 Apoptosefähigkeit von NBS-Zellen ...70
5.5 Die Rolle von Nbs1 ...83
6 Zusammenfassung ...85
Literaturverzeichnis ...88
Erklärung an Eides Statt ...102
Danksagung ...103
Abkürzungsverzeichnis
AILD angioimmunoblastisches T-Zell-Lymphom ALL akute lymphatische Leukämie
AT Ataxia teleangiectasia
ATM Ataxia teleangiectasia, mutated
ATR ATM and Rad3-related
Ax Annexin
BLM Bleomycin
bp Basenpaar
BRCT breast cancer carboxy terminal Chk2 Checkpoint-Kinase 2
CPA Cyclophosphamid
DLBL diffuse large B-cell-lymphoma DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat DSB Doppelstrangbruch
EBV Epstein-Barr-Virus
FACS fluoreszenzaktivierte Durchflusszytometrie FHA fork-head-associated
FITC Fluoreszeinisothiocyanat FKS fetales Kälberserum
FL Fluorescence
FSC Forward Scatter (Vorwärtsstreulicht) HPV-16 humanes Papillomavirus 16
HR homologe Rekombination kb kilo Basen
KCl Kaliumchlorid kDA kilo Dalton LD letale Dosis
MEF mouse embryonic fibroblast (embryonale Maus-Fibroblasten) MNNG N-methyl-N'nitro-N-nitrosoguanidin
M/R/N Komplex aus Mre11, Rad50 und Nbs1 MRT Magnet-Resonanz-Tomographie MTX Methotrexat
NBS Nijmegen-Breakage-Syndrom
Nbs1 Gen des Nijmegen-Breakage-Syndroms NHEJ Non-homologous end joining
PBS phosphate buffered saline
PCR Polymerase Chain Reaction (Polymerasekettenreaktion) Pen Penicillin
PI Propidiumiodid
PI3K Phosphatidylinositol-3-Kinase ähnliche Kinase PS Phosphatidylserin
RDS radioresistente DNA-Synthese
rpm rounds per minute (Umdrehungen pro Minute) RPMI Roswell Park Memorial Institute
Abkürzungsverzeichnis - IV - RNA Ribonukleinsäure
SDS Natriumdodecylsulfat Ser Serinrest
SSC Sideward Scatter (Seitwärtsstreulicht) Strep Streptomycin
SV40 Simian Virus 40 TBE Tris-Borat-EDTA
TE Tris-EDTA
V. Version
VNTR Variable Number of Tandem Repeats
1 Einleitung 1.1
1.2
Entstehung von DNA-Schäden
Das Erbmaterial aller lebenden Organismen ist kontinuierlich chemischen und physikalischen Reizen ausgesetzt, die es schädigen oder in seiner Funktion beeinträchtigen. Diese Schädigungen können sowohl endogenen als auch exogenen Ursprungs sein.
Endogen wirken Sauerstoffradikale, die durch Oxidationsprozesse im Zellstoffwechsel entstehen, potentiell DNA-schädigend. Über 100 verschiedene DNA-Modifikationen durch Oxidierung sind bisher beschrieben [Cadet et al., 2003]. Zu den exogen einwirkenden Noxen zählen ionisierende Strahlung, mutagene Chemikalien und ultraviolette Strahlung.
Die sofortige Erkennung und effektive Reparatur derartig entstandener Läsionen oder aber die gezielte Elimination geschädigter Zellen durch programmierten Zelltod ist Voraussetzung für die Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität der Zelle. Blieben die Veränderungen unerkannt und akkumulierten in der DNA, hätte dies in Form von Mutationen fatale Folgen für die Zelle. Wie alle Lebewesen verfügt der Mensch deshalb über eine Reihe von Mechanismen, die entstandene Schäden erkennen und reparieren.
Mehrzellige Organismen haben zudem die Möglichkeit, irreparabel geschädigte Zellen in den programmierten Zelltod, die Apoptose, zu leiten.
Konsequenzen von DNA-Schäden und Störungen in deren Reparatur
DNA-Schäden bergen die Gefahr von Mutationen, die zur Störung der Genwirkung und zum Verlust der zellulären Homöostase führen können. Für einzellige Organismen bedeutet dies in der Regel den Zelltod. Bei mehrzelligen Organismen hingegen, deren verschiedenartig differenzierte Gewebe eine präzise Regulation des Zellwachstums erfordern, können Veränderungen dieses sensiblen Gleichgewichts zu ungesteuerter Zellteilung führen. Eine gesteigerte zelluläre Mutationsrate, z. B. durch Mutagene oder den Ausfall von DNA-Reparatur-Mechanismen verursacht, führt so zu einem erhöhten Krebsrisiko. KINZLER und VOGELSTEIN erklärten bereits 1997 das Zusammenspiel von DNA-Reparatur und Krebsentstehung [Kinzler und Vogelstein, 1997].
Einleitung - 2 - Den Autoren zu Folge gibt es zwei Gruppen von Genen, die für die Krebsentstehung wichtig sind: die Caretakers (dt. 'Hausmeister') und die Gatekeepers (dt.
'Schrankenwärter'). Während die Caretakers als DNA-Reparatur-Enzyme für die Instandhaltung der DNA verantwortlich sind, kontrollieren die Gatekeepers die Progression des Zellzyklus, um die Weitergabe fehlerhafter Erbinformation zu verhindern. Defekte in der Funktion dieser zwei Genklassen haben unterschiedliche Auswirkungen (vgl. Abb. 1). Überlastung oder Ausfall der Caretakers führt zu einer erhöhten Mutationsrate. Solange die Gatekeepers noch intakt sind, werden derartig geschädigte Zellen erkannt und durch Apoptose eliminiert. Erst der zusätzliche Ausfall eines Gatekeepers führt nach diesem Modell zu unkontrolliertem Zellwachstum und bildet den ersten Schritt zur Tumorentstehung.
Defekte DNA-Reparatur-Enzyme (Caretakers)
Mutation
Intakte Zellzyklus- Prüfstellen (Gatekeepers)
Defektes Gatekeeper-Gen
Proliferations-Stopp oder Apoptose
Ungesteuerte Zellteilung
Abb. 1: DNA-Reparatur, Apoptose und Krebsentstehung. Defekte Caretakers führen zur Anhäufung von Mutationen. Solange die Gatekeeper-Gene noch intakt sind, können die Mutationen erkannt und die mutierte Zelle unschädlich gemacht werden. Sind jedoch auch die Gatekeepers defekt, kann sich die veränderte Zelle ungesteuert teilen [Abb.
modifiziert nach Kinzler und Vogelstein, 1997].
Angeborene Gen-Defekte beider Klassen gehen demnach mit einem erhöhten Krebsrisiko einher. So führt z. B. die Mutation eines Caretakers, einem Enzym der Nukleotid-Exzisionsreparatur, zum Krankheitsbild der Xeroderma pigmentosum.
Betroffene sind überempfindlich gegenüber UV-Strahlung und haben ein stark erhöhtes Risiko, an Hautkrebs zu erkranken [Stary und Sarasin, 2002]. Das Li-Fraumeni- Syndrom beruht dagegen auf Mutationen im Tumorsuppressorgen p53, das die Funktion eines Gatekeepers hat [Malkin et al., 1990]. Die betroffenen Patienten entwickeln frühzeitig verschiedenartige Tumore [Li und Fraumeni, 1969].
1.2.1 DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur
Angesichts der verschiedenartigen DNA-Läsionen – Einzel- und Doppelstrangbrüche, fehlerhafte Basen – muss es mehr als nur einen Caretaker-Reparaturmechanismus geben. Im Laufe der Evolution hat sich deshalb ein ausgefeiltes, verwobenes Netz an Reparatursystemen entwickelt, das fast alle Schäden beseitigen kann. Besondere Bedeutung kommt dabei der Erkennung und Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSB) zu, da sie die für die Zelle potentiell gefährlichste Form der DNA-Schädigung darstellen. Ein einziger unreparierter Doppelstrangbruch kann bereits zum Tod der Zelle führen [Blocher und Pohlit, 1982].
Die Besonderheit der DSB liegt darin, dass sie nicht nur durch exogene Noxen, allen voran die ionisierende Strahlung, verursacht werden, sondern auch als notwendige Zwischenprodukte physiologischer Vorgänge entstehen. Hierzu zählen die genetische Rekombination während der Meiose und die V(D)J-Rekombination der Immunglobulin- und T-Zell-Rezeptorgene während der B- und T-Zell-Reifung. Eine weitere Quelle von DNA-Doppelstrangbrüchen stellt die DNA-Replikation selbst dar. Trifft die Replikationsgabel während der Replikation auf ein Hindernis, z. B. eine DNA- Interstrangvernetzung oder einen Einzelstrangbruch, können als Folge Doppelstrangbrüche entstehen.
Das häufige Vorkommen einerseits und die große Gefahr, die DSB für die Zelle darstellen, andererseits, haben zur Entwicklung effektiver DSB-Reparaturmechanismen in eukaryotischen Zellen geführt. Zwei Hauptwege sind dabei bekannt; die homologe Rekombination (HR) und die Verknüpfung freier DNA-Enden (non-homologous end joining, NHEJ). Beide Mechanismen spielen auch bei physiologischen Prozessen wie der V(D)J-Rekombination und der Keimzellbildung eine wichtige Rolle [Ivanov et al., 1992; Lieber, 1999].
Bei der HR wird ein homologer Chromosomenabschnitt – in der Regel die Schwesterchromatide – als Matrize für die Reparatur verwendet. Dies erklärt, warum
Einleitung - 4 - dieser Prozess der S- und der G2-Phase des Zellzyklus vorbehalten ist, denn in diesen Phasen befindet sich die neu synthetisierte, identische Erbinformation in unmittelbarer Nähe. Das Prinzip der HR beruht zunächst auf der Prozession des DSB zu einem Einzelstrang mit 3'-Überhang mittels einer Nuklease. Die entstandenen 3'-Enden lagern sich an die intakte homologe Doppelhelix an und eine DNA-Polymerase kopiert die korrekte Basenabfolge. Zuletzt wird die Überkreuz-Struktur ('Holliday-Junction') durch eine Resolvase wieder aufgelöst. Diesen Reparaturmechanismus findet man vorwiegend bei niederen Eukaryonten wie der Hefe [Rattray und Symington, 1995].
Im Gegensatz zur HR benötigt das NHEJ keinen homologen Partner, wodurch es zellzyklusunabhängig durchgeführt werden kann [Takata et al., 1998]. Es beruht auf der Prozessierung und nachfolgenden schlichten Verknüpfung der durch den DSB entstandenen freien DNA-Enden. Generell ist dieser Mechanismus ungenauer als die HR, da kleine Deletionen in Kauf genommen werden müssen. Da allerdings nur ca. 2%
des menschlichen Genoms kodierende Funktion besitzt, werden diese Mikrodeletionen im Allgemeinen gut toleriert. Das NHEJ findet auch bei den Umbauten der Immunglobulingene statt und stellt in Säugetieren den Hauptreparaturweg für Doppelstrangbrüche dar.
1.2.2 Zellzykluskontrolle und Apoptose
Um Zeit für die DNA-Reparatur zu gewinnen, muss die Zelle nach einer DNA- Schädigung den Generationszyklus kurzfristig stoppen. Dies ist Aufgabe der Gatekeeper. Fiele diese Kontrolle weg, wären unkoordiniertes Zellwachstum und die Weitergabe potentiell krebserzeugender Mutationen an Tochterzellen die Folge.
In der G1-Phase ist die Zelle besonders stoffwechselaktiv und vollbringt die für sie typischen Leistungen und Funktionen. Der Chromosomensatz liegt in diploider Form vor. Ein Teil der Zellen verliert in der G1-Phase die Fähigkeit, sich auch weiterhin mitotisch zu teilen; diese Zellen gehen in die G0-Phase über und scheiden aus dem Generationszyklus aus (vgl. Abb. 2). In der S-Phase wird die genetische Information für die Zellteilung verdoppelt. In der sich anschließenden G2-Phase bereitet sich die Zelle auf die darauf folgende Mitose vor, indem sie energiereiche Substanzen in das Zytoplasma einlagert. Im Verlauf der Mitose wird das zuvor identisch replizierte Genom gleichmäßig auf die beiden entstehenden Tochterzellkerne verteilt.
Ein komplexes Netzwerk verschiedener interagierender Faktoren ist an der Kontrolle des Zellzyklus beteiligt. Vermutlich beinhaltet es mindestens drei Kontrollpunkte (Checkpoints), an denen die Zelle den fehlerfreien Ablauf der Zellteilung überprüft und ggf. – z. B. im Falle vorhandener Doppelstrangbrüche – den Eintritt in die nächste Phase verzögert, um zunächst den Schaden zu beseitigen (vgl. Abb. 2). Während der G1/S- und der Intra-S-Checkpoint die Replikation geschädigter DNA verzögern oder gar verhindern, sorgt der G2/M-Checkpoint dafür, dass veränderte Informationen nicht an die Tochterzellen weitergegeben werden.
Mitose
G1 G2
S-Phase G0
G1/S- Checkpoint Intra-S-
Checkpoint G2/M- Checkpoint
Abb. 2: Die Phasen des Zellzyklus. Der Übergang von einer Phase in die folgende wird an mindestens drei Checkpoints kontrolliert.
Ist eine vorliegende DNA-Schädigung zu ausgedehnt, als dass die Mechanismen des Zellzyklusarrests und der DNA-Reparatur noch greifen könnten, wird in der Zelle der programmierte Zelltod, die Apoptose, eingeleitet. Hierbei handelt es sich um einen komplex regulierten, in der Evolution hoch konservierten Vorgang, der für den Erhalt der genomischen Stabilität der Zelle und die Prävention der Tumorentstehung unabdingbar ist. Er befähigt den Organismus, einzelne Zellen planmäßig zu eliminieren. Zahlreiche interne und externe Faktoren können das Apoptoseprogramm auslösen [Collatz, 2001].
Hierzu gehören z. B. der Entzug von Wachstumsfaktoren oder die Wirkung von TNFα und Glukokortikoiden. Ionisierende Strahlung und Zytostatika wirken über die Induktion von DNA-Schäden pro-apoptotisch.
Lichtmikroskopisch erkennt man apoptotische Zellen an charakteristischen morphologischen Veränderungen wie Bläschenbildung der Plasmamembran (membrane blebbing) und Abschnürung kleiner Vesikel (Apoptosekörperchen), Zellschrumpfung und Vakuolisierung des Zytoplasmas sowie Chromatinverdichtung und
Einleitung - 6 - den Zerfall des Zellkerns in basophile Körper (vgl. Abb. 3). Die Zellüberreste werden rasch von Nachbarzellen oder Makrophagen aufgenommen; es kommt nicht zur Entzündungsreaktion oder Antikörperbildung. Während bei diesem Vorgang die Ultrastruktur der Zellorganellen und der Zellmembran erhalten bleiben, wird die DNA systematisch durch Endo- und Exonukleasen abgebaut [Wyllie, 1980]. Die dabei entstehenden charakteristischen DNA-Bruchstücke von ca. 180bp können angefärbt dem Apoptosenachweis dienen.
Vitale Zelle Chromatinverdichtung Fragmentierung Sekundäre Nekrose
erhaltene
Mitochondrienstruktur intakte
Membranen
Apoptosekörperchen
Abb. 3: Morphologischer Verlauf der Apoptose [Abb. modifiziert nach o.V., 2004, Roche Applied Science].
Im Gegensatz zur Apoptose zeichnet sich die Nekrose durch eine anfängliche Zellschwellung und den späteren Verlust der Zellmembranintegrität aus. Durch den Austritt lytischer Enzyme und Botenstoffe führt dies zur Entzündungsreaktion im umgebenden Gewebe (vgl. Abb. 4).
Vitale Zelle Reversible Schwellung Irreversible Schwellung Desintegration
Veränderungen der Mitochondrien
erhaltene Kernstruktur
Abb. 4: Morphologischer Verlauf der Nekrose [Abb. modifiziert nach o.V., 2004, Roche Applied Science].
Aus biochemischer Sicht gelten zwei Wege zur Induktion der Apoptose als gesichert:
der Todesrezeptorweg (death receptor pathway) und der mitochondriale Weg (vgl.
Abb. 5). Beide münden in die Aktivierung cysteinabhängiger, aspartatspezifischer Proteasen, so genannter Caspasen. Sie sind die zentralen Effektorenzyme der Apoptose, die die Zelle zerlegen [Thornberry und Lazebnik, 1998]. Bis heute sind 15 verschiedene Caspasen in Säugetierzellen identifiziert worden [Joza et al., 2002].
Beim Todesrezeptorweg binden Liganden an auf der Zelloberfläche liegende Rezeptoren (z. B. CD95/Fas, TNF1-Rezeptor, Death Receptor 3) [Hengartner, 2000;
Nagata und Golstein, 1995]. Die Rezeptoren aggregieren und bilden den so genannten Death Inducing Signalling Complex (DISC) [Ashkenazi und Dixit, 1998], der über den Adapter FADD (FAS-associated death domain protein) die Caspasen 8 und 3 aktiviert.
Der mitochondriale Weg wird überwiegend durch intrazelluläre Stimuli wie DNA- Schäden, Glukokortikoide oder Störungen im Redoxgleichgewicht ausgelöst. Eine zentrale Rolle spielt hier der Tumorsuppressor p53, dessen Gehalt in der Zelle innerhalb von Minuten nach einer DNA-Schädigung ansteigt [Vogelstein et al., 2000;
Zhan et al., 1993]. p53 führt unter anderem zur Aktivierung von Proteinen der bcl-2- Familie und der BAX-Subfamilie, die sich daraufhin an die äußere Mitochondrienmembran heften und zur Freisetzung von Cytochrom C führen [Adams und Cory, 1998]. Dies bewirkt die Ausbildung des so genannten Apoptosoms – einem Komplex aus Cytochrom C, Apaf-1 und Caspase 9 [Cain et al., 1999] – der wiederum die Caspase 3 aktiviert, dem gemeinsamen Endmolekül beider Apoptosewege.
Abbildung 5 zeigt den Ablauf beider Wege im Überblick.
Einleitung - 8 -
p53 Caspa
se 8
Procas pase 3
Caspa se 3
CytC
Apoptose
Todesrezeptorweg
CytC Caspa
se 9 Apaf 1
DNA-Schädigung
FADD Zellmembran
p53-unabhängig (über Nur77, Chk2, p73
Caspase 2) Fas
Procas pase 8 FasL
Apoptosom DISC
Mitochondrialer Weg
Apaf 1: Apoptotic protease activating factor, Chk2: Checkpoint-Kinase 2, CytC:
Cytochrom C, FADD: Fas-associated death domain protein, FasL: Fas-Ligand, Nur77:
Nuclear Hormone Receptor TR53.
Abb. 5: Zwei Wege der Apoptoseinduktion sind bekannt: Beim Todesrezeptorweg (extrazellulär) wird der Oberflächenrezeptor Fas durch Bindung entsprechender Liganden (FasL) aktiviert. Dies führt zur Ausbildung eines membrangebundenen Death Inducing Signalling Complex (DISC), bestehend aus FADD, Fas und Procaspase 8. Der DISC aktiviert 'Downstream'-Caspasen, die die Zelle zerlegen. Der mitochondriale Weg wird durch intrazelluläre Stimuli wie z. B. DNA-Schädigung ausgelöst und p53-abhängig oder -unabhängig an die Mitochondrien übermittelt. Über Freisetzung von CytC kommt es zur Ausbildung des Apoptosoms, das wiederum die Procaspase 3, das gemeinsame Endmolekül beider Apoptosewege, aktiviert [Abb. modifiziert nach Hengartner, 2000].
Auch p53-unabhängige Apoptose ist beschrieben worden [Han et al., 1995; Seki et al., 1994]. So können Nur77 [Li et al., 2000], Caspase 2 [Tinel und Tschopp, 2004], p73 [Melino et al., 2004] oder Chk2 [Yang et al., 2002] auch ohne das Mitwirken von p53 das Apoptoseprogramm auslösen (vgl. Abb. 5).
Die Apoptose unterliegt einer strengen und komplexen Kontrolle durch Gatekeeper- Gene. Ungleichgewichte im Netzwerk pro- und antiapoptotischer Faktoren haben fatale Folgen für die Zelle. So wurden Erkrankungen wie Parkinson, Rheuma, Aids oder Herzerkrankungen bereits in Zusammenhang mit übermäßiger Apoptose gestellt.
Demgegenüber spielt der Verlust der Apoptoseinduktion eine wichtige Rolle in der Krebsentstehung [Igney und Krammer, 2002].
Auch wenn zahlreiche an der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen, der Zellzykluskontrolle und der Apoptoseregulation beteiligte Gene bereits identifiziert wurden, ist man von einem eigentlichen Verständnis, wann welcher 'pathway' in der Zelle eingeschlagen wird, weit entfernt. Dies hängt nicht zuletzt damit zusammen, dass einzelne Gene in mehrere Schritte involviert sein und sehr komplexe Rückkopplungsmechanismen vorliegen können. Es sollte daher anstelle von 'pathways' besser von einem Netzwerk der Genwirkung gesprochen werden. Ein derartiges, evolutionär entstandenes Netzwerk zeichnet sich auch durch seine Pufferwirkung aus:
Der Ausfall eines Gens kann von anderen kompensiert werden.
1.3 Das Nijmegen-Breakage-Syndrom
Welch weitreichende Folgen eine genetisch bedingte Störung der zellulären Antwort auf DNA-Schäden für den Organismus haben kann, zeigt sich bei Betroffenen des Nijmegen-Breakage-Syndroms.
Mit weltweit ca. 100 betroffenen Familien ist das Nijmegen-Breakage-Syndrom (NBS) eine seltene Erkrankung. Die höchste Prävalenz findet sich in Osteuropa, insbesondere in Polen, Tschechien und der Ukraine. In Tschechien liegt die Heterozygotenfrequenz bei ca. 1:150 [Varon et al., 2000]. Die Erkrankung wird autosomal rezessiv vererbt und zählt mit der Ataxia teleangiectasia (AT), dem Bloom´s-Syndrom und der Fanconi- Anämie zur Gruppe der erblichen Chromosomenbruchsyndrome. Bei diesen Erkrankungen beobachtet man auf zellulärer Ebene eine erhöhte spontane sowie durch spezifische Mutagene induzierbare Brüchigkeit der Chromosomen.
Erstmals 1981 beschrieben [Weemaes et al., 1981], hielt man die Krankheit aufgrund zahlreicher Übereinstimmungen sowohl im klinischen Erscheinungsbild als auch auf zellulärer Ebene zunächst für eine Variante der AT (AT-V) (vgl. Tab. 1) [Jaspers et al., 1988]. Diese Ansicht wurde durch Kopplungsanalysen in Frage gestellt, in denen die AT-Region als NBS-Genort ausgeschlossen werden konnte [Stumm et al., 1995]. Mit der Lokalisation des NBS-Gens auf Chromosom 8q21 stand endgültig fest, dass es sich bei AT und NBS um genetisch distinkte Erkrankungen handelt [Saar et al., 1997].
Gestützt auf die Methode der Positionsklonierung konnte das dem NBS zugrunde
Einleitung - 10 - liegende Nbs1-Gen 1998 von zwei Arbeitsgruppen zeitgleich identifiziert werden [Matsuura et al., 1998; Varon et al., 1998].
Tab. 1: Klinische und zelluläre Merkmale von Nijmegen-Breakage-Syndrom (NBS) und Ataxia teleangiectasia (AT).
Merkmal NBS AT
Klinisch
erhöhtes Krebsrisiko ++ +
Strahlenempfindlichkeit + +
Immundefizienz + +
ovarielle Dysgenesie + +
Hyperpigmentierung + (+)
Wachstumsretardierung + (+)
Mikrozephalie + -
mentale Retardierung (+) -
charakteristische Fazies + -
Ataxie - +
zerebelläre Degeneration - +
Teleangiektasien d. Konjunktiven - +
erhöhtes α-Fetoprotein - +
Zellulär
chromosomale Instabilität ++ +
Strahlenempfindlichkeit + +
radioresistente DNA-Synthese + ++
Zellzyklus-Defekte + +
Beide Genprodukte, ATM (Ataxia teleangiectasia mutated) und Nbs1, sind nach einer DNA-Schädigung an den beiden wichtigen zellulären Schutzmechanismen DNA- Reparatur und Zellzyklusarrest beteiligt [Digweed und Sperling, 2004; Shiloh, 2003].
Obgleich über die Wechselwirkungen von Nbs1 und ATM und deren Bedeutung im Einzelnen noch viele Unklarheiten bestehen, kann heute doch von einer engen Zusammenarbeit beider Proteine zur Erhaltung der genomischen Stabilität und dem Schutz vor maligner Entartung ausgegangen werden.
1.3.1 Klinisches Bild des Nijmegen-Breakage-Syndroms
Die Ausprägung des Nijmegen-Breakage-Syndroms ist sehr variabel [The International Nijmegen-Breakage-Syndrome Study Group, 2000]. Zu den Hauptmerkmalen der Erkrankung zählen die schwere Mikrozephalie, kombiniert mit Entwicklungs- verzögerung, Immundefizienz und einem erhöhten Krebsrisiko [Seemanova et al., 1985]. Lebensbegrenzend sind die meist schon im Jugendalter auftretenden malignen Lymphome, angeführt von der Gruppe der Non-Hodgkin-Lymphome.
Phänotypisch zeigen NBS-Patienten eine charakteristische kraniofaziale Dysmorphie.
Parallel zur Mikrozephalie entwickelt sich ein prominentes Mittelgesicht mit langer Nase und breitem Philtrum. Weiterhin fallen dünnes Haar, eine fliehende Stirn, Mikrogenie sowie tiefsitzende Ohrmuscheln auf.
Abb. 6: Geschwisterpaar mit Nijmegen-Breakage-Syndrom. Das Bild wurde freundlicherweise von Prof. Dr. E. Seemanova (Prag) zur Verfügung gestellt.
75% der Patienten zeigen bereits bei der Geburt eine Mikrozephalie, die sich bei 25%
erst innerhalb der ersten Lebensmonate manifestiert. Im kranialen MRT finden sich verkleinerte Frontallappen kombiniert mit einer Einengung der lateralen Ventrikel [Bekiesinska-Figatowska et al., 2000; Van de Kaa et al., 1994]. Als Ursache der Mikrozephalie werden ein reduziertes Gehirnwachstum und die vorzeitige Fusion der Schädelknochen diskutiert. Die geistige Entwicklung ist bei 35% der Patienten normal, bei 45% zeigt sich ein IQ im unteren Normbereich, 20% zeigen eine mäßige Retardierung.
Einleitung - 12 - Eines der Hauptmerkmale des NBS ist der Minderwuchs. Während Geburtsgewicht und -länge noch im Normbereich liegen, fällt die Körpergröße im Laufe der Entwicklung unter die 10. Perzentile. Im Alter von zwei Jahren liegt in der Regel bereits ein manifester Kleinwuchs vor. Das Körpergewicht verhält sich dabei proportional zur Körperlänge [Chrzanowska et al., 1995].
1 2 3 4 5 6
KopKopfumfang...
50
45
40
35 55
3 10 25 50 75 90 97
Alter (Jahre)...
cm
1 2 3 4 5 6
Alter (Jahre)...
Körpergröße
10 3 25 50 75 90
130 97
120 110 100 90 80 70 60
cm.
50
Abb. 7: Kopfumfang und Längenwachstum zweier männlicher NBS-Patienten. Abbildung der Daten mit freundlicher Genehmigung von Prof. Dr. E. Seemanova (Prag).
An Hautmanifestationen sind Vitiligo, Café-au-lait-Flecken sowie sklerale Tele- angiektasien beschrieben.
Immunologisch finden sich eine gestörte humorale und zelluläre Immunität. Allerdings variiert auch hier die Ausprägung stark. So sind etwa 10% der Patienten hinsichtlich des Immunglobulinstatus unauffällig [Gregorek et al., 2002; Weemaes et al., 1994]. Die Mehrheit der Patienten weist jedoch einen selektiven oder kombinierten IgG- und IgA- Mangel auf [van Engelen et al., 2001]. Bis zu einem Drittel der Fälle imponieren mit einer Agammaglobulinämie. Die zelluläre Immunität ist bei mehr als 90% der Patienten eingeschränkt. Dies zeigt sich in einer milden bis mäßigen Lymphopenie, niedrigen CD3+- und CD4+-Helferzellspiegeln und einer reduzierten CD4+/CD8+ Suppressorzell- ratio. In vitro ist die T-Lymphozytenproliferation nach Mutagenbehandlung ebenfalls
gestört [Weemaes et al., 1994]. Klinisch kommt es zu rezidivierenden Infektionen der oberen und unteren Atemwege. Harnwegs- und gastrointestinale Infekte treten gehäuft auf.
Das Risiko, an Krebs zu erkranken, ist bei NBS-Patienten stark erhöht [Seemanova et al., 1985]. Etwa 40% der Patienten entwickeln bereits bis zum 20. Lebensjahr eine bösartige Neubildung, wobei Lymphome an erster Stelle stehen. 18 von 48 registrierten polnischen Patienten erkrankten schon vor dem 15. Lebensjahr an einem malignen Lymphom. Auffällig ist zudem die für das Kindesalter unübliche Verteilung der Lymphome: Non-Hodgkin-Lymphome (NHL), hier insbesondere das ‘diffuse large B- cell-lymphoma’ (DLBL), treten unverhältnismäßig häufig auf [Seidemann et al., 2000].
Ebenso das periphere T-Zell-Lymphom (AILD) – hier liegt das durchschnittliche Erkrankungsalter in der Bevölkerung bei 61 Jahren – findet sich gehäuft unter NBS- Patienten. Lediglich vier NBS-Patienten sind bisher an für das Kindesalter typischen Neoplasien – der akuten lymphoblastischen Leukämie (ALL) und dem Medulloblastom – erkrankt. Lange umstritten war die Frage, ob auch NBS-Heterozygote ein erhöhtes Krebsrisiko besitzen. Nach aktuellem Forschungsstand ist damit zu rechnen [Steffen et al., 2004].
1.3.2 Zellulärer NBS-Phänotyp
Auf zytogenetischer Ebene zeigt sich beim NBS eine erhöhte spontane Brüchigkeit der Chromosomen. Typisch sind dabei Rearrangements unter Beteiligung der Chromosomen 7 und 14, wobei die Bruchpunkte sich besonders häufig im Bereich der Immunglobulin- und T-Zellrezeptorgene befinden [Chrzanowska et al., 1995; van der Burgt et al., 1996].
NBS-Patienten zeigen eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber ionisierender Strahlung, deren therapeutische Anwendung für die Patienten lebensbedrohlich sein kann [Distel et al., 2003]. Auf zellulärer Ebene zeigt sich die Radiosensitivität durch eine im Vergleich mit Kontrollzellen mindestens doppelt so hohe Sterberate primärer und transformierter NBS-Patientenzellen nach Bestrahlung [van der Burgt et al., 1996].
Zudem ist die Rate an Chromosomenaberrationen in NBS-Zellen nach Bestrahlung verglichen mit Kontrollzellen drastisch erhöht, wobei es sich meist um Schäden vom Chromatid-Typ handelt [Antoccia et al., 1997; Antoccia et al., 1999; Taalman et al., 1983].
Einleitung - 14 -
1.3.3 Molekulare Grundlagen 1.3.3.1 Das Nbs1-Gen
Das Nbs1-Gen liegt auf Chromosom 8q21, weist 16 Exons auf und erstreckt sich über 50kb. Sein Genprodukt, das Nibrin, besteht aus 754 Aminosäuren. Durch Sequenzvergleiche konnten zwei funktionelle Domänen identifiziert werden: eine 'breast cancer carboxy terminal'-Domäne (BRCT) und eine 'fork-head-associated'-Domäne (FHA). Solche Domänen sind in eukaryotischen Zellen häufig in Proteinen der Zellzykluskontrolle und der DNA-Reparatur enthalten, wobei die FHA-Domäne vermutlich bei der Wechselwirkung mit phosphorylierten Proteinen eine Rolle spielt [D'Amours und Jackson, 2002]. Hinweise auf eine eigene Kinaseaktivität gibt es bei Nibrin nicht.
754 AS hMre11-Binding
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
657del5
698del4 835del4 842insT
1142delC Q326X
BRCT
Ser278 Ser343
Nibrin NBS1
Ser397 Ser615
FHA-Domain BRCT-Domain
2265 BP 900del25
Y363X 681delT
742insGG
AS: Aminosäuren, BP: Basenpaare, BRCT: breast cancer carboxy terminal, FHA: fork- head-associated, Ser: Serinrest
Abb. 8: Das Nbs1-Gen und sein Genprodukt, das Nibrin. Mutationen im Nbs1-Gen führen zum klinischen Bild des Nijmegen-Breakage-Syndroms. Bisher sind 9 verschiedene Mutationen bekannt. Die 657del5-Mutation ist mit über 90% bei NBS- Patienten am häufigsten.
Nibrin konnte als das menschliche Äquivalent des Hefe-DNA-Reparaturgens Xrs2 identifiziert werden [Carney et al., 1998]. Allerdings besteht nur eine sehr schwache Sequenzhomologie vom Nbs1 zum Hefegen. Zusammen mit den Proteinen Mre11 und Rad50 bildet es, homolog zum Xrs2 in der Hefe, ein Trimer (M/R/N), das in Caretaker- Funktion eine Rolle bei der Reparatur von Doppelstrangbrüchen (DSB) spielt. Hierauf deutet unter anderem eine in vitro nachgewiesene Endo- und Exonukleasefunktion des
M/R/N-Komplexes hin, die bei der DSB-Reparatur eine Rolle spielen könnte [Paull und Gellert, 1998; Trujillo et al., 1998]. In der Hefe ist die Beteiligung des M/R/N-Komplexes an der Reparatur von DNA-DSB bekannt.
Über 90% der NBS-Patienten weisen im Nbs1-Gen die gleiche 5bp-Deletion (657del5) auf (vgl. Abb. 8) [Varon et al., 1998]. Daneben wurden 9 weitere Mutationen gefunden, die ebenfalls zum Abbruch der Translation nach den benachbarten BRCT- und FHA- Domänen führen [Digweed et al., 1999]. Alle gefundenen Mutationen liegen in der zentralen Region und betreffen weder die BRCT- noch die FHA-Domäne selbst (vgl.
Abb. 8).
Obwohl man vollständiges, intaktes Nibrin in NBS-Zellen erwartungsgemäß nicht findet, werden zwei Proteinfragmente – ein N-terminales 26kDa und ein carboxyterminales 70kDa Peptid – variabel exprimiert [Maser et al., 2001]. Möglicherweise besitzen diese Fragmente eine Restfunktion. Dies könnte erklären, weshalb Nbs1-Mutationen des Menschen mit dem Leben vereinbar sind, während 'knock-out'-Mäuse, die in dem entsprechenden Gen Null-Mutationen besitzen, bereits im Embryonalstadium absterben.
1.3.3.2 Nbs1 und DNA-Reparatur
In der Hefe scheint der Komplex aus Mre11, Rad50 und Xrs2 sowohl am DNA- Reparaturmechanismus durch homologe Rekombination (HR) als auch durch Non- homologous end joining (NHEJ) beteiligt zu sein. Man nahm daher an, dass das entsprechende Trimer in menschlichen Zellen, M/R/N, ähnliche Funktionen besitzt.
Nachdem HUANG ET AL. der Nachweis einer Beteiligung des Komplexes am NHEJ in vitro bereits 2002 gelungen war [Huang und Dynan, 2002], konnte dieser Befund jetzt erstmals auch in vivo bestätigt werden. KRACKER ETAL. konnten eine signifikante Verminderung des Ig-Klassenwechsels bei der Immunglobulinsynthese in NBS- Lymphozyten nachweisen [Kracker et al., 2005]. Kontrovers diskutiert wird zurzeit noch eine Beteiligung von M/R/N am Reparaturmechanismus der HR. Kürzlich konnten TAUCHI ETAL. in einer Nbs -/- Hühnerzelllinie mit Hilfe eines spezifischen Assays eine signifikante Verminderung der HR in den defekten Zellen nach Mitomycin-C- Behandlung nachweisen [Tauchi et al., 2002]. Da das Einbringen des intakten Gens jedoch nicht zur Korrektur des Defekts führte, bleibt die Signifikanz dieses Befundes umstritten. Zudem ist der verwendete Zelltyp genetisch außergewöhnlich instabil.
Einleitung - 16 - Aus den vorliegenden Ergebnissen entwickelten TAUCHI ET AL. ein Modell zur M/R/N- Funktion im Hinblick auf die Erkennung und Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen [Tauchi et al., 2002]. Danach könnte die Reparatur in zwei Schritten erfolgen. Im ersten Schritt markiert Nbs1 den Ort der Schädigung, indem es an ein zuvor durch ATM phosphoryliertes Histon in der Nähe des Doppelstrangbruchs bindet. Dies bewirkt die Lokalisation vom frei im Zellkern vorliegenden M/R-Komplex zum Ort der DNA-Läsion.
Dieser Prozess kann sogar mikroskopisch durch entsprechende Immunfärbung sichtbar gemacht werden [Nelms et al., 1998]. Im zweiten Schritt könnte der nun assoziierte M/R/N-Komplex direkt an die geschädigte DNA binden und deren Reparatur initiieren.
Da der Nachweis einer M/R-unabhängigen Funktion von Nibrin jedoch bisher nicht erbracht werden konnte, bleibt das Modell vorerst eine Hypothese.
Möglicherweise dient M/R/N auch lediglich als molekulares Gerüst, das die DNA-Enden zangenartig zusammenhält, um die Reparatur durch andere Enzyme zu ermöglichen.
Letzteres wird durch elektronenmikroskopische- und Röntgenbeugungs-Analysen impliziert [Anderson et al., 2001; de Jager et al., 2001].
Wenn auch in Bezug auf die genaue Funktion des M/R/N-Komplexes noch zahlreiche Unklarheiten bestehen, gilt nach heutigen Erkenntnissen eine Beteiligung von Nbs1 an der Erkennung und Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen als gesichert.
1.3.3.3 Funktionen von Nbs1 bei der Zellzykluskontrolle und Apoptose
Im Falle einer DNA-Schädigung muss die Zelle den Zellzyklus vorübergehend stoppen, um nötige Reparaturarbeiten zu ermöglichen. Dieser Mechanismus wird von Genen mit Gatekeeper-Funktion übernommen. Eine Schlüsselrolle in der Reaktion der Zelle auf eine DNA-Schädigung spielt in diesem Zusammenhang das bei AT-Patienten mutierte ATM-Gen. Es besitzt Kinaseaktivität und phosphoryliert nach einer DNA-Schädigung multiple, an der Zellzykluskontrolle beteiligte Proteine [Iliakis et al., 2003]. Infolgedessen sind Zellen von AT-Patienten nach Bestrahlung nicht in der Lage, den Zellzyklus vorübergehend zu stoppen. Ein gut untersuchtes Beispiel ist das Unvermögen von AT- Zellen, nach Bestrahlung die Replikation in der S-Phase zu stoppen. Dieses Phänomen wird radioresistente DNA-Synthese (RDS) genannt.
Kontroverser als seine Funktionen als Caretaker bei der DNA-Reparatur werden die Aufgaben von Nbs1 als Gatekeeper-Gen bei Prozessen der Zellzykluskontrolle diskutiert. Unumstritten ist dabei eine zumindest partielle Beteiligung von Nbs1 am intra-
S-Phase-Checkpoint. Nbs1 wird an mindestens vier Serinresten von ATM phosphoryliert, wobei die Reste 278 und 343 eine wichtige Rolle im S-Phase- Checkpoint spielen [Gatei et al., 2000; Lim et al., 2000; Wu et al., 2000; Zhao et al., 2000]. Dementsprechend sind fast alle untersuchten NBS-Zelllinien ebenso wie AT- Zellen nicht in der Lage, den Zellzyklus nach Bestrahlung kurzfristig zu stoppen – auch hier beobachtet man die radioresistente DNA-Synthese [Sullivan et al., 1997; Taalman et al., 1983].
Die Bedeutung von Nbs1 im G1/S-Checkpointarrest ist umstritten. Wiederholt wurde die verzögerte und verminderte p53-Stabilisierung in NBS-Zellen nach Bestrahlung beobachtet [Antoccia et al., 1999; Jongmans et al., 1997; Matsuura et al., 1998]. Dieses wirkt – u. a. durch Induktion von p21 – als Hauptakteur im G1/S-Arrest [el-Deiry et al., 1993]. Dementsprechend konnten einige Arbeitsgruppen einen gestörten G1/S- Checkpoint in NBS-Zellen nachweisen [Antoccia et al., 1999; Jongmans et al., 1997;
Sullivan et al., 1997]. In anderen Studien fand sich dagegen ein normaler G1/S-Arrest [Girard et al., 2000; Williams et al., 2002; Yamazaki et al., 1998]. KANG ETAL. zeigten anhand ihres Mausmodells in unbestrahlten MEF-Zellen sogar einen – verglichen mit Kontrollzellen – stärkeren G1/S-Phasenarrest [Kang et al., 2002].
Daten zum G2/M-Arrest in NBS-Zellen sind ähnlich widersprüchlich. DNA-Schäden, insbesondere Doppelstrangbrüche, müssen repariert werden, bevor die Zellen in die Mitose eintreten. Der G2/M-Arrest stellt hierfür die nötige Zeit zur Verfügung. GIRARD
und YAMAZAKI konnten keinen G2/M-Defekt in primären NBS-Fibroblasten nach Bestrahlung finden [Girard et al., 2000; Yamazaki et al., 1998]. Auch XU ETAL., die EBV- transformierte NBS-Lymphozyten untersuchten, fanden einen normalen G2/M-Arrest [Xu et al., 2001]. Andere Autoren fanden wiederum einen gestörten G2/M-Phasenarrest.
Dabei wurden sowohl ein verminderter [Buscemi et al., 2001; Demuth et al., 2004; Stiff et al., 2004; Williams et al., 2002] als auch ein verstärkter [Ito et al., 1999; Kang et al., 2002; Williams et al., 2002] Phasenarrest beschrieben. Insgesamt ist eine Erklärung für die divergierenden Ergebnisse vermutlich auch in den unterschiedlichen verwendeten Zelltypen sowie in der Verschiedenheit der NBS-Mutation in humanen und Mauszellen zu suchen.
Trotz der teilweise widersprüchlichen Ergebnisse scheint Nbs1 eine wichtige Rolle bei der Zellzykluskontrolle zu spielen. So gilt die Fehlsteuerung des Zellzyklus in Form von
Einleitung - 18 - radioresistenter DNA-Synthese mittlerweile als eines der Hauptmerkmale des zellulären NBS-Phänotyps.
1.4 Zielsetzung der Arbeit
Nach dem Modell von KINZLER und VOGELSTEIN spielen zwei Klassen von Genen bei der Entartung von Zellen eine besondere Rolle, die Caretaker und die Gatekeeper [Kinzler und Vogelstein, 1997]. Während die Caretaker sich um die Instandhaltung der DNA durch Reparatur kümmern, kontrollieren die Gatekeeper den Zellzyklus und die Apoptose um entartete Zellen zu hemmen bzw. zu eliminieren (vgl. Abb. 1). Mutationen in Genen beider Gruppen können zur Krebsentstehung führen.
Ein erhöhtes Krebsrisiko ist ein Hauptmerkmal des autosomal rezessiv vererbten Nijmegen-Breakage-Syndroms [Seemanova et al., 1985], einem mit weltweit ca. 100 betroffenen Patienten seltenen Chromosomenbruchsyndrom. 1998 konnte die zugrunde liegende Mutation, eine 5bp-Deletion im Nbs1-Gen, identifiziert werden [Varon et al., 1998]. Die Funktionen des durch die Mutation betroffenen Genprodukts, dem Nibrin, sind noch nicht vollständig bekannt. Als unumstritten gilt heute eine Beteiligung des Nibrins als Caretaker bei der DNA-Reparatur. Dabei spielt es eine wichtige Rolle bei der Reparaturform des Non-homologous end joining [Kracker et al., 2005]. Die Funktionen von Nbs1 als Gatekeeper sind hingegen weniger gut erschlossen. Die Kontrolle des Zellzyklus wurde oft untersucht und ergab widersprüchliche Ergebnisse (vgl. Abschnitt 1.3.3.3). Noch unklarer als die Zellzykluskontrolle ist die Rolle von Nbs1 als Gatekeeper bei der Regulation der Apoptose. Zu diesem Themenkomplex liegen zudem bisher kaum Veröffentlichungen vor.
Hauptziel dieser Arbeit war die Charakterisierung von NBS-Zellen hinsichtlich der Fähigkeit, nach einer DNA-Schädigung die Apoptose zu induzieren. Dies war besonders hinsichtlich des klinischen Bildes beim NBS interessant, da Störungen in der Apoptoseregulation mit einem erhöhten Krebsrisiko einhergehen können [Igney und Krammer, 2002]. Mittels zweier verschiedener Apoptose-Nachweismethoden sollten die Apoptoseraten bei sieben lymphoblastoiden NBS-Zelllinien nach der Behandlung mit dem Radiomimetikum Bleomycin durchflusszytometrisch bestimmt werden. Aufgrund der klinischen und zellulären Überschneidungen im Phänotyp von NBS und Ataxia teleangiectasia (AT) wurden zwei AT-Zelllinien in die Untersuchungen einbezogen.
Zur erfolgreichen Durchführung der Apoptosemessungen war zunächst die Etablierung von Standardbedingungen erforderlich. Die im Rahmen hierzu durchgeführten Experimente zu Zellwachstum und Wachstumsinhibition nach Mutagenexposition dienten gleichzeitig dem Zweck, ein differenzierteres Bild des zellulären NBS- Phänotyps zu gewinnen. Hierbei interessierten – besonders im Hinblick auf die ausgeprägte klinische Variabilität des Krankheitsbildes – evtl. auftretende interindividuelle Unterschiede im zellulären Phänotyp.
Material - 20 -
2 Material
In diesem Kapitel sind die zur Durchführung der Versuche verwendeten Materialien, Geräte und Computeranwendungen sowie deren Hersteller tabellarisch aufgeführt. Ist bei der Bezugsquelle kein Land aufgeführt, handelt es sich um Orte in Deutschland.
2.1 Zelllinien
Bei sämtlichen verwendeten Zelllinien handelte es sich um Epstein-Barr-Virus (EBV)- transformierte B-Lymphozyten (lymphoblastoide Zellen).
NBS-Zelllinien Ort der Transformation
JaCe Institut für Humangenetik, Universität
Würzburg
PeAb Institut für Humangenetik, Universität
Würzburg
RoZd Institut für Humangenetik, Universität
Würzburg
94P247 Institut für Humangenetik, Charité
Universitätsmedizin Berlin
94P307 Institut für Humangenetik, Charité
Universitätsmedizin Berlin
95P185 Institut für Humangenetik, Charité
Universitätsmedizin Berlin
96P0048 Institut für Humangenetik, Charité
Universitätsmedizin Berlin
AT-Zelllinien
AT15 Institut für Humangenetik, Charité
Universitätsmedizin Berlin
L15 Department of Human Genetics, Sackler
Faculty of Medicine, Tel Aviv/Israel
Kontrollzelllinien
95P466 Institut für Humangenetik, Charité
Universitätsmedizin Berlin
98P651 Institut für Humangenetik, Charité
Universitätsmedizin Berlin
C520 Institut für Humangenetik, Charité
Universitätsmedizin Berlin 2.2
2.3
Zellkulturmedien
Medium Hersteller
Fetales Kälberserum Gibco BRL GmbH,
Penicillin/Streptomycin PAA Laboratories GmbH, Linz, Österreich
RPMI PAA Laboratories GmbH, Linz,
Österreich Chemikalien
Substanz Hersteller
Agarose Gibco BRL GmbH, Eggenstein
Big Dye Terminator Mix Applied Biosystems GmbH, Weiterstadt
Bleomycin Mack Medizintechnik GmbH,
Pfaffenhofen
Cyclophosphamid Baxter Oncology GmbH, Frankfurt
DMSO Sigma Aldrich Chemie GmbH,
Deisenhofen
dNTPs Rapidozym, Berlin
Einbettmedium Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA
Ethanol Merck, Darmstadt
Ethidiumbromid Serva, Heidelberg
Methotrexat Medac GmbH, Wedel
Natriumcitratdihydrat Merck, Darmstadt
Material - 22 -
Paraformaldehyd ICN Biomedicals, Aurora, OH, USA
PBS-Tabletten ICN Biomedicals, Aurora, OH, USA
Rinderserumalbumin Sigma Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen
Saccharose Roth, Karlsruhe
SDS Sigma Aldrich Chemie GmbH,
Deisenhofen
Tris Merck, Darmstadt
2.4
2.5
Enzyme
Enzym Hersteller
DNAse I Boehringer Mannheim GmbH,
Mannheim
DNA-Polymerase I Gibco BRL GmbH, Eggenstein
Proteinase K Boehringer Mannheim GmbH,
Mannheim
Taq-DNA-Polymerase Gibco BRL GmbH, Eggenstein Lösungen und Puffer
Lösung/Puffer Zusammensetzung bzw. Hersteller
Einfriermedium 90% RPMI (15% FKS, Pen/Strep), 10%
DMSO
Facs Flow/Safe/Rinse Becton Dickinson, San Jose, CA, USA
Fixierungslösung 25% Essigsäure, 75% Ethanol
Giemsa-Färbelösung 5%ig: 5 ml Giemsa, 10 ml 10xGiemsa- Puffer, 85 ml H2O
Isoton-Lösung (Zellzahlbestimmung) Beckman Coulter GmbH, Krefeld
Ladepuffer A 20% Ficoll 400, 5 mM EDTA, autokl.,
0,05% Bromphenolblau
Lysepuffer 1xPCR-Puffer, 1,7 µM SDS, 50 µg/ml
Proteinase K
Nicoletti-Puffer 1 M Natriumcitratdihydrat, 0,1% Triton x-100, 50 µg/ml Propidiumiodid
PBS 0,14 M NaCl, 2,7 mM KCl, 6,5 mM Na2HPO4
10xPCR-Puffer I 100 mM Tris-HCl (pH 8,5), 500 mM KCl, 30 mM MgCl2 (Mycoplasmentest Minerva)
TBE-Puffer (10x) (Laufpuffer) 900 mM Tris, 900 mM Borsäure, 40 mM EDTA
TE-Puffer 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA
Triton X-100 Calbiochem, La Jolla, CA, USA
2.6 Geräte
Gerät Hersteller ABI Sequencer 3100 Applied Biosystems GmbH, Weiterstadt
Automatische Pipettierhilfe Integra Biosciences GmbH, Fernwald
Brutschrank Heraeus Holding GmbH, Hanau
Dispensette Brand GmbH, Wertheim
FACS Calibur Becton Dickinson, San Jose, CA, USA
FACS Scan Becton Dickinson, San Jose, CA, USA
Feinwaage BP3100S Sartorius AG, Göttingen Fluoreszensmikroskop Zeiss Axiophot, Oberkochen
Geldokumentation Herolab, Wiesloch
Gelelektrophoresekammer Renner GmbH, Dannstadt Invertmikroskop Telaval 31 Zeiss, Oberkochen
Mikroliterpipetten Eppendorf GmbH, Hamburg
N2-Tank Messer Griesheim GmbH, Krefeld
Partikelzähler Beckman Coulter GmbH, Krefeld
Schüttelinkubator Thermomixer 5436 Eppendorf GmbH, Hamburg
Spannungsgeräte (Elektrophorese) Pharmacia Biotech, San Francisco, CA, USA
Sterilbank Laminair HBB2448 Heraeus Holding GmbH, Hanau
Thermocycler Biometra, Göttingen
Wasserbad GFL, Burgwedel
Zentrifugen Heraeus, Eppendorf
Material - 24 - 2.7
2.8
2.9
Fertige Kits
Kit Hersteller Annexin-V Apoptosis Detection Kit BD Biosciences, San Jose, CA, USA
Dye Ex Spin Kit Qiagen, Hilden
In Situ Cell Death Detection Kit,
Fluorescein Roche Diagnostics GmbH, Mannheim
Montage PCR (Reinigungskit) Millipore Corp., Bedford, MA, USA Venor GeM®-Mycoplasma Detection
Kit Minerva Biolabs GmbH, Berlin
Verbrauchsmaterialien
Material Hersteller Blue-Caps (15/50 ml) Falcon, Heidelberg
Eppendorfgefäße (1,5 ml) Sarstedt, Nümbrecht FACS-Röhrchen (5 ml) Falcon, Heidelberg Gewebezuchtflaschen (50/275 ml) Falcon, Heidelberg
Kryoröhrchen Greiner Labortechnik, Frickenhausen Multiwell-Platten (6er/24er) Falcon, Heidelberg
Pipettenspitzen Sarstedt, Nümbrecht
PS-Röhrchen (14 ml) Falcon, Heidelberg
Sterilpipetten (5/10/25 ml) Falcon, Heidelberg
Transferpipetten, 2,5 ml steril/unsteril Sarstedt, Nümbrecht
Computeranwendungen
Anwendung Hersteller CellQuest Software, V. 4.0.2 BD Biosciences, San Jose, CA, USA WinMdi, V. 2.8 J. Trotter, La Jolla, CA, USA
Sigma Plot, V. 8.0 SPSS Science, Chicago, IL, USA Microsoft Excel 97 Microsoft Corp., Seattle, WA, USA
Als DNA-Längenvergleichsstandard wurde der Marker pSP65/Hinf I (AG Digweed) eingesetzt. Für molekularbiologische Arbeiten wurde deionisiertes Wasser aus einer
Aufbereitungsanlage (MilliQ UFplus) der Firma Millipore Corp. (Bedford, MA, USA), mit einer Leitfähigkeit von 5 –15 mΩ/cm verwendet.
Methoden - 26 -
3 Methoden
Dieses Kapitel stellt die zur Durchführung der Experimente verwendeten Methoden dar.
Die Abschnitte 3.1 bis 3.6 befassen sich mit allgemeinen Methoden wie der Kultivierung der Zelllinien, der Bestimmung der Zellzahl und der Chromosomenanalyse. Hier werden auch die Methoden der PCR und der DNA-Sequenzierung vorgestellt, die vor Beginn der eigentlichen Versuchsreihen zur Unterscheidung der Zelllinien, zur Testung auf Mycoplasmen und zum Nachweis der 657del5-Mutation in den NBS-Zelllinien verwendet wurden.
Die Abschnitte 3.7 bis 3.9 stellen die Untersuchungen zum Wachstumsverhalten und zur Wachstumsinhibition der NBS-Zelllinien dar. Die Wachstumsinhibition wurde mit drei verschiedenen Mutagenen untersucht, die kurz charakterisiert werden.
In den Abschnitten 3.10 und 3.11 folgt die Beschreibung der Versuche zur Apoptoseinduktion in lymphoblastoiden NBS-Zelllinien. Die verwendeten Apoptose- nachweisverfahren – die sub-G1-peak-Methode und die Annexin-V-Färbung – werden vorgestellt. Darüber hinaus werden kurz die Grundlagen der durchflusszytometrischen Technik beschrieben, die zur Messung der Apoptoseraten verwendet wurde.
3.1 Kultivieren und Passagieren von Zellen
Zum Auftauen wurden die Zellen nach der Entnahme aus dem Stickstofftank (-196°C) auf Eis transportiert und in einem 37°C warmen Wasserbad aufgetaut. Die in Einfriermedium gelösten Zellen wurden mit einer Transferpipette in 9 ml RPMI (15%
FKS/Pen/Strep) überführt und 10 min bei 800 rpm zentrifugiert. Nach Absaugen des Überstandes wurde das Pellet in 5 ml frischem Medium resuspendiert, in eine kleine Gewebezuchtflasche (50 ml) überführt und in den Brutschrank gestellt.
Die Zellen wurden in Gewebezuchtflaschen (275 ml) im Brutschrank bei 37°C und 5%
CO2 kultiviert. Das verwendete Zellkulturmedium (RPMI) wurde mit 15% fetalem Kälberserum (FKS) und Antibiotika (Penicillin und Streptomycin) versetzt und bei 4°C verwahrt. Im Durchschnitt wurden die Zellen alle 3-4 Tage im Verhältnis von 1:2, 1:4 oder 1:9, je nach Teilungsrate, in eine neue Flasche überführt. Das Umsetzen erfolgte unter sterilen Bedingungen in folgenden Schritten:
• Vereinzelung der Zellen durch Auf- und Abpipettieren mit einer sterilen 10 ml Pipette
• Überführen des entsprechenden Anteils Zellsuspension in eine neue Flasche
• Auffüllen bis auf 50 ml mit frischem Medium
Sollten Zellen über einen längeren Zeitraum konserviert werden, wurden sie nach folgendem Protokoll eingefroren:
• Die durch Auf- und Abpipettieren vereinzelten Zellen wurden aus der mittleren Gewebezuchtflasche in ein 50 ml Blue-Cap-Röhrchen überführt und bei 100 rpm für 10 min zentrifugiert.
• Das sichtbare Zellpellet wurde mit einer sterilen Transferpipette in 2-3 ml gekühltem Einfriermedium aufgenommen. Zusatz von Dimethylsulfoxid (DMSO) verhinderte die Kristallbildung innerhalb der Zellen sowie die partielle Dehydratation des Zytoplasmas.
• Jeweils 1 ml der Zellsuspension wurde in ein verschließbares Kryoröhrchen gegeben und sofort auf Eis gestellt.
• Um ein schrittweises Abkühlen zu gewährleisten, wurden die Zellen für mindestens 24 h in einer Einfrierbox aus Styropor bei -80°C aufbewahrt.
Über den Zeitraum von einigen Monaten konnten die Zellen bei -80°C verwahrt werden;
bei längerer Verwahrung wurden sie in flüssigem Stickstoff (-196°C) gelagert.
3.2 Zellzahlbestimmung
Die Zellzahl wurde automatisch mit Hilfe eines Partikelzählers der Firma Beckman Coulter bestimmt. Das Prinzip der Zählung und Größenbestimmung beruht auf der Messung der Widerstandsänderung, die eine Zelle auslöst, wenn sie in einer elektrisch leitfähigen Flüssigkeit suspendiert wird und durch eine kleine Kapillaröffnung tritt. Die zu messende Partikelgröße wurde auf 7,7-13,4 µm Durchmesser, die durchschnittliche Lymphozytengröße, eingestellt. Da tote Zellen einer Schrumpfung unterliegen, ist ihr Durchmesser kleiner als der lebender Zellen, so dass nur vitale Zellen gezählt werden.
Für die Zellzahlbestimmung mussten die Zellen zunächst vereinzelt werden. 200 µl der Zellsuspension wurden in ein Zählgefäß mit 10 ml isotoner Lösung gegeben, unter die
Methoden - 28 - Kapillare in den Partikelzähler gestellt und gemessen. Das Gerät zählt jeweils zweimal 500 µl und mittelt das Ergebnis. Auf einem Display wurden die Zellzahl und die Größenverteilung der Zellen abgelesen. Das Ergebnis wurde mit dem Faktor 100 multipliziert.
3.3 Chromosomenanalyse
Um grobe Aberrationen wie z. B. eine Tetraploidie der verwendeten Zelllinien auszuschließen, wurden die Zellen vor Beginn der Versuche einer Chromosomenanalyse unterzogen.
Für die Analyse wurden 1x106 Zellen entnommen, 10 min bei 1000 rpm zentrifugiert und in 3 ml frischem Medium aufgenommen. Die Suspension wurde in 50 ml Gewebezuchtflaschen überführt und zwei Tage im Brutschrank verwahrt.
Zur Fixierung wurden Die Zellen eine Stunde in 30 µl Colcemid inkubiert und anschließend in Röhrchen überführt und 10 min bei 1000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Zellen in 5 ml 0,4% KCl resuspendiert und 10 min inkubiert. Die hypotone Lösung bewirkt ein Aufquellen der Zellen. Währenddessen wurden 100 ml Fixierungslösung bestehend aus 25 ml Essigsäure und 75 ml Ethanol angesetzt. Der Überstand wurde bis auf etwa 500 µl abgenommen und die Zellen resuspendiert.
Da die erste Fixierung langsam erfolgen muss, wurden mehrere Tropfen Fixativ langsam nacheinander zugegeben. Anschließend wurden die Röhrchen geschüttelt und weitere 5 ml Fixativ zugegeben. Wieder wurde 10 min/1000 rpm zentrifugiert. Die Zellen wurden zwei weitere Male in 5 ml Fixativ fixiert, resuspendiert und 10 min/1000 rpm zentrifugiert.
Je zwei Tropfen der Zellsuspension wurden auf gekühlte, beschriftete Objektträger aufgetropft und unter einer 65-Watt-Lampe getrocknet.
Für die Färbung wurden die Objektträger für 8 min in Giemsa-Lösung getaucht und mit Wasser abgespült. Die Präparate wurden auf einer Wärmebank bei 42°C getrocknet, etwas Einbettmedium aufgebracht und ein Deckglas aufgedrückt. Für die Auswertung wurden die Präparate unter dem Lichtmikroskop auf grobe Veränderungen im Chromosomensatz untersucht. Pro Zelllinie wurden 20 Metaphasen beurteilt. Bei mehr als einer tetraploiden Metaphase wurde die Zelllinie von den Apoptoseversuchen
ausgeschlossen. Pro Präparat wurden zwei digitale Fotos von Metaphasen gemacht und abgespeichert.
3.4
3.5
DNA-Extraktion aus lymphoblastoiden Zellen
Nach sorgfältiger Resuspension wurde 1 ml Zellsuspension in ein Eppendorfgefäß überführt. Zunächst erfolgte die Zentrifugation für 2 min bei 2000 rpm, anschließend für 30 sec bei 14 000 rpm. Der Überstand wurde verworfen und die Zellen in 30 µl Lysepuffer resuspendiert, 1 h bei 37°C und nochmals für 10 min bei 85°C inkubiert. Die anschließende Zentrifugation von 10 min bei 14 000 rpm bewirkte die Sedimentation von Zelltrümmern am Boden des Gefäßes während die DNA im Überstand gelöst war.
Der Überstand wurde in ein neues Eppendorfgefäß überführt. 1,5 µl des Überstandes wurden für die nachfolgend beschriebenen PCR-Reaktionen verwendet.
Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Die PCR ist eine Methode zur enzymatischen Amplifikation spezifischer DNA- Abschnitte. Voraussetzung hierfür ist die Kenntnis der Nukleotidsequenzen, die den gewünschten Genabschnitt flankieren. Zwei synthetisch hergestellte Oligonukleotide (Primer), die komplementär zu den flankierenden Sequenzen sind, binden an die durch Erhitzen denaturierte, einzelsträngig vorliegende DNA und dienen als Startpunkt für die DNA-Synthese. Eine hitzestabile DNA-Polymerase verlängert die Primer entlang der einzelsträngigen Matrize und synthetisiert so den komplementären DNA-Strang. Durch ein in der Regel dreistufiges Temperaturprofil werden die Einzelschritte der Reaktion – Denaturierung des Doppelstrangs, Anlagerung der Primer und Synthetisieren der komplementären DNA – koordiniert. Durch 20-35fache Wiederholung dieses Zyklus lässt sich eine nahezu exponentielle Anreicherung der Zielsequenz erreichen.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die PCR zur Abgrenzung der verwendeten Zelllinien gegeneinander zu Beginn und Ende der Experimente genutzt. Kontaminationen der Zelllinien untereinander sollten dadurch ausgeschlossen werden. Weiterhin wurden alle Linien mittels PCR auf Mycoplasmen getestet. Außerdem wurden PCR-Produkte der sieben verwendeten NBS-Zelllinien zum Nachweis der 657del5 Mutation sequenziert.
Methoden - 30 - 3.5.1 Nachweis der Zellgleichheit
Vor Beginn und nach Abschluss der Versuche wurden die verwendeten Zelllinien molekulargenetisch auf Zellgleichheit untersucht. Zu diesem Zweck kam der so genannte Minisatellitentest zum Einsatz. Minisatelliten-DNA besteht aus Kopien von DNA-Abschnitten (Repeats) von 16-64 Basenpaaren, die sich über das gesamte Genom verteilt finden. Überwiegend werden sie weder transkribiert, noch kann ihnen eine funktionelle Bedeutung zugeschrieben werden. Man bezeichnet diese polymorphen Sequenzen auch als VNTR (Variable Number of Tandem Repeats). Da die Anzahl dieser repetitiven Sequenzeinheiten von Mensch zu Mensch variiert, ist es möglich, durch die Bestimmung der Anzahl an Repeats Individuen gegeneinander abzugrenzen.
Der hier verwendete Minisatellit D1S80 besteht aus einer Einheit von 16 Basenpaaren, die im menschlichen Erbgut zwischen 13 und 37mal kopiert vorliegen kann. Mittels PCR läßt sich die genaue Anzahl der Sequenzeinheiten bestimmen.
Für den Versuch wurde humane genomische DNA aus den Zelllinien extrahiert (vgl.
Abschnitt 3.4). Ein PCR-Ansatz mit 25 µl Endvolumen enthielt 2 µl genomische DNA und 0,2 µl Taq-DNA-Polymerase (5 U/µl). Die Konzentration der Desoxynukleotid- triphosphate (dNTPs) betrug 0,8 mM, die der Primer jeweils 0,15 µM. Durch Zusatz von
1/10 Volumen 10xPCR-Puffer wurde die Konzentration der zusätzlichen Komponenten eingestellt.
PCR-Profil:
5 min 94°C 30 sec 94°C
30 sec 65°C 32 Zyklen 1 min 72°C
10 min 72°C
3.5.2 Gelelektrophorese der PCR-Produkte
Die elektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte erfolgte in horizontalen Agarosegelen. Der pH-Wert des TBE-Puffers lag mit 8,3 im basischen Bereich, in dem Protonen von der DNA abdiffundieren und diese somit negativ geladen vorliegt. Durch
Anlegen eines elektrischen Feldes bewegt sich die DNA zur positiv geladenen Anode.
Abhängig von der Größe der PCR-Produkte wandert die DNA unterschiedlich schnell durch das Agarosegel. Dadurch kommt es zur Auftrennung der Fragmente nach ihrer Größe, wobei die kleinsten Fragmente am schnellsten wandern.
Zur Herstellung des in dieser Arbeit verwendeten 1,5%igen Agarosegels wurden 1,5 g Agarose auf 100 ml mit TE-Puffer aufgefüllt, in einem Mikrowellengerät aufgekocht und gelöst. Zur Detektion der DNA wurden 0,05 µg/ml des Farbstoffes Ethidiumbromid zugegeben. Ethidiumbromid lagert sich in die DNA ein und fluoresziert nach Anregung durch UV-Licht. Die Agaroselösung wurde in eine Gelkammer gegossen und ein Probenkamm eingesetzt. Nach Erkalten und Verfestigung des Gels wurde der Kamm herausgezogen und das Gel mit TBE-Puffer überschichtet.
Die DNA wurde in Ladepuffer aufgenommen (0,3 Vol.) und in die Geltaschen gegeben.
Als DNA-Längenvergleichsstandard dienten selbst hergestellte Marker der entsprechenden Repeatzahl, die zusammen mit den PCR-Produkten aufgetragen wurden. Anhand ihrer Größe ließ sich die jeweilige Größe der Produkte in Basenpaaren schätzen.
Die Auftrennung der PCR-Produkte erfolgte bei 120 V für 30 min. Nach Abschluss der Elektrophorese wurde das Gel unter UV-Licht fotografiert und das Bild digital gespeichert.
3.5.3 Mycoplasmentest
Vor Beginn der Experimente wurden alle Zelllinien auf Mycoplasmen getestet.
Mycoplasmen sind zellwandlose Bakterien mit einem besonders kleinen Genom. Für die Zellkultur stellen sie eine besondere Gefahr dar, da sie nur schwer nachweisbar sind, den Zellstoffwechsel jedoch nachhaltig beeinflussen können. So können sie z. B.
das Zellwachstum hemmen und zu chromosomaler Instabilität führen.
Die Zellen wurden resuspendiert und je 200 µl des Zellsuspensionsüberstandes in Eppendorfgefäße überführt. Diese wurden für 5 min bei 100°C im Wasserbad inkubiert, um evtl. enthaltene Mycoplasmen zu lysieren und DNAsen zu inaktivieren. Durch anschließende Zentrifugation für 5 min bei 13 000 rpm wurden störende Zelltrümmer abgetrennt. Für die PCR-Reaktion wurden 0,5 µl des Überstandes verwendet. Eine
Methoden - 32 - Null-Kontrolle (steriles, deionisiertes Wasser) und eine Mycoplasmen-Positivkontrolle (Mycoplasma orale DNA, Minerva Biolabs) wurden mitgeführt.
Das Gesamtvolumen eines PCR-Ansatzes betrug 10 µl. Er enthielt 1 µl 10xPCR Reaktionspuffer (Minerva), 1 µl Primer/Nukleotide (Minerva) und 0,04 µl Taq-DNA- Polymerase (5 U/µl). Mit ddH2O wurde auf ein Volumen von 9,5 µl aufgefüllt. Nach Zugabe von 0,5 µl DNA wurde die PCR nach folgendem Profil durchgeführt.
2 min 94°C 2 min 55°C 2 min 72°C 30 sec 94°C 1 min 55°C 1 min 72°C
34 Zyklen
Die Auftrennung der PCR-Produkte erfolgte wie unter 3.5.2 beschrieben im 1,5%igen Agarosegel bei einer Spannung von 120 V für ca. 30 min.
3.6 Mutationsnachweis durch Sequenzierung
Vor Beginn der Versuche wurden alle verwendeten NBS-Zelllinien auf die Mutation 657del5 getestet, um sicher zu gehen, dass die Linien tatsächlich Träger der Mutation sind. Hierfür wurde das von SANGER ETAL. beschriebene Verfahren der Sequenzierung durch kontrollierten Kettenabbruch verwendet [Sanger et al., 1977]. In Abhängigkeit von Primer und Matrizenstrang wird von einer DNA-Polymerase ein farbiges DNA-Produkt synthetisiert. Die Markierung erfolgt mit in vier verschiedenen Farben fluoreszierenden ddNTPs. Jeder Base ist ein spezifisches Fluorophor zugeordnet. Bei der Gelelektrophorese misst ein Detektor die Fluoreszenzsignale der vorbeiwandernden DNA und zeichnet sie auf. Die Ausgabe der Ergebnisse erfolgt in Form von Intensitätsprofilen, aus denen die exakte Basensequenz abgelesen werden kann (vgl.
Abb. 9).
3.6.1 Reinigung der PCR-Produkte
Die PCR wurde unter den in 3.5 beschriebenen Bedingungen durchgeführt. Für jede Zelllinie wurde ein PCR-Produkt von Exon 6 des Nbs1-Gens mit Hilfe der Primer NBS Ex6-F und -R (biomers.net GmbH, Ulm) gewonnen. Nach der Agarosegelkontrolle
wurden die Produkte von restlichen Primern, dNTPs, Salzen etc. gereinigt. Dies erfolgte mit Hilfe eines Kits der Firma Millipore. Das Kit besteht aus Eppendorf-ähnlichen Probengefäßen und kleinen Säulen mit Filter.
Zunächst wurde für jede Probe eine Filtersäule in ein Probengefäß gesteckt. Die PCR- Produkte wurden in 4 µl ddH2O gelöst, mit sterilem Wasser auf 500 µl aufgefüllt und auf die Filtersäulen aufgetragen. Die Säulen wurden 15 min bei 5000 rpm zentrifugiert, der Durchlauf verworfen und die DNA-haltige Filtersäule auf ein sauberes Probengefäß gesteckt. Für die Elution der DNA wurden 30 µl H2O zugegeben und erneut zentrifugiert (2 min/4000 rpm).
3.6.2 Ansatz der Sequenzierreaktion
Die Sequenzierreaktion wurde nach folgendem Ansatz auf Eis pipettiert:
5 µl PCR-Produkt
2 µl Big Dye Terminator Mix 2 µl 1,6 µl/mol Primer
7 µl steriles H2O 4 µl Puffer
PCR-Profil zur Sequenzierung:
10 sec 96°C 5 sec 50°C
4min 60°C
25 Zyklen
Das Sequenzierprodukt wurde von nicht eingebauten Nukleotiden mit dem Dye-Ex Spin Kit gereinigt. Dieses Kit besteht aus kleinen Säulen mit einer Gelmatrix (Sephadex) und entsprechenden 2 ml Probengefäßen zum Auffangen der eluierten DNA. Zunächst wurden die Deckel der Säulen geöffnet und die Säulen kurz gemischt, um das Sephadex vollständig zu resuspendieren. Dann wurde der Säulenverschluss am Boden entfernt und die Säule in ein Eppendorfgefäß gesetzt. Die Säulen mit Eppendorfgefäß wurden 3 min bei 3000 rpm zentrifugiert und in saubere Eppendorfgefäße gesetzt.
Anschließend wurde das gesamte Volumen der Sequenzierreaktion auf die Membran aufgetragen. Es folgte eine weitere Zentrifugation von 3 min bei 3000 rpm, um die DNA
