Varianten des Reparaturgens ATR beim bilateralen Mammakarzinom

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Aus der

Klinik für Frauenheilkunde und Geburtshilfe der Medizinischen Hochschule Hannover

Varianten des Reparaturgens ATR beim bilateralen Mammakarzinom

Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der

Medizinischen Hochschule Hannover

vorgelegt von

Hag Mi Kim-Schatte

aus Daegu (Südkorea)

Hannover 2009

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Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover Am 20.09.2010

Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover Präsident/Präsidentin:

Professor Dr. med. Dieter Bitter-Suermann

Betreuer/Betreuerin der Arbeit:

Professor Dr. med. Peter Hillemanns

Referent/Referentin:

Prof.’in Dr. med. Brigitte Schlegelberger

Korreferent(en) / Korreferentin(nen):

Prof. Dr. med. Michael Bremer

Tag der mündlichen Prüfung:

20.09.2010

Promotionsausschussmitglieder:

Prof. Dr. Reinhold Ernst Schmidt Prof. Dr. Anke Schwarz

Prof. Dr. Bettina Wedi

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Danksagung

Diese Arbeit wurde in den Jahren 2002-2009 in der Abteilung I für Frauenheilkunde und Geburtshilfe der Frauenklinik an der Medizinischen Hochschule Hannover angefertigt.

Ich möchte mich ganz herzlich bei allen bedanken, die zu dem Gelingen dieser Dissertation beigetragen haben.

Herrn Prof. Dr. Christof Sohn und Herrn Professor Dr. Peter Hillemanns möchte ich dafür danken, dass ich diese Arbeit unter ihrer Leitung der Abteilung anfertigen durfte.

Herrn Prof. Dr. Johann H. Karstens möchte ich für die Zusammenarbeit mit der Klinik für Radioonkologie und Strahlentherapie sowie ermöglichte Zugang zu allen notwendigen klinischen Daten für diese Arbeit danken. Ein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Michael Bremer sowie den Mitarbeitern und Mitarbeiterinnen der Klinik für das Zusammentragen der Patientenproben sowie die ausführliche Anamneseerhebung der Patientinnen.

Ein ganz besonderer Dank gilt Herrn Dr. Thilo Dörk-Bousset für die Überlassung dieses interessanten Dissertationsthemas und für die Betreuung dieser Arbeit. Sein fachkundlicher Rat, die hilfreichen Anregungen und Diskussionen haben sehr zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen.

Ferne möchte ich mich auch bei Frau Dr. Regina Waltes und Frau Dr. Natalia Bogdanova bedanken für wertvolle fachliche Diskussionen und bei Dr. Bogdanova auch für ihre Anregungen und Hilfe insbesondere bei der letzten Phase der Anfertigung dieser Arbeit.

Darüber hinaus möchte ich mich besonders herzlich bei allen Mitarbeitern und Mitarbeiterinnen des molekulargenetischen Labors der Abteilung I für Frauenheilkunde und Geburtshilfe für das nette und familiäre Arbeitsklima bedanken. Ein ganz spezieller Dank gilt Doktorandin Katrin Gerriets für die gute Zusammenarbeit und Diskussionsbereitschaft.

Noch ein Dank gilt Herrn Bernhard Vaske für die grosse Hilfe bei statistischen Auswertungen.

Abschließend möchte ich ganz herzlich Herrn Dr. Walter Schatte und seine Familie danken für die kontinuelle Unterstützung.

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Danksagung

………...

3 1. Einleitung

……….….

7

1.1. Einführung……….

7

1.2 Die Entwicklung des Krebses………....

7

1.3 Risikofaktoren von Brustkrebs………...

10

1.3.1 Einleitung………...

10

1.3.2. Genetische Risikofaktoren………

10

1.3.3 Hormonelle Faktoren………………

11

1.3.4 Weitere Risikofaktoren ……….………

12

1.4 Das bilaterale Mammakarzinom………

13

1.5 Genetische Ursachen von Mammakarzinom…… ……….…

14

1.5.1 Bekannte genetische Loci die eine Rolle in der Brustkrebsentwicklung zeigen… ……

14

1.5.2 Fehlerhafte Zelluläre Antwort auf DNA Doppelstrangbrüche als Krebsdispositions Faktor………… ………

15

1.5.2.1 Antwort auf DNA Doppelstrangbrüche als ein Teil des DNA-Reparatur Signalweges………...………

15

1.5.2.2 Die Signalwege, die zu Zellzyklus-Kontrollpunkten führen … ……….

17

1.5.3 Defekte in der DNA-Reparatur-Maschinerie und Brustkrebs ………

21

1.5.3.1 Ataxia-telangiectasia, ATM Mutationen und Mammakarzinom………

21

1.5.3.2 Mutationen in den MRE11-RAD50-NBN (MRN) Komplex, verknüpfte genomische Instabilitätssyndrome und Brustkrebsprädisposition………… ………..

22

1.5.4 Suche nach zusätzlichen Brustkrebs Prädispositionsgenen……… ……….

24

1.5.5 Zusätzliche Brustkrebs – Kandidaten - Gene die an der DNA Reparatur beteiligt sein können………...

25

1.6. ATR Mutationen und Seckel Syndrom ………..

27

1.6.1. Struktur und Funktion von ATR ………...

27

1.6.2. ATR Veränderungen beim Seckel Syndrom ……….

28

1.7. Ziele der Studie………

30 2. Material

………

31

2.1 Geräte ……….

31

2.2 Kleinmaterialien ……… ………..

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4.1.4.2 Sequenzierung des Abschnitts 16 ………..………

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94 Erklärung

……… ………

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1. Einleitung

1.1. Einführung

Krebs ist nicht lediglich eine der häufigsten Erkrankungen dieses Jahrhunderts sondern auch eine mit der höchsten Mortalitätsrate. Brustkrebs (medizinisch Mammakarzinom) ist der häufigste bösartige Tumor der Brustdrüse des Menschen. Er kommt hauptsächlich bei Frauen vor; nur etwa jeder hundertste Betroffene dieser Krebserkrankung ist männlich (Roubidoux und Patterson 2005).

In den westlichen Staaten ist Brustkrebs die häufigste Krebsart bei Frauen und verursacht auch die meisten Krebstodesfälle in der weiblichen Bevölkerung. Es gibt sowohl erbliche als auch erworbene Risikofaktoren; die meisten Erkrankungen sind jedoch sporadisch (zufällig). Nach Angaben des deutschen statistischen Bundesamtes (DSB, Pressemitteilung am 02. März 2006) starben im Jahr 2004 17590 Frauen an Brustkrebs. Diese Zahl entspricht 4% aller Todesfälle bei Frauen und mit 17% gehört Brustkrebs zu den häufigsten Krebstodesursachen. Laut DSB stiegen seit 1985 die durch Brustkrebs bedingten Todesfälle um 8%. Allerdings ergibt sich dieser Anstieg aus der Zunahme der älteren weiblichen Bevölkerung. Durch Ausrechnung des Alterungseffektes verringert sich die Zahl der durch Brustkrebs verstorbenen Frauen von 40 auf 37 je 100 000. In der europäischen Union erkrankt jährlich jede neunte Frau an Brustkrebs (Europäisches Parlament, Karin Jöns: Brustkrebs in der Europäischen Union(2002/2279(INI)) ferner schwankt laut den Angaben der WHO die Mortalitätsrate um über 50% (WHO und "Surgical approaches to Early Breast Cancer", International Collaborative Cancer Group, London).

Angesichts dieser Zahlen, die die Zunahme von Mammakarzinom dokumentieren, wird die ernorme Relevanz weiterer Forschungen zu diesem Thema deutlich. Das Ziel solcher Arbeiten ist es, die Risikofaktoren und Zusammenhänge besser zu verstehen und auf diesem Wege therapeutisch gezielter und sogar eventuell präventiv tätig werden zu können.

1.2 Die Entwicklung des Krebses

Krebs ist eine genetische Krankheit, die aus der Anhäufung von Veränderungen/Mutationen in Genen entsteht, die Zellproliferation, Entwicklung und Differenzierung regeln. Der Krebs- Zellphänotyp kann durch sechs Eigenschaften beschrieben werden: Die Unabhängigkeit von Wachstumssignalen, keine Antwort auf wachstumshemmende Signale, Aufhebung des programmierten Zelltodes, grenzenloses replikatives Potenzial, verstärkte Angiogenesis, Gewebeinvasion und Metastasierung (Hanahan und Weinberg 2000). Allgemein wird vermutet, dass drei bis sieben aufeinander folgende Veränderungen für die bösartige Konvertierung erforderlich sind (Müller 1980; Weinberg 1989; Vogelstein und Kinzler 1993). Man schätzt, dass

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spontane Mutagenese ungefähr 25000 Basen pro menschlichem Erbgut pro Zelle pro Tag aus den 3 x 10^-9 Basenpaaren im Genom verändert. Jedoch sind die Zellen mit spezifischen Mechanismen ausgestattet, um den Schaden zu reparieren/zu ersetzen und um Veränderungen/Mutationen auf angemessenem Niveau zu halten. Folglich kann die Mutations-Last zu jeder vorgegebenen Zeit sowohl in der Keimbahn als auch in somatischen Zellen als das Ergebnis des dynamischen Gleichgewichts zwischen dem Ausmaß des DNA-Schadens und der Leistungsfähigkeit der DNA- Reparatur angesehen werden (Friedberg 2001). In Anbetracht der normalen Mutationsrate, normalerweise 1.4 x 10^-10 Veränderungen/Mutationen pro Basenpaar pro Zellgeneration, ist die Wahrscheinlichkeit, dass eine einzelne Zelle genug unabhängige für die bösartige Transformation erforderliche Veränderungen/Mutationen erwerben wird, sehr niedrig (Loeb 1991). Jedoch ist darauf hingewiesen worden, dass es zwei Hauptmechanismen gibt, die die Reihe von Krebs fördernden Veränderungen wahrscheinlicher machen. Dies sind Mutationen, die die Zellproliferation erhöhen (Novel 1976) und Veränderungen der Stabilität des kompletten Genoms, entweder an der DNA oder auf chromosomaler Ebene, und dadurch die gesamte Mutationsrate vergrößernd (Loeb 1991, Loeb 1994).

Die meisten für die Entwicklung der Bösartigkeit verantwortlichen Gene fallen in zwei Hauptkategorien: Proto-Onkogene und Tumorsuppressor-Gene (Weinberg 1996). Unter normalen Zuständen stimulieren Proto-Onkogene Zellproliferation und Differenzierung. Ihre Protein- Produkte werden an verschiedenen Signal Kaskaden beteiligt und schließen Wachstumsfaktoren, Wachstumsfaktor-Empfänger, Signalwandler und andere Faktoren ein. Unpassende oder unkontrollierte Aktivierung kann sie in krebsverursachende Onkogene verwandeln, und diese Funktionsveränderung in einem einzelnen Allel kann sogar einer Zelle einen Wachstumsvorteil verschaffen. Umgekehrt gilt dies für Tumorsuppressor-Gene, deren Verlust oder Funktionsverlust die Bösartigkeit fördert (Frank 2001, Cavenee und White 1995). Diese sind gewöhnlich negative Regler des Wachstums oder anderer Zellfunktionen, die angreifendes und metastatisches Potenzial betreffen können (Osborne u. a. 2004). Die Tumorsuppressor-Gene können noch weiter in zwei Klassen gemäß ihrer Funktion unterteilt werden. „Gatekeepers“ handeln direkt, um Zellproliferation zu regeln, wohingegen „Caretakers“ die Integrität des Genoms aufrechterhalten und Tumorwachstum indirekt fördern, indem sie eine erhöhte Mutationsrate verursachen (Kinzler und Vogelstein 1997).

Der Beitrag von Tumorsuppressoren in der Tumorgenesis wurde von Alfred Knudson beschrieben und vorgeschlagen (1971) und basierte auf epidemiologischen Studien von Rethinoblastom am Anfang. Gemäß dem "Zwei-Erfolge-"-Modell („Two-hit“ model) von Knudson (Abbildung 1.1) müssen beide Kopien des verantwortlichen Tumorsuppressor-Genes für die Krebs-Bildung inaktiviert sein. In der Familienform der Krankheit wird das veränderte Allel von einem der Eltern geerbt, und das zweite somatisch inaktiviert (Knudson 1971). Herkömmlich ist der zweite „hit“

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häufig mit einer großen „Deletion“ verbunden, die als Verlust von Heterozygosity (LOH) in dem Tumor bezeichnet werden kann.

Sporadischer Krebs

Normale Chromosomen Inaktivierung eines Alleles Inaktivierung beider Allele

Hereditärer Krebs

Normale Zelle Zelle prädisponiert zum Krebs

Inaktivierung eines Alleles Inaktivierung beider Allele

Abbildung 1.1 „Two – hit“ Modell der Tumorgenese, Knudson (1971). Dieses Modell weist darauf hin, dass sich Krebs durch den Verlust der Funktion von beiden Allelen eines Tumorsuppressorgens entwickelt.

Sporadischer Krebs beginnt mit zwei normalen Kopien eines Krebs-Prädispositionsgens, und für die Entwicklung des Krebses sind zwei aufeinander folgende Ereignisse notwendig. Dies sind die Mutationen ("two hits") in der einzelnen Zelle an jedem Allel. Dieser Prozess verlangt Zeit und kommt einmal in einer einzelnen Zelle vor. In geerbten Formen des Krebses gibt es einen Verlust eines Allels in jeder Zelle, weil ein „hit“ an diesen genetischen Loci schon vorhangen ist. Der Verlust des restlichen Allels (Verlust von Heterozygosity, „loss of heterozygosity“, LOH), oder der zweite „hit“, kann infolge eines Umweltfaktors oder zufällig während der DNA-Replikation vorkommen. Dieses Modell von Tumorgenesis kann sich gut anpassen an Tumorsupressor-Gene und DNA-Reparatur-Gene.

Das Modell von Knudson ist später ebenso auf andere Formen des Familienkrebses angewandt worden. Ein Verlust der Funktion in Tumorsuppressor-Genen kann nicht nur durch die rezessive

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Mutationen stattfinden (Ponder 1988), neue Beweise weisen darauf hin, dass die Inaktivierung oder der Verlust der Funktion in Tumorsuppressor-Genen auch bei Haploinsuffizienz vorkommen kann (Cook und McCaw 2000). Das zeigt an, dass nicht nur biallele Inaktivierung vom Tumorsuppressor-Gen sondern auch eine Wirkung der „Gen-Dosierung“ genügend sein kann, um einen Zellphänotyp auszuüben, der zur Tumorgenesis führt. Besonders Haploinsuffizienz, wie gedacht wird, beeinflusst „caretaker“ Gene, diese führt zu Defekten, welche zur genomischen Instabilität, und so zur beschleunigten Konvertierung einer normalen Zelle in eine neoplastische Zelle führen (Fodde und Smits 2002).

1.3 Risikofaktoren für Brustkrebs 1.3.1 Einleitung

Brustkrebs ist der häufigste Krebs von Frauen in Westländern: 22 % der weiblichen Krebsarten (Parkin u. a. 2001). Das Risiko eines Brustkrebses nimmt mit dem Alter zu, sich ungefähr alle zehn Jahre bis zum Klimakterium verdoppelnd, danach verlangsamt sich die Rate der Zunahme deutlich (McPherson u. a. 2000). Die Ursachen des Brustkrebses sind multifaktoriell, und es gibt einen starken Zusammenhang zwischen genetischen und Umweltfaktoren. Der bedeutendste einzelne Risikofaktor für Brustkrebs ist die Familiengeschichte. Andere wichtige Risikodeterminanten sind mehrere reproduktive und hormonale Faktoren, wie frühes Eintreten der Menarche, Nullparity, und spätes Eintreten ins Klimakterium (Couch und Weber 1998), die ein hormonales Muster von hohen endogenen Östrogenen widerspiegeln. Zusätzliche Risikofaktoren sind vorherige nicht bösartige Brusterkrankungen und ionisierende Strahlung (IS); insbesondere, wenn Aussetzung der Brustbildung in der Phase der Pubertät vorkommt, sowie postmenopausales Übergewicht, Alkohol- Missbrauch, eine fettreiche Diät, Verwendung eines oralen Verhütungsmittels und Östrogen- Ersatztherapie (McPherson u. a. 2000; Hulka und Moorman 2001). Nicht zu unterschätzen ist die Rolle von genetischen Faktoren, die auch in Zusammenhang mit Umweltfaktoren für die Entwicklung von manchen Mammakarzinomen verantwortlich sein können.

Zusammenfassend: Risikofaktoren, die zur Entwicklung von Brustkrebs führen, können solche wie Genetische -, Hormonelle -, Umwelt- und Lebensstil Faktoren und andere einschließen.

1.3.2. Genetische Risikofaktoren

Etwa 5% der Brustkrebserkrankungen sind erblich bedingt. (Deutsche Krebsgesellschaft:

Patientinneninformation, 5.6.07 „Familiäre Vorbelastung“) Nur bei einer kleinen Gruppe von Frauen (etwa 1 pro 500) findet man definierte, krankheitsverursachende Mutationen. Wesentlich

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häufiger sind genetische Veränderungen, die die Suszeptibilität (Empfänglichkeit) für Brustkrebs erhöhen.

Die höchste Wahrscheinlichkeit, an der erblichen Form des Brustkrebses zu erkranken, besteht bei Frauen mit Mutation in den so genannten Breast Cancer Susceptibility Genes (Brustkrebs Genen) BRCA1 und BRCA2. Es kommt bereits bei einer Mutation in einem Allel dieser Gene zur Erkrankung (man spricht von so genannten Proto-Onkogenen mit autosomal-dominantem Erbgang).

Die Wahrscheinlichkeit, im Laufe des Lebens an Brustkrebs zu erkranken, wird mit 65% für BRCA1 beziehungsweise 45% für BRCA2 Mutationsträger angegeben (Antoniou u. a. 2003).

Weitere Genveränderungen mit hohem Risiko betreffen zum Beispiel Mutationen von PTEN (Cowden-Syndrom), STK11 (Peutz-Jeghers-Syndrom) Genen, deren Häufigkeit und Risiko für die Brustkrebserkrankung ist jedoch nicht genau bekannt (siehe auch Kapitel 1.5). Mäßig erhöht ist das Risiko bei den seltenen genetischen Veränderungen mit mittlerer Penetranz, diese betreffen unter anderem die folgenden Gene: ATM (Ataxia teleangiectatica), CHEK2 (checkpoint - Kontrollpunkt kinase 2), NBN (Nijmegen Breakage Syndrom), PALB2 (partner and colocalizer of BRCA2) und BRIP1 (BRCA1 interaction partner) (Stratton und Rahman 2008). Insgesamt gehen nicht mehr als 5% der Brustkrebserkrankungen auf diese Genveränderungen mit hohem oder mittlerem Risiko zurück (Schmutzler und Meindl 2007).

Die wesentlich häufigeren Allelveränderungen mit geringer Penetranz erhöhen das Brustkrebsrisiko höchstens auf das 1,25-fache bei heterozygoten Veränderungen und auf das 1,65-fache bei homozygoten Veränderungen. Dazu gehört zum Beispiel insbesondere die Veränderung von FGFR2 (fibroblast growth factor receptor 2) und anderen Loci (sehe auch Kapitel 1.5). Es wird geschätzt, dass solche Mutationen mit geringer Penetranz bei 58 % der Brustkrebserkrankungen eine Rolle spielen (Hemminki u. a. 2008).

1.3.3 Hormonelle Faktoren

Weibliche Körperzellen, auch die Tumorzellen, tragen Rezeptoren für die Sexualhormone Östrogen und Progesteron. Viele Mammakarzinome werden in ihrem Wachstum durch diese Hormone beeinflusst. Östrogen- und Progesteronhaltige Medikamente gegen Wechseljahresbeschwerden (Hormonersatztherapie) erhöhen das Erkrankungsrisiko um bis zu 45% (Siegmund-Schultze u. a.

2008). Auch Frauen mit früher Menarche und später Menopause tragen ein etwas höheres Erkrankungsrisiko. Kinderlose Frauen erkranken um etwa 30% häufiger (Women’s Health Initiative, zitiert nach Gyn online, 4.6.07). Frauen, die früh Kinder bekommen und lange stillen, haben hingegen ein niedrigeres Risiko.

Ob die Antibabypille das Risiko erhöht, ist substanz- und dosisabhängig und daher nicht vollständig geklärt. Die „Nurses' Health Study“ und weitere Studien haben eine Erhöhung des Risikos auf das

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1,2- bis 1,4- fache nach einer Einnahme der „Pille“ über mehr als fünf Jahre gezeigt.

Schwangerschaftsabbrüche erhöhen das Brustkrebsrisiko einer Metaanalyse aus dem Jahr 2004 zufolge nicht (V. Beral u. a. 2004). Auch in anderen Studien mit hohen Fallzahlen konnte man einen solchen Zusammenhang nicht nachweisen (Brewster u. a. 2005, Paoletti und Clavel-Chapelon 2003, Reeves u. a. 2006).

Phytoöstrogene sind Pflanzeninhaltsstoffe mit schwach östrogenartiger Wirkung. Ob Diäten, die reich an solchen Stoffen sind (etwa auf Sojabasis) das Erkrankungsrisiko erhöhen oder im Gegenteil durch Interaktion mit der körpereigenen Hormonproduktion senken, ist noch unbekannt, da die Ergebnisse der wissenschaftlichen Untersuchungen widersprüchlich sind (Rice und Whitehead 2006).

1.3.4 Weitere Risikofaktoren

Die Exposition mit ionisierender Strahlung in jungen Jahren erhöht das spätere Brustkrebsrisiko (Nekolla 2004). Mammographie-Untersuchungen bei Frauen über 40 Jahren führen zu keiner bedeutsamen Risikosteigerung mehr (Mettler u. a. 1996, Nekolla u. a. 2008).

Auch die Lebensweise beeinflusst das Risiko. So erkranken adipöse Frauen 2,5- mal häufiger als Normalgewichtige (Women’s Health Initiative, zitiert nach Gyn online, 4.6.07). Starkes und langjähriges Zigarettenrauchen erhöht die Erkrankungswahrscheinlichkeit um 30% (Reynolds u. a.

2004). Auch Frauen, die täglich mindestens 20 g Alkohol trinken, haben ein um 30% erhöhtes Mammakarzinomrisiko, möglicherweise wegen des höheren Sexualhormonspiegels (Women’s Health Initiative, zitiert nach Gyne online, 4.6.07). Ein weiterer möglicher Risikofaktor könnte Sonnen- bzw. Vitamin-D-Mangel sein. Dieser Zusammenhang wird auch für Prostatakrebs, Dickdarmkrebs, Ovarialkrebs, Melanome und Blasenkrebs vermutet (Medical Tribune 2007). Wenn ältere (postmenopausale) Frauen zur Vorbeugung von Knochenbrüchen Calcium und Vitamin D einnehmen, scheint das Erkrankungsrisiko stark zu sinken (Lappe u. a. 2007).

Ungefähr 95 % von bösartigen Brusttumoren sind Karzinome, die aus dem Epithel der Milchdrüse entstehen. Die Transformation geht normalerweise durch mehrere Stufen weiter. Normales Brustepithelium verwandelt sich zuerst zu atypischer Hyperplasie und Krebs in situ. Schließlich entwickeln sich die bösartigen Zellen in dem angreifenden Krebstumor zu Zellen mit dem metastatischem Potenzial (Couch und Weber 1998). Die Mehrheit des Brustkrebses ist ductal (70

%) oder lobulär (ungefähr 6 %). Seltene Histologische Subtypen sind: medullär, mucinös, papillär und tubulär, sowie die Krankheit von Paget (Berg und Hutter 1995). Die Prognose von Brustkrebs- Patienten hängt größtenteils von dem klinischen Stadium zur Zeit der Diagnose ab. Die fünfjährige Überlebensrate für Patienten mit der lokalisierten Krankheit ist 93 %, für Patienten mit Regionalmetastasen 69%, und für Patienten mit entfernten Metastasen 22 % (Dickman u. a. 1999).

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1.4 Das bilaterale Mammakarzinom

Unter bilateralem Brustkrebs versteht man das Auftreten von zwei unabhängigen Malignomen in beiden Brüsten. Das bilaterale Mammakarzinom kann simultan oder sukzedan auftreten; es kann metastatisch bedingt sein oder einem echten Zweitkarzinom entsprechen. Diesbezüglich nimmt der bilaterale Brustkrebs eine Sonderstellung ein. Verschiedenen Studien zufolge ist das aber eine seltene klinische Form, die nur bei 2-8 % aller Brustkrebspatientinnen auftritt (Healey u. a. 1993, Mose u. a. 1995). Wenn zwischen beiden Tumorereignissen weniger als sechs Monate liegen, spricht man von einem synchronen Mammakarzinom. Bilateraler Tumor der in Abstand von mehr als sechs Monaten folgt, bezeichnet man als metachrones Mammakarzinom. Statistisch gesehen beträgt der Anteil an synchronen Mammakarzinomen ca. 25-40 % und an metachronen ca. 60-75 % aller bilateralen Fälle (Mose u. a. 1995, Maculotti u. a. 1996).

Entstehungsursachen eines bilateralen Mammakarzinoms entsprechen prinzipiell den Risikofaktoren der Gesamtheit aller Mammakarzinome. Besonders das junge Alter bei Erstdiagnose eines Mammakarzinoms sowie positive Familienanamnese sind die Prädispositionsfaktoren für die Entwicklung von bilateralem Brustkrebs (Chen u. a. 1999). Daraus folgend wird an eine genetische Ursache gedacht (Anderson 1971; Knudson, 1971).

Mutationen in BRCA1- und BRCA2- Genen prädisponieren ihre Trägerinnen zu einem deutlich erhöhten Lebenszeitrisiko an einem kontralateralen Brustkrebs zu erkranken und sind von Bedeutung für familiären Brustkrebs (Ford u. a. 1994, Easton u. a. 1995 und 2004). Andere Studien jedoch konnten keinen klaren, signifikanten Zusammenhang zwischen BRCA1/BRCA2-Mutationen und dem bilateralen Mammakarzinom in Assoziationsstudien nachweisen (Papelard u. a. 2000, Steinmann u. a. 2001). Obwohl der proportionale Anteil an BRCA1-/BRCA2-Mutationsträgerinnen unter bilateralen Brustkrebspatientinnen höher ist als bei sporadischen Brustkrebsfällen (Bergthorsson u. a. 2001, Steinmann u. a. 2001), haben jedoch die meisten bilateral betroffenen Brustkrebspatientinnen keine BRCA1- oder BRCA2- Mutation. Auf der Suche nach weiteren genetischen Prädispositionen werden in letzter Zeit bei der Entstehung sowohl des unilateralen als auch des bilateralen Mammakarzinoms auch Polymorphismen in verschiedenen Genen in Betracht gezogen.

Außerdem könnte die Prävalenz des beidseitigen Mammakarzinoms mit zurückgehender Mortalität noch zunehmen. Patientinnen mit kontralateralem Mammakarzinom weisen eine erhöhte Disposition für strahleninduzierte Chromosomenbrüche auf (Buchholz und Wu 2001).

Zwillingsstudien haben eine genetische Prädisposition für die Entwicklung eines bilateralen Mammakarzinoms nachgewiesen (Peto und Mack 2000).

Weil familiärer und bilateraler Brustkrebs Ähnlichkeiten dahingehend aufweisen, was frühes Erkrankungsalter und Mutationen in BRCA1/BRCA2 betrifft, kann man annehmen, dass Studien von

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Kollektiven mit bilateralem Brustkrebs ähnlich solchen mit hohem familiärem Risiko des Mammakarzinoms sein dürften, was die statistische Aussage einer Fall-Kontroll-Studie erhöhen könnte. Diese These lag meiner Arbeit zugrunde (Skasko u. a. 2009).

1.5 Genetische Ursachen für Mammakarzinom

1.5.1 Bekannte genetische Loci die eine Rolle in der Brustkrebsentwicklung zeigen

Der größte Teil des Brustkrebses entsteht ohne offenbare Familiengeschichte der Krankheit. Jedoch in etwa 5-7 % aller Fälle wird eine geerbte Geneigtheit vorgeschlagen (Claus u. a. 1996). BRCA1 (Miki u. a. 1994) und BRCA2 (Wooster u. a. 1995) sind die wichtigsten Hoch-Penetranz Brustkrebs- Prädispositionsgene. Das durchschnittliche kumulative Risiko im Alter von 70 Jahren ist ca. 65 % für BRCA1 Mutationsträger und ca. 45 % für BRCA2 Mutationsträger. Während der primäre Tumor-Typ der mit Mutationen in beiden Genen assoziiert wird Brustkrebs ist, sind Gen-Defekte von BRCA1/BRCA2 auch für Eierstockkrebs verantwortlich: mit kumulativen Risiken von ca. 39 % für BRCA1 Mutationsträger und ca. 11 % für BRCA2 Mutationsträger (Antoniou u. a. 2003).

Zusätzlich sind BRCA2 Mutationen mit hohem Risiko für männlichen Brustkrebs verbunden (Thorlacius u. a. 1995). Andere Krebsarten, die mit Mutationen in diesen Genen korreliert werden, sind Prostata- und Bauchspeicheldrüsenkrebs für BRCA2 (Breast Cancer Linkage Consortium 1999) und Prostata- und Darmkrebs für BRCA1 (Ford u. a. 1994). Große Assoziationsstudien zeigen an, dass nur 15-20% des gesamten Familienbrustkrebses mit Mutationen in diesen Genen (Anglian Brustkrebs-Arbeitsgruppe 2000) verknüpft sind. Ein kleiner Anteil der Familienbrustkrebs-Fälle wird auch durch Mutationen in anderen bekannten Krebs-Prädispositionsgenen verursacht, einschließlich p53 (Malkin u. a. 1990), PTEN (Nelen u. a. 1996), LKB1 (Boardman u. a. 1998), BLM (German 1993, Gruber u. a. 2002), MSH2 und MLH1 (Cohen u. a. 1991). Jedoch haben die Mutationen in diesen Genen selten ein höheres Risiko für Brustkrebs und hauptsächlich im Zusammenhang mit definierten Familienkrebs-Syndromen, wie Li-Fraumeni Syndrom, die Krankheit von Cowden, Peutz-Jeghers Syndrom, Bloom Syndrom und Muir-Torre Syndrom. In Brustkrebs-Patienten ohne andere Eigenschaften dieser Syndrome werden diese selten gesehen (Börresen u. a. 1992, Tsou u. a. 1997, FitzGerald u. a. 1998, Bignell u. a. 1998, Huusko u. a. 1999, Rapakko u. a. 2001). Weil Mutationen in den beschriebenen Genen nur einen Bruchteil von Familienfällen erklären, wurde die Hypothese aufgestellt, dass andere Gene mit weniger Penetranz den Rest genetisch prädisponierten Brustkrebses erklären könnten (Nathanson und Weber 2001, Pharoah u. a. 2002). Neue Daten aus den letzten Jahren zeigen, dass Heterozygote von ATM Mutationen, das Gen welches in der Ataxia-telangiectasia (AT) mutiert ist, ein erhöhtes Risiko für Brustkrebs haben (Easton 1994, Olsen u. a. 2001, Renwick u. a. 2006, Bogdanova u. a. 2008). Es gibt eine deutliche Überlappung des klinischen Phänotyps von AT und NBS (Nijmegen Breakage

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Syndrom) - andere Syndrome mit genomischer Instabilität und einer Prädisposition für Krebs, obwohl jede Krankheit auch ihre einzigartigen Kennzeichen hat (Chrzanowska u. a. 1995, Seemanova u. a. 1990, van der Burgt u. a. 1996, Weemaes u. a. 1994). NBS hat mit Blick auf die strahlenresistente DNA-Synthese (fehlerhafter Arrest der DNA-Synthese nach ionisierender Strahlung) eine nahezu vollständige Übereinstimmung mit dem AT Syndrom. Mutationen in NBN (NBS1) Gen sind auch als mit dem Brustkrebs assoziiert aufgezeigt (Gorski u. a. 2003 und 2005, Bogdanova u. a. 2008). Außerdem sind Mutationen in CHEK2 (Kontrollpunkt kinase 2) (The CHEK2-Breast Cancer Consortium 2002, Cybulski u. a.2004 und 2006, Bogdanova u. a. 2005 und 2007), BRIP1 (BRCA1-Interakzionspartner) und PALB2 (für den 'Partner und Localizer von BRCA2') mit Brustkrebs assoziiert worden (Rahman u. a. 2007, Erkko u. a. 2007). Die Protein- Produkte aller dieser Gene und vieler anderen fungieren in einem komplizierten Signalnetz, das als Antwort auf den DNA-Schaden - DNA Doppelstrangbrüche (DSB) - aktiviert wird. Mehrere Studien wiesen darauf hin, dass Verbindungen zwischen unvollständiger Reparatur von DSBn und genetischer Prädisposition zu Brustkrebs bestehen, und dass die Produkte von BRCA1 und BRCA2 auf diesem allgemeinen biochemischen Weg fungieren, ein Hauptargument ist ((Parshad und Sanford 2001, Speit und Trenz 2004). Dennoch, selbst wenn die Effekte aller oben erwähnten Gene zusammen genommen werden, so erklären sie nur 20-25% des Familienbrustkrebses und einen sehr kleinen Anteil von allen Brustkrebsarten. Zweifellos bestehen wirklich zusätzliche Brustkrebs- Prädispositionsgene. Auf der Suche nach weiteren Niedrig-Penetranz Genen, die mit dem Brustkrebs assoziiert sind, werden große Assoziationsstudien derzeit weltweit geführt. Es wird die Hypothese aufgestellt, dass das Lebensrisiko für Brustkrebs durch Varianten und vielleicht ihre Kombinationen in vielen anderen Genen abgestimmt wird, von denen mehrere an der Antwort der Zellen auf DNA-Schaden teilnehmen können.

1.5.2 Fehlerhafte Zelluläre Antwort auf DNA-Doppelstrangbrüche als Krebsdispositions-Faktor 1.5.2.1 Antwort auf DNA Doppelstrangbrüche als ein Teil des DNA-Reparatur Signalweges

Die genomische Integrität der Zelle wird aufrechterhalten, indem DNA Schäden, die sowohl durch endogene als auch umweltbedingte DNA zerstörende Einflüsse verursacht werden, kontrolliert und repariert werden. Eine Unfähigkeit, richtig auf den DNA-Schaden zu antworten, führt zu genetischer Instabilität, was eine der Hauptursachen ist, die Anfang und Fortschritt der Tumorgenese steuern (Khanna und Jackson 2001, Hoejimakers 2001). Im Allgemeinen prädisponieren geerbte Defekte auf dem DNA – Schaden – Signal - und Reparatur – Wege für die Krebsentwicklung. Beispiele von Familienkrebs-Syndromen, die durch Defekte in diesen Prozessen verursacht sind, werden in Tabelle 1 präsentiert. Diese entweder dominant oder rezessiv geerbten Syndrome sind vertreten durch einzelne Hauptgendefekte, die den Krebs verursachen.

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Kein einzelner Reparatur-Weg kann mit allen Arten des Schadens fertig werden; vielfach verwobene DNA-Reparatur-Systeme (Netze) sind erforderlich. Mindestens vier Hauptmechanismen auf dem – DNA – Schaden – Reparatur - Wege funktionieren in Mammalia. Diese sind die Nukleotid Ausschneidungsreparatur (nucleotide-excision repair – NER) einschließlich der globalen Genom-Reparatur (global genome repair – GGR) und die Transkriptions-verbundene Reparatur (transcription-coupled repair – TCR), die Reparatur durch Basen- Ausschneidung (base-excision repair – BER), die Fehlpaarungsreparatur („mismatch repair“ – MMR) und die so genannte illegitime Rekombinations-Reparatur, die die homologe Rekombination (homologous recombination – HR) und die nicht homologe End-zu-End-Verknüpfung („non-homologous end-joining“ – NHEJ) einschließen (Hoejimakers 2001; Pierce u. a. 2001). Jedoch, statt der Bewertung der verschiedenen DNA Reparatur Mechanismen als getrennte Prozesse, sollten sie als komplexe Netzwerke betrachtet werden, die von einem größeren Pool von Proteinen, die mit DNA interagieren, kontrolliert sind. Diese besonderen Komplexe bilden sich gemäß den spezifischen Stimuli, die durch beschädigte DNA oder ungewöhnliche DNA-Konformationen bestimmt sind (Cleaver u. a. 2001). Die Bildung der Komplexe ändert sich wahrscheinlich dynamisch während des Zellzyklus, wo verschiedene Mehrprotein-Komplexe als Antwort auf verschiedene Stimuli geschaffen und „auseinander genommen“ werden können (Abraham 2001). Ein solcher Komplex ist BASC (BRCA1 assoziierter Genom-Kontroll-Komplex), wo, wie man gefunden hat, BRCA1 mit mehreren Tumorsupressor - Proteinen, DNA-Schaden-Sensoren und Signal - Proteinen einschließlich ATM, ATR, MRE11 Komplexe, Replikationsfaktor C, BLM, MSH2, MSH6 und MLH1 interagiert. Die Mitglieder von BASC haben Rollen als Anerkennung für anomale DNA- Strukturen oder beschädigte DNA, und mehrere dieser Proteine nehmen an der DNA Reparatur teil.

So koordiniert BRCA1 vielfache Tätigkeiten, die für die Wartung der genomischen Integrität und in der DNA-Reparatur erforderlich sind (Wang u. a. 2000).

Obwohl sich die Reparatur von verschiedenen Typen des DNA-Schadens auf verschiedene Sätze von Proteinen verlässt, lösen die verschiedenen Formen des DNA-Schadens einen allgemeinen Signalweg aus. Eine wichtige Eigenschaft dieser DNA-Schaden-Antwort ist das Verlangsamen oder der Stop des Zellzyklus an G1, S und G2 Kontrollpunkten (Zhou und Elledge 2000). Ein anderer Aspekt schließt Änderungen in der Chromatin Struktur an der Seite des Schadens und die Transkriptionale Induktion und Posttranslationsmodifizierung von verschiedenen an der DNA- Reparatur beteiligten Proteinen ein. Wechselweise, wenn der Schaden zu stark ist, um repariert zu werden, kann die Zelle zur Apoptose weitergeleitet werden (Rouse und Jackson 2002).

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Tabelle 1.1. Familienkrebs-Syndrome, die durch Defekte in Antwort auf DNA Schaden verursacht sind

Gen Defekte Weg Syndrom Tumorart

Dominant geerbte Krebs-Syndromen

BRCA1 DSB, HR Erblicher Brust und Ovarienkrebs Brust und Ovarienkrebs BRCA2=FANCD1 DSB, HR Erblicher Brust und Ovarienkrebs Brust und Ovarienkrebs MLH1, MSH2,MSH6 MMR Erblicher Darm Krebs Darm Krebs

TP53 ZK Li-Fraumeni Syndrome Sarkom, Brustkrebs, Leukämie

RB ZK Retinoblastom Retinoblastom, Osteosarkom

Rezessiv geerbte Krebs-Syndrome

ATM DSB Ataxia Teleangiectatica Lymphom, Leukämie

BLM HR Bloom Syndrome Leukämie, Lymphom, solid

Tumoren FANCA-FANCG

FANCJ,FANCL HR Fanconi Anämie Akute myeloische Leukämie

LIG IV NHEJ Ligase IV Syndrome Leukämie

NBN DSB Nijmegen Breakage Syndrome Lymphom

WRN HR Werner Syndrom Verschiedene Tumoren

XPA-XPG NER, TCR Xeroderma pigmentosum Basalzellkarzinom, Melanom Abkürzungen: ZK – Zyklus-Kontrollpunkte, DSB –DNA Doppeltstrangbrüche, HR – homologe Rekombination, MMR – Fehlpaarungsreparatur, NER – Nukleotide Ausschneidungsreparatur, NHEJ – nicht homologe End-zu-End-Verknüpfung, und anschließend TCR – Transkription verbundene Reparatur.

(Hoeijmakers 2001, Thompson und Schild 2002, Marsh und Zori 2002, Chow u. a. 2004).

1.5.2.2 Die Signalwege, die zu Zellzyklus-Kontrollpunkten führen

DSB sind die tödlichsten genetischen Schäden, die auf chromosomale Aberrationen, Störung der genomischen Integrität und schließlich Entwicklung des Krebses (Khanna und Jackson 2001) hinauslaufen können. DSB entstehen aus vielen Quellen, einschließlich IS, freier Radikale und Chemikalien, aber sie können auch während der normalen Prozesse in der Zelle vorkommen, wie der DNA-Replikation und Meiosis. In eukaryotischen Zellen wird eine DSB Reparatur durch zwei Hauptreparatur-Wege ausgeführt: HR und NHEJ. NHEJ kann mehr fehlbar sein, da es die ausgestellten DNA-Enden ohne irgendwelche Schablonen liiert, während HR Reparatur angrenzende homologe Regionen als eine Schablone für die Reparatur verwendet. HR wird während und nach der S-Phase im Zellzyklus bevorzugt verwendet, da die DNA repliziert ist und das homologe Schwester-Chromatid eine Schablone für den Reparaturvorgang darstellt. Im Gegensatz dazu ist NHEJ in der G1-Phase des Zellzyklus am wichtigsten, wenn die zweite Kopie der DNA noch nicht verfügbar ist (Haber 2000; Hoeijmakers 2001). In beiden Prozessen müssen DSB jedoch zuerst entdeckt und effizient bearbeitet werden, um nachfolgende Reparatur-Schritte zu ermöglichen (Hopfner u. a. 2002).

Die anfängliche Erkennung des DSB, die Erweiterung des Signals und Transduktion in passende Antworten werden durch Kontrollpunkt Signalwege vermittelt. Diese geben Signale, die Transduktions – Kaskaden, Zellzyklus-Verzögerung oder Arrest als Antwort auf den DNA-Schaden

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an G1-, S- und G2- Phase Kontrollpunkten (Zhou und Elledge 2000) fördern. Eine vereinfachte schematische Präsentation des DSB Signalweges wird in der Abbildung 1.2 präsentiert. Einer der ersten Prozesse, die durch DSB ausgelöst werden, ist die massive Phosphorylierung der Histonvariante H2AX zu γH2AX. Die Bildung von γH2AX ist kritisch, da sie den Zusammenbau von spezifischen DNA-Reparatur-Komplexen auf der beschädigten DNA vermittelt. Jedoch gibt es zunehmend Hinweise, dass das DSB-Signal am Anfang mittels Netzprozesse verstärkt werden könnte, jedoch nicht durch eine Reihe von Schritten mit einer geradlinigen Hierarchie (Redon u. a.

2002; Thompson und Shild 2002).

Es wird vermutet, dass der MRE11 Komplex, der aus MRE11, NBN (früher bezeichnet als NBS1) und RAD50 Proteinen zusammengesetzt ist, der anfängliche DSB Sensor und Verarbeiter ist, der das Timing und den Umfang aller abwärts gelegenen („downsteam“) Prozesse bestimmt. Der Komplex besitzt DNA Nuclease, Helicase, ATPase und Annealing - Tätigkeiten, und nimmt sowohl an NHEJ als auch an HR teil (Futaki und Liu 2001, Connelly und Leach 2002, Lieber u. a. 2003, Lukas und Bartek 2004).

Abbildung 1.2. Ein vereinfachtes Schema des DSB Signalwegs, der zu Zellzyklus-Kontrollpunkten führt. Die ATM und ATR Kinasen phosphorylieren (gezeigt mit 'P') verschiedene Bestandteile des Netzes entweder direkt oder durch CHEK1 und CHEK2. Die Rekrutierung von MDC1, 53BP1, BRCA1 und MRE11 Komplexen durch den DNA-Schaden ist von ATM und ATR unabhängig, aber ihre Akkumulation

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in den Reparatur-Foci hängt von der ATM/ATR abhängigen Phosphorylierung von γH2AX ab. Die grauen Pfeile zeigen andere Interaktionen, die den S-Phase-Arrest beeinflussen. Modifiziert nach Kastan und Lim (2000), Bartek und Lukas (2001), Falck u. a. (2002), Kastan und Bartek (2004).

ATM und ATR Protein Kinasen sind die zwei Hauptsignalvermittler. Als Antwort auf DSB reagiert ATM zuerst und ist für die unmittelbare, schnelle Phase der Antwort verantwortlich (Abraham 2001), wohingegen sich ATR zusammen mit ATRIP (ATR Interaktionsprotein) später anschließt und den phosphorylierten Stand von spezifischen Substraten aufrechterhält (Abraham 2001; Bartek u. a. 2004). Abwärts „downstream“ von ATM und ATR funktionieren zwei Kontrollpunkt Kinasen CHEK1 und CHEK2 (Zhou und Elledge 2000). Es wird traditionell vermutet, dass CHEK1 dem ATR-vermittelten Signalweg zugeordnet ist, wohingegen CHEK2 in erster Linie durch ATM fungiert. Jedoch weisen neue Belege darauf hin, dass ATR-CHEK1 und ATM-CHEK2 „Pathways“

nicht parallele Zweige der DNA-Schaden-Antwort sind, sondern dass sie eher einen hohen Grad einer Kreuzwirkung und der Konnektivität zeigen (Gatei u. a. 2003, Jazayeri u. a. 2006).

Unter dem Signal Ermittler sind die Effektoren, die die Funktionen der DNA-Schaden-Antwort durchführen. Diese schließen die Substrate sowohl von ATM/ATR als auch von CHEK1/CHEK2 Kinasen und Proteinen ein, die an der DNA-Reparatur, Transkription Regulierung und Zellzyklus- Kontrolle beteiligt sind. Jedoch, abhängig vom Zusammenhang, können bestimmte Moleküle vielfache Funktionen im Signaltransduktionsweg (Zhou und Elledge 2000) haben. Diese so genannten Vermittler vertreten eine besondere Klasse von Kontrollpunkt-Reglern. Diese können so fungieren, um andere Faktoren zu den Seiten des DNA-Schadens zu rekrutieren, und eine komplizierte Funktion sowohl aufwärts („upstream“) als auch abwärts („downstream“) als Hauptsignalvermittler (ATM/ATR) zu haben. Das richtige Timing und die Schnelligkeit der ATM/ATR kontrollierten Antwort verlässt sich auf das funktionelle Wechselspiel von mindestens drei Vermittlern: MDC1 (Goldberg u. a. 2003, Stewart u. a. 2003, Lou u. a. 2003), 53BP1 (Wang u.

a. 2002) und BRCA1 (Venkitaraman 2002, Kitagawa u. a. 2004).

Der Zellzyklus-Arrest am G1 Kontrollpunkt wird durch zwei Signaltransduktionswege vermittelt.

In der Dominante, dem p53-abhängigen Weg, phosphoryliert ATM sowohl p53, auf Ser15, als auch seinen Hauptpartner, die Ubiquitin Ligase MDM2. Zusätzlich aktiviert ATM CHEK2 durch Phosphorylierung auf Thr68, was zur nachfolgenden Phosphorylierung von p53 auf Ser20 durch CHEK2 führt. Diese Ereignisse führen zusammen zur Bindung von p53 zu MDM2, was zur p53 Stabilisierung führt und die p53 abhängige Regulierung von mehreren Genen, einschließlich p21 (auch bekannt als WAF1 und Cip1) veranlasst (Banin u. a. 1998, Canman u. a. 1998, Dumaz und Meek 1999, Matsuoka u. a. 2000, Melchionna u. a. 2000, Maya u. a. 2001). Das p21 Protein bindet und hemmt die Tätigkeit von cyclin E und seinem Partner CDK2, die für den Übergang von G1- S- Phasen im Zellzyklus erforderlich sind. Dieser Weg kann manchmal sogar dauerhaften G1-Arrest (Kastan und Lim 2000) veranlassen. Der andere Weg, der zum G1 Kontrollpunkt führt, wird ATM

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anhängig aktiviert, aber p53-unabhängig, in dem das Hauptziel CHEK2 ist. Auf diesem Weg wird CHEK2 an vielen Ser/Thr Aminosäuren phosphoryliert, einschließlich Thr68, was zur wesentlichen Regulierung von der CHEK2 Tätigkeit führt und der Phosphorylierung seines abwärts gelegenen Ziels CDC25A. Das stimuliert die CDC25A Degradierung, was den S-Phase Zugang blockiert und die CDC25A-abhängige Dephosphorylierung was die Aktivierung von CDK2 (Bartek und Lukas 2001) verhindert. Das ist ein schneller Weg, G1 zum S Übergang für nur ein paar Stunden zu verzögern, es sei denn, dass der anhaltende p53-abhängige Mechanismus den G1-Arrest (Kastan und Bartek 2004) verlängert.

Der S-Phase Kontrollpunkt (der inmitten der S-Phase auftritt) wird durch eine verminderte Rate der DNA-Synthese nach einem DSB manifestiert. Es gibt zwei parallele, zusammenarbeitende Wege, die zur schnellen und vergänglichen Hemmung der DNA-Synthese beitragen (Falck u. a. 2002). Im CDC25A Zweig aktiviert ATM CHEK2, welcher den Zellzyklus-Regler CDC25A phosphoryliert, was zu seiner Degradierung durch die ubiquitinierungsabhängige Proteolyse führt (Matsuoka u. a.

2000, Falck u. a. 2001, Falck u. a. 2002). Der zweite Zweig ist der ATM - geregelte NBN/BRCA1/SMC1 Weg. Als Antwort auf DSB phosphoryliert ATM Ser957 und Ser966 von SMC1, dadurch wird der S-Phase Kontrollpunkt aktiviert. Die SMC1 Phosphorylierung verlangt NBN und BRCA1, weil beide eine Rolle beim Rekrutieren von aktiviertem ATM zu den DNA- Brüchen haben (Yazdi u. a. 2002, Kitagawa u. a. 2004). Außerdem ist die ATM abhängige Phosphorylierung von NBN auf Ser343 und Ser278 (Lim u. a. 2000, Zhao u. a. 2000) und von BRCA1 auf Ser1387 für die Kontrollpunkt-Funktion erforderlich (Xu u. a. 2002). Wie man auch zeigte, spielte die NBN-abhängige Phosphorylation von FANCD2 auf Ser222 durch ATM eine Rolle in der Aktivierung dieses Kontrollpunktes (Taniguchi u. a. 2002, Nakanishi u. a. 2002).

Der G2-Phase Kontrollpunkt ist der Endkontrollpunkt, der den Zugang von beschädigten Zellen in die Mitose blockiert. Das kritische Ziel ist die Cyclin B/CDC2 Kinase, deren Aktivierung durch ATM/ATR und CHEK1/CHEK2 gehemmt wird. Jedoch ist gezeigt worden, dass ATM für die Aktivierung des Kontrollpunktes für den G2-Arrest (Stop) entbehrlich ist, es sei denn, dass der DNA-Schaden während der G2-Phase selbst vorkommt. CHEK2 scheint auch eine Nebenrolle in der Wartung aber nicht für die Einleitung des G2-Arrestes (Kastan und Lim 2000) zu spielen. Im Gegensatz dazu ist der Hauptspieler in diesem Kontrollpunkt CHEK1, der den Zugang zur Mitosis durch Phosphorylierung von CDC25C auf Ser216 blockiert. Das beruht auf seiner Bindung zu 14-3- 3σ Proteinen und Kernexport. Infolgedessen ist CDC25C unfähig, hemmende Phosphate von CDC2/Cyclin B zu entfernen und den Zugang zur Mitosis zu verhindern (Peng u. a. 1997, Sanchez u. a. 1997, Liu u. a. 2000). Deregulation in den Zellzyklus-Kontrollpunkt-Wegen und der anschließend aktivierten DNA-Reparatur-Maschinerie führen zur Akkumulation von Mutationen und einer Zunahme in der chromosomalen Instabilität. Geerbte Defekte in diesen Wegen erhöhen

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die Möglichkeit von Entwicklungsmissbildungen sowie das Risiko des Krebses, einschließlich des Brustkrebses.

1.5.3 Defekte in der DNA-Reparatur-Maschinerie und Brustkrebs

1.5.3.1 Ataxia-telangiectasia, ATM Mutationen und Mammakarzinom

Das ATM Gen ist in der Chromosomalen Region 11q22.3 lokalisiert. Es umfasst 66 Exons, von denen 62 das ATM-Protein mit einem Molekulargewicht von 370 kDa kodieren. ATM gehört einer Familie von konservierten Hefe- und Säugetierproteinen an, die Kontrollpunkte im Zellzyklus regulieren und in der DNA-Reparatur und Rekombination involviert sind: im weitesten Sinn gehört es zu den Phosphatidylinositol-3-Kinasen (PIK) (Savitsky u. a. 1995a, Savitsky u. a. 1995b, Uziel u.

a. 1996). Das ATM Protein hat eine katalytische Domäne mit Kinase Aktivität, in seiner hoch konservierten carboxyterminalen Region mit Homologie zur Phosphatidylinositol-3-Kinase Domäne (PI-3 Kinase) (Zakian 1995).

ATM ist der Hauptkontrolleur der Zellantwort auf die DNA DSB (siehe auch 1.5.2). Der Haupteffekt dieser Antwort ist die sehr schnelle Aktivierung seiner Kinase Tätigkeit im Anschluss an die DSB Bildung (Banin u. a. 1998, Canman u. a. 1998). Es ist vermutet worden, dass ATM Moleküle in unbeschädigten Zellen untätig sind, als Dimer oder in höhere Ordnung als Multimer vorliegen. Auf DSBs, und vielleicht auch auf andere Änderungen in der Chromatin Struktur, phosphoryliert ATM sich selbst an Ser1981 (Bakkenist und Kastan 2003). Kürzlich sind zwei andere Autophosphorylierungs-Stellen Ser367 und Ser1893 entdeckt worden (Kozlov u. a. 2006).

Autophosphorylierung führt zur ATM Dimer Trennung und Aktivierung von ATM Monomeren, die zu den Substraten rekrutiert werden, die den DNA-Schaden lokalisieren. Dieser Mechanismus in der ATM Regulierung erlaubt ein schnelles und empfindliches Einschalten der Kontrollpunkt-Wege (Bakkenist und Kastan 2003). Zusätzlich zu seiner Rolle in den Signalwegen, die zu Zellzyklus- Arrest (Kapitel 1.4.2) führen, aktiviert ATM einen anderen Signaltransduktionsweg, der durch die Stress - aktivierte Proteinkinase bedient wird - ABL, eine kernige nicht reziptorische Tyrosinkinase (Baskaran u. a. 1997, Shafman u. a. 1997, Shangary u. a. 2000). ATM ist auch für die ABL- abhängige Rekrutierung des RAD51-Reparatur-Protein-Komplexes im Anschluss an IS erforderlich (Chen u. a. 1999).

ATM hat auch andere für die genomische Stabilität notwendige Rollen, weil es an der Wartung der Telomer-Länge und -Integrität teilnimmt, die sowohl beim Altern als auch beim Krebs entscheidend sind (Smilenov 1997, Hande u. a. 2001, Pandita 2001). Außerdem scheint ATM eine Rolle bei der Apoptose zu spielen (Smith u. a. 1999).

Mutationen in ATM verursachen eine autosomal rezessive neurodegenerative Krankheit: Ataxia- telangiectasia (AT) (Savitsky u. a. 1995a). AT wird durch das frühe Auftreten von progressiver

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zerebellärer Ataxie, oculocutanen Telangiectasien, Immunschwäche und Prädisposition zu Krebs charakterisiert. Etwa 70 % der Bösartigkeit sind Lymphomas und T-Zellleukämien, während der Rest verschiedene Tumorarten darstellt, einschließlich Brustkrebs. Die Zellen mit ATM Mutationen zeigen chromosomale Instabilität, Zellzyklus-Kontrollpunkt-Defekte und äußerste Empfindlichkeit zu IS (Lavin und Shiloh 1997, Shiloh 2003).

Die heterozygoten Träger von AT Mutationen sind von gesunden Personen nicht klinisch unterscheidbar, aber, wie man berichtet hat, Heterozygote haben erhöhte Risiken für eine Krebs- entwicklung (Swift u. a. 1987). Interessanterweise scheint die „Gen-Dosis“ eine Wirkung auf das Tumor-Spektrum zu haben: wohingegen die Hauptkrebs-Typen in AT Patienten Leukämien und Lymphomas sind (Lavin und Shiloh 1997), haben AT Heterozygote ein erhöhtes Risiko für Brustkrebs (Olsen u. a. 2001; Thompson u. a. 2005). Die Beteiligung von A-T Heterozygotie in der Brustkrebsprädisposition ist lange vermutet worden, schon in der Mitte der 70er Jahre beginnend (Swift u. a. 1976). Epidemiologische Studien offenbarten eine zwei- bis sechsfache Risiko- Erhöhung für Brustkrebs unter Blutsverwandten von A-T Patienten (Swift u. a. 1987, Swift u. a.

1991, Athma u. a. 1996, Inskip u. a. 1999, Olsen u. a. 2001, Thompson u. a. 2005). Jedoch ist es schwierig gewesen, diese Risikoschätzungen auf Bevölkerungsniveau in verschiedenen Fall- Kontroll- Studien von nicht ausgewählten oder Familienbrustkrebs-Patienten zu bestätigen, was eine beträchtliche Debatte über die Rolle von ATM Mutationen für das Brustkrebs-Risiko auslöste (Fitzgerald et al. 1997, Broeks u. a. 2000, Dörk u. a. 2001). Eine Studie von Familienbrustkrebs- Fällen ohne BRCA1/2 Mutationen (Renwick u. a. 2006) hat starke Beweise zur Verfügung gestellt, dass ATM Mutationen, die A-T im Homozygoten Zustand verursachen, Brustkrebs- Prädispositionsallele sind, die mit etwa einer zwei - bis dreifachen Risikoerhöhung der Krankheit verbunden sind. Diese These wird durch die Ergebnisse einer neueren Studie unserer Arbeitsgruppe unterstützt (Bogdanova u. a. 2008).

1.5.3.2 Mutationen in den MRE11-RAD50-NBN (MRN) Komplex, verknüpfte genomische Instabilitätssyndrome und Brustkrebsprädisposition

Der MRN Komplex wird aus MRE11, NBN und RAD50 Proteinen zusammengesetzt, die jeweils durch MRE11 an 11q21 (Petrini u. a. 1995), NBN an 8q21 (Varon u. a. 1998, Carney u. a. 1998) und RAD50 an 5q31 (Dolganov u. a. 1996) kodiert sind. Dieser Protein-Komplex dient der Früherkennung von DNA DSB, Zellzyklus-Kontrollpunkten, DNA-Rekombination und in der Wartung von Telomeren (Zhu u. a. 2000, Wu u. a. 2000, Stracker u. a. 2004). Er integriert DNA- Reparatur mit der Aktivierung von Kontrollpunkten, die durch ATM signalisiert sind, und funktioniert sowohl aufwärts als auch abwärts von ATM im DNA-Schaden-Antwort Signalweg. Die abwärts gelegene Rolle ist durch die ATM - abhängige Phosphorylierung von mindestens NBN und

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MRE11 als ein Teil der Antwort auf DSB demonstriert worden (Gatei u. a. 2000, Zhao u. a.

2000, Lim u. a. 2000). Dieser ist das am besten charakterisierte Ereignis der Phosphorylierung von NBN (Kapitel 1.4.2), wohingegen die Natur und die funktionellen Folgen der MRE11 Phosphorylierung noch unbestimmt bleiben. Neue Studien haben auch aufwärts eine Rolle für den MRN Komplex angedeutet; es scheint für die volle Aktivierung von ATM nach niedrigen Dosen von IS erforderlich zu sein (Uziel u. a. 2003, Carson u. a. 2003, Costanzo u. a. 2004, Horejsi u. a.

2004). Es ist vorgeschlagen worden, dass der MRN Komplex die Rekrutierung von ATM zu beschädigten DNA-Enden erleichtert (Dupré u. a. 2006). Wie hinzuzufügen ist, scheint der MRN Komplex als Adapter in der Phosphorylierung von bestimmten ATM Substraten wie CHEK2 zu dienen. Besonders für diese Funktion, scheint die Anwesenheit und die Phosphorylierung von NBN (Lee und Paull 2004) notwendig zu sein. Wegen seiner unabhängigen Wirkung sowohl mit NBN als auch mit RAD50 ist MRE11 als der Kern des Komplexes angesehen worden, wohingegen die Interaktion zwischen NBN und RAD50 indirekt ist und durch MRE11 vermittelt wird (Carney u. a.

1998, Desai-Mehta u. a. 2001, Tauchi u. a. 2001).

Die Hauptrolle des MRN Komplexes in der ATM-kontrollierten Genom-Kontrolle wird durch die Tatsache illustriert, dass deren Funktionsmangel einige der in A-T beobachteten Defekte wiederholt (Tauchi u. a. 2001). Hypomorphe Mutationen in MRE11 verursachen eine der Ataxia-telangiectasia ähnliche Krankheit (ATLD) (Stewart u. a. 1999), während hypomorphe NBN Mutationen auf Nijmegen Breakagesyndrom (NBS) hinauslaufen (Varon u. a. 1998); beides sind seltene geerbte Syndrome, die phänotypisch mit A-T verbunden sind. Auf der Zellebene zeigen diese drei Syndrome Hyperempfindlichkeit zu IS, radioresistente DNA-Synthese und genetische Instabilität (Stewart u. a. 1999, Varon u. a. 1998, Kastan und Lim 2000). ATLD Patienten zeigen die meiste Ähnlichkeit mit A-T, obwohl mit späterem Auftreten und mit einer langsameren Entwicklung (Stewart u. a. 1999). Jedoch ist, trotz der beobachteten genomischen Instabilität, über eine Neigung zu Krebs nicht berichtet worden (Stewart u. a. 1999, Delia u. a. 2004, Fernet u. a. 2005). Auch NBS Patienten zeigen ein bedeutendes Übergreifen von Symptomen mit denjenigen von A-T und ATLD.

Außerdem zeigen NBS Patienten Microcephalie und ein charakteristisches "vogelähnliches"

Gesichtsäußeres, das in ATLD und A-T fehlt (Weemaes u. a. 1994, van der Burgt u. a. 1996).

Während NBS vergleichbare Eigenschaften mit A-T hat, so hat es auch Eigenschaften, die dem Seckel Syndrom ähnlich sind, welches mit Mutationen in ATR (Kapitel 1.6) assoziiert ist. Das könnte mit der Rolle von NBN in der ATR-abhängigen Signalübermittlung verbunden sein, und es ist vorgeschlagen worden, dass die klinischen Eigenschaften von NBS das Ergebnis der vereinigten Defekte sowohl in ATM als auch in ATR Signalwegen sind (Stiff u. a. 2005). Außer A-T, ATLD und Seckel Syndrom, zeigt NBS klinisches Übergreifen mit dem LIG4 (Ligase IV) Syndrom und der FA (Fanconi Anämie). Es gibt sogar Patienten, bei denen ursprünglich FA diagnostiziert wurde, die, wie man nachher fand, seltene Mutationen in NBN hatten (Gennery u. a. 2004, New u. a. 2005,

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Ben-Omran u. a. 2005). Eine Mehrheit von NBS Patienten sind Homozygote für die slawische Mutation NBN*657del5, die zu einem vorzeitig gekürzten Protein führt (Matsuura u. a. 1998, Varon und al. 1998, Carney u. a. 1998). NBS Patienten haben ein erhöhtes Risiko für Krebs, besonders Lymphome (Weemaes u. a. 1994, van der Burgt u. a. 1996). Es ist darauf hingewiesen worden, dass heterozygote Träger von klassischen NBS Mutationen auch gefährdet für Krebs sein können. Tatsächlich ist dies gefunden worden: Heterozygotie für NBN*657del5 scheint mit einer erhöhten Prädisposition für Prostata-, Eierstocks- und Brustkrebs, Melanom, akute lymphoblastische Leukämie (ALL) und non-Hodgkin Lymphom assoziiert zu sein (Plisiecka- Halasa u. a. 2002, Dębniak u. a. 2003, Górski u. a. 2003, Cybulski u. a. 2004, Chrzanowska u. a.

2005, Steffen u. a. 2006, Bogdanova u. a. 2008). Kürzlich, wie man zeigte, beherbergte eine Patientin mit einer verschiedenen Form von NBS ohne Immunschwäche biallelische Mutationen in RAD50 (Waltes et al. 2009). Die Patientin ist compound heterozygot für zwei Mutationen. In Fibroblast- und Lymphoblastzelllinien dieses Patienten wurde das RAD50 Protein reduziert gefunden - in einem Anteil von weniger als ein Zehntel des normalen Proteins, und eine hohe Frequenz von spontanen Chromatid-Änderungen. Jedoch hat die Patientin bis jetzt keine Tumore entwickelt und hat keinen Krebs in der Familiengeschichte (Waltes et al. 2009). Folglich sind alle drei Bestandteile des Mre11 Komplexes in zusammenhängende Syndrome hineingezogen worden.

Jedoch, da der Mangel an MRE11, NBS1 und RAD50 Proteinen nicht zu genau demselben klinischen Bild führt, weist dies darauf hin, dass die Bestandteile des komplizierten Komplexes auch getrennt funktionieren.

1.5.4 Suche nach zusätzlichen Brustkrebs Prädispositionssgenen

Jedoch bleibt noch die Mehrheit von Familienbrustkrebs-Fällen durch einige oben genannte Gene unerklärt. Fortschritte in Assoziationsstudien sind durch die neuen Erkenntnisse in der Entdeckung von „Single Nucleotide Polymorphisms“ (SNPs) gefördert worden; die Dichte von SNPs überall im Genom, die bequeme Genotypisierung und die gemäßigten Kosten tragen dazu außerordentlich bei.

Technologische Fortschritte haben eine Möglichkeit zur Verfügung gestellt, Hunderttausende von SNPs zu untersuchen. So können Risikoallele ohne vorherige Kenntnisse der Position oder Funktion identifiziert werden. Durch eine genügend große Studie sind kürzlich häufige missense Varianten in zwei Genen, CASP8 (caspase 8, ein wichtiger Initiator von Apoptose, wird auch durch Außentodessignale und als Antwort auf den DNA-Schaden aktiviert), und TGFB1 (Wachstumsfaktor-Beta 1, steuert Proliferation, Differenzierung, und andere Zellfunktionen) als mit dem Brustkrebs-Risiko assoziiert gezeigt worden (Cox u. a. 2007). Diese Studie demonstrierte die Wichtigkeit von großen Analysen, weil individuelle Studien häufig nicht genug statistische Relevanz haben, allgemeine Varianten, die mit einem Brustkrebsrisiko korreliert sind, zu identifizieren. Mit der Absicht, solche zusammenarbeitenden Studien an Brustkrebs zu erleichtern,

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wurde das Brustkrebs-Assoziationskonsortium (Breast Cancer Association Consorcium – BCAC) im April 2005 gegründet. Das Konsortium schließt zurzeit mehr als 40 internationale zusammenarbeitende Forschungsgruppen ein, mit mehr als 50.000 Fällen und 50.000 Kontrollen.

Eine neue Studie des BCAC offenbarte neuartige unabhängige Brustkrebs-Prädispositionsloci, die durch Scannen vom ganzen Genom identifiziert wurden; sie enthalten plausible Gen-Kandidaten (FGFR2 Wachstumsfaktorrezeptor von Fibroblasten 2, beeinflusst Mitogenese und Differinzierung;

TNRC9 - auch bekannt als TOX3, bindet zur DNA, regelt Transkription; MAP3K1 - Mitogen- aktivierte Proteinkinase, beteiligt an der Zellantwort auf mehrere mitogenische und metabolische Stimuli, einschließlich des Insulins und vieler Wachstumsfaktoren; und LSP1 - Lymphozyten spezifisches Protein 1, ein intrazelluläres F-actin bindendes Protein). Die Identifizierung von SNPs an diesen und acht weiteren Loci zeigte starke und konsequente Belege auf für die Assoziation häufiger Genvarianten mit dem Brustkrebs (Easton u. a. 2007, Hunter et al. 2007, Stacey u. a. 2007, Stacey et al. 2008, Ahmed et al. 2009, Thomas et al. 2009, Zheng et al. 2009). Bis heute ist noch nicht bekannt, wie diese Gene miteinander oder mit Lebensstil-Faktoren in Zusammenhang wirken, von denen jeder das Risiko für Brustkrebs vergrößern kann (Easton u. a. 2007), aber die Berichte zeigen, dass viele zusätzliche allgemeine Prädispositionsallele durch solche Studien identifizierbar sein könnten.

1.5.5 Die zusätzlichen Brustkrebs-Kandidaten-Gene die an der DNA Reparatur beteiligt sein können

Die Funktionsanalysen von bisher identifizierten Brustkrebs-Genen demonstrieren eine faszinierende Verbindung zwischen der Reparatur von strahleninduzierten DNA Doppelstrangbrüchen und dem Brustkrebsrisiko. Tatsächlich scheinen Störungen der Chromosom- Brechungsreparatur, eine Hauptrolle in der Entwicklung des Brustkrebses zu spielen, der mit der Rolle der Fehlanpassungsreparatur (Mismatch) im Darm-Krebs oder UV induzierten Schaden Reparatur im Hautkrebs vergleichbar ist. Warum die Funktionsstörung der Chromosom- Brechungsreparatur von solcher besonderer Wichtigkeit für Brusttumoren ist, ist noch unbekannt.

Jedoch zeigen diese Ergebnisse den Weg für die Identifizierung von zusätzlichen Brustkrebsallelen seit bekannte Gene an demselben Signalweg (Englisch „pathway“) beteiligt sind und deren Rolle genomische Integrität zu bewahren scheint. Klar sind andere Gene, die in diesem „pathway“ der intensiven Analyse unterworfen sein können. Außerdem kann es derzeit unerkannte Mitglieder dieses Signalweges geben, die auch mit dem Brustkrebs Risiko assoziiert sein können. Einige Kandidaten können unter Proteinen gefunden werden, die sich an BRCA1 oder BRCA2 binden.

Wie man glaubte, kann einer der Partner von BRCA1, das Protein BARD1 ("BRCA1-verbundenes

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RING-Gebiet"), eine strahleninduzierte Hemmung von mRNS polyadenylation (Kleiman und Manley 2001) regulieren und könnte an sporadischem oder erblichem Brustkrebs beteiligt sein (Thai u. a. 1998, Karppinen u. a. 2006). Aber neuere Studien zeigen keine Beweise für BARD1 als Brustkrebs-Prädispositionsallel (Jakubowska u. a. 2008). Ein anderer Interaktionspartner sowohl der BRCA1 als auch der BRCA2 Proteine ist RAD51, ein für die homologe Rekombination notwendiges Protein. Ein SNP in der 5' nicht translatierten Region von RAD51, 135G-> C, ist als ein möglicher Modifikator des Brustkrebs-Risikos im BRCA1 und BRCA2 Mutationsträger gefunden worden (Antoniou u. a. 2007). Weil das RAD51 Protein mit RAD52 in der homologen Rekombination zusammen „arbeitet“, können allgemeine Varianten von RAD52 auch Kandidat - Modifikatoren sein (Bell u. a. 1999). Ein anderer Partner von BRCA1 ist das RAD50 Protein, das ein Teil des Kerns – MRN – Reparatur - Komplexes ist. Die MRE11 und die RAD50 Gen Mutationen führen zur fehlenden Funktion von Proteinen und verursachen seltene erbliche Strahlenempfindlichkeitssyndrome, beziehungsweise die, die AT als auch NBS ähneln (Stewart u.

a. 1999, Waltes 2002). Es ist deshalb möglich, dass Veränderungen in diesen beiden Genen mit der Strahlenempfindlichkeit und dem Brustkrebs-Risiko verbunden sein können. Ein proteinverkürzendes Allel von RAD50 - im nördlichen Finnland identifiziert- schien ein ungefähr 4-fach erhöhtes Risiko des Familienbrustkrebses dieser Bevölkerung zuzuteilen (Heikkinen u. a.

2006). Ein anderer Regulator von BRCA1 ist 53BP1, ein p53-verbindliches Protein, das die strahleninduzierte Phosphorylierung von BRCA1 und CHEK2 abstimmt; dies scheint für die Rekrutierung von BRCA1 bei strahlenveranlasster Reparatur der Foci notwendig zu sein (DiTullio u. a. 2002). MDC1, das auch BRCA1-Funktionen regelt (Lou und al 2003), ist für die Antwort des DNA-Schadens erforderlich und erleichtert die Rekrutierung des ATM und MRN Komplexes an DNA-Schaden-Foci (Stucki und Jackson 2005). Weitere Proteine, die bei der DNA DSB Reparatur involviert sind, schließen die XRCC Proteine ein, von denen eines das XRCC11/BRCA2 Protein ist. Die XRCC Proteine werden als Supressoren von strahleninduzierten chromosomalen Aberrationen betrachtet. Das XRCC4 Protein (zusammen mit der DNA Ligase IV), sowie XRCC6/KU70 oder XRCC5/KU80, zum Beispiel, funktionieren bei der DNA DSB Reparatur durch

"nichthomologes Endjoining" und verhindern dadurch oncogene Translokationen. Mehrere häufige Genvarianten von XRCC1, XRCC2, XRCC3, XRCC4, XRCC5, XRCC6 und LIG4/DNA-Ligase IV wurden als potenzielle Modifikatoren des Brustkrebs-Risikos identifiziert (Price u. a. 1997, Lunn u.

a. 1999, Goode u. a. 2002, Kuschel u. a. 2002, Rafii u. a. 2002, Fu u. a. 2003), obwohl eine Studie eines großen internationalen Konsortiums einige der vorgeschlagenen Assoziationen widerlegt hat (Breast Cancer Association Consortium 2006). Nachdem das XRCC9 Gen als das Gen, welches eine Form der Fanconi Anämie - FANCG verursacht, erkannt worden ist (de Winter u. a. 1998), wurde BRCA2 als das Gen identifiziert, das für den Fanconi Anämie-Typ D verantwortlich ist, d. h. als FANCD1 Gen (Howlett u. a. 2002), PALB2 als FANCN, BRIP2 als FANCJ, und schließlich wird

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der Fanconi Anämie Pathway mit dem BRCA1 Pathway über H2AX verbunden. Einige Spekulationen sind darüber erhoben worden, dass andere Fanconi Anämie Proteine auch Kandidaten für die Brustkrebs Prädisposition sein könnten. Schließlich könnten die Proteine, die an

„upstream“ Regulierung dieser Genprodukte beteiligt sind, starke Kandidaten für die Brustkrebs Prädisposition sein. Zum Beispiel hat ATR (″ataxia-telangiectasia and Rad3-related″), das durch Replikations Blöcke induziert wird und mehrere Zielproteine hat, genau selber wie die homologe ATM Kinase, solche wie p53, CHEK1 oder BRCA1. ATR erscheint als eine Wartungskinase, im Signaling nach ionisierender Strahlung handelnd. Jedoch haben bis jetzt bekannte Studien über ATR Varianten keinen Zusammenhang mit Brustkrebs offenbart (Heikkinen u. a. 2005, Marsh u. a.

2007).

1.6. ATR Mutationen und Seckel Syndrom 1.6.1. Struktur und Funktion von ATR

Das ATR Gen liegt in der chromosomalen Region 3q22-q24, etwa 130 Kilobytes und umfasst 47 Exons (Cimprich u. a. 1996). Es verschlüsselt eine Proteinkinase (Abbildung 1.3), die ein Mitglied der Phosphatidylinositol 3-kinase Familie und ein Hauptregler der Signalkaskaden ist, die durch einen DNA-Schaden veranlasst sind (Abraham 2001). Als Antwort auf IS handelt ATR in der Parallele und kooperativ mit ATM (Kapitel 1.5.2). Wohingegen ATM für die unmittelbare, schnelle Phase der Antwort verantwortlich ist, schließt sich ATR später an und hält den phosphorylierten Status von spezifischen Substraten aufrecht (Abraham 2001, Bartek u. a. 2004).

Abbildung 1.3. Das ATR Protein. Die Hauptstrukturgebiete werden über dem Diagramm angezeigt.

Abkürzungen: FAT – FRAP/ATM/TRRAP, FATC – FRAP/ATM/TRRAP Carboxy-Terminal, PI3K phosphoinositide 3-kinase katalytische Domäne (modifiziert von Abraham, 2001).

Nach einem DNA-Schaden können keine messbaren Änderungen in der ATR Kinase Tätigkeit festgestellt werden. Eher scheint es, dass ATR bestimmend bereit sein kann, um seine Substrate zu phosphorylieren, und die Zellfunktionen scheinen größtenteils von seiner Subzelllokalisierung (Kastan und Bartek 2004) kontrolliert zu werden. Eine wichtige Eigenschaft von ATR ist die Aktivitätsabhängigkeit von einem zusätzlichen Protein – ATRIP (Cortez u. a. 2001). Die ATR Aktivierung scheint von der vorherigen Verarbeitung von DSBs zur einzeln gestrandeten DNA (ssDNA) abzuhängen, und es ist darauf hingewiesen worden, dass ATR lokalisiert für ssDNA durch die Bindung von ATRIP Protein zum Replikationsprotein A (RPA) – ein ssDNA-verbundenes, an der DNA-Replikation beteiligtes Protein ist. Es scheint, dass sowohl ATM als auch der MRN