Einfluss einzelner Parameter bei der PCR Optimierung

In die Reaktionsgefäße müssen unterschiedliche Substanzen gegeben werden, damit die Polymerasekettenreaktion stattfinden kann (vgl. Kap. 3.3.3). Diese reagieren in der Regel nicht nur mit einem Reaktionspartner, sondern beeinflussen auch die anderen Substanzen. Das kann in der Praxis zu Schwierigkeiten führen. Es manifestiert sich z. B. in dem Fehlen eines Produkts, Doppelbanden oder schlierigem Gel.

Im Folgenden soll kurz auf die eingesetzen Substanzen, ihre Interaktionen und die Auswirkung ihrer gewählten Konzentration eingegangen werden.

Die DNA Menge darf nicht zu wenig sein, weil sonst nicht genügend PCR Produkt entstehen kann. Liegt zu viel DNA als Matrize vor, können Verunreinigungen durch die Lösung

Menge Lösung Beschreibung

2 l DNA Probe in kleinem Reaktions Gefäß vorlegen;

Ausgangskonzentration 30 50 ng/ l Für Mastermix zu Grunde legen:

2 l Vorwärts Primer Ausgangskonzentration 5 M 2 l Rückwärts Primer Ausgangskonzentration 5 M

2 l 10x Puffer je nach Polymerase wie von Qiagen im Kit mitgeliefert

4 l Q Solution von Qiagen

6 l autoklaviertes HPLC Wasser

1,5 l MgCl2 Ausgangskonzentration 25 mM

1,5 l dNTPs Ausgangskonzentrationen 2 mM

0,2 l DNA Polymerase 5U/ l Top 9;P. oder HotStar 9;P. je nach zu amplifizierendem Exon;

siehe Anhang 3. und 4.

19,2 l Gesamtvolumen ~18 l in jedes Reaktionsgefäß mit der vorgelegten Probe bzw. Wasser im Falle des Leerwertes geben

3. METHODEN 53 eingeschleppt werden, die die PCR negativ beeinflussen oder es können unspezifische Produkte gebildet werden.

Die Primer müssen ebenfalls bestimmten Kriterien genügen, damit sie spezifisch und zuverlässig binden (vgl. Kap. 3.3.6). Setzt man sie in zu geringer Konzentration zu, ist die DNA Ausbeute zu gering. Im entgegengesetzten Fall würden unspezifische Produkte entstehen.

Magnesium Ionen sind ein unverzichtbarer Kofaktor der Polymerasen. Diese müssen im Ansatz zur Verfügung stehen, damit die DNA Polymerase optimal Substrate umsetzen kann.

In zu hoher Konzentration hemmen sie sie allerdings. Zu Bedenken ist auch ihr Einfluss auf die Hybridisierung der Primer, die durch Magnesium Ionen erleichtert wird. Durch die Stabilisierung der Wasserstoffbrückenbindungen ist in der Konsequenz für die Denaturierung der DNA zu Beginn eines jeden PCR Zyklus eine höhere Temperatur sowie eine niedrigere Annealing Temperatur für die Bindung der Primer nötig.

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Das Problem der richtigen Magnesiumkonzentration ist durch die von den Herstellern der Polymerasen mitgelieferten passenden Puffer (s. u.) weitgehend Geschichte. Damit stellt sich heute auch nicht mehr vordergründig die Frage nach der geeigneten dNTP Konzentration.

Zuviele dNTPs würden die Rate an falsch eingebauten Basen erhöhen. Die erprobten Konzentrationen reichen aus, damit nach ionischer Bindung einiger Moleküle durch die Magnesium Kationen noch ausreichend Substrat für die Bildung der neuen DNA Stränge zur Verfügung steht.

In den ersten Jahren der PCR erschwerte die Verwendung des Fragmentes Klenow der DNA Polymerase von &! " das Verfahren. Diese Polymerase wurde zu Beginn eines jeden Zyklus während der DNA Denaturierung ebenfalls denaturiert und musste somit vor jedem neuen Annealing Schritt wieder manuell zugesetzt werden.

Ein wichtiger methodischer Fortschritt war in diesem Zusammenhang die Entdeckung hitzeunempfindlicher DNA Polymerasen. Das Archäum !$'&9''& wurde aus einem heißen Geysir im Yellowstone Nationalpark in den USA isoliert (Chien ., 1976;

Innis , 1988; Saiki ., 1988; Tindall & Kunkel, 1988). Seine DNA Polymerase ( 9 Polymerase) hat ihr Temperaturoptimum bei 72° C. Bei dieser Temperatur vermag die 9

3. METHODEN 54 Polymerase eine DNA Synthese mit einer Geschwindigkeit von etwa 150 Nukleotiden pro Sekunde zu gewährleisten. Da diese jedoch auch noch bei 94° C bzw. bei 95° C, der für die Denaturierung benötigten Temperatur, stabil ist, muss die 9 Polymerase nur einmal zu Beginn der PCR zugegeben werden und bleibt dann während aller durchgeführten Zyklen erhalten. Die 9 Polymerase ermöglichte damit die Automatisierung der PCR Zyklen.

Zudem verbesserte sie die Spezifität der PCR Methode, da sich die Oligonukleotidprimer bei den verwendeten hohen Temperaturen nur sehr selten an unerwünschte Stellen anheften (Saiki ., 1988; Tindall & Kunkel, 1988; Watson ., 1993).

Mit den Jahren liegen zu diesem Verfahren so viele Erfahrungen und Forschungsergebnisse vor, dass jedes Labor seine Vorlage für einen PCR Ansatz entwickelt hat. So auch das der Frauenklinik der Medizinischen Hochschule Hannover, in dem die experimentelle Grundlage für diese Arbeit geschaffen wurde.

Erleichtert wurde die Entwicklung solcher Standard Ansätze durch das Angebot gentechnisch hergestellter DNA Polymerasen. Die biochemischen Herstellerfirmen liefern den passenden Puffer, Magnesiumchlorid und eine im Falle der Firma Qiagen sogenannte „Q Solution“ mit.

Der Puffer sorgt für ein hohes Maß spezifischer Primerbindung über einen weiten Bereich von Mg²⁺ Konzentrationen und Annealingtemperaturen. (www.qiagen.com).

Die PCR Ansätze wurden zur Vermeidung der Exonukleaseaktivität immer auf Eis pipettiert und die Polymerase immer als Letztes zum Mastermix hinzugefügt.

Die Berücksichtigung von Q Solution im PCR Ansatz wird bei GC reichen Amplifizierungsstücken empfohlen und wenn die DNA ein hohes Maß an Sekundärstruktur ausbildet. Dadurch wird die Denaturierung erleichtert (www.qiagen.com).

3. METHODEN 55 3.3.5 Angewandte Strategien der PCR Optimierung für die Amplifizierung von

exonständigen Abschnitten und den dazugehörigen intronständigen Fragmenten der Gene und

Die im vorangegangenen Kapitel betrachteten Zusammenhänge führten zur Etablierung des laborüblichen Standard PCR Ansatzes, der die Grundlage für jede PCR Optimierung bildete.

Alle im Rahmen dieser Arbeit pipettierten PCR Ansätze enthielten Q Solution unabhängig vom GC Gehalt des zu amplifizierenden DNA Abschnittes, damit das Pipettierschema möglichst einheitlich war. Für einige Exons war eine zufriedenstellende Amplifizierung nach dem üblichen Schema anfänglich nicht möglich. In diesem Fall wurden die Ansätze dann bei der Optimierung einmal mit und einmal ohne Zugabe von Q Solution getestet. In keinem der Fälle führte dies allerdings zu einer Verbesserung des DNA Produktes.

Die Primer und die Annealingtemperatur sind die Parameter, die in erster Linie zur Optimierung der PCR variiert wurden. Dazu wurde so verfahren, dass für die Amplifizierung einer jeden codierenden Sequenz drei Ansätze mit zwei Parallelen vorbereitet wurden. Die beiden Parallelen wurden dann jeweils bei einer Annealingtemperatur im Thermocycler getestet. Anschließend erfolgte die Überprüfung auf erfolgreiche Vervielfältigung mittels elektrophoretischer Auftrennung im Agarosegel (vgl. Kap. 3.4). Als Testtemperaturen wurden immer 57° C, 60° C und 63° C gewählt. Es wurde die Temperatur als optimale Annealingtemperatur festgelegt, bei der im Gel eine möglichst intensive gut abgegrenzte einzelne Bande vorlag.

In einem Fall war mit steigender Temperatur zu erkennen, dass eine vorhandene unspezifische zweite Bande immer schwächer wurde. In diesem Fall wurde die Optimierung noch auf Ansätze bei 65° C und 67° C ausgeweitet. Erwartungsgemäß lag bei 67° C nur noch eine Bande vor, so dass dies die optimale Temperatur ergab.

Es gab PCR Ansätze, deren zugehörige Banden auch nach Weglassen der Q Solution nicht auf eine erfolgreiche Vervielfältigung schließen ließen. In diesen Fällen wurde statt der üblichen Top 9 Polymerase dann HotStar 9 Polymerase eingesetzt. Verlief auch hier die Amplifizierung erfolglos, wurden neue Primerpaare bestellt und getestet. Diese wurden auch bestellt, wenn die Sequenzierung trotz optimal erscheinender Banden keine lesbaren Basenabfolgen ergab.

3. METHODEN 56 Die optimierten Primer und Annealingtemperaturen sind im Anhang aufgeführt (vgl. Anhang 8.1 bis 8.4).