und Spezielle Onkologie
der Medizinischen Hochschule Hannover (Direktor: Prof. Dr. med. Hans Christiansen)
Varianten des TCTP -Gens bei weißrussischen Patientinnen
mit Mammakarzinom
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Leonie Maria Küper
aus Hannover Hannover 2016
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 22.02.2017 Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Prof. Dr. med. Christopher Baum
Betreuer der Arbeit: Prof. Dr. med. Hans Christiansen Referentin: Prof. Dr. med. Brigitte Schlegelberger Korreferentin: Prof. Dr. med. Tjuong-Won Park-Simon Tag der mündlichen Prüfung: 09.01.2017
Promotionsausschussmitglieder: Prof. Dr. med. Wolfgang Koppert PD Dr. med. Christoph Schröder
Prof. Dr. med. Hans Heinrich Wedemeyer
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 1
1.1 Das Mammakarzinom ... 1
1.1.1 Geschichte des Mammakarzinoms ... 1
1.1.2 Epidemiologie des Mammakarzinoms ... 3
1.1.3 Risikofaktoren für die Entstehung eines Mammakarzinoms ... 5
1.1.4 Klinik, Diagnose und Therapie des Mammakarzinoms ... 10
1.2 Zellbiologische Grundlagen der Kanzerogenese ... 12
1.2.1 Tumorentstehung ... 12
1.2.2 DNA-Reparaturmechanismen ... 15
1.3 Das Gen TCTP und sein Protein ... 18
1.3.1 Charakterisierung von TCTP ... 18
1.3.2 Regulation von TCTP ... 20
1.3.3 Funktion von TCTP ... 21
1.3.4 TCTP und Brustkrebs ... 26
1.4 Ziel der Arbeit ... 26
2 Material ... 28
2.1 Geräte ... 28
2.2 Kleingeräte und Zubehör ... 30
2.3 Chemikalien ... 31
2.4 Lösungen, Medien und Puffer... 32
2.5 Software ... 33
3 Methoden ... 35
3.1 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)... 35
3.1.1 Funktionsprinzip ... 35
3.1.2 Arbeitsweise ... 35
3.2 Gel-Elektrophorese ... 39
3.2.1 Funktionsprinzip ... 39
3.2.2 Arbeitsweise ... 40
3.3 PEG-Fällung ... 41
3.3.1 Funktionsprinzip ... 41
3.3.2 Arbeitsweise ... 41
3.4 Sequenzierreaktion ... 43
3.4.1 Funktionsprinzip ... 43
3.4.2 Arbeitsweise ... 44
3.5 High Resolution Melting (HRM) ... 47
3.5.1 Funktionsprinzip ... 47
3.5.2 Arbeitsweise ... 47
4 Ergebnisse ... 52
4.1 Einführung ... 52
4.2 Ergebnisse der Sequenzierung des TCTP-Gens ... 52
4.3 Ergebnisse des „High Resolution Meltings“... 55
4.4 Prädiktion der funktionellen Effekte der Mutationen ... 57
4.4.1 Beeinträchtigung der Proteinfunktion ... 57
4.4.2 Beeinflussung von Spleißstellen ... 60
4.5 Epidemiologische Gesichtspunkte ... 62
5 Diskussion ... 64
5.1 Einführung ... 64
5.2 Mögliche Auswirkungen der ermittelten Varianten ... 65
5.2.1 Mögliche Auswirkungen der Variante c.452A>G ... 65
5.2.2 Mögliche Auswirkungen der Variante c.492G>A ... 71
5.2.3 Assoziation der Varianten mit anderen Merkmalen ... 73
5.3 Fazit... 73
5.4 Ausblick ... 75
6 Zusammenfassung ... 79
7 Literaturverzeichnis... 81
8 Anhang ... 91
8.1 Primer für das TCTP-Gen (PCR) ... 91
8.2 Primer für das TCTP-Gen (HRM) ... 91
9 Danksagung ... 92
10 Lebenslauf ... 93
11 Erklärung nach § 2 Abs. 2 Nrn. 6 und 7 ... 95
Abkürzungsverzeichnis
AKAP9 A kinase (PRKA) anchor protein 9 gene Akt Proteinkinase B
AP-Endo- nuklease
Apurinische/apyrimidinische Endonuklease
ATM Ataxia Telangiectasia Mutated gene ATM Ataxia Telangiectasia Mutated protein Bax Bcl-2-associated X protein
Bcl-2 B-cell lymphoma 2
Bcl-xL B-cell lymphoma-extra large protein
BLM Bloom Syndrome, RecQ Helicase-Like gene BRCA1 breast cancer type 1 susceptibility gene BRCA2 breast cancer type 2 susceptibility gene BRCA2 breast cancer type 2 susceptibility protein
bzw beziehungsweise
ca circa
cAMP Cyklisches Adenosinmonophosphat
CASP8 caspase 8, apoptosis-related cysteine peptidase gene
cGy Centigray
CHD1L Chromodomain-helicase-DNA-binding protein 1-like protein CHFR checkpoint with forkhead and ring finger domain
ClinSeq A Large-Scale Medical Sequencing Clinical Research Pilot Study
CRE cAMP-response element protein
CREB cAMP-response element binding protein CtIP CtBP-interacting protein
DNA Desoxyribonucleic Acid (dt.: Desoxyribonukleinsäure) DNA-PK DNA-dependent protein kinase
DNA- PKcs DNA-dependent protein kinase catalytic subunit dNTP Desoxyribonucleoside triphoshate
DSBR Double-Strand Break Repair
dsRNA Double-strand Ribonucleic Acid EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid EGFR epidermal growth factor receptor
eIF2 Eukaryotic Translation Initiation Factor 2 eIF4E Eukaryotic Translation Initiation Factor 4E ESEfinder Exonic Splice Enhancer Finder
ExAc Exome Aggregation Consortium
FANCA Fanconi anemia, complementation group A gene FANCB Fanconi anemia, complementation group B gene
g Gramm
GGR Globale Genom-Reparatur
GM-CSF granulocyte–macrophage colony-stimulating factor
h Stunde
HCl Hydrochloric Acid
HER2/neu human epidermal growth factor receptor 2 hMLH1 human mutL homolog 1 gene
hMSH2 human mutS homolog 2 gene
HPLC High-performance liquid chromatography HRF Histamine-releasing factor protein
HRM High Resolution Melting (dt.: hochauflösende Schmelzkur- ven-Analyse)
Hsp27 heat shock protein 27
kb Kilobase
Ku70 X-ray repair cross-complementing protein 6 Ku80 X-ray repair cross-complementing protein 5
LW Leerwert
MaxEntScan Maximum Entropy Scan
M Mol/Liter
MAP Mitogen-activated protein
MAP3K1 mitogen-activated protein kinase 1, E3 ubiquitin protein ligase gene
Mcl-1 Myeloid cell leukaemia 1 protein MDM2 Mouse double minute 2 homolog
MGMT O6-Alkylguanintransferase
min Minute
MiR-27b MicroRNA-27b
ml Milliliter
MRE11 Meiotic recombination 11 homolog A protein mRNA Messenger-Ribonucleic Acid
MSS4 Probable phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinase
mSv Millisievert
mTOR mechanistic target of Rapamycin
MYC V-myc avian myelocytomatosis viral oncogene homolog gene
µl Mikroliter
Na+-Ka+-AT- Pase
Natrium-Kalium-Adenosintriphosphatase
NANOG nach „Tír na nÓg“, dem Land der ewigen Jugend in der kelti- schen Mythologie
NBS1 Nijmegen Breakage Syndrome protein 1, Nibrin NCBI National Center for Biotechnology Information NHEJ Nicht-homologes End-Joining
NHLBI GO National Heart, Lung and Blood Institute Grand Opportunity OCT4 octamer-binding transcription factor 4
PAH Polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe P16 Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor 2A gene P23 Translationally controlled tumor protein gene P21 Cyclin-dependent kinase inhibitor 1A
P23 Translationally controlled tumor protein
P53 Tumor Protein P53
PCB Polychlorierte Bephylene
PCR Polymerase Chain Reaction (dt. Polymerase-Kettenreaktion)
PEG Polyethylenglykol
pH Potentia hydrogenii, negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionen-Aktivität
Pi3K Phosphoinositid-3-Kinase
PKR Proteinkinase R
PLCγ Phospholipase Cγ PLK-1 Polo-like Kinase 1
PolyPhen-2 Polymorphism Phenotyping 2 PROVEAN Protein Variation Effect Analyzer PTEN Phosphatase and tensin homolog gene RAD50 radiation-sensitive mutant 50 homolog RAD51 RAD51 recombinase protein
Ras rat sarcoma viral oncogene homolog gene
RB retinoblastoma gene
Rheb Ras homolog enriched in brain protein
RNA Ribonucleic Acid
ROS Reactive oxygen species RPA Replication Protein A
rpm rounds per minute
RpS6 Ribosomales Protein S6
SDSA Synthesis-dependent Strand annealing ShRNA Small hairpin RNA
SIFT Sorts Intolerant From Tolerant siRNA Small interfering RNA
SNP Single Nucleotide Polymorphism
Src Sarcoma gene
Src Src proto-oncogene, non-receptor tyrosine kinase SRSF1 Serine/arginine-rich splicing factor 1
SRSF2 Serine/arginine-rich splicing factor 2 SRSF5 Serine/arginine-rich splicing factor 5 STK11 Serine/threonine kinase 11 gene Taq Thermus aquaticus
TBE TRIS-Borat-EDTA
TCTP Translationally controlled tumor protein gene TCTP Translationally controlled tumor protein TGR transkriptionsgekoppelte Reparatur
TNM Tumor, Lymphknotenstatus (engl.: Nodes), Metastasen
TOR Target of Rapamycin
TOX3 TOX high mobility group box family member 3 gene TP53 Tumor Protein 53 gene
TPT1 Tumor protein, translationally-controlled 1 TRIS Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
UV Ultraviolett
UTR Untranslated Region
XPA Xeroderma pigmentosum complementation group A protein XPC Xeroderma pigmentosum complementation group C protein XPG Xeroderma pigmentosum complementation group G protein XRCC4 X-ray repair cross-complementing protein 4
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1.1: Einflüsse auf die TCTP-Expression ... 21
Tabelle 3.1: Optimierte Primertemperaturen ... 36
Tabelle 3.2: PCR-Ansatz ... 37
Tabelle 3.3: PCR-Ansatz für das High Resolution Melting ... 48
Tabelle 4.1: Scores der MaxEntScan-Analyse ... 60
Tabelle 5.1: Übersicht der Funktionen TCTPs ... 64
Tabelle 5.2: Vergleich der Eigenschaften von Tyrosin und Cystein ... 66
Tabelle 5.3: Vergleich der verwendeten Prädiktions-Programme... 67
Tabelle 5.4.: Im NCBI hinterlegte Mutationsfrequenzen für c.492G>A ... 71
Tabelle 8.1: PCR-Primer ... 91
Tabelle 8.2: HRM-Primer ... 91
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1.1: Jährliche Neuerkrankungs- und Sterbefälle sowie altersstandardisierte
Neuerkrankungs- und Sterberaten ... 4
Abbildung 1.2: Altersspezifische Neuerkrankungsraten nach Geschlecht und Altersgruppen ... 5
Abbildung 1.3: Ablauf der Signaltransduktion bei DNA-Schaden ... 13
Abbildung 1.4: Tertiärstruktur des „Translationally Controlled Tumor Protein“ ... 19
Abbildung 1.5: Funktion von TCTP in Bezug auf DNA-Schäden und ihre Reparatur .. 25
Abbildung 3.1: Ablauf einer Polymerase-Kettenreaktion am Beispiel des Exons 1 ... 39
Abbildung 3.2: Gel-Elektrophorese mit sichtbaren PCR-Produkten des Exons 4 ... 40
Abbildung 3.3: Gel-Elektrophorese der PEG-Fällung einzelner Proben des Exons 5....42
Abbildung 3.4: Ablauf einer Sequenzierreaktion ... 45
Abbildung 3.5: Ausschnitt einer Gensequenz (Exon 3) ... 46
Abbildung 3.6: PCR-Zyklus mit HRM ... 49
Abbildung 3.7: Ergebnis eines High Resolution Meltings ... 50
Abbildung 4.1: Die Punktmutation c.452A>G ... 54
Abbildung 4.2: Die Punktmutation c.492G>A ... 55
Abbildung 4.3: HRM-Analyse mit den verschiedenen Schmelzkurven der Wildtyp- Proben und Variaten...56
Abbildung 4.4: Ergebnis der SIFT-Analyse ... 57
Abbildung 4.5: Ergebnis der PROVEAN-Analyse ... 58
Abbildung 4.6: Ergebnis der MutationTaster-Analyse ... 59
Abbildung 4.7: Ergebnis der PolyPhen-2-Analyse ... 60
Abbildung 4.8: Ergebnis der ESEfinder-Analyse der Variante c.452A>G ... 61
Abbildung 4.9: Ergebnis der ESEfinder-Analyse der Variante c.492G>A ... 62
Abbildung 5.1: Darstellung der Mutation durch Polyphen-2 ... 68
Abbildung 5.2: Ergebnis der ScanSite3-Analyse ... 69
1 Einleitung
1.1 Das Mammakarzinom
1.1.1 Geschichte des Mammakarzinoms
Durch die exponierte Lokalisation der weiblichen Brust kann Brustkrebs im Gegensatz zu vielen anderen Tumoren auch ohne technische Hilfsmittel sichtbar sein. So war er schon vor mehreren Tausend Jahren Gegenstand medizinischen Interesses (1). Mit der Übersetzung des vom Forscher Edwin Smith erworbenen und nach ihm benannten alt- ägyptischen Papyrus im Jahre 1930 ließen sich die ersten dokumentierten Fälle von Brust- krebs nachvollziehen. Das Alter dieses Papyrus wird auf 3600 Jahre geschätzt. Es enthält detaillierte Beschreibungen historischer Diagnose- und Therapiemethoden und ist allge- mein die älteste Dokumentation neoplastischer Erkrankungen (2,3).
Auch andere antike Kulturen wie die Griechen etablierten bereits chirurgische Protokolle, die den heutigen sehr ähnlich sind: Schon damals wurde auf Operabilität und Exzisions- abstand geachtet. Der Arzt Galen von Pergamon verwendete erstmals den Begriff
„Krebs“, um die radiär vom Tumor ausstrahlenden Venen zu beschreiben (4). Außerdem war Galen einer der Ersten, die der Ursache der Krankheit auf den Grund zu gehen ver- suchten (5). Während diese Entwicklung im Mittelalter in Europa weitgehend stagnierte, versuchten islamische Gelehrte wie Albucasis, insbesondere das chirurgische Wissen zu erweitern. Er empfahl die Verödung als Methode der Wahl, um den Brustkrebs an der Ausbreitung zu hindern, und erfand chirurgische Instrumente für eine einfachere Tumor- entfernung (4).
Über viele Jahrhunderte hielt sich die Theorie von der Vier-Säfte-Lehre als Ursache vieler Erkrankungen, darunter Brustkrebs. Nach dieser auch Humoralpathologie genannten Hy- pothese resultiert ein Ungleichgewicht der vier Körperflüssigkeiten Blut, Schleim, gelbe Galle und schwarze Galle in Krankheit (6). Auch die Religion spielte lange Zeit eine große Rolle in dem Versuch, den Ursprung von Brustkrebs zu erklären, zum Beispiel mit der Ansicht, die Erkrankung sei eine Strafe für begangene Sünden (4).
Erst während der Renaissance kamen Zweifel an diesen Lehren auf und man besann sich auf andere mögliche Risikofaktoren wie das Einatmen giftiger Gase oder Traumata. Die familiäre Häufung von Brustkrebs deutete für die Denker des 16.-18. Jahrhunderts auf
eine infektiöse Ursache hin (4).
Maler der Renaissance zeigten auf ihren Gemälden weibliche Oberkörper, welche die Diagnose Brustkrebs nahelegten, wie beispielsweise Rembrandt im Jahre 1654 bei seiner
„Bathsheba mit Davids Brief“: Bathshebas linke Brust weist Einziehungen und Verfär- bungen auf (1). Brustkrebs beschäftigte also nicht nur Ärzte, sondern auch die Künstler jener Zeit.
Die Erfindung des Lichtmikroskops machte das vergrößerte Betrachten von malignen Gewebeproben möglich: Die Geburtsstunde der Pathologie. Johannes Müller veröffent- lichte 1838 sein Werk „Ueber den feinern Bau und die Formen der krankhaften Ge- schwülste“. Er vermutete entartete Zellen als Ursache neoplastischer Krankheiten und legte außerdem den Grundstein für die Unterscheidung zwischen benignen und malignen Tumoren (5).
Aufgrund solcher Erkenntnisse wurde im 19. Jahrhundert auch die chirurgische Therapie des Brustkrebs revolutioniert: Der britische Chirurg William Banks dehnte das Operati- onsgebiet bei seinen Mastektomien auf die Axilla als Ort der lymphatischen Metastasie- rung aus (7). Innovationen wie das sterile Arbeiten, das Anwenden von Ligaturen und die Allgemeinanästhesie konnten ebenfalls zu verbesserten Ergebnissen beitragen (4). Aller- dings gab es für Brustkrebs nach wie vor keine andere Therapie als das chirurgische Ent- fernen des Tumors.
Im Jahre 1895 verkündete Konrad Röntgen die Entdeckung der nach ihm benannten Strahlen und nur 60 Tage später erfolgte durch den Medizinstudenten Emil Grubbe der erste Therapieversuch eines Mammakarzinoms mithilfe von Röntgenstrahlen. Allerdings war dieser nicht von Erfolg gekrönt – trotz der Verwendung von Bleiplatten zur Abschir- mung gesunder Hautareale entwickelten sowohl die Patientin als auch Grubbe selbst Ent- zündungen der Hände, Augenlider und Bindehäute sowie Haarausfall (8). Es folgten viele Versuche, maligne Erkrankungen vornehmlich der Haut durch Röntgenstrahlung zu be- handeln. Aber erst durch die vom Franzosen Henri Coutard vorgestellte Methode, die Strahlung fraktioniert zu verabreichen, konnten erfolgreiche Behandlungen ohne die be- schriebenen Nebenwirkungen verzeichnet werden (9).
Mitte des 20. Jahrhunderts wurden erste Versuche unternommen, Tumore mit Chemothe- rapeutika zu behandeln. Kurioserweise fand zunächst ein Mittel aus der chemischen Kriegsführung seinen Weg in die Labore: Nachdem bei Italienern, welche Senfgasangrif- fen ausgesetzt gewesen waren, post mortem eine verringerte Zahl weißer Blutkörperchen
aufgefallen war, schloss Dr. Steward Francis Alexander auf eine Auswirkung des Gases auf sich schnell teilende Zellarten (10). Nach einer Reihe von Tierversuchen wurde ein dem Senfgas verwandtes Agens, Mechlorethamin, erstmalig bei Patienten mit Lympho- men erfolgreich getestet (11). Parallel wurde unter der Gabe von Folsäure bei jungen Pa- tienten mit Akuter Lymphatischer Leukämie eine Progredienz ihrer Krankheit beobach- tet, wodurch der US-amerikanische Arzt Sidney Farber Folsäure-Antagonisten als Chemotherapeutika testete und teilweise Remissionen vermelden konnte (12). Das erste erfolgversprechende Chemotherapieregime wurde 1976 von Bonadonna et al. publiziert:
Die Kombination von Cyclophosphamid, Methothrexat und 5-Fluoruracil als adjuvante Therapie zusätzlich zur radikalen Mastektomie zeigte eine signifikante Risikoreduktion für Rezidive im Vergleich zur alleinigen Mastektomie (13).
1.1.2 Epidemiologie des Mammakarzinoms
Das Mammakarzinom nimmt unter epidemiologischen Gesichtspunkten einen besonde- ren Stellenwert im Gesundheitswesen ein. Es ist die häufigste Krebserkrankung der Frau weltweit. Im Jahr 2012 wurden international 1.671.149 neue Fälle gezählt, im selben Jahr starben 521.907 Frauen an Brustkrebs. Bezogen auf die Gesamtsumme aller Krebserkran- kungen bei Frauen macht der Brustkrebs 25,1% aller Neuerkrankungen und 14,7% aller Krebstodesfälle aus (14). Die Diagnose Brustkrebs differiert jedoch in ihrer Häufigkeit international: In West- und Mitteleuropa ist diese zum Beispiel vergleichsweise höher als im tropischen Afrika oder Asien. Ansteigende Inzidenzraten sind während der vergange- nen Jahrzehnte sowohl in Industrie- als auch in Entwicklungsländern beobachtet worden (15).
Auch in Deutschland ist das Mammakarzinom mit rund 70.000 Neuerkrankungen pro Jahr die häufigste Krebserkrankung bei Frauen und verursacht jährlich circa 17.500 To- desfälle. Je 100.000 Personen erkranken 123,3 Frauen pro Jahr, hier findet sich analog zum internationalen Trend eine steigende Tendenz (16). Man geht heutzutage von einer Lebenszeitprävalenz von 10-12% aus, sodass statistisch gesehen jede achte bis zehnte Frau im Laufe ihres Lebens an Brustkrebs erkrankt (17).
Diese sowohl weltweit als auch in Deutschland auffallende wachsende Inzidenz von Mammakarzinomen lässt sich einerseits durch das vermehrte Auftreten der in Kapitel 1.1.3 genannten Risikofaktoren, andererseits aber auch durch das flächendeckendere Screening erklären, wodurch heutzutage mehr Fälle detektiert werden können. Abbildung
1.1 zeigt, dass die Mortalität trotz steigender Fallzahlen relativ konstant bleibt, was die verbesserten Screening- und Behandlungsmethoden abbildet (18).
Abbildung 1.1: Jährliche Neuerkrankungs- und Sterbefälle sowie altersstandardisierte Neuerkrankungs- und Sterberaten (Europastandard), Deutschland 1980-2004, ICD-10, C50 (18)
Wie in Abbildung 1.2 zu sehen ist, bezieht sich der Anstieg der Inzidenz in Deutschland hauptsächlich auf die Altersgruppe der 45- bis 70-jährigen Frauen, welche auch Haupt- zielgruppe des Mammographie-Screenings ist. In der Gruppe der über 75-jährigen Frauen sinkt die Inzidenz seit einigen Jahren sogar. Insgesamt handelt es sich beim Mammakar- zinom wie bei vielen Neoplasien um eine altersabhängige Erkrankung. Die Fallzahlen aus dem Jahr 2004 (Abbildung 1.2) zeigen, dass die Wahrscheinlichkeit, in jungen Jahren (<45) an Brustkrebs zu erkranken, unter 1:1000 liegt, wohingegen Frauen im mittleren und hohen Alter ein beinahe dreimal so hohes Risiko haben.
Der Nutzen des Mammographie-Screenings ist nach wie vor umstritten, beispielsweise wegen der psychischen Belastung, der Frauen mit positivem Screening-Befund aber letzt- endlich negativem Kontrollergebnis ausgesetzt sind. Eine Studie mit englischen und US- amerikanischen Patientinnen zeigte allerdings, dass die Brustkrebs-Mortalität nach der Einführung flächendeckender, jährlicher Mammographien um 11% sank (19).
Abbildung 1.2: Altersspezifische Neuerkrankungsraten nach Geschlecht und Altersgruppen, Deutschland 1980, 1990 und 2004, ICD-10 C50 (18)
Auch Männer können an Brustkrebs leiden, jedoch sind hier die Fallzahlen deutlich ge- ringer: Weltweit wird der Anteil von Brustkrebs bei männlichen Patienten an allen Brust- krebserkrankungen auf etwa 1% geschätzt. Beispielsweise in den USA macht Brustkrebs bei Männern sogar noch weniger als 1% aller Brustkrebserkrankungen aus und ist für 0,1% der durch Krebs verursachten Sterbefälle verantwortlich (20).
1.1.3 Risikofaktoren für die Entstehung eines Mammakarzinoms
Man ist sich mittlerweile einig, dass für die maligne Entartung einer Zelle und die damit verbundene Tumorgenese ein mehrstufiger Prozess verantwortlich ist, der durch das Auf- einandertreffen mehrerer ungünstiger Faktoren initiiert wird (21). Im Falle des Mammakarzinoms sind bereits viele Risikofaktoren identifiziert worden, die diesen Pro- zess einleiten oder begünstigen können. Diese können in die Gruppen der vermeidbaren und unvermeidbaren Risikofaktoren unterteilt werden.
Vermeidbare Risikofaktoren
Der Lebensstil ist ein sehr weit gefasster Begriff, der bereits viele der vermeidbaren Ri- sikofaktoren beinhaltet, so beispielsweise die Ernährung. Sie scheint eine nicht zu ver- nachlässigende Auswirkung auf das Brustkrebsrisiko zu haben. Viele Studien zeigen,
dass Übergewicht bei postmenopausalen Frauen das Brustkrebsrisiko erhöht und darüber hinaus ihre Prognose in Bezug auf Rezidive und Todesfälle verschlechtert (22). Entge- gengesetzt weisen Frauen, die eine gesunde Ernährungsweise mit viel Obst, Gemüse, Ge- flügel, Fisch und Vollkornprodukten sowie einer geringen Fettzufuhr bevorzugen, ein um 11% reduziertes Risiko auf (23). Weitere Bestandteile der Nahrungszufuhr haben eben- falls Einfluss auf das Brustkrebsrisiko: Ein erniedrigter Vitamin D-Spiegel erhöht nicht nur das Risiko für Brustkrebs, sondern scheint auch mit besonders aggressiven Verlaufs- formen zu korrelieren (24). Eine erhöhte Aufnahme von Alkohol kann das Risiko für Brustkrebs um bis zu 21% steigern (23). Tabakkonsum, sowohl aktiv als auch passiv, gewinnt ebenfalls an Evidenz, einen schädlichen Einfluss auf die Brustkrebsentwicklung auszuüben, die direkte Kausalität ist allerdings noch nicht geklärt worden (25). Erhöhte Insulinlevel sind bei postmenopausalen Frauen ebenfalls mit einem gesteigerten Brust- krebsrisiko assoziiert (26).
Auch Umweltfaktoren, denen Patientinnen ausgesetzt sind, haben Auswirkungen auf das Brustkrebsrisiko. Polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAH) und Polychlo- rierte Bephylene (PCB) sollen in der Lage sein, eine östrogenähnliche Wirkung auf den Körper auszuüben und so das Risiko für Mammakarzinome zu erhöhen. PAH ist Bestand- teil von Auspuffgasen und Smog (27), wohingegen die Verwendung von PCB seit 2004 in Europa verboten ist (28). Dioxine, Chlorkohlenwasserstoffe und Pestizide werden ebenfalls verdächtigt, sich auf das Brustkrebsrisiko auszuwirken (27).
Auch ionisierende Strahlung gehört zu den vermeidbaren Risikofaktoren für Brustkrebs.
Hierzu zählen sowohl therapeutisch angewandte als auch akzidentell absorbierte Strah- lungsformen. Im Gebiet um den Reaktorunfall in Tschernobyl wurde beispielsweise ei- nige Jahre nach dem Vorfall ein um den Faktor 2,24 erhöhtes relatives Risiko für Brust- krebs im Vergleich zum von der Kontaminierung nur wenig betroffenen Teil des Landes festgestellt (29). Hochdosierte Strahlenbehandlungen des Brustkorbs können das relative Risiko für Brustkrebs sogar auf bis zu 4,0 erhöhen (30).
Die Signifikanz von Lifestyle und Umweltfaktoren als Risikofaktoren für Brustkrebs zei- gen Studien, welche die Brustkrebsraten von Migrantinnen beobachten. Es konnte bereits dargelegt werden, dass sich das Risiko für Brustkrebs nach Auswanderung rasch dem des Einwanderungslandes anpasst. Bei polnischen Auswanderinnen in den USA wurde bei- spielsweise innerhalb einer Generation eine Risikoverdreifachung beobachtet, womit das Risiko fortan dem der US-Bevölkerung entsprach (31). Ähnliche Verläufe dokumentierte man bei japanischen, chinesischen und philippinischen Frauen in den USA(31). Aktuell
wird versucht, die Lifestyle-Veränderungen, welche mit dem Landeswechsel einherge- hen, genauer darzustellen, um mögliche protektive und schädliche Faktoren einzugren- zen. Für die Aufnahme von grünem Tee und Sojaprodukten konnten bereits derartige ne- gative Korrelationen mit dem Brustkrebsrisiko gezeigt werden (31).
Darüber hinaus spielt das Hormoneinnahme-Verhalten eine signifikante Rolle: Östrogen- haltige Kontrazeptiva sind eine beliebte Form der Verhütung und werden von vielen Frauen über Jahre hinweg eingenommen. Außerdem kann Östrogen zur Behandlung me- nopausaler Beschwerden wie Osteoporose oder Hitzewallungen eingesetzt werden. Die karzinogene Wirkung von Östrogen auf die Brust ist seit Längerem bekannt. Sie variiert jedoch abhängig vom hormonellen Status zum Zeitpunkt der Einnahme (32). Während eine Metaanalyse aus dem Jahre 1996 ein relatives Risiko von 1.24 für die Entwicklung von Brustkrebs bei Anwenderinnen östrogenhaltiger Kontrazeptiva gegenüber Kontroll- gruppen feststellte (33), konnte eine Metaanalyse aus dem Jahr 2013 keinen derartigen Zusammenhang bei prämenopausalen Frauen feststellen (32). Dies könnte an der signifi- kanten Abnahme der in Kontrazeptiva enthaltenen Wirkstoffkonzentrationen liegen.
Auch 1996 war man sich bereits einig, dass das Risiko von Frauen mit und ohne Kontra- zeptiva-Anamnese sich spätestens zehn Jahre nach Einnahmestopp angleicht. Außerdem fand man heraus, dass die Anwenderinnen von Kontrazeptiva ein verringertes relatives Risiko für bereits metastasierten Brustkrebs zum Zeitpunkt der Diagnose hatten. Es be- trug im Vergleich zur Kontrollgruppe 0.88 (33).
Für Frauen, die östrogenhaltige Präparate während oder nach der Menopause einnehmen, ergeben sich hingegen ausschließlich nachteilige Effekte: Es zeigt sich ein bis zu um den Faktor 1.38 erhöhtes Risiko für Brustkrebs sowie aggressivere Tumoren im Vergleich zu Kontrollgruppe (34). Allerdings treten diese Ergebnisse nur bei kombinierten Hormon- präparaten auf – alleinige Östrogengabe ohne Progesteron, wie sie bei Frauen nach einer Hysterektomie gegeben wird, scheint sogar protektive Wirkungen auf die Brust zu haben (32).
Bei Östrogeneinnahme in der Schwangerschaft ist nicht nur das Brustkrebsrisiko der Mut- ter erhöht, sondern auch das des ungeborenen Kindes. Im Tierversuch konnte gezeigt werden, dass dieser Risikoanstieg durch epigenetische Prozesse verursacht wird und sich bis in die Generation der Urenkelinnen fortsetzt (32).
Unvermeidbare Risikofaktoren
Zuerst sollte sicherlich das Geschlecht genannt werden, ist es doch der einflussreichste Risikofaktor für die Entwicklung von Brustkrebs. 99% der Brustkrebsfälle weltweit wer- den bei Frauen diagnostiziert. Die Menge an Brustdrüsengewebe ist bei Männern im Ver- gleich deutlich geringer und spiegelt somit auch ihr Erkrankungsrisiko in Bezug auf das Mammakarzinom wider (20).
Das Alter spielt wie bei vielen Krebserkrankungen eine große Rolle: Sowohl Inzidenz als auch Mortalität wachsen mit steigendem Alter. Die Inzidenz beträgt bei Frauen zwischen 20 und 30 Jahren 0,01%, wohingegen sie bei Frauen über 60 Jahre bei 0,3% liegt. Das durchschnittliche Diagnosealter beträgt beispielsweise in den USA 64 Jahre (35).
Der ethnische Hintergrund einer Person steht ebenfalls mit dem Erkrankungsrisiko in Korrelation. Afroamerikanische Frauen leiden im Vergleich zur kaukasischen US-Bevöl- kerung häufiger unter aggressivem Brustkrebs und werden später einem Therapieregime zugeführt, wie die Gruppe Tammemagi et al. beschrieb (36). Es bleibt zu untersuchen, inwiefern soziale Faktoren diese Ergebnisse beeinflussen. Größen wie das Inanspruch- nahme-Verhalten von Vorsorgeuntersuchungen, Einnahme von Östrogenpräparaten oder Ernährungsverhalten könnten zwischen verschiedenen Ethnien differieren und als Stör- faktoren agieren, sodass das erhöhte relative Risiko afroamerikanischer Frauen kaum o- der gar nicht auf genetische Unterschiede zurückzuführen wäre.
Des Weiteren ist die mammographische Dichte der Brust bedeutsam. Ist die Brust von mehr Binde- als Fettgewebe durchzogen, erscheint sie in der Mammographie hell, also dicht. Hierbei besteht eine positive Korrelation dieses Dichtegrades und dem Brustkrebs- risiko: Das relative Risiko für Brustkrebs ist beispielsweise bei einer röntgendichten Brust im Vergleich zu einer radiologisch unauffälligen Brust um den Faktor 4,6 erhöht (37).
Allerdings bezieht sich dieser Zusammenhang auf die prozentuale röntgendichte Fläche der Brust, nicht auf die absolute (38).
Wie im Abschnitt „vermeidbare Risikofaktoren“ beschrieben, ist die Exposition gegen- über synthetischem Östrogen ein Risikofaktor für Mammakarzinome. Dies gilt ebenso für körpereigenes Östrogen, welches primär während der fertilen Lebensjahre der Frau produziert wird. Folglich führen eine frühe Menarche und eine späte Menopause zu einer elongierten Östrogenexposition und steigern so das Brustkrebsrisiko. Ebenso wirken sich das späte Gebären des ersten Kindes (39) sowie der Verzicht auf das Stillen der Kinder negativ aus (40). Erhöhte Werte der Androgene Androstendion und Testosteron können
einen ähnlichen Effekt haben, da sie durch das Enzym Aromatase in Östrogene umge- wandelt werden (41).
Genetische Risikofaktoren sind seit Jahrzehnten Gegenstand intensiver Forschung, so- dass bereits eine Vielzahl identifiziert werden konnte (42). Die prominentesten Beispiele für sogenannte Risikogene sind sicherlich BRCA1 (breast cancer type 1 susceptibility gene) und BRCA2 (breast cancer type 2 susceptibility gene) (42). Mutationen in diesen Genabschnitten führen im Falle von BRCA1 zu einem Lebenszeit-Brustkrebsrisiko von 55-85%. Bei Vorliegen einer Mutation in BRCA2 beträgt dieser Wert 35-60% (42). Das Risiko für Ovarialkarzinome und weitere Krebsarten ist bei Mutationsträgern beider Gene ebenfalls signifikant erhöht (43). Hier stellt sich die Frage nach einer prophylaktischen Entfernung karzinomgefährdeter Organe, was von manchen Betroffenen aus Angst vor bösartigen Neubildungen in Anspruch genommen wird (42).
Auch im Rahmen vieler Syndrome ist das Brustkrebsrisiko bedeutsam erhöht: Beim Li- Fraumeni-Syndrom besteht eine Mutation im TP53-Gen (tumor protein p53 gene).
Dadurch kommt es zu einer Erhöhung des Risikos für zahlreiche Krebsarten (44). Das Cowden-Syndrom (Mutation in PTEN (Phosphatase and tensin homolog gene )), das her- editäre nicht-polypöse kolorektale Karzinom (Mutation in hMSH2 (human mutS homolog 2 gene) oder hMLH1 (human mutL homolog 1 gene)), das Peutz-Jeghers-Syndrom (Mu- tation in STK11 (Serine/threonine kinase 11 gene)), das Bloom-Syndrom (Mutation in BLM (Bloom Syndrome, RecQ Helicase-Like gene)), Ataxia Teleangiectasia (Mutation in ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated gene)) (42) oder die Fanconi-Anämie (Mutatio- nen an 15 oder mehr verschiedenen Genloci) sind Beispiele für mit einem erhöhten Brust- krebsrisiko vergesellschaftete Syndrome (45).
Die oben genannten Mutationen gehören zur Gruppe der seltenen bis mittelseltenen Ver- änderungen, haben dafür aber eine vergleichsweise hohe Penetranz. Sie sind allerdings nur an 2-5% der Mammakarzinome ursächlich beteiligt. Darüber hinaus gibt es diverse genetische Variationen, die relativ häufig sind, jedoch im Vergleich mit den erwähnten Mutationen eine geringere Penetranz aufweisen. Diese sind in mindestens 58% der Brust- krebsfälle vorzufinden (46). In diese Kategorie fallen zum Beispiel Mutationen von Ge- nen mit den Namen CASP8 (caspase 8, apoptosis-related cysteine peptidase gene), TOX3 (TOX high mobility group box family member 3 gene), AKAP9 (A kinase (PRKA) anchor protein 9 gene) oder MAP3K1 (mitogen-activated protein kinase 1, E3 ubiquitin protein ligase gene) (47).
1.1.4 Klinik, Diagnose und Therapie des Mammakarzinoms
Das häufigste Erstsymptom des Mammakarzinoms ist ein tastbarer Knoten in der Brust.
Aufgrund dieser Tatsache werden Frauen ab 20 Jahren dazu angehalten, selbstständig und regelmäßig ihre Brust zu untersuchen, um eventuelle Veränderungen früh feststellen zu können (48). Außerdem können Symptome wie Hautrötungen, -einziehungen oder -ero- sionen, veränderter Ausfluss, Seitendifferenzen in Form und Größe der Brust, Schmerzen sowie axilläre und supraklavikuläre Schwellungen auf Brustkrebs hindeuten (49). Über 90% der Brustkrebs-Diagnosen werden gestellt, nachdem Patientinnen selbst Verände- rungen bemerkt haben – somit spielt die Mammographie im Vergleich zur Selbstuntersu- chung eine untergeordnete Rolle (48). Umso wichtiger ist eine zeitnahe Vorstellung der Patientin nach Entdeckung erster Symptome zur Abklärung ebendieser. Diese wird je- doch von vielen Patientinnen hinausgezögert, oft im Glauben, das Symptom werde von selbst verschwinden. Patientinnen, welche über mögliche Symptome von Brustkrebs auf- geklärt sind, suchen meist zügiger einen Arzt auf als Patientinnen, die sich aufgrund ihres Unwissens nicht um ihre Gesundheit sorgen (49,50). Ist das Karzinom bereits metasta- siert, können neben den oben beschriebenen Symptomen auch fern vom Tumor Be- schwerden auftreten. Die häufigsten Metastasierungsorte des Mammakarzinoms sind Lunge und Knochen, gefolgt von Lymphsystem und Leber (50). Auch systemische Krankheitszeichen wie Gewichtsverlust, disseminierter Schmerz oder Mattigkeit sind nicht unüblich (51).
Zur Abklärung des Verdachts auf Brustkrebs dient meist die Biopsie. Sie klärt die Fragen nach dem Typ und der Malignität des Tumors und bildet zusammen mit bildgebenden Maßnahmen die Grundlage für die Auswahl des Therapieverfahrens. Bevor mit der The- rapie begonnen wird, werden so mehrere prognostisch relevante Faktoren evaluiert:
Durch die Biopsie wird der histologische Subtyp des Karzinoms bestimmt – hierbei macht das duktale Karzinom circa 75% der Diagnosen aus, während das lobuläre Karzinom für ungefähr 15% der Fälle verantwortlich ist. Die restlichen 10% werden zum Beispiel durch tubuläre, entzündliche, medulläre und papilläre Karzinome gebildet (52).
Die Biopsie kann auch beim Grading des Tumors helfen: Allen Neoplasien wird ein Grad von G1 bis G4 zugewiesen, wobei G1 für eine gute Differenzierung der Tumorzellen steht, während G4 anaplastische Zellen beschreibt (53).
Des Weiteren werden alle Karzinome in die TNM-Klassifikation eingeteilt, dies kann allerdings oft auch erst postoperativ möglich sein. TNM steht für Tumor, Nodes (engl.:
Lymphknoten) und Metastasen.
Durch einen Zahlencode wird die Tumorgröße und -invasion des umliegenden Gewebes beschrieben, außerdem die Anzahl der befallenen Lymphknoten und der Metastasenstatus (54). Diese Parameter helfen beim Staging des Tumors, also dem Einteilen desselben in die von der „Union internacional contre le cancer“ herausgegebenen Stadien 0,IA/B, IIA/B, IIIA/B oder IV, an welchen sich wiederum die Therapie orientiert (55). Auch die 5-Jahres-Überlebensraten der Stadien 0-IV weisen große Unterschiede auf: Patientinnen des Stadiums 0 haben eine Überlebensrate von 92%, Patientinnen des Stadiums IV hin- gegen nur von 13% (56).
Mithilfe immunhistochemischer Nachweisverfahren kann außerdem der Rezeptorstatus des Karzinoms bestimmt werden. Für Tumoren der Brust gibt es drei mögliche therapie- relevante Zellrezeptoren: Östrogen-, Progesteron und HER2/neu-Rezeptoren. Im Falle ei- ner Rezeptorpositivität – bei 2/3 der Patientinnen findet sich beispielsweise ein positiver Östrogenrezeptorstatus – eröffnen sich neue Möglichkeiten der Therapie, welche gezielt die rezeptorpositiven Zellen angreifen kann (57).
Neuerdings versucht man neben diesen etablierten Stagingverfahren eine weitere Eintei- lung einzuführen, welche alleinig auf den Rezeptorstatus beruht und mithilfe von DNA- Microarrays diagnostiziert werden kann (58). Hierbei unterscheidet man fünf Gruppen:
„Luminal A“ (Hormonrezeptorposiv, HER2-Rezeptornegativ), „Luminal B“ (Hormonre- zeptorpositiv, HER2-Rezeptorpositiv), „Basal-like“ (Hormon- und HER2-rezeptornega- tiv, Zytokeratinrezeptorpositiv und/oder HER1-Rezeptorpositiv), „HER2+/ER-“ (HER2- Rezeptorpositiv, Hormonrezeptornegativ) und „Unclassified“ (negativ für alle Rezepto- ren) (58). Es besteht die Hoffnung, dass dieses System eine exaktere Prognose und auch Therapie bieten kann als das herkömmliche „Staging“ (58).
Die Therapie des Mammakarzinoms erfolgt abgestimmt auf das diagnostizierte Stadium und besteht aus den drei Säulen Chirurgie, Pharmakotherapie und Bestrahlung. Typi- scherweise spielt die Chirurgie eine große Rolle, da die Brust als exponiertes Organ einen guten Operationszugang bietet. Abhängig vom Stadium der Krankheit werden entweder nur der Tumor oder die ganze Brust entfernt. Zusätzlich werden in den meisten Fällen die axillären Lymphknoten exstirpiert (59). Mittlerweile gibt es vielerlei rekonstruktionschi- rurgische Verfahren, um das natürliche Aussehen der Brust nach dem Entfernen malignen Gewebes bestmöglich wiederherzustellen. Die Möglichkeiten reichen von der Verwen- dung autologer Gewebelappen über das Einsetzen von Implantaten und Expandern bis
zur Tätowierung der Brustwarze, um ein optimales ästhetisches Ergebnis zu erzielen (60).
Die pharmakologische Therapie kann sowohl prä- (neoadjuvant) als auch postoperativ (adjuvant) oder palliativ eingesetzt werden. Hier muss ebenfalls auf das Krankheitssta- dium geachtet und das Therapieregime dementsprechend initiiert werden. Neben Chemotherapeutika stehen Patientinnen mit positivem Östrogen- oder Progesteronrezep- torstatus Hormontherapien zur Verfügung. Für Patientinnen mit positivem HER2/neu- Rezeptorstatus sind außerdem Antikörpertherapien entwickelt worden (59). Die Neben- wirkungen der Chemotherapie wie beispielsweise Übelkeit oder Anämie sind nicht zu unterschätzen und erfordern ihrerseits eine individuelle Medikation, um der Patientin ein Höchstmaß an Lebensqualität zukommen zu lassen (61).
Die Radio- oder Strahlentherapie bildet die dritte Säule der Brustkrebs-Therapie. Sie wird meist adjuvant oder palliativ, manchmal aber auch bereits intraoperativ eingesetzt. Im Vergleich zur Chemotherapie ist die Radiotherapie nebenwirkungsärmer, kann aber trotz- dem unerwünschte Nebeneffekte haben. Diese sind in ihrer Mehrzahl akute Reaktionen, chronische Folgen sind eher selten. Beispiele für akute Nebenwirkungen sind lokale Hau- tirritationen oder Krankheitsgefühl (62).
Auch die psychischen Folgen einer malignen Erkrankung und der damit verbundenen kraftraubenden Behandlungen sind nicht zu vernachlässigen und bedürfen ebenfalls einer einfühlsamen Therapie (63).
1.2 Zellbiologische Grundlagen der Kanzerogenese
1.2.1 Tumorentstehung
Der menschliche Körper besteht aus schätzungsweise 1014 Zellen (21). Sie stehen in ei- nem physiologischen Gleichgewicht aus Vermehrung und Absterben, sodass die Integri- tät des Zellverbandes gewahrt werden kann. Es gibt viele Regulatoren, die auf zellbiolo- gischer Ebene für den Erhalt dieses Gleichgewichts sorgen. Wird die Balance gestört, beispielsweise durch Mutationen in regulatorischen Genen, sodass eine ungebremste Ver- mehrung von Zellen stattfindet, ist die Grundlage für die Entwicklung einer bösartigen Erkrankung geschaffen (64). Diese Mutationen können sowohl durch exo- als auch durch endogene Noxen verursacht werden. Als exogene Noxen werden beispielsweise UV-, ra-
dioaktive Strahlung oder Viren angesehen, endogene Noxen können etwa freie Sauer- stoffradikale sein (65). Die Regulatoren der DNA-Reparatur werden im Modell von Zhou et al. (2001, siehe Abb. 1.3) in Sensoren, Transduktoren und Effektoren eingeteilt (66).
Aufgabe der Sensoren wie beispielsweise des MRN Komplexes ist es, Schäden an der DNA oder Schwierigkeiten während der Replikation zu erkennen und diese den Trans- duktoren zu melden. Der MRN-Komplex besteht aus den Proteinen MRE11A („meiotic recombination 11 homolog A“), RAD50 („radiation-sensitive mutant 50 homolog“) und NBS1 („Nijmegen Breakage Syndrome protein 1“, Nibrin) (67). Der prominenteste Ver- treter der Transduktoren ist hingegen ATM („Ataxia teleangiectasia mutated“). Die Transduktoren geben ihrerseits ein Signal an die Effektoren wie beispielsweise BRCA1 und p53 („Tumor Protein P53“) ab, welche je nach der ihnen anhaftenden Funktion eine Aktion ausführen (im Fall von TP53 beispielsweise als Transkriptionsfaktor). Diese kann je nach Ausmaß des DNA-Schadens zum Abbruch des Zellzyklus, zur Einleitung des programmierten Zelltodes, zur Transkription von für Reparaturproteine kodierenden Ge- nen oder zur Reparatur des DNA-Schadens führen (66).
Abbildung 1.3: Ablauf der Signaltransduktion bei DNA-Schaden, modifiziert nach Zhou und Elledge (66)
Transkription
Dieses hochdifferenzierte System kann bereits einen Großteil der auftretenden Fehler auf- fangen: Pro Tag und Zelle kommt es zu 10.000 bis 1.000.000 Läsionen auf molekularer Ebene, die größtenteils von den Reparatursystemen korrigiert werden (68). Die Gene, welche für die Krebsentstehung relevant sind, wenn sie durch Mutationen verändert wer- den, lassen sich in zwei Gruppen einteilen: Tumorsuppressor-Gene und Proto-Onkogene.
Veränderungen, welche die Funktionalität von Tumorsuppressoren behindern oder die Wirksamkeit von Proto-Onkogenen erhöhen, bahnen den Weg für die Tumorentstehung.
Die Nomenklatur dieser beiden Begriffe bezieht sich weniger auf ihre physiologischen Funktionen als vielmehr auf die Resultate ihrer Fehlregulation. Alle Gene, deren Proteine regulierend in den Zellzyklus und die -proliferation eingreifen, können durch Mutationen Neoplasien hervorrufen (69).
Beispiele für Tumorsuppressor-Gene sind RB (Retinoblastoma Gen), welches als erstes seiner Art identifiziert wurde und das Retinoblastom bedingt, p16 („Cyclin-dependent Kinase Inhibitor 2A gene“), das für manche Melanome verantwortlich ist, oder TP53, das sicher berühmteste Tumorsuppressorgen und Verursacher des Li-Fraumeni-Syndroms (69).
Um einen Tumor zu induzieren, sind für Tumorsuppressorgene gemeinhin zwei mutierte Allele notwendig, deshalb werden sie auch als rezessive Tumorgene bezeichnet. Die so- genannte „Second-Hit-Theorie“ beschreibt dieses Verhalten: Sie besagt, dass für die Tu- morentstehung mindestens zwei aufeinanderfolgende Mutationsereignisse in einem Tu- morsuppressorgen erforderlich sind. Alfred Knudson beschrieb diese Theorie im Jahre 1971 und legte damit einen wichtigen Grundstein für die heutige Genforschung. Demnach ist entweder bereits ein Allel in Form einer Keimbahnmutation verändert und gewinnt durch eine zusätzliche somatische Mutation die Homozygotie, oder beide Mutationen ent- stehen somatisch (70). Allerdings gibt es auch Ausnahmen von dieser Theorie, sodass teilweise auch schon eine Mutation ausreicht, um ein Tumorsuppressor-Gen zum Tumor- wachstum beitragen zu lassen (69).
Proto-Onkogene hingegen sind Gene, welche durch Mutationen zu Onkogenen, also tu- morinduzierenden Genen werden können. Als Beispiele seien SRC („sarcoma gene“) ge- nannt, das als erstes Proto-Onkogen 1970 entdeckt wurde und bei vielen Krebsarten eine Rolle spielt (71), oder MYC („V-myc avian myelocytomatosis viral oncogene homolog gene“), das in mutierter Form beim Burkitt-Lymphom anzutreffen ist (72). Auch die Mit- glieder der RAS-Genfamilie („rat sarcoma viral oncogene homolog gene“) sind bekannte Vertreter der Proto-Onkogene (73). Generell gilt, dass Proto-Onkogene nur eine Mutation
benötigen, um ihr kanzerogenes Potential zu erreichen, sie sind also im Gegensatz zu Tumorsuppressor-Genen als dominant einzustufen (69).
Der Prozess der Tumorentstehung wird gemeinhin in drei Phasen unterteilt: Die Entste- hung einer Zelle mit durch Mutation ungebremsten Zellteilungs-Eigenschaften wird als Initiation bezeichnet. Ihr klonales Wachstum durch Zellteilung nennt man Promotion und die anschließende mutationsbedingte benigne oder maligne Ausbreitung Progression (65).
1.2.2 DNA-Reparaturmechanismen
Haben Sensorproteine des Signaltransduktionsmodells (siehe 1.2.1) einen Schaden an der DNA entdeckt, bestehen verschiedene Möglichkeiten der Reparatur, abhängig vom je- weils detektierten Mangel.
Schadensumkehrung
Bei Kleinstschäden ist die Zelle in der Lage, diese rückgängig zu machen. Durch UV- Strahlung kann aus der Base Guanin O6-Alkylguanin entstehen. Das körpereigene Enzym O6-Alkylguanintransferase (MGMT) vermag die addierte Methylgruppe zu entfernen, so- dass die Guanin-Base wieder unversehrt zur Verfügung steht. Allerdings ist diese Reak- tion nur einmalig möglich, da das Enzym nach der Aufnahme der Methylgruppe der Pro- teolyse zugeführt wird (67).
Basenexzisionsreparatur
DNA-Schäden, die sich nur auf einen der beiden Stränge beschränken, können durch die Basenexzisionsreparatur rückgängig gemacht werden. Hieran sind mehrere Enzyme be- teiligt: Zunächst erkennt eine DNA-Glykosylase defekte Basen und entfernt diese. Da- raufhin führt eine AP-Endonuklease (Apurinische/apyrimidinische Endonuklease) einen Einzelstrangbruch an derselben Stelle herbei. Anschließend sorgen eine DNA-Poly- merase und eine DNA-Ligase für die Neusynthese der beseitigten Base sowie deren Ein- bindung in den DNA-Strang. Auf diese Weise können sowohl einzelne („short patch re- pair“) als auch bis zu zwanzig Nukleotide parallel ausgetauscht werden („long patch re- pair“) (74).
Nukleotidexzisionsreparatur
Auch die Nukleotidexzision ist eine Reparaturweise, welche sich für Einzelstrangdefekte eignet. Sie konzentriert sich jedoch im Gegensatz zur Basenexzisionsreparatur auf De- fekte im Rückgrat der DNA-Stränge, die eine Veränderung („bulk“) in der Helix-Forma- tion verursachen. Dieser Reparaturmechanismus unterteilt sich in die globale Genomre- paratur (GGR), welche sich mit nicht transkribierter DNA beschäftigt, und die transkrip- tionsgekoppelte Reparatur (TGR), die fehlerhafte aktiv transkribierte DNA ersetzt. Diese Reparaturwege unterscheiden sich in ihren Erkennungsmechanismen, nicht jedoch im weiteren Verlauf des Reparaturprozesses. Während bei der GGR das Protein XPC („Xe- roderma pigmentosum complementation group C“) die schadhaften Stellen erkennt, über- nimmt bei der TGR die RNA-Polymerase diese Aufgabe. Im Anschluss wird die Doppel- helix-Struktur der DNA durch Helikasen teilweise geöffnet. Die Vollendung der Öffnung erfolgt durch die Enzyme XPG („Xeroderma pigmentosum complementation group G“), XPA („Xeroderma pigmentosum complementation group A“) und RPA („Replication Protein A“). XPA und RPA sind außerdem für die Positionierung der Endonukleasen ver- antwortlich. Diese wiederum entfernen eine Nukleotidsequenz von 24 bis 32 Basen. Der Ersatz des entfernten Stranges erfolgt analog zur Basenexzisionsreparatur durch eine DNA-Polymerase und –Ligase (67,74).
Homologe Rekombinationsreparatur
Generell sind Doppelstrangbrüche seltener als andere DNA-Schäden, können jedoch bei Ausfall der entsprechenden Reparatursysteme gravierende Folgen haben. Kommt es wäh- rend der S- oder G2-Phase des Zellzyklus zu einem Doppelstrangbruch, kann dieser durch die sogenannte Homologe Rekombinationsreparatur beseitigt werden. Hierfür wird ein dem geschädigten Strang identisches Schwesterchromatid benötigt, welches nur während dieser Zellzyklus-Phasen vorhanden ist und somit als Matrize für die zu ersetzende DNA zur Verfügung steht. Der Doppelstrangbruch wird zunächst vom MRN-Komplex, beste- hend aus den Proteinen MRE11A, RAD50 und NBS1, erkannt. Der MRN-Komplex ak- tiviert, unterstützt vom CtIP („CtBP-interacting protein“), weitere essentielle Proteine wie ATM und stellt freie 3’-Einzelstränge her. Diese werden sofort vom RPA („replica- tion protein A“) besetzt, welches die DNA-Einzelstränge noch weiter auftrennen kann.
Parallel wird das Schwesterchomatid auf den Informationsaustausch vorbereitet, indem es von seinen Histonen gelöst wird. Es folgt der Ersatz von RPA durch RAD51 („DNA repair protein RAD51“), katalysiert durch Proteine wie BRCA2 („breast cancer type 2
susceptibility protein“). RAD51 katalysiert wiederum durch die Ausbildung von Nucle- oproteinfilamenten den Austausch jeweils eines DNA-Stranges zwischen dem gebroche- nen Chromatid und seinem identischen Schwesterchromatid, wodurch der sogenannte D- Loop gebildet wird. Nun kann das verloren gegangene Material durch DNA-Polymerasen und -Ligasen neu synthetisiert werden, indem diese sich am vollständigen Chromatid ori- entieren. Die Auflösung des D-Loops kann auf zwei Wegen geschehen: Beim „Synthesis- Dependent Strand Annealing“ (SDSA) wird der D-Loop durch spezielle Helikasen auf- gelöst und die neu entstandenen DNA-Stränge an die restliche DNA angeknüpft, sodass keine Überschneidungen entstehen. Im Falle eines „Double Holliday Junction Model“- Pfades entstehen sogenannte doppelte Holliday-Kreuzungen, da auch das 5’-Ende des gebrochenenen Stranges an das Schwesterchromatid angelagert wird. Als Endprodukte können hier DNA-Stränge mit oder ohne Überschneidungen entstehen (67,75).
Nicht-homologes End-Joining
Im Gegensatz zur Homologen Rekombinationsreparatur braucht der Reparaturweg der Nicht-homologen End-Verknüfung („Non-homologous End-Joining“, NHEJ) keine Mat- rize, sodass er auch während der G1-Phase des Zellzyklus stattfinden kann, wenn sich kein Schwesterchromatid in nächster Nähe zum Strangbruch befindet. Durch NHEJ wer- den ebenfalls ausschließlich Doppelstrangbrüche repariert. Die Entscheidung für einen der beiden Reparaturwege wird über die Cyclin-abhängige Kinase 1 reguliert, die abhän- gig vom Zellzyklus exprimiert wird, nämlich nur während der Phasen G2 und S (76).
Zunächst bindet das Heterodimer Ku70/80 („X-ray repair cross-complementing protein 6/5“) an beide offenen Doppelstrang-Enden und rekrutiert eine Proteinkinase mit dem Namen DNA-PKcs („DNA-dependent protein kinase catalytic subunit“), welche sich selbst und verschiedene weitere Proteine, darunter p53 phosphorylieren kann (67). Im nächsten Schritt bereiten zwei Komplexe die Enden auf ihre Ligation vor: der RAD50-MRE11- NBS1-Komplex und der XRCC4 („X-ray repair cross-complementing protein 4“)-DNA- Ligase-IV-Komplex. Ist dies geschehen, sorgt der XRCC4-DNA-Ligase-IV-Komplex ebenfalls für die Verbindung der nun prozessierten Endstücke (67). Das nicht-homologe End-Joining kann, anders als die Homologe Rekombination, mit Verlust von Genmaterial verbunden sein und ist somit ein potentieller Verursacher von Krebserkrankungen. Bei- spielsweise sollen 5-15% der im Gen TP53 beobachteten Mutationen durch fehlerhaftes NHEJ verursacht werden (77).
Die erfolgreiche Reparatur von DNA-Schäden ist folglich eine Verknüpfung hochkom- plexer Prozesse, welche die funktionierende Zusammenarbeit vieler Akteure voraussetzt.
Einer dieser Akteure ist das „Translationally Controlled Tumor Protein“ (TCTP), dessen kodierendes Gen im Rahmen dieser Arbeit gezielt untersucht wurde. Es ist an vielfachen intra- und extrazellulären Abläufen beteiligt und scheint auf vielen Ebenen der Zell-Ho- möostase eine wichtige Rolle zu spielen (78). Gerade während der letzten Jahre hat sich TCTP aufgrund der Vielfältigkeit seiner Funktionen zu einem Gegenstand intensiver For- schung entwickelt.
1.3 Das Gen TCTP und sein Protein
1.3.1 Charakterisierung von TCTP
Der Name „Translationally Controlled Tumor Protein“ wird sowohl für das kodierende Gen als auch für das resultierende Protein verwendet. Das Gen TCTP ist auf dem langen Arm des Chromosoms 13 in der Region 14 lokalisiert. Es besteht aus sechs Exons und ist somit ein recht kleines Gen. Neben TCTP wird das Gen außerdem TPT1 („Tumor protein, translationally controlled 1“) genannt (79). Die Transkription generiert zwei unterschied- lich lange mRNA-Abschnitte von ca. 0.8 und 1.2 kb Länge, welche in der Länge ihrer 3’UTRs („3’-Untranslated Regions“) differieren. Dies wird durch alternative Polyadeny- lierungsstellen ermöglicht. Beide mRNA-Transkripte sind in allen menschlichen Gewe- beformen präsent, wobei das kürzere Transkript in größerer Menge vorhanden ist als das längere Produkt. Die Funktion dieser doppelten Prozessierung ist noch ungeklärt (80,81).
Das Protein TCTP, auch unter den Namen Fortilin, p23 und HRF („Histamine releasing factor“) bekannt, besteht aus 172 Aminosäuren (82). Die Entdeckung dieses Proteins ist wohl der Gruppe Brawermann et al. zuzuschreiben, welche es im Jahre 1988 erstmals aus Mäusetumoren isolieren, allerdings noch keine Funktion belegen konnte (83). TCTP lässt sich in allen eukaryotischen Zellen sowohl im Cytosol als auch im Nucleus nachweisen, wobei der Nucleus den Hauptanteil des Proteins beherbergt (84). TCTP ist ein Protein, welches sich im Vergleich zu anderen als evolutionär hoch konserviert erweist: Zwischen dem humanen und dem tierischen Protein der Maus herrscht eine Übereinstimmung von 95%, während das menschliche und murine Protein Bcl-2 (B-cell lymphoma 2) nur zu
72% identisch ist (84). Das Gen TCTP lässt sich in nahezu allen Gewebearten des Men- schen nachweisen, wird allerdings in Leber, Dünndarm, Skelettmuskel und Niere ver- mehrt exprimiert (84). Interessanterweise gelang es jedoch mehreren Arbeitsgruppen nicht, das Protein TCTP in Nierengewebe zu zeigen, was für eine ausgeprägte Regulation der Expression spricht (80). Diese ist in tumorösen Zellverbänden im Vergleich zu ge- sundem Gewebe ebenfalls gesteigert, wobei diese Steigerung besonders bei Tumoren epithelialen Ursprungs beobachtet wurde (84).
Die Struktur TCTPs beinhaltet drei Alpha-Helices und zwei Beta-Faltblätter sowie eine kleine, sehr mobile und ungeordnete Region. Die Beta-Faltblätter bestehen aus insgesamt neun Beta-Strängen (85).
Abbildung 1.4: Tertiärstruktur des „Translationally Controlled Tumor Protein“(86)
Teile von TCTP ähneln strukturell anderen Proteinen. So erinnert es partiell an MSS4 („Probable phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinase“), ein Protein mit Chaperonfunk- tion. Die Ähnlichkeit der Strukturen von TCTP und MSS4 könnte auch auf Entsprechun- gen auf funktioneller Ebene hindeuten. Der Ort dieser Strukturhomologie ist gleichzeitig der am höchsten konservierte Teil des Proteins TCTP (87). Zwei der drei Alpha-Helices sind darüber hinaus den Alpha-Helices H5 und H6 des Bax-Proteins („Bcl-2-associated X protein“) sehr ähnlich. Dieses wird allerdings von TCTP inhibiert (85).
Die Aminosäuren 80-133 bilden eine Helix-Schleifen-Helix-Formation, die als Bin-
dungsdomäne fungiert und mit mehreren Bindungspartnern interagiert. Hierzu zählen Tu- bulin, Calcium, MDM2 („Mouse double minute 2 homolog“), die Na+-Ka+-ATPase (Nat- rium-Kalium-Adenosidtriphosphatase) und vermutlich auch p53 („Tumor Protein p53“) (88).
1.3.2 Regulation von TCTP
Die Proteinexpression wird sowohl auf transkriptioneller, als auch, wie der Name des Proteins andeutet, auf translationeller Ebene kontrolliert. Darüber hinaus kann auch das bereits synthetisierte Protein reguliert werden.
Es wurden bereits mehrere Promoter-Regionen am 5’-Ende des TCTP-Gens identifiziert.
So kann die Transkription von TCTP beispielsweise durch den CRE/CREB-Komplex („cAMP-response element / cAMP-response element binding protein“), welcher durch cAMP (Cyklisches Adenosinmonophosphat) phosphoryliert wird, aktiviert werden (81).
Auch die Bindung von CHD1L („chromodomain helicase/ATPase DNA binding protein 1-like“) an einen anderen Promoter hat einen positiven Einfluss auf die Transkriptions- rate. Viele chemische Agenzien können außerdem Einfluss auf die Transkription von TCTP nehmen und diese induzieren, so zum Beispiel Dioxine, Schwermetalle, Zytosta- tika wie Etoposid und Cisplatin, Phorbolester, Lipopolysaccharide und Calcium (88).
Auch Androgene können in Prostatakrebs-Zellen diesen Effekt haben(89). „Der Wächter des Genoms“ p53 kann jedoch die Transkription von TCTP unterbinden, indem er an einen eigenen Promotor bindet (88).
Auf translationeller Ebene findet ebenfalls eine starke Regulierung statt. Die mRNA von TCTP verfügt über Areale, die typisch für translationell kontrollierte Proteine sind. Am 5’-Ende findet sich ein Oligopyrimidin-Abschnitt (5’-TOR) und der ebenfalls dort gele- gene untranslatierte Bereich (5’-UTR) ist reich an Guanin und Cytosin. Diese Abschnitte können durch Methylierung die Translation aktivieren beziehungsweise deaktivieren.
Des Weiteren bildet die mRNA eine doppelsträngige Sekundärstruktur, wodurch sie zum potentiellen Bindungspartner der Proteinkinase R wird, die ebenfalls einen regulierenden Einfluss auf die Translation der mRNA haben könnte (90). Die PKR phosphoryliert und inaktiviert den Transkriptionsfaktor eIF2 („Eukaryotic Translation Initiation Factor 2“).
Die PKR selbst wird wiederum durch zellulären Stress wie erhöhte Calcium-Spiegel oder Serum-Entzug aktiviert (91). Außerdem wird die Transkription TCTPs durch eIF4E („Eu- karyotic Translation Initiation Factor 4E“) aktivierend reguliert. Bei eIF4E handelt es sich
um ein Molekül, welches analog zur PKR bevorzugt an mRNA mit Basenpaarung bindet.
Auch das Ribosomale Protein S6 (rpS6) kann die Transkription anregen. Die MicroRNA 27b (MiR-27b) wurde in Oralkarzinom-Zelllinien als Inhibitor der Translation von TCTP identifiziert (88).
Für das Protein TCTP sind bisher zwei direkte regulatorische Pfade bekannt: Zum einen interagiert das anti-apoptotische Protein Mcl-1 („Myeloid cell leukaemia 1 protein“) mit TCTP und stabilisiert es (92), zum anderen schützt hsp27 („heat shock protein 27“) TCTP vor dem Abbau durch Proteasomen (93). Tabelle 1.1 zeigt eine Zusammenfassung der oben genannten Faktoren der TCTP-Regulation.
Tabelle 1.1: Einflüsse auf die TCTP-Expression
Regulationsebene Positive Faktoren Negative Faktoren
Transkription CRE/CREB
CHD1L Dioxine Zytostatika Phorbolester Lipopolysaccharide
Calcium Androgene
P53
Translation eIF4E
rpS6
PKR Calcium Serum-Entzug
MiR-27b
Protein Mcl-1
hsp27
1.3.3 Funktion von TCTP Zellwachstum und –entwicklung
TCTP spielt eine nicht zu vernachlässigende Rolle in der embryonalen Entwicklung. Bei Experimenten mit TCTP-Knockout-Mäusen entstanden nicht lebensfähige Embryos, die bereits in utero verstarben. Man beobachtete bei diesen Embryos ein mangelhaftes Zell- wachstum und erhöhte Apoptoseraten (94). Durch die Herunterregulierung von TCTP bei Drosophila-Fliegen erreichten die Larven nur ein frühes Lebensstadium, bevor sie eben- falls zugrunde gingen. Auch hier wurden eine verminderte Zellgröße, -anzahl sowie Organgröße dokumentiert. Der Phänotyp der TCTP-insuffizienten Fliegen
ähnelte stark dem von Fliegen mit mutierten Rheb-Proteinen („Ras homolog enriched in brain“) (95). Diese Erkenntnisse sprechen für eine Beteiligung TCTPs an der mTOR- Kaskade („mechanistic target of Rapamycin“), da Rheb für diese essentiell ist. Anderer- seits gibt es Studien, die nahelegen, dass TCTP weder mit Rheb noch mit der mTOR- Kaskade interagiert (96,97). Der exakte Zusammenhang zwischen TCTP und diesem Sys- tem bleibt zu erforschen.
Zellzyklus
Die von TCTP ausgeübten Funktionen im Zellzyklus haben den Fortschritt desselben, Zellwachstum sowie Zellvermehrung zur Folge. Dies wird durch zahlreiche von TCTP eingegangene Bindungen ermöglicht. Eine davon ist die Anlagerung TCTPs an die intra- zelluläre Domäne der Na+-Ka+-ATPase (Natrium-Kalium-Adenosintriphosphatase) und die Freisetzung der Kinase SRC („Src proto-oncogene, non-receptor tyrosine kinase“), welche durch die Phosphorylierung von EGFR („epidermal growth factor receptor“) meh- rere Kaskaden einleitet. Hierzu zählen die PI3K/AKT (Phosphoinositol-3-Kinase/Pro- teinkinase B)-Kaskade, die MAP („Mitogen-activated protein“)-Kinase-Kaskade und die PLCγ(Phospholipase Cγ)-Pfade. Sie alle resultieren in Zellproliferation (88,98).
Außerdem bindet TCTP an Tubulin und während der Metaphase auch vorübergehend an die Mitosespindel (99). Hier agiert TCTP allerdings als ein Stabilisator der Mikrotubuli.
Um den Zellzyklus voranzutreiben, muss TCTP von PLK-1 (Polo-like Kinase 1) phos- phoryliert werden, sodass die Beweglichkeit der Mikrotubuli erhöht wird (99). Wird PLK-1 verstärkt exprimiert, wie es bei vielen Krebszellen der Fall ist, sorgt dies für eine verstärkte Phosphorylierung von TCTP und somit zu einem beschleunigten Ablauf des Zellzyklus (88), was wiederum zu der Weitergabe unvollständig synthetisierten Erbguts an Tochterzellen führen könnte. Aus diesen Tochterzellen kann dann potentiell ein ma- ligner Tumor entstehen (88).
Ein weiterer Bindungspartner von TCTP ist die E3 Ubiquitin-Protein Ligase CHFR („checkpoint with forkhead and ring finger domain“), welche eine entscheidende Kon- trollfunktion im Zellzyklus einnimmt. Der Komplex dieser beiden Proteine bleibt wäh- rend des gesamten Zellzyklus stabil und bindet an die Mitosespindel (100).
Apoptose
TCTP übt eine antiapoptotische Wirkung auf die Zelle aus. Analog zu seiner Rolle im Zellzyklus sind auch hier mehrere Protein-Interaktionen zu nennen.
Diese antiapoptotische Funktion lässt sich grob in zwei Bereiche teilen: Einerseits redu- ziert TCTP zelluläre Stressoren, die zur Apoptose führen könnten, andererseits nimmt es durch die Interaktion mit an Apoptoseprozessen beteiligten Proteinen Einfluss auf diese Abläufe (88).
Ein Calcium-Einstrom in die Zelle zählt zu den möglichen Apoptose-Induktoren. TCTP kann Ca2+ binden und somit den programmierten Zelltod verhindern. Die Arbeitsgruppe Graidist et al. fand heraus, dass Zellen mit einer TCTP-Mutante, welcher die Bindungs- fähigkeit an Ca2+ fehlt, einen Calciumeinstrom nicht überleben (101).
Auch Oxidativer Stress, verursacht durch freie Sauerstoff-Radikale („reactive oxygen species“, ROS), kann den Zelltod herbeiführen. Hier gibt es allerdings unterschiedliche Meinungen in Bezug auf die Rolle von TCTP bezüglich der ROS: Eine Studie aus dem Jahre 1997 fand eine hohe TCTP-Expression in Zellen, die oxidativen Stress überlebt hatten, was für eine protektive Wirkung TCTPs spricht (102). Auch in einer Fadenwurm- Spezies wurde 2007 eine antioxidative Funktion von TCTP gezeigt (103). Eine jüngere Arbeit von 2011 belegte wiederum, dass die Überexpression von TCTP die Bildung von ROS triggert (98). Die genaue Funktion TCTPs in Bezug auf ROS bleibt also unklar.
Ferner wird die Expression von TCTP durch unterschiedliche Faktoren gesteigert, wie in Kapitel 1.3.2 beschrieben. Hierzu gehören Zytostatika, Dioxine und andere Zellgifte.
Dies könnte auf eine schützende Wirkung TCTPs vor diesen Agenzien hinweisen (88).
Im Jahre 2009 identifizierte die Arbeitsgruppe Gnanasekar et al. TCTP als bis dahin un- bekanntes Hitzeschockprotein, das bei Temperaturanstiegen eine Chaperonfunktion über- nimmt und Strukturen vor der Denaturierung schützt. Im Falle einer erhöhten Zelltempe- ratur wird die TCTP-Expression deshalb ebenfalls gesteigert, um die Zelle vor dem durch Hitzeschock induzierten Zelltod zu bewahren (104).
McL-1 („myeloid cell leukemia protein 1“) und Bcl-xL („B-cell lymphoma-extra large“) sind zwei antiapoptotische Proteine, die an der Mitochondrienmembran lokalisiert sind.
TCTP bindet direkt an diese beiden Strukturen und scheint sie vor Degradation zu schüt- zen, beziehungsweise im Fall von Bcl-xL sogar zu aktivieren (78,105,106). Des Weiteren wird Bax („Bcl-2-associated X protein“), ein proapoptotisches Protein, von TCTP inhi- biert. Dies geschieht allerdings nicht durch direkte Bindung an Bax, sondern indem TCTP sich in die mitochondriale Membran einlagert und die Bildung von Bax-Dimeren blo- ckiert (85).
Das proapoptotische Protein p53 wird ebenfalls von TCTP inhibiert, sowohl auf direktem
Wege durch Unterdrückung der p53-Transkription und Destabilisierung des Proteins (78), als auch indirekt durch Stabilisierung des Proteins MDM2 (Mouse double minute 2 homolog), welches seinerseits die Ubiquitinierung von p53 vorantreibt (107).
Immunsystem und Entzündungsreaktion
Bereits im Jahre 1995 wurde die Funktion von TCTP als Zytokin von der Gruppe MacDo- nald et al. beschrieben. So kam TCTP zu seinem alternativen Namen „Histamin-releasing Factor“ (HRF). TCTP agiert unabhängig vom Endoplasmatischen Retikulum und Golgi- Apparat als extrazellulärer Botenstoff und sorgt für die Freisetzung von Histamin sowie die Produktion von Interleukin 4 und 13 in basophilen Granulozyten (108,109). Auch auf eosinophile Granulozyten nimmt TCTP Einfluss: Hier sorgt das Protein für eine ver- stärkte Sekretion des Interleukins 8 sowie in einigen Fällen für eine Calcium-Mobilisa- tion. B-Zellen werden durch TCTP ebenfalls stimuliert. Sie exprimieren daraufhin ver- mehrt Interleukin 1 und Interleukin 6 (110). Eine weitere Zellgruppe, die dem Einfluss von TCTP unterliegt, sind Bronchialepithelzellen. Sie werden durch TCTP zur vermehr- ten Ausschüttung von Interleukin 8 und GM-CSF („granulocyte–macrophage colony-sti- mulating factor“) angeregt (111). Schließlich wirkt TCTP stimulierend und instandhal- tend auf T-Zellen (88).
TCTP besitzt also auch abseits seiner Funktion im Zellinneren eine Wirkung als interzel- lulärer Mediator von Entzündungsreaktionen.
Nukleäres Reprogramming
Die umgekehrte Entwicklung reifer Zellen zu embryonalen Stammzellen ist seit Jahren Gegenstand intensiver Forschung, vor allem im Hinblick auf die vielversprechenden Möglichkeiten der Therapie fataler Krankheiten. Es wurden bereits mehrere für die nuk- leäre Neuprogammierung essentielle Proteine ermittelt, darunter OCT4 („octamer-bin- ding transcription factor 4“) und NANOG (nach „Tír na nÓg“, dem Land der ewigen Jugend in der keltischen Mythologie). TCTP wurde als aktivierender Bindungspartner dieser beiden Proteine identifiziert (112). Der Zusammenhang zwischen TCTP und OCT4 ist darüber hinaus interessant, da die OCT4-Konzentration in Krebszellen in direktem Zusammenhang mit ihrer Malignität steht. TCTP könnte also ebenfalls an dieser Deter- minierung beteiligt sein (113).
Strahlenbedingte DNA-Schäden und ihre Reparatur
Eine 2012 veröffentlichte Studie der Gruppe Zhang et al. fand heraus, dass das TCTP- Level in mit geringen Strahlendosen (0.2 cGy/h oder 6 cGy/min) bearbeiteten Zellen im Nucleus um das Sechsfache gesteigert war. Außerdem wurde belegt, dass TCTP sich an den Ort des DNA-Schadens begibt und dort mit mehreren an DNA-Reparaturmechanis- men beteiligten Proteinen kommuniziert: ATM und p53 sind zwei dieser Proteine. Sie beide sind wichtige Effektoren der genetischen Integrität. ATM scheint wiederum zusam- men mit DNA-PK („DNA-dependent protein kinase“) eine Rolle in der Expressionsstei- gerung von TCTP unter Bestrahlung zu spielen (114). Durch seine Aktivierung werden strahleninduzierte Zellzyklus-Kontrollpunkte moduliert. P53 hingegen sorgt für eine Ver- langsamung des Zellzyklus sowie eine potentielle Einleitung der Apoptose.
Auch Ku70/Ku80, das am Nicht-homologen End-Joining beteiligte Heterodimer, ist ein Bindungspartner von TCTP(114). Ebenso bindet TCTP unter Bestrahlung an Filamin A, welches die DNA-Reparatur durch Homologe Rekombination unterstützt (114). Mehrere Hitzeschock-Proteine sind ebenfalls strahleninduzierte Substrate von TCTP (114).
TCTP zeigt demnach unter ionisierender Strahlung ein gänzlich anderes Funktionsprofil als unter normalen Bedingungen. So agiert es im Gegensatz zum Regelfall als Partner von p53 und bremst die Zellvermehrung. Abbildung 1.5 illustriert diese Zusammenhänge.
Abbildung 1.5: Funktion von TCTP in Bezug auf DNA-Schäden und ihre Reparatur (114)1
1.3.4 TCTP und Brustkrebs
In vielen karzinomatösen Zellverbänden wurde eine verstärkte Expression von TCTP im Vergleich zu gesundem Gewebe festgestellt, unter anderem in Karzinomen der Organe Colon, Leber, Prostata, Haut und Rachen (88). Dies lässt sich vermutlich durch die Rolle TCTPs in der Zellproliferation und seine antagonistische Wirkung auf Faktoren erklären, welche wie p53 das Zellwachstum hemmen. Trotz gewisser chaperonähnlicher Funktio- nen begünstigt das antiapoptotische Protein TCTP wahrscheinlich die Entstehung von Krebs. Sein entzündungsfördernder Effekt könnte ebenfalls zur Tumorgenese beitragen, da Entzündungen ein relevanter Faktor derselben sind.
Was die Überexpression von TCTP betrifft, bilden die Tumoren der Brust keine Aus- nahme, im Gegenteil: Die Expressionsrate in Brustkrebsgewebe ist im Vergleich zu ge- sundem Brustgewebe um 60% gesteigert (115). Ferner korreliert die Überexpression po- sitiv mit der Tumorgröße, dem klinischen Stadium der Erkrankung, dem Lymphknoten- status und dem histologischen Differenzierungsgrad des Gewebes (115). TCTP ist also sowohl ein Marker für Brustkrebs als auch ein möglicher Prognosefaktor der Erkrankung.
Dieser Zusammenhang scheint stark durch die Interaktion von p53 und TCTP bedingt zu sein: Wird die durch TCTP bedingte Hemmung von p53 ausgeschaltet, kommt es zu ei- nem Anstieg der Expression von p53 und einer Abnahme der Anzahl von tumorösen Zel- len (116).
Eine weitere interessante Erkenntnis wurde 2002 von Tuynder et al. publiziert: Bei Zel- len, welche durch das Verfahren der Tumorreversion ihre malignen Eigenschaften abge- legt hatten, wurde eine verminderte TCTP-Expression festgestellt. Also versuchte man, durch Unterdrückung der Expression einen Verlust des malignen Phänotyps zu erreichen, was auch gelang. Dieselbe Gruppe konnte bereits beobachten, dass antihistaminerge Wirkstoffe den TCTP-Level senken und Krebszellen abtöten können (117,118). Hier er- geben sich möglicherweise weitreichende Konsequenzen für die Forschung in der Krebs- therapie.
1.4 Ziel der Arbeit
Die vorliegende Arbeit sollte der Untersuchung von Sequenzvarianten im Gen TCTP in einer Population von Brustkrebspatientinnen mit Kontakt zu ionisierender Strahlung die- nen.
