Varianten des RAP80-Deubiquitinierungskomplexes bei Patientinnen mit Mammakarzinom

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INHALTSVERZEICHNIS I

Inhaltsverzeichnis

Seite

Abkürzungsverzeichnis VII

1. Einleitung 1

1.1 Stellenwert des Mammakarzinoms im Gesundheitswesen 1

1.2 Epidemiologie des Mammakarzinoms 2

1.3 Beeinflussende Faktoren bei der Entwicklung eines Mammakarzinoms 3

1.3.1 Einführung 3

1.3.2 Unvermeidbare Risikofaktoren 3

1.3.3 Vermeidbare Risikofaktoren 5

1.4 Maßnahmen zur Senkung der Mammakarzinominzidenz und mortalität 8

1.5 DNA Reparaturwege und Mammakarzinom 11

1.5.1 Einführung 11

1.5.2 Die Basenexzisionsreparatur (BER) 12

1.5.3 Die Nukleotidexzisionsreparatur (NER) 13

1.5.4 Das Non homologous end joining (NHEJ) 13

1.5.5 Die homologe Rekombination (HR) 15

1.5.6 Mögliche Folgen von Defekten in den Reparaturwegen 19

1.6 Funktionen von BRCA1 20

1.7 Bedeutung einzelner Reparaturproteine bei Doppelstrangbrüchen (DSB) 21

1.8 Der RAP80 Deubiquitinierungskomplex 24

1.8.1 Die Bindungspartner und ihre Aufgaben bei der

Doppelstrangbruchreparatur 24

1.8.2 Die Bindung des RAP80 Deubiquitinierungskomplexes an

Chromatin 27

1.8.3 Funktionen des BRCA1 KomplexesA und ihre Bedeutungen 28

1.8.4 Charakterisierung von RAP80 30

1.8.5 Charakterisierung von MERIT40 32

1.8.6 Bekannte Varianten von und ihre Assoziation mit dem

Mammakarzinom 32

INHALTSVERZEICHNIS II Seite 1.8.7 Bekannte Varianten von und ihre Assoziation mit

dem Mammakarzinom 35

1.9 Zielsetzung 36

2. Material 37

2.1 Überblick 37

2.2 Biotechnische Geräte 37

2.3 Kleingeräte und Zubehör 39

2.4 Laborbedarf 41

2.5 Chemikalien und Kits 41

2.6 Lösungen, Puffer und Gele 42

3. Methoden 45

3.1 Überblick 45

3.2 Extraktion von genomische DNA aus Vollblut 45

3.3 PCR Technik zur Amplifizierung von genomischer DNA 47 3.3.1 Geschichtlicher Hintergrund der Entdeckung der PCR nach

einer Schilderung von K. B. Mullis (1990) 47

3.3.2 Automatisierte Durchführung der PCR mit dem Thermocycler 48 3.3.3 Herstellen eines PCR Ansatzes zur Amplifizierung von DNA

Abschnitten 51

3.3.4 Einfluss einzelner Parameter bei der PCR Optimierung 52 3.3.5 Angewandte Strategien der PCR Optimierung für die

Amplifizierung von exonständigen Abschnitten und den dazugehörigen intronständigen Fragmenten der Gene

und 55

3.3.6 Primer Design 56

3.4 Agarose Gelelektrophorese 57

3.4.1 Prinzip 57

3.4.2 Verfahren 57

3.5 PEG Fällung der PCR Produkte 59

3.6 Beurteilung der Fällungsprodukte 60

INHALTSVERZEICHNIS III Seite

3.7 Sequenzierreaktion 61

3.8 Fällung der Produkte der Sequenzierreaktion mittels Natriumacetat und

Uvasol 62

3.9 Sequenzierung 62

3.10 „High Resolution Melting“ (HRM) Analyse mit dem Rotor Gene 6000 63

3.10.1 Experimenteller Hintergrund 63

3.10.2 Prinzip 64

3.10.3 PCR Optimierung und Ansatz für die HRM Analyse 64

3.11 Bioinformatische Methoden 66

3.11.1 Einführung 66

3.11.2 Einschätzung der Schadenswahrscheinlichkeit von „missense“

Mutationen 66

3.11.3 Berechnung möglicher Beeinflussung intronständiger

Spleißstellen 67

3.11.4 Voraussage über die Beeinflussung von exonständigen Spleiß

Enhancern 68

3.11.5 Statistische Berechnungen 69

3.11.6 Bestimmung der Haplotypen und Testen auf

Kopplungsungleichgewicht 70

3.11.7 Berechnung von tagSNPs für und 71

4. Ergebnisse 73

4.1 Einführung 73

4.2 Varianten im Gen für RAP80 73

4.2.1 Nomenklatur 73

4.2.2 Varianten in Exon 2 73

4.2.3 Varianten in Exon 3 74

4.2.4 Varianten in Exon 5 75

4.2.5 Varianten in Intron 5 75

4.2.6 Varianten in Exon 8 76

4.2.7 Varianten in Exon 9 76

4.2.8 Varianten in Intron 9 77

INHALTSVERZEICHNIS IV Seite

4.2.9 Varianten in Exon 10 78

4.2.10 Varianten in Intron 10 78

4.2.11 Varianten in Intron 11 79

4.2.12 Varianten in Intron 12 79

4.2.13 Zusammenfassung aller Varianten von in beiden

Kollektiven 80

4.3 Varianten im Gen für MERIT40 80

4.3.1 Nomenklatur 80

4.3.2 Varianten in Intron 1 81

4.3.3 Varianten in Intron 3 82

4.3.4 Varianten in Intron 6 83

4.3.5 Varianten in Intron 8 84

4.3.6 Varianten in Exon 9 85

4.3.7 Zusammenfassung aller Varianten von in beiden

Kollektiven 86

4.4 Vergleich exonständiger Spleiß Enhancer von und 86

4.4.1 Einführung 86

4.4.2 Mögliche exonständige Spleiß Enhancer in den Varianten von

86

4.4.2.1 Überblick 86

4.4.2.2 Exon 2 von – Basenaustausch von CGT zu TGT

bei Nukleotid 100 der codierenden Sequenz 87 4.4.2.3 Exon 3 von – Basenaustausch von ATC zu ATT

bei Nukleotid 228 der codierenden Sequenz 88 4.4.2.4 Exon 5 von – Basenaustausch von TCC zu TCT

bei Nukleotid 381 der codierenden Sequenz 88 4.4.2.5 Exon 8 von – Basenaustausch von CCA zu CTA

bei Nukleotid 1304 der codierenden Sequenz 90 4.4.2.6 Exon 9 von – Basenaustausch von ACC zu

ACA bei Nukleotid 1344 der codierenden Sequenz 90 4.4.2.7 Exon 10 von – Basenaustausch von TGC zu

CGC bei Nukleotid 1531 der codierenden Sequenz 92

INHALTSVERZEICHNIS V Seite 4.4.3 Mögliche exonständige Spleiß Enhancer in den Varianten von

93

4.4.3.1 Überblick 93

4.4.3.2 Exon 9 von – Basenaustausch von AAG zu

AAA bei Nukleotid 837 der codierenden Sequenz 93 4.5 Mögliche intronständige Spleißstellenveränderungen in den Varianten von

und der beiden untersuchten Kollektive 94

4.5.1 Einführung 94

4.5.2 Intronständige Spleißstellenveränderungen in 94 4.5.3 Intronständige Spleißstellenveränderungen in 95

4.6 Allelfrequenzen 96

4.6.1 Allelfrequenzen der Varianten von 96

4.6.2 Allelfrequenzen der Varianten von 98

4.7 Analyse des Kopplungsungleichgewichts für Einzelnukleotid

Polymorphismen von 99

4.7.1 Einführung 99

4.7.2 Genotypen des deutschen Patientinnenkollektivs für 100 4.7.3 Genotypen des weißrussischen Patientinnenkollektivs für 101 4.7.4 Haplotypberechnung und Kopplungsanalyse für 102 4.8 Analyse des Kopplungsungleichgewichts für Einzelnukleotid

Polymorphismen von 106

4.8.1 Einführung 106

4.8.2 Genotypen des deutschen Patientinnenkollektivs für 106 4.8.3 Genotypen des weißrussischen Patientinnenkollektivs für

108 4.8.4 Haplotypberechnung und Kopplungsanalyse für 108 4.9 Screening der p.R34C Variante im Gen mittels „High Resolution

Melting“ Analyse 111

4.9.1 Einführung 111

4.9.2 Optimierungsergebnis für die Unterscheidung der Varianten in

Exon 2 von 112

4.9.3 Bestimmung der Variante p.R34C von 113

INHALTSVERZEICHNIS VI Seite

5. Diskussion 115

5.1 Überblick 115

5.2 Bedeutung der Varianten von für die Entstehung eines familiären

Mammakarzinoms 116

5.2.1 Überblick 116

5.2.2 Mögliche Auswirkungen exonständiger „missense“ Mutationen

p.R34C, p.P435L, p.C511R des Gens 117

5.2.3 Mögliche Auswirkungen exonständiger synonymer Mutationen

p.I76I, p.S127S, p.T448T des Gens 121

5.2.4 Mögliche Auswirkungen intronständiger Varianten IVS10 17 A>T,

IVS12 17 G>A des Gens 123

5.2.5 Mögliche Auswirkungen intronständiger Varianten IVS5 42 A>T,

IVS9+42 C>T, IVS11+24 G>A des Gens 125

5.2.6 Kopplungsanalyse der Varianten von 126

5.2.7 Ausblick zu 129

5.3 Bedeutung der Varianten von für die Entstehung eines familiären

Mammakarzinoms 129

5.3.1 Überblick 129

5.3.2 Mögliche Auswirkungen der exonständigen synonymen Mutation

p.K279K des Gens 130

5.3.3 Mögliche Auswirkungen intronständiger Varianten IVS1 7 C>T,

IVS8 6 C>T des Gens 132

5.3.4 Mögliche Auswirkungen intronständiger Varianten IVS1 31 G>A,

IVS3+41 A>T, IVS6 50 G>A des Gens 134

5.3.5 Kopplungsanalyse der Varianten von 135

5.3.6 Ausblick zu 137

5.4 Gesamtausblick 138

6. Zusammenfassung 140

7. Literaturliste 143

8. Anhang 166

9. Danksagung 177

10. Lebenslauf 178

11. Erklärung 180

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS VII

% Prozent

° C Grad Celsius

l Mikroliter

M Mikromolar

3D 3 dimensional

53BP1 p53 bindendes Protein 1

Abb. Abbildung

AIR Abraxas interacting region

APLF Aprataxin und Polynukleotid Kinase like Faktor

AS Aminosäure(n)

AT Ataxia teleangiectatica

AT Adenosin und Thymin

A TLD Ataxia teleangiectasia like Disorder

ATM Ataxia telangiectasiamutated

ATR Ataxia telangiectasia and Rad3 related

BRISC and BRCA1 A complex member

BACH1 BTB and CNC homology 1

BARD1 BRCA1 associated RING domain 1

BER Basenexzisionsreparatur

BLM Bloom Helikase

BRCA Breast Cancer susceptibility gene 1

BRCC36 BRCA1/BRCA2 containing complex, subunit 3

BRCC45 (=BRE) brain and reproductive organ expressed

BRCT BRCA1 C terminale Domäne

bzw. beziehungsweise

ca. circa

CASP8 Caspase 8

CCDC98 (Abraxas) coiled coil domain containing 98

Cdc25A cell division cycle 25 homolog A

CDK1 Cyclin dependent Kinase

cDNA copy DNA

CEU „Probanden europäischer Herkunft“

Chk1, Chk2 Checkpointkinase 1 (2)

cM Centimorgan

CtIP CtBP interacting protein

D „Differenz zwischen der erwarteten und der beobachteten Wahrscheinlichkeit für das gemeinsame Auftreten zweier Allele zweier SNPs“

D` D/ Dmax

ddNTP Didesoxyribonukleosidtriphosphat

dF/dT Differential der Fluoreszenz nach der Temperatur

Dmax min (pApb, papB)

DNA Desoxyribonukleinsäure

DNA PK DNA abhängige Proteinkinase

dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat

DSB Doppelstrangbruch ( brüche)

Abkürzungsverzeichnis

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS VIII

dt. deutsch

E1, E2, E3 Enzymunterheiten

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EM Expectation Maximization Algorithm

ESE exonic splicing Enhancer (exonständiger Spleißverstärker) ESS Exonic splicing Silencer (exonständiger Spleißminderer)

FANCD1 Fanconi Anämie 1

FHA Forkhead associated

GADD45 Growth arrest and DNA damage inducible protein 45

GC Guanin und Cytosin

H2AX Histonvariante 2 AX

HDM2 Mdm2 p53 binding protein homolog

HERC2 hect domain and RLD2

HNPCC Hereditäres nicht polypöses Kolonkarzinom

HPLC High pressure liquid chromatography

HR Homologe Rekombination

HRM High Resolution Melting

IR Infrarot

IRIF Ionizing radiation induced foci

JAMM JAB1/CSN5/MPN domain metalloenzyme motif

K63, K6, K48 Lysin 63 (6, 48)

Kap. Kapitel

kB Kilobasen

KM MRT Kontrastmittel Magnetresonanztomographie

Ku70, Ku80 ATP dependent DNA helicase 2 subunit 1

LD Linkage Disequilibrium (Kopplungsungleichgewicht)

LOD Logarithm of the odds

LOH Loss of heterozygosity

lt. laut

M Mol

MAF Minor allele frequency (kleinste Allelfrequenz)

MDC1 Mediator of DNA damage checkpoint protein 1

Merit40 Mediator of Rap80 interactions and targeting 40 kD

Mg²⁺ Magnesium Ion

MgCl₂ Magnesiumchlorid

min Minuten

ml Milliliter

MLH1, MLH3 mutL homolog 1 (3), colon cancer, nonpolyposis type 2

mM Millimolar

MMR Mismatch Reparatur

MRE11 Mutation of meiotic recombination 11

MRN „Komplex aus MRE11, RAD50 und NBN“

mRNA messenger RNA

MSH2, MSH3, MSH4, MSH6 mutS homolog 2 (3, 4, 6)

Na Natrium

NBA1 (= Merit40) New component of the BRCA1 A complex

NBS1 Nijmegen Breakage Syndrom 1

NBSLD Nijmegen Breakage Syndrom like Disease

NER Nukleotidexzisionsreparatur

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS IX

ng Nanogramm

NHEJ Non homologous end joining

OR Odds Ratio

p Wahrscheinlichkeit

p21 cyclin dependent kinase inhibitor 1

p53 Tumorprotein p53

Pat. Patientin(nen)

PCR Polymerasekettenreaktion

PEG Polyethylenglykol

PIKK Phosphoinositide 3 kinase like kinase

PK Pyruvatkinase(n)

PNK Polynukleotidkinase

PSIC Position specific independent counts

px Allelfrequenz für das Allel x

r² Bestimmtheitsmaß

RAD50,51, 52 RAD50 (51, 52) homolog

RAP80 Receptor associated protein 80

RING (finger Domäne) Really Interesting New Gene (finger Domäne)

RNA Ribonukleinsäure

RNF8, RNF168 Ring Finger 8 (168)

ROS Reaktive Sauerstoffspezies

RPA Replication protein A

rpm Umdrehungen pro Minute

RS SCID Radiosensitive severe combined immunodeficiency RTR retinoid related testis associated receptor

S Svedberg

S. Seite

s. siehe

s.o. siehe oben

SDT (motif) Serin Aspartat Threonin (motif)

siRNA small interfering RNA

Smc1 Structural maintenance of chromatin 1

SNP Single Nucleotid Polymorphism (Einzelbasenaustausch)

sn RNA small nuclear RNA

S(PO₄)PXF (motif) (Phospho )Serin Prolin beliebige AS Phenylalanin (motif)

ss single stranded (einzelsträngig)

ssDNA single stranded DNA

Tab. Tabelle

tagSNP „SNP, der als Marker dient“

TBE TRIS Borat EDTA

TE TRIS EDTA

TOP3 Topoisomerase 3

Tr.freq. Trägerfrequenz

U Units

Ubc13, Ubc9, UbcH5c Ubiquitin conjugating 13 (9, H5c)

UIM Ubiquitin interacting motif

Ubiquitin interacting motif containing 1

UTR untranslated region

UV Ultraviolett

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS X

V Volt

vgl. vergleiche

vs. versus

VWF von Willebrandt Faktor

WRN Werner Helikase

XPA, XPB,..., XPG Xeroderma pigmentosa A, B,..., G

XRCC1, ..., XRCC4 X ray complementing Chinese hamster gene

γ Gamma

γ H2AX Phosphorylierte Form der Histonvariante H2AX

θ Teta; „Rekombinationsrate“; „Wert einer

Likelihoodfunktion”

α Standardabweichung

1. EINLEITUNG 1

1. Einleitung

1.1 Stellenwert des Mammakarzinoms im Gesundheitswesen

In den letzten Jahren wurden im Rahmen der Reformierung des deutschen Gesundheitswesens Zentren gegründet und zertifiziert, die sich der Behandlung eng umschriebener Krankheitsbilder widmen sollten. Dazu gehören die sogenannten „Brustzentren“, darunter eines an der Medizinischen Hochschule Hannover. Diese sind interdisziplinär organisiert. Ihre Aufgabe besteht in der Diagnostik und Behandlung des Mammakarzinoms und der Betreuung der Patientinnen auch im psychosozialen Bereich.

Eine Voraussetzung für die Zertifizierung als Brustzentrum ist der Nachweis von

150 Mammaoperationen bei Mammakarzinom im Jahr

(http://www.senologie.org/brustzentren/brust_zertifirichtl.php). Da es in Deutschland fast 200 zertifizierte Brustzentren gibt, wird deutlich, welchen Stellenwert diese Erkrankung im Gesundheitswesen einnimmt. Die Einbindung der ambulanten Ebene durch die Entwicklung des DMP (Disease Management Programm) Brustkrebs für die Betreuung dieser Patientinnengruppe unterstreicht dies.

Neben der persönlichen Leidensgeschichte, die jede chronische und potenziell tödliche Erkrankung mit sich bringt, ist die volkswirtschaftliche Relevanz nicht zu übersehen. Die durch Brustkrebs verursachten Kosten betrugen in Deutschland im Jahr 2002 1,6 Mrd. Euro.

Dies entsprach 0,7 % der Gesamtkosten. Im Vergleich dazu entfielen auf die am meisten Kosten verursachende Diagnosegruppe der ischämischen Herzkrankheiten 3,1 %, welches 7,0 Mrd. Euro entsprach (Statistisches Bundesamt Pressestelle, 2004). Da das Mammakarzinom zu den vier kostenintensivsten Erkrankungen gehört und jede 10. Frau im Laufe ihres Lebens, mit erheblichen Konsequenzen für ihr weiteres Leben und das ihrer Angehörigen, mit dieser Diagnose konfrontiert werden wird, ist diese Krankheit wohl zu recht bereits über viele Jahre das Ziel wissenschaftlicher Forschung. Dabei wird einerseits danach gefragt, wodurch das Mammakarzinom entsteht, und andererseits, wie es frühzeitig erkannt und optimal behandelt werden kann.

Kennt man die statistisch erhebbaren Parameter, die mit der Entstehung des Mammakarzinoms korrelieren, so hat man hiermit eine Möglichkeit geschaffen, vermeidbare

1. EINLEITUNG 2 Risikofaktoren, die den Lebensstil betreffen, zu vermeiden. Bei Frauen mit unvermeidbaren Risikofaktoren wie der genetischen Prädisposition ergäbe sich für dieses Setting die Aufgabe einer angepassten medizinischen Überwachung. Die besondere Attraktivität in der Erforschung genetischer Risikofaktoren und ihrer Manifestation auf molekularer Ebene liegt aus medizinischer Sicht in der Früherkennung und der Option daraus ableitbarer Therapiemöglichkeiten.

Die folgenden Unterkapitel geben einen Überblick über die Epidemiologie und beeinflussende Faktoren bei der Entwicklung eines Mammakarzinoms und die daraus folgenden Diagnose und Therapieoptionen.

1.2 Epidemiologie des Mammakarzinoms

In Deutschland erkrankten im Jahr 2004 nach Schätzungen des Robert Koch Instituts fast 58.000 Frauen am Mammakarzinom. Das ist mit knapp 28 % der größte Teil aller Krebserkrankungsfälle in der weiblichen Bevölkerung. Auch bei den Todesursachen ist die Diagnose Mammakarzinom führend. Hieran starben laut Robert Koch Institut fast 18 % aller Frauen. (Robert Koch Institut, Gesellschaft der epidemiologischen Krebsregister in Deutschland e. V., 2008)

Das mittlere Erkrankungsalter lag 2004 bei 63 Jahren. Die Inzidenz des Mammakarzinoms folgt in den Altersklassen annähernd einer Sättigungskurve. Während es unter den 0 bis 14 jährigen keinen Fall gab, waren es in der Altersklasse von 15 bis 34 Jahre ca. 10 Fälle pro 100.000 Frauen. Bei den 40 bis 44 jährigen waren es bereits etwas mehr als 100 Fälle pro 100.000 Frauen. In den Gruppen 55 bis 59 Jahre, 60 bis 64 Jahr und 65 bis 69 Jahre finden sich mit ca. 300 Fällen pro 100.000 Frauen die höchsten Inzidenzen. In den folgenden Altersklassen sinkt die Inzidenz auf ca. 230 Fälle. (Robert Koch Institut, Gesellschaft der epidemiologischen Krebsregister in Deutschland e. V., 2008)

Vor diesem Hintergrund ist es verständlich, dass die Frauen im Alter von 50 bis 69 Jahren für das Mammographie Screening in den Fokus gerückt wurden. Hier erscheint das Risiko für diese Frauen hoch, in ihrer verbleibenden zu erwartenden Lebenszeit am Mammakarzinom zu sterben. Im Kreis Münster/ Warendorf in Nordrhein Westfalen hat sich gezeigt, dass dort durch das Screening signifikant mehr Tumore im Frühstadium erkannt wurden als ohne das Screening, so dass eine bessere Prognose besteht (Weigel , 2009). Es gibt aus anderen

1. EINLEITUNG 3 Regionen allerdings auch Einwände gegen das Screening, die im Wesentlichen auf falsch positiven Befunden fußen, welche die betroffenen Frauen unnötig physischen und psychischen Schädigungen aussetzen, so dass hierzu weitere Entwicklungen abzuwarten bleiben (Gotzsche & Nielsen, 2009).

Betrachtet man die Inzidenz und Mortalität des Mammakarzinoms von 1980 bis 2004, so stellt man einen kontinuierlichen Anstieg der Inzidenz von ca. 75 auf ca. 105 Fälle pro 100.000 Frauen bei leicht sinkender Mortalität von ca. 30 Fällen um 5 bis 10 % fest. Das bedeutet, dass 2004 nicht mehr so viel erkrankte Frauen gestorben sind wie 1980, was unter anderem für einen wissenschaftlichen Fortschritt in der Therapie spricht.

Deutschland weist im internationalen Vergleich eine ähnlich hohe Inzidenz auf wie andere westliche Industrienationen. Belgien und Frankreich führen die Statistik vor den USA und Australien an. Bei Tschechien und Polen als osteuropäischen Ländern sind die Fälle ca. 20 % und in Japan ca. 50 % geringer als in Deutschland. (Robert Koch Institut & Gesellschaft der epidemiologischen Krebsregister in Deutschland e. V., 2008)

1.3 Beeinflussende Faktoren bei der Entwicklung eines Mammakarzinoms

1.3.1 Einführung

Bei der Entstehung des Mammakarzinoms kann man nach heutigen Erkenntnissen von einer multifaktoriellen Genese ausgehen. Es ist gelungen, Risikofaktoren zu finden, die die Erkrankungswahrscheinlichkeit erhöhen. Diese hängen unter anderem erwartungsgemäß mit den typisch weiblichen Hormonen der Östrogene und Gestagene zusammen. Weitere Beispiele sind Lebensstilfaktoren, der soziale Status so wie auch die genetische, familiäre Vorbelastung der Frau, die eine unterschiedlich große Rolle spielen. Diese werden im Folgenden klassifiziert und vorgestellt.

1.3.2 Unvermeidbare Risikofaktoren

Zu den unvermeidbaren Risikofaktoren gehört das Alter (vgl. Kap. 1.2).

1. EINLEITUNG 4 Die mammographische Dichte der Mamma zählt ebenso dazu. Für eine Dichte über 75 % wird eine vier bis sechsfache Risikoerhöhung diskutiert. Wie in kürzlich erschienenen Reviews dargelegt, ist eine Risikozuordnung zur Mammadichte schwierig, da in den Studien unterschiedliche Definitionen für die Dichte und unterschiedliche Methoden für ihre Bestimmung herangezogen wurden, die auch einen Bias wahrscheinlich machen. Die digitale Mammographie sei die zuverlässigste Methode. Allgemein akzeptiert wird, dass es einen Zusammenhang zwischen der Dichte und dem Mammakarzinomrisiko gibt, vor allem bei Veränderungen des Gewebes über die Zeit. (Boutet, 2008; Yaffe, 2008; Colin , 2010).

Diese Erkenntnis ist für die Diagnostik von Relevanz. Für die Zukunft wären Fortschritte in der volumetrischen Dichtebestimmung wünschenswert sowie eine Untersuchung ohne den Einsatz ionisierender Strahlen. Diese Strahlen können in der menschlichen Zelle zu Doppelstrangbrüchen der DNA beitragen und damit die schwerste Art der Erbgutschädigung bewirken (vgl. Kap. 1.5.4 und 1.5.5). Dadurch kann unter anderem ein Mammakarzinom entstehen, wie die erste hierzu durchgeführte Studie wahrscheinlich erscheinen ließ, die überlebende Frauen der Angriffe auf Nagasaki und Hiroshima untersuchte (Wanebo , 1968).

Bei familiärer und genetischer Vorbelastung steigt das Erkrankungsrisiko ebenfalls unvermeidbar an. Hier sind besonders ethnisch unterschiedliche risikoassoziierte Mutationen in den beiden Tumorsuppressorgenen und zu nennen (Bogdanova , 2010;

Kurian, 2010). Sie erhöhen das Lebenszeitrisiko, am Mammakarzinom zu erkranken, auf bis zu 90 % (Easton , 1993; Wooster , 1994; Levy Lahad , 1997). Für Frauen, deren am Mammakarzinom erkrankte Verwandte ersten Grades negativ für und getestet wurden, ergab eine prospektive Studie in Kanada, dass sie ein vierfach erhöhtes Erkrankungsrisiko haben, wenn es in ihrer Familie mindestens zwei Mitglieder gab, die im Alter von unter 50 Jahren erkrankten, oder wenn mindestens drei Verwandte unabhängig vom Alter erkrankten (Metcalfe , 2009). Damit bestätigen sie die Ergebnisse einer Metaanalyse aus dem Jahr 2001 von 52 epidemiologischen Studien (Collaborative Group on Hormonal Factors in Breast Cancer, 2001).

Abgesehen davon ist noch an die Gruppe von Erkrankungen zu denken, bei denen Mutationen in anderen Genen mit hoher Penetranz zu einem Syndrom führen, das auch die Möglichkeit der Entstehung eines Mammakarzinoms mit einschließt, wie zum Beispiel

durch Mutationen im Gen, das Li Fraumeni Syndrom durch Mutationen im Gen für p53 oder , und andere (vgl. Kap. 1.5.5).

1. EINLEITUNG 5 1.3.3 Vermeidbare Risikofaktoren

Zu den vermeidbaren Risikofaktoren gehört die Hormonersatztherapie mit Östrogen und Gestagenpräparaten, die bei Frauen in der Perimenopause zur Linderung der mit dem Klimakterium einhergehenden Beschwerden besonders in den 1990er Jahren oftmals großzügig verordnet wurden. Zu Beginn des neuen Jahrtausends enthüllten zwei groß angelegte Studien (Rossouw , 2002; Beral & Million Women Study Collaborators, 2003) dann eine Erhöhung des Mammakarzinomrisikos unter den teilnehmenden Frauen, die die Ersatztherapie erhielten, so dass die von der „Women Health Initiative“ unterstützte Studie vorzeitig abgebrochen werden musste. Dabei verursachten die Kombinationspräparate den größten Schaden. Eine Metaanalyse, die Daten mehrer Staaten bis 2004 auswertete, kam zu dem gleichen Ergebnis. Dabei erreichte das Risiko für eine Mammakarzinomerkrankung knapp 8 % (Lee , 2005). Daraufhin wurden in den kommenden Jahren weniger dieser Hormonpräparate verordnet. Nach einem Bericht im Ärzteblatt wurde zeitlich versetzt in mehreren Regionen eine Abnahme der Mammakarzinominzidenz verzeichnet. Hier einen Ursache Wirkungs Zusammenhang aufzustellen wäre nicht fundiert, obgleich plausibel. Es wird in dem Artikel auch berichtet, dass sich das durch die Therapie erhöhte Risiko nach ca.

vier Jahren wieder normalisiert (Siegmund Schultze , 2008).

Da orale Kontrazeptiva ein häufig angewandtes Mittel zur Empfängnisverhütung sind, stellt sich auch hier die Frage nach dem erhöhten Risiko bezüglich eines Mammakarzinoms. Dazu ist die Studienlage allerdings noch uneinheitlich (Bernstein, 2006), was damit zusammenhängen könnte, dass sich die Zusammensetzung der Präparate in den letzten Jahrzehnten seit Einführung stark geändert hat. Sowohl die Wirkstoffe als auch die Menge hat sich geändert. So enthalten moderne Präparate nur noch ca. ein Fünftel der Östrogenkomponente von vor vierzig Jahren. In einer Analyse mehrerer Studien kommt Casey zu dem Schluss, dass die modernen oralen Kontrazeptiva das Mammakarzinomrisiko wohl nicht in klinisch relevantem Maß beeinflussen, was aber zukünftig zu belegen wäre (Casey , 2008). Interessanterweise ergab die kürzlich durchgeführte Metaanalyse von Studien zwischen 1966 und 2008 kein signifikant höheres Risiko für die Entwicklung eines Mammakarzinoms bei Frauen mit familiärer Vorbelastung durch die Einnahme oraler Kontrazeptiva. Die Studien, die eine zusätzliche Erhöhung des Risikos fanden, betrafen Frauen, die in den Jahren vor 1975 Präparate mit fünfmal soviel Wirkstoff einnahmen wie heute üblich (Gaffield , 2009).

1. EINLEITUNG 6 Die medizinische Verordnung oraler Kontrazeptiva hat sich unter Beachtung der Kontraindikationen bis heute auf Grund ihrer psychosozialen Vorteile bewährt. Nach heutigem Wissensstand erscheint die Sorge, Frauen dadurch in bedeutendem Maße dem Risiko eines Mammakarzinoms auszusetzen gering im Vergleich zu demjenigen, das die Betroffenen durch den Konsum der Lifestyle Droge Alkohol selbst erhöhen (Hamajima , 2002). Die Höhe des Erkrankungsrisikos war von der Menge des Alkoholgenusses pro Tag abhängig. Boyle und Boffetta analysierten mehrere Studien auch neueren Datums und gelangten zu demselben Ergebnis bezüglich des Zusammenhangs zwischen Alkoholkonsum und Mammakarzinomrisiko (Boyle & Boffetta, 2009). Dabei kann durch eine entsprechende Zufuhr eine Risikoverdopplung oder mehr erreicht werden.

Rauchen erhöhte das Mammakarzinomrisiko hingegen nicht nachweisbar (Hamajima , 2002).

Bereits seit vielen Jahren wird der Einfluss unserer Ernährung und körperlichen Fitness auf die Gesundheit untersucht. Für das Mammakarzinom wurden immer wieder Zusammenhänge aufgezeigt. Dabei rückten auch einzelne Nahrungsbestandteile in den Fokus. Insgesamt erscheint es offensichtlich, dass eine ausgewogene Ernährung mit viel Obst und Gemüse auch bezüglich des Mammakarzinoms keinen nachteiligen Einfluss haben wird. Die Rolle von Soja, welches reich an Phytoöstrogenen wie Isoflavonoiden ist, rückte in den Mittelpunkt des Interesses, als bekannt wurde, dass das Mammakarzinom unter Asiatinnen wesentlich weniger verbreitet ist als bei Europäerinnen und Amerikanerinnen. Wenn Asiatinnen allerdings unter den Einfluss westlicher Lebensweise kamen, entwickelte sich unter ihnen dieselbe Inzidenz für die Erkrankung wie sie in dem jeweiligen Land unter den einheimischen Frauen üblich war. Kürzlich wurde in einer Studie mit sogar bereits am Mammakarzinom erkrankten Frauen aus Shanghai gezeigt, dass die Höhe des Sojakonsums nach der Diagnose die Mortalität und Rezidivhäufigkeit senkt (Shu , 2009).

Als weiterer Nahrungsbestandteil wurde für Folsäure als unverzichtbarer Bestandteil des C1 Stoffwechsels die Hypothese aufgestellt, das Risiko für ein Mammakarzinom positiv zu beeinflussen. Dieser Effekt konnte allerdings nur für Östrogenrezeptor positive und gleichzeitig Progesteronrezeptor negative Tumoren in Aussicht gestellt werden. Außerdem konnte den nachteiligen Effekten des Alkoholkonsums mit Folsäurezufuhr entgegengewirkt werden. Für alle anderen Fälle zeigte sich keine positive Beeinflussbarkeit des Mammakarzinomrisikos (Larsson ., 2007; Larsson ., 2008; Maruti , 2009).

1. EINLEITUNG 7 Wesentlich entscheidender erscheinen vor diesem Hintergrund die Ergebnisse groß angelegter Studien bezüglich Ernährungsgewohnheiten und Sport. Als Beispiel sei hier die „Million Women Study“ aus Großbritannien genannt. Mit den gesammelten Daten von über einer Million Frauen konnte nachgewiesen werden, dass ein Body Mass Index über 25 bei postmenopausalen Frauen das relative Risiko für ein Mammakarzinom um fast 50 % erhöht.

Bei prämenopausalen Frauen fand sich kein erhöhtes Risiko (Reeves , 2007).

Da es in Mexiko von 1980 bis 1990 einen Anstieg der Mortalität des Mammakarzinoms von 6,4 auf 13,1 von 100.000 Frauen gab und dadurch diese bis dahin untergeordnete Todesursache den ersten Rang einnahm, wurden in diesem Staat auch die Lebensgewohnheiten genauer untersucht, da es in dieser Zeit zu einer Veränderung in Richtung des westlichen Lebensstils gekommen war. Frauen ernährten sich anders, bekamen später und weniger Kinder, stillten sie kürzer, nahmen mehr Hormonpräparate ein, trieben weniger Sport. In Studien konnte ein Zusammenhang zwischen den Lebensgewohnheiten und dem Mammakarzinomrisiko nachgewiesen werden (Romieu & Lajous, 2009). In dem zitierten Review gingen Adipositas und mangelnde körperliche Ertüchtigung mit einem höheren Mammakarzinomrisiko besonders bei postmenopausalen Frauen einher. Insbesondere wirkten ein hoher Anteil von Kohlehydraten in der Nahrung, ein hoher glykämischer Index derselben, geringe Ballaststoffzufuhr und geringe Folsäure und Vitamin B12 Aufnahme ebenfalls risikoerhöhend.

Abschließend sei auf die reproduktive Lebenszeit der Frau eingegangen. In den entwickelten Ländern wie Deutschland ist diese länger. Allerdings bekommen immer mehr Frauen keine oder nur wenige Kinder und diese erst in späterem Lebensalter. Die Kinder werden gar nicht oder kürzer gestillt als früher.

Parsa und Parsa (Parsa & Parsa, 2009) geben in ihrem Review einen Überblick über Studienergebnisse zum Einfluss reproduktiver Faktoren auf das Mammakarzinomrisiko. Es kann zusammengefasst werden, dass Geburten das Erkrankungsrisiko senken. Ist das Alter der Mutter unter 25 Jahre, senkt es das Risiko. Stillen wirkt sich ebenfalls protektiv aus. Eine frühe Menarche ist mit der Ausnahme des Ergebnisses einer Studie an japanischen Frauen nachteilig. Eine späte Menopause erhöht das Risiko einer Mammakarzinomerkrankung.

1. EINLEITUNG 8 1.4 Maßnahmen zur Senkung der Mammakarzinominzidenz und –mortalität

Durch die steigende Inzidenz und relativ hohe Mortalität der Patientinnen mit Mammakarzinom stellt sich unweigerlich die Frage, wie dem entgegen gewirkt werden kann.

Durch die Kenntnis der Risikofaktoren und des Krankheitsverlaufs ergeben sich drei Angriffspunkte. Der erste ist die Ausschaltung bekannter vermeidbarer Risikofaktoren, der zweite die Früherkennung und der dritte die Optimierung der Therapie.

Die Risikofaktoren zu erkennen und hierüber Aufklärung zu betreiben, wird im Rahmen ärztlichen Handelns vor allem in der gynäkologischen und allgemeinmedizinischen Praxis Anwendung finden und ist eng mit Prävention und Früherkennung verknüpft.

Die Früherkennung des Mammakarzinoms fällt in den Aufgabenbereich des Gynäkologen, dem durch die entsprechende gesetzliche Vorsorgeuntersuchung ein wichtiges Instrument hierfür zur Verfügung steht. Dies setzt voraus, dass die Frauen über die Vorsorgemaßnahmen zur Früherkennung informiert sind und daran teilnehmen.

In einer epidemiologischen Untersuchung unter Frauen aus Bielefeld (NRW) stellten Klug fest, dass sich mehr als 80 % ausreichend über die Möglichkeit der Früherkennungsuntersuchung unterrichtet fühlten (Klug , 2005). Mehr als 80 % wurden darüber von ihrem niedergelassenen Gynäkologen informiert. Den Hausärzten kommt es zu, Frauen zu regelmäßigen Besuchen eines Gynäkologen anzuhalten, damit möglichst alle Frauen von den Früherkennungsmaßnahmen profitieren.

Im Rahmen der Früherkennung wird der anamnestizierende Arzt die in den vorangegangenen Kapiteln beschriebenen Risikofaktoren seiner Patientin erkennen und danach sein weiteres Management ausrichten. Bei der Untersuchung der Brust wird diese zusammen mit den dazugehörigen Lymphabflusswegen inspiziert und palpiert. Anamnestisch sind Schmerzen in der Brust und im Arm zu eruieren. Vom 50. bis zum 69. Lebensjahr wird alle zwei Jahre eine bilaterale Mammographie im Rahmen des Screenings durchgeführt. Ergeben sich bei diesen Untersuchungen Auffälligkeiten, wird weitere Diagnostik angeschlossen. Bei Frauen, die jünger als 30 Jahre alt sind, sollte besonders die Familienanamnese Beachtung finden, um Hochrisikopatientinnen rechtzeitig erkennen zu können.

Der Hintergrund dieses Vorgehens ist es, ein Mammakarzinom bereits im Frühstadium zu erkennen und diejenigen Frauen zu bestimmen, die auf Grund ihrer Risikofaktoren ein

1. EINLEITUNG 9 erhöhtes Risiko haben, am Mammakarzinom zu erkranken. Diese bedürften dann einer intensiveren Beratung bezüglich ihres Lebensstils und eventuell sinnvoller erweiterter und häufigerer diagnostischer Untersuchungen oder Prophylaxen.

Eine wichtige Gruppe bilden diejenigen Frauen, die auf Grund einer familiären Vorbelastung ein hohes Risiko haben, am Mammakarzinom zu erkranken. Das sind mehr als 1 % aller Frauen, denn bei mindestens 10 % aller Frauen mit Mammakarzinom wird eine genetische Prädisposition unbekannter oder bekannter Ursache angenommen. Bei Patientinnen mit einer starken familiären Häufung des Mammakarzinoms wird in ca. 30 % der Fälle eine oder Mutation nachgewiesen, die unter anderem altersabhängig zu einem bis zu 33 fachen relativen Risiko für die Entwicklung von Mamma oder Ovarialkarzinom führen kann, wie Antoniou (2003) in ihrer Metaanalyse für eine Gruppe von 30 – 39 jährigen britischen Frauen fanden. Insgesamt werden Penetranzen von 50 90 % berichtet (Easton , 1993; Wooster , 1994; Levy Lahad , 1997), so dass dieser besonders gefährdeten Gruppe besondere Aufmerksamkeit zu schenken ist.

In den S3 Leitlinien zur Früherkennung des Mammakarzinoms der Deutschen Gesellschaft für Senologie e. V. und der Deutschen Krebshilfe e. V. wurde drei Gruppen von Frauen, die normales, erhöhtes und hohes Risiko repräsentieren, Rechnung getragen. Je nach ermitteltem Risiko wird ein spezielles Vorgehen in der Früherkennung vorgeschlagen. Dieses bezieht sich im Wesentlichen auf zusätzliche apparative Diagnostik und bietet einen Algorithmus an, der bis zur Diagnosefindung reicht. (Albert , 2008)

Für die Hochrisikogruppe wird die Überweisung zur genetischen Beratung empfohlen, um in interdisziplinärer Zusammenarbeit gemeinsam mit der Frau zu einer tragfähigen Vorgehensweise zur Risikoermittlung und der sich daraus ergebenden Konsequenzen zu gelangen. Diese Beratung findet in spezialisierten Zentren statt, von denen eines der Medizinischen Hochschule Hannover angegliedert ist. Es soll allen Frauen, bei denen eine mehr als 10 % ige Wahrscheinlichkeit für das Vorliegen von Hochrisikomutationen besteht, eine genetische Beratung angeboten werden.

Diese Frauen werden nach entsprechender Beratung einer genetischen Testung unterzogen, die die Sequenzierung des und Gens bei der ratsuchenden Frau und bei einer Frau mit Mamma oder Ovarialkarzinom aus der Familie beinhaltet. Wird bei der Frau mit Mamma oder Ovarialkarzinom eine eindeutig pathogene Mutation gefunden, die die

1. EINLEITUNG 10 Ratsuchende auch aufweist, beträgt ihr Erkrankungsrisiko etwa 80 %. (Schmutzler & Meindl, 2006)

In Anlehnung an die englischen Leitlinien sieht auch die deutsche Leitlinie ein intensiviertes Früherkennungsprogramm für die Frauen der Hochrisikogruppe vor. Demnach erhalten die Frauen im Allgemeinen altersabhängig eine Einweisung in die regelmäßig durchzuführende Selbstuntersuchung der Brust, eine halbjährliche ärztliche Tastuntersuchung und Sonographie, Mammographie und KM MRT. (http://www.nice.org/CG04)

Außerdem besteht die Möglichkeit der prophylaktischen Salpingo Ovarektomie oder Mastektomie (Schmutzler & Meindl, 2006).

Für die Hochrisikogruppe der Frauen ist es also gelungen, ein spezielles Früherkennungsprogramm zu etablieren. Da in deutschen Familien mit familiärem Mammakarzinom weniger als die Hälfte und/ oder Mutationen gefunden wurden (Meindl & German Consortium for Hereditary Breast and Ovarian Cancer, 2002), stellt sich die Frage nach weiteren verursachenden Mutationen in anderen Genen. In den letzten Jahren wurden etliche genetische Varianten beschrieben, die mit dem Mammakarzinom assoziiert sind. Wie Ripperger (2009) in ihrem Review darstellten, können diese in zwei Gruppen eingeteilt werden. Einmal die seltenen Mutationen, die mit einem moderaten Risiko verbunden sind und zu Genen des DNA Reparaturweges gehören und zum anderen die häufigen mit niedriger Penetranz, die unterschiedliche Gene betreffen oder auch Loci, die keinem Gen zugeordnet werden konnten. Diese Forschungsergebnisse konnten klinisch noch nicht umgesetzt werden. Die Autoren kommen zu dem Schluss, dass Mutationen gefunden werden müssen, die wenigstens in bestimmten Populationen ausreichend häufig sind. Außerdem müssten Ergebnisse vorliegen, die einer Variante ein signifikantes Risiko zuweisen. Ferner sei es notwendig, für das Vorliegen mehrerer Varianten kumulative Risiken zu kennen. Für die Risikoberatung der Frauen sei es nötig, dass es Programme gäbe, die unter Berücksichtigung aller Risikofaktoren inklusive Lebensstil und hormonelle Vorgeschichte eine zuverlässige Vorhersage machten. Erst dann könne über medizinische Konsequenzen analog der Hochrisikogruppe nachgedacht werden, die dann zu evaluieren wären. Ripperger schlagen zu diesem Zweck vor, sich primär den Genen zu widmen, deren Proteine in den DNA Reparaturweg oder andere Mammakarzinom assoziierte Wege involviert sind. Abschließend wird die Möglichkeit herausgestellt, dass durch die Entdeckung neuer Genvarianten auch neue Wege für die Therapie eröffnet werden könnten (Fagerholm , 2008; Garcia Closas , 2008; Stacey , 2008; Dunning , 2009;

1. EINLEITUNG 11 Ripperger , 2009). Ist eine Variante speziell mit einer Histopathologie wie dem östrogen positiven Tumor assoziiert, könnte eine prophylaktische Tamoxifen oder Anastrozoltherapie vielversprechend erscheinen.

Seit dem Erscheinen des Reviews sind besonders von dem Breast Cancer Association Consortium weiterführende Ergebnisse über die Risikobeeinflussung bei dem Vorliegen mehrerer Varianten (Osorio , 2008; Antoniou , 2009; Osorio , 2009b;

Schmidt , 2009) erzielt worden. Hier führt der besonders große Probenumfang zu validen Resultaten. Für D302H wurde eine Risikoreduktion bestimmt (Palanca Suela , 2010; Sergentanis & Economopoulos, 2010). Darüber hinaus sind Assoziationen mit Tumorhistopathologien bestimmt worden (Tapper , 2008; Kirchhoff , 2009).

Antill (2010) untersuchten Ductallavagematerial von oder mutationspositiven Frauen auf Methylierungsmuster, um darauf basierend Vorhersagen für eine Erkrankungswahrscheinlichkeit machen zu können. Die erzielten Ergebnisse erfordern auf Grund des geringen Probenumfangs allerdings noch weitere Bestätigung.

Die vorliegende Arbeit trägt dazu bei, Gene auf Varianten hin zu untersuchen, die den DNA Reparaturweg betreffen. Damit eröffnet sie grundsätzlich die Möglichkeit, zur frühen Diagnostik und Therapie des familiären Mammakarzinoms beizutragen.

1.5 DNA Reparaturwege und Mammakarzinom

1.5.1 Einführung

Eine Zelle ist ohne Zweifel die faszinierendste Einheit unseres Körpers. Nur dann, wenn sie ihre Aufgaben fehlerfrei ausführt, befindet sie sich in Einklang mit den Nachbarzellen, gewährleistet sie die Funktion des Organs, dessen Teil sie ist und trägt damit wiederum in Einklang mit den anderen Organen zur Funktion des Organismus Mensch bei. Nur wenn die Kommunikation der Zellen untereinander gewährleistet ist und jede Zelle die ihr natürlicherseits gesteckten Grenzen einhält, kann die Zusammenarbeit im Dienst des Lebens stehen. Die Grundlage, die die Erfüllung all dieser Aufgaben ermöglicht, ist in den Genen kodiert, denn der Stoffwechsel der Zelle und die Kommunikation mit anderen Zellen werden durch Proteine gesteuert. Die Proteine werden ihrerseits gemäß der genetischen Kodierung synthetisiert.

1. EINLEITUNG 12 Da die DNA als Fundament für die Gewährleistung der zellulären Funktionen angesehen werden kann, ist es evolutionsbiologisch zu erwarten, dass sich Mechanismen entwickeln, mit denen die in der DNA kodierte Information geschützt wird.

Die DNA befindet sich in einer Mikroumgebung, die nicht vollständig vor schädigenden Einflüssen schützt. Neben endogenen und exogenen chemischen Agenzien sind auch die physikalischen Schadensverursacher zu berücksichtigen. Radikale ebenso wie γ Strahlung können einen Einzel oder Doppelstrangbruch in dem Phosphonukleotid Rückgrat verursachen. Außerdem können Radikale zu Basenverlusten führen. Durch thermische Spaltung können Purine abgespalten werden, Desaminierung von Cytosin, Adenin, Guanin oder 5 Methylcytosin führt zu Uracil , Hypoxanthin , Xanthin oder Thyminbildung. UV Licht induziert die Bildung von Thymindimeren (Hoeijmakers, 2001). Die Basen betreffende Schäden sind am Häufigsten, DNA Doppelstrangbrüche sind mit unter 1 % zwar selten, aber gravierend.

1.5.2 Die Basenexzisionsreparatur (BER)

Die intakte Zelle verfügt über DNA Reparaturmechanismen, mit denen entstandene Schäden wieder repariert werden können. Durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) entstandene Basenveränderungen werden in der Regel mittels Basenexzisionsreparatur (BER) behoben (Maynard ., 2009). Dazu wird ein Einzelstrangbruch gesetzt, das nicht passende Nukleotid ausgeschnitten und das Passende ansynthetisiert. Abschließend wird der Einzelstrang wieder ligiert. Ähnlich erfolgt die Reparatur eines durch γ Strahlung entstandenen Einzelstrangbruchs. Hierfür werden allerdings mehrheitlich andere Proteine benötigt. Es wurden Einzelfälle beschrieben, bei denen die Karzinomentstehung auf Mutationen in Genen von Proteinen zurückgeführt wurde, die für die Basenexzisionsreparatur benötigt werden (Maynard , 2009). Zhang (2006) fanden eine leichte Risikoerhöhung für das Mammakarzinom im Zusammenhang mit einer Variante des Gens. Dies galt allerdings nur für eine asiatische Population. Bisher gibt es keine umfassenden Studien, die eine Zuordnung von Mutationen, die die Gene der BER betreffen, zu Syndromen zuließe.

1. EINLEITUNG 13 1.5.3 Die Nukleotidexzisionsreparatur (NER)

Die Nukleotidexzisionsreparatur (NER) wird bei DNA Schäden durchgeführt, wie sie durch UV Strahlung oder polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (Insektizide, Farbstoffe, Tabak) aus anthropogenen Umwelteinträgen verursacht werden. Das sind zum Beispiel durch UV Strahlung verursachte Thymindimere. Proteine der NER suchen die DNA nach fehlender Basenpaarung ab und rekrutieren dann Reparaturproteine, die die fehlerhafte Stelle über ca. 30 Basenpaare hinweg ausschneiden und die Lücke durch Vorgänge wie bei der üblichen DNA Replikation wieder füllen. Bei Mutationen in Genen der Reparaturproteine ist die NER so geschädigt, dass sich DNA Schäden des beschriebenen Typs anhäufen können. Da das natürliche Licht auch UV Strahlung beinhaltet, ist die Haut permanent der mutagenen Strahlung ausgesetzt. Die Folge sind bereits im Kindesalter auftretende Hauttumoren, die zum typischen Phänotyp der !"#!$%$"&'$ gehören (de Boer & Hoeijmakers, 2000). In einer indischen Population wurde ein erhöhtes Mammakarzinomrisiko für einen Basenaustausch im ( Gen beschrieben (Mitra , 2009).

Während der DNA Replikation kann es sowohl zu falschen Basenpaarungen als auch zu kleinen Insertionen bzw. Deletionen (Indels) kommen. Diese werden durch die Proteine des mismatch Reparatursystems (MMR) erkannt, ein Stück DNA mit dem enthaltenen Fehler entfernt und die Lücke dann wieder durch die entsprechende DNA Polymerase geschlossen.

Mutationen der Gene ) und *) führen zum Hereditären nicht polypösen Kolonkarzinom (HNPCC), dem Lynch Syndrom, das auch mit stark erhöhtem Vorkommen von Endometriumkarzinom einhergeht (Peltomaki, 2005; Modrich, 2006). Conde . (2009) fanden einen Zusammenhang zwischen Mammakarzinom und )+/ ), Varianten, der für ein kleineres Risiko spricht und einen solchen betreffend )/ *)+ Varianten, der für ein höheres Risiko spricht, was allerdings noch in einer umfangreicheren Studie bekräftigt werden müsste.

1.5.4 Das Non homologous end joining (NHEJ)

Eine besondere Herausforderung für die Sicherung der Genomstabilität ist die Reparatur von Doppelstrangbrüchen (DSB). Diese entstehen durch schädigende Einflüsse wie ionisierende

1. EINLEITUNG 14 Strahlung, aber auch im Rahmen eines natürlichen Vorgangs. Bei der Synthese von T Zellrezeptoren und Immunglobulinen gewährleistet die V(D)J Rekombination eine ausreichende Anpassung unseres Immunsystems an schädigende Viren und Bakterien.

Das Zusammenfügen der Bruchenden wird als Non homologous end joining (NHEJ) bezeichnet. Es ist im Vergleich zu den anderen Reparaturwegen und insbesondere zu der im Anschluss beschriebenen Möglichkeit der Homologen Rekombination (HR) relativ fehlerträchtig, weil dem Reparaturapparat kein „template“ zur Verfügung steht. Auf der anderen Seite hat dies den Vorteil, dass NHEJ in jeder Phase des Zellzyklus aktiv sein kann.

(Rothkamm ., 2003; Branzei & Foiani, 2008). In menschlichen Zellen ist NHEJ der überragende Reparaturweg für DSB in der G1 Phase des Zellzyklus (Branzei & Foiani, 2008).

DSB entstehen durch zweimaligen Einzelstrangbruch. Dadurch ergeben sich in der Regel zwei überhängende Enden, deren chemische Gruppen nicht ohne Vorbereitung wieder ligiert werden können.

Der NHEJ Reparaturweg besteht aus dem Erkennen und Fixieren des DSB, der Prozessierung der Enden und der Ligation der Enden. Für die Erkennung des DSB ist das Ku70 (XRCC6)/

Ku80 (XRCC5) Heterodimer verantwortlich, welches an den Strangenden bindet.

Anschließend erfolgt die Bindung von DNA PK an die Enden, so dass der sogenannte

„synaptische Komplex“ entsteht, der die Enden zusammenhält. Das Prozessieren der Enden erfolgt durch Artemis und wohl auch durch weitere Proteine wie zum Beispiel DNA Polymerase und λ, Polynukleotidkinase (PNK), Aprataxin und Polynukleotid Kinase like Faktor (APLF) und Werner Syndrom Helikase (WRN), deren Zusammenwirken letztlich ligierbare Enden hinterlässt. Dabei kann es zu kleineren Deletionen kommen. Die Ligation erfolgt dann durch den XRCC4 DNA Ligase IV Komplex. (Mahaney ., 2009)

Bei Mutationen in den beteiligten Proteinen kann es zu Erkrankungen kommen. So sind Mutationen in dem Gen für das Artemis Protein mit RS SCID (radiosensitive severe combined immunodeficiency) assoziiert. Hierbei liegt bei den Betroffenen nicht nur eine Immunschwäche vor. Es kommt auch häufig zu Lymphomen. Eine gute Übersicht über NHEJ und HR assoziierte Krankheiten bieten McKinnon & Caldecott (2007). Interessant ist auch der Zusammenhang neurologischer Symptome hiermit. Ein direkter Zusammenhang von Mutationen in den aufgeführten Genen des NHEJ mit dem Mammakarzinom ist bisher nicht so zwingend zu sehen. Willems und seine Mitarbeiter fanden bei belgischen Patientinnen eine sowohl negative wie auch positive Assoziation von Varianten in -'. und -' mit dem Mammakarzinom (Willems , 2008). Fu und Mitarbeiter konnten zwei SNPs in -'. und

1. EINLEITUNG 15 beschreiben, die das Mammakarzinomrisiko erhöhen (Fu , 2003). Außerdem konnten sie Hinweise darauf finden, dass die Varianten in mehreren Genen des NHEJ Reparaturweges gleichzeitig sowie der Einfluss von Östrogen in Kombination mit Varianten die Wahrscheinlichkeit für die Entwicklung eines Mammakarzinoms erhöhen. Meine Kollegin Katrin Gerriets konnte für die Variante IVS7 1 G>A zwar keinen direkten Zusammenhang mit der Entstehung eines Mammakarzinoms nachweisen, aber doch eine Beeinflussung des Erkrankungsalters und der Metastasierung unterstreichen (Gerriets, 2007).

Die Ergebnisse weiterer Forschungsarbeiten zu dem Thema bleiben abzuwarten.

1.5.5 Die homologe Rekombination (HR)

Die sicherste Methode für den Schluss von DSB ist der Reparaturweg der homologen Rekombination (HR). Der MRN Komplex, der aus MRE11 (meiotic recombination 11), RAD50 (radiation repair gene 50) und NBN (auch NBS1, Nijmegen breakage syndrom 1) besteht, bindet an die betroffene Stelle der DNA. CDK1 (cyclin dependent kinase 1) (Ira , 2004) und wohl auch CtIP (C terminal binding protein1 interacting protein) (Takeda , 2007) bewirken die Entfaltung der 5´ 3´ Exonukleaseaktivität von MRE11.

Dadurch entstehen an der Stelle des DSB nun zwei einzelsträngige Überhänge. Hieran binden RPA Moleküle. Diese binden ATR, welches die Chk1 aktiviert und damit eine Verbindung zur Zellzykluskontrolle herstellen kann. Ob dies tatsächlich für die Signalwege nach DNA Doppelstrangbrüchen relevant ist, ist noch nicht abschließend geklärt (Zou , 2006).

Nun erfolgt der durch die Chk1 beeinflusste Austausch der RPA Moleküle gegen RAD52 und auch RAD51 (Sleeth , 2007). Dieser Prozess ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Wie Rodrigue (2006) zeigen konnten, sind auch die RAD51 Paraloge RAD51B D, XRCC2 und XRCC3 an der Homologen Rekombination beteiligt. RAD51 gelangt BRCA2 vermittelt an die DNA Schadensstellen. Es ist direkt an die BRC Repeats von BRCA2 und, vermutlich indirekt über BRCA2 an BRCA1 gebunden (Scully , 1997; Marmorstein , 1998;

Chen , 1999; Yuan , 1999; West, 2003; Davies & Pellegrini, 2007; Forget &

Kowalczykowski, 2010; Liu , 2010).

Das letztendlich entstandene, durch RAD51 und ssDNA charakterisierte Nukleofilament, ist in der Lage, den zur geschädigten Stelle homologen Bereich auf dem Schwesterchromatid zu finden und hieran zu binden. Dadurch entsteht durch die sich kreuzenden Stränge eine sogenannte „Holliday Junction“. Da bei einem DSB zwei Nukleofilamente gebildet werden,

1. EINLEITUNG 16 kann die Bindung des zweiten Filamentes an dem freiwerdenden Strang des Bereichs, an den das erste Filament band, zusätzlich erfolgen. Dadurch entstehen zwei Überkreuzungen, die als doppelte Holliday Junctions bezeichnet werden. DNA Polymerasen verlängern nun die eingewanderten Einzelstränge. Im Fall des einzeln eingewanderten Einzelstranges wird dieser nach erfolgter Synthese durch DNA Helikase wieder gelöst und die fehlenden Basen auf dem Komplementärstrang werden ergänzt. Die doppelten Holliday Junctions werden durch Endonukleasen oder durch Bloom Helikase und die TOP3 Topoisomerase wieder getrennt.

DNA Ligasen verbinden abschließend das DNA Rückgrat (Branzei & Foiani, 2008).

Damit die Reparaturprozesse stattfinden können, muss die Progression des Zellzyklus während der Reparaturzeit verhindert werden. Dies geschieht unter anderem durch ATM („Ataxia teleangiectasia mutated“), welches wie in Kap. 1.8.1 und 1.8.2 dargestellt auch noch für die Propagierung des DNA Schadenssignals sorgt. ATM wird durch den MRN Komplex an die Schadensstelle rekrutiert. Im Ergebnis bewirkt die ATM Autophosphorylierung an NBN (Uziel ., 2003; You ., 2005) durch Vermittlung von Chk2 und CDK einen G2 Block (Branzei & Foiani, 2008).

Defekte im HR Reparaturweg konnten als Ursache für einige Erkrankungen gefunden werden.

Dabei konnte eine Assoziation von Mutationen im * Gen und im /0 Gen mit dem Mammakarzinom gefunden werden (Broberg ., 2009; Wang ., 2009b). Die Werner Helikase ist an der korrekten Bindung des Nukleofilamentes an den homologen DNA Abschnitt beteiligt (Sidorova, 2008). Beide Erkrankungen gehören in die Gruppe der Chromosomenbruchsyndrome. Patienten mit Bloom Syndrom haben Teleangiektasien, Minderwuchs, Schädeldeformitäten, Immundefekte und eine erhöhte Malignomrate. Patienten mit Werner Syndrom fallen durch ihre frühzeitige und schnelle Alterung auf.

Fanconi Anämie ist ein Krankheitsbild, welches sich im Kleinkindalter manifestiert. Die Blutbildung ist durch die Rückbildung des Knochenmarks stark eingeschränkt, so dass die Anzahl intakter Blutkörperchen nicht mehr ausreicht, ihre Aufgaben zu gewährleisten. Die Kinder sind stark infektanfällig und zeigen früh Tumore in Schleimhäuten. Welche Aufgaben die der Fanconi Anämie zu Grunde liegenden 14 Gene wahrnehmen, ist noch nicht abschließend geklärt. 1230(4, 12 )23056BRCA1 interaction partner4 *1230*6partner and localizer of BRCA24 und (7 als Bestandteile des Fanconi Anämie Weges wurden auch als Suszeptibilitätsgene für das Mammakarzinom erkannt (Seal . 2006, Rahman . 2007, Erkko . 2007, Meindl . 2010).

1. EINLEITUNG 17 Da das Gen 30( identisch mit ist, kann hieraus eine Beteiligung bei der HR abgeleitet werden kann. Erst kürzlich wurden Mutationen im Gen (7gefunden, bei deren homozygotem Vorliegen es zur Entwicklung einer Fanconi Anämie ähnlichen Erkrankung kommt (Levy Lahad, 2010; Vaz ., 2010). Bei der Untersuchung von Familien, in denen Mamma und Ovarialkarzinome häufig auftraten, die aber negativ für und waren, fand die Arbeitsgruppe um Meindl, dass Mutationen in (7 mit diesen Tumoren assoziiert waren. Das Mammakarzinomrisiko ließ sich für die Trägerinnen mit 60 % bis 80 % und das Ovarialkarzinomrisiko mit 20 % bis 40 % beziffern (Levy Lahad, 2010; Meindl ., 2010). Allerdings wurden diese Mutationen nicht bei den Patientinnen gefunden, in deren Familien ausschließlich Mammakarzinome auftraten.

Es gibt auch Hinweise auf Beteiligung dieser Gene am NHEJ Reparaturweg, an der Zellzykluskontrolle und an der Wahl des Reparaturweges (McKinnon & Caldecott, 2007).

gehört wie in Kap. 1.4 beschrieben zu den Hochpenetranzgenen für Mamma und Ovarialkarzinome. Es scheint im NHEJ Reparaturweg nach derzeitigem Kenntnisstand keine Rolle zu spielen, ist aber unentbehrlich im HR Reparaturweg zur Bildung der Nukleofilamente aus ssDNA und RAD51 (McKinnon & Caldecott, 2007).

Die Rolle von bei der Reparatur von Doppelstrangbrüchen ist noch nicht eindeutig geklärt. Es ist unbestritten, dass es ein unverzichtbarer Teil des HR Reparaturweges ist (Moynahan et al., 1999), obgleich die molekularen Interaktionen noch nicht lückenlos geklärt sind. Es gibt Hinweise auf eine Beteiligung am NHEJ Reparaturweg, die dessen Zuverlässigkeit erhöht und es ist möglich, dass BRCA1 an der Wahl des Reparaturweges mitwirkt (West, 2003; McKinnon & Caldecott, 2007; Shrivastav ., 2008). Klärende Forschungsergebnisse hierzu bleiben noch abzuwarten.

Mutationen im und Gen führen jedenfalls wie die anderen Chromosomenbruchsyndrome zu genomischer Instabilität und zu erhöhter Malignomrate, darunter zu einem erhöhten Risiko von Mammakarzinomen.

1995 wurde von Savitsky . das mutierte Gen als Ursache für die , auch als Louis Bar Syndrom bezeichnet, beschrieben (Savitsky ., 1995).

Es wird autosomal rezessiv vererbt. AT ist mit 1:100 000 eine seltene Erkrankung. Bei homozygoten AT Trägern kommt es bereits im Kindesalter zu erhöhter Strahlensensibilität, zerebellärer Ataxie und Teleangiektasien. Darüber hinaus ist eine erhöhte Infektanfälligkeit, besonders für pulmonale Infekte, charakteristisch. Die Betroffenen entwickeln häufig

1. EINLEITUNG 18 Leukämien und Hodgkin Lymphome. Das Risiko ein Mammakarzinom zu entwickeln, ist ebenfalls erhöht. Das ist allerdings abhängig von der Mutation und betrifft auch heterozygote Träger (Thompson ., 2005; Tavtigian ., 2009).

Es wurden drei Syndrome beschrieben, die durch Mutationen in Genen des MRN Komplexes entstehen. Die Syndrome sind alle durch erhöhte Strahlensensibilität, Chromosomeninstabilität und gestörte Zellzyklus Kontrolle gekennzeichnet.

1981 beschrieben Weemaes . einen Jungen und seine Familienmitglieder. Der Junge wies Kennzeichen eines Chromosomeninstabilitätssyndroms auf, ohne dass die klinischen Parameter zu den bekannten Syndromen passten. Im Gegensatz zu AT gibt es bei den Betroffenen keine Ataxie und keine Teleangiektasien. Neurologisch ist aber eine Mikrozephalie festzustellen. Die wenigen bisher diagnostizierten Kinder sind wachstumsretardiert und haben eine charakteristische Kopfanatomie. Sie sind immundefizient (Weemaes ., 1981) und es besteht ein wesentlich erhöhtes Risiko für Lymphome (Weemaes ., 1994; Kondratenko ., 2007). Die Erkrankung wurde als Nijmegen Breakage Syndrom bezeichnet und wird autosomal rezessiv vererbt. Sie ist sehr selten und vorwiegend im ost und mitteleuropäischen Raum anzutreffen. Dort wird die Erkrankung durch eine häufige Gründermutation des 00 Gens verursacht (Varon ., 1998).

Heterozygote Träger haben ein erhöhtes Risiko, an einem Malignom, darunter dem Mammakarzinom, zu erkranken (Bogdanova ., 2008; di Masi & Antoccia, 2008;

Wang , 2010).

1999 beschrieben Stewart . zwei Familien, die ähnliche Symptome aufweisen wie diejenigen mit AT, bei denen aber keine so schwer wiegende Immundefizienz vorliegt und kein Verdacht auf ein erhöhtes Malignomsrisiko bestand wie bei den AT Patienten. Für diese Patienten konnten sie nachweisen, dass das Gen mutiert war. Dieses Syndrom wurde als A TLD (Ataxia teleangiectasia like disease) bezeichnet.

Auch das dritte im MRN Komplex beteiligte Protein führte zu der Beschreibung eines neuen Syndroms. Bisher ist allerdings nur eine Patientin bekannt, deren klinische Symptomatik der von NBS gleicht, die aber nie schwere Infektionen hatte und bis zum Alter von 23 Jahren kein Lymphom entwickelte. Das Syndrom wurde als NBS like disorder (NBSLD) bezeichnet und von meiner Kollegin genetisch erforscht. Die beschriebene Patientin ist „compound“

heterozygot für Mutationen im (7 Gen (Waltes ., 2009).

Die Reparaturwege wurden hier getrennt voneinander dargestellt. Betrachtet man alle beteiligten Proteine und die bekannten Verknüpfungen zwischen ihnen, wie es Mahaney

1. EINLEITUNG 19 vorstellen, dann drängt sich die Hypothese auf, dass durch ionisierende Strahlung verursachte Schäden mehrere Reparatursysteme in Gang setzen. Ihre Koordination könnte durch die Mitglieder der PIKK Familie erfolgen (Mahaney ., 2009).

1.5.6 Mögliche Folgen von Defekten in den Reparaturwegen

Wenn es zu Defekten in den Reparaturwegen kommt, wie beispielsweise durch Mutationen in den zugehörigen Genen, wird der Weg zur Entstehung weiterer Mutationen bereitet. Es kann zu Punktmutationen mit unterschiedlichen Folgen kommen. So kann sich eine synonyme Mutation gar nicht auf Proteinebene bemerkbar machen, oder es könnte durch das Entstehen einer „Enhancer“ oder „Silencer“ Bindungsstelle ein anderes Protein entstehen, das wohl sehr wahrscheinlich nicht mehr die ursprüngliche Funktion ausüben würde. Die gleiche Konsequenz hätte eine „nonsense“ Mutation, bei der ein neues Stopp Kodon für ein kleineres Genprodukt mit anderen chemischen Eigenschaften sorgen könnte. Eine „missense“ Mutation würde zu dem Austausch einer Aminosäure führen. Die Folgen können unterschiedlich schwerwiegend sein. Liegen diese Mutationen in heterozygoter Form vor, sorgt das Wildtyp Allel für die Bereitstellung von funktionsfähigem Protein, so dass damit noch eine restliche Gesamtaktivität gewährleistet ist.

Chromosomen und Genommutationen, wie sie insbesondere bei Defekten im HR Reparaturweg entstehen, führen zu schweren Beeinträchtigungen der genomischen Stabilität.

Es entstehen Deletionen, Translokationen und es kann durch die Beeinträchtigung der üblichen Chromosomensegregation während der Mitose zu Aneuploidie kommen. Auch Genamplifikation ist möglich. Diese Veränderungen im Genom ziehen weitere Schäden nach sich. Sind Protoonkogene, Tumorsuppressorgene und/ oder Apoptosegene so betroffen, dass der Zellzyklus nicht mehr kontrolliert werden kann und die Apoptose nicht eingeleitet werden kann, teilt sich die Zelle immer weiter. Durch das fehlerhafte Reparaturprotein und den oder die damit verbundenen beeinträchtigten Reparaturwege häufen sich Mutationen immer weiter an. Die Zelle entdifferenziert immer mehr. Liegen Mutationen in Onkogenen vor, wirken sich diese dominant aus. Das heißt, dass bereits der heterozygote Zustand für ein unkontrolliertes Wachstum sorgt. Mutationen in Tumorsuppressorgenen wirken rezessiv. Bei sporadischen Tumoren müssen also beide Allele mutieren („double hit“ Hypothese), bevor die Zelle außer Kontrolle gerät. Bei familiären Tumorerkrankungen wird mindestens ein mutiertes Allel vererbt. In der entarteten Zelle entsteht durch die Mutation im zweiten Allel dann der für die

1. EINLEITUNG 20 Tumorsuppression fatale Zustand. Dieser Mechanismus wurde bereits 1971 von Knudson durch statistische Untersuchungen an Patienten mit Retinoblastom entdeckt (Knudson, 1971).

Er wird als „loss of heterozygosity" (LOH) bezeichnet.

1.6 Funktionen von BRCA1

Die fehlerhafte Reparatur von Doppelstrangbrüchen manifestiert sich auf nukleärer Ebene wie beschrieben als Korrelat der genomischen Instabilität. Deshalb liegt es nahe, die Gene derjenigen Proteine zu untersuchen, die in diesen Reparaturwegen vorkommen. Dies wurde in unserer Arbeitsgruppe, wie oben zitiert, für die den Proteinen zugehörigen Gene beider Reparaturwege verfolgt (vgl. Kap. 1.5.4 und 1.5.5).

BRCA1 steht seit langem im Mittelpunkt weiterer Forschung. Trotzdem warten noch etliche Fragen zu seiner Rolle im HR Reparaturweg auf Antworten. Es sind zwar bereits einige Puzzleteile gefunden worden; das Gesamtbild weist allerdings noch Lücken auf. Es ist jedenfalls klar, dass BRCA1 unterschiedliche Aufgaben an unterschiedlichen Punkten eines Netzwerks wahrnimmt und somit weit davon entfernt ist, Teil eines linearen Geschehens zu sein. Im Folgenden soll nur ein kurzer Eindruck davon vermittelt werden. Im folgenden Kapitel wird dann der Frage nachgegangen werden, wie BRCA1 an die DSB Stellen gebunden wird; eine Voraussetzung für die Reparatur eben dort.

Außer in der Reparatur von strahlungsinduzierten DSB via HR, findet HR auch bei arretierten Replikationsgabeln statt, wie sie während der Synthesephase vorzufinden sind. In beiden Fällen ist BRCA1 sowohl am Reparaturvorgang als auch an der Zellzykluskontrolle beteiligt.

BRCA1 trägt dazu bei, dass die für die Fortsetzung des Zellzyklus verantwortlichen cyclin abhängigen Kinasen (CDK) ihre Phosphorylierungsaktivität verlieren und es dann zu einem Arrest in der S beziehungsweise G2 Phase kommt. Während der Zeit des Arrests wird die Reparatur durchgeführt und der Zellzyklus anschließend weitergeführt (Scully & Livingston, 2000; Xu ., 2001; Venkitaraman, 2002; Yarden ., 2002; Kastan & Bartek, 2004;

Durant & Nickoloff, 2005; Yan ., 2005; Branzei & Foiani, 2008). Ohne funktionsfähiges BRCA1 können die Zellen den Arrest der S bzw. G2 Phase nicht mehr realisieren. Sie haben dann eine erhöhte IR Sensitivität, was sich in einem reduzierten Überleben nach Bestrahlung zeigt. (Wang ., 2007)

1. EINLEITUNG 21 Es wird vermutet, dass BRCA1 an der Transkriptionsregulation beteiligt ist. Es wurden Verbindungen zu RNA Polymerase II und zu p53 als Transkriptionsfaktor für p21 gefunden, die aber auf molekularer Ebene noch nicht weiter konkretisiert werden konnten. p21 hemmt durch die Bindung von Cyclin abhängigen Kinasen die Phosphorylierung von pRb und damit den Übergang von der G1 in die S Phase.

BRCA1 könnte auch in die östrogenabhängige Transkription von Genen involviert sein. Auch dies bedarf noch weiterer Untersuchung (Welcsh ., 2000). Ferner ist eine durch BRCA1 gegebene Induktion von ((7 beschrieben worden, die p53 unabhängig ist. Damit gibt es einen Hinweis auf die Beteiligung von BRCA1 bei der Apoptose (Harkin ., 1999).

BRCA1 ist unter anderem über seine Ubiquitinierung von γ Tubulin an der korrekten Duplikation der Zentrosomen vor der Mitose beteiligt. mit Deletionen in Exon 11 führen zu einer Zentrosom Amplifikation mit einem kompromittierten Spindelapparat, was in gestörter Chromosomenseggregation resultiert. (Xu , 1999; Parvin, 2009)

BRCA1 wurde, teilweise kontrovers, als Teil der X Chromosom Inaktivierung im Rahmen des Gen Silencing in somatischen Zellen beschrieben (Silver , 2007). Lose . fanden in Mutationsträgerinnen mit Mamma oder Ovarialkarzinom eine erhöhte Rate fehlender inaktivierter X Chromosomen im Vergleich zu den Kontrollen und eine Assoziation der fehlenden Inaktivierung mit früherem Diagnosealter (Lose ., 2008).

1.7 Bedeutung einzelner Reparaturproteine bei Doppelstrangbrüchen (DSB)

In den letzten Jahren wurde durch die Erforschung der „upstream“ von BRCA1 stattfindenden Prozesse deutlicher, wie dieses Protein an dem Ort des Doppelstrangbruchs gebunden wird.

Dazu trugen Immunfärbeverfahren, Konfokalmikroskopie, Immunopräzipitation sowie Gensequenzierung und bioinformatische Modellierungen bei. Experimentell werden DSB in ausgewählten Zellen durch IR (ionisierende Strahlung) erzeugt. Dadurch kommt es zur Rekrutierung einiger tausend Moleküle an die geschädigten Stellen, so dass sogenannte IRIF (ionizing radiation induced foci) entstehen (Shiloh, 2003). Sind die interessierenden fluoreszenzmarkierten Moleküle auch dabei, lässt sich die IRIF Bildung im Fluoreszenzmikroskop beurteilen.