Der Vergleich der Träger und Allelfrequenzen (vgl. Anhang 8.5) ergibt für die Varianten in Intron 5 und Intron 11 keine statistischen Unterschiede zu den anderen Fallgruppen. Für Intron 5 standen keine Trägerinformationen für das CEU Kollektiv zum Vergleich zur Verfügung.
Für Intron 9 stellt sich eine vergleichbare statistische Situation dar wie für Intron 5. Aus dem für IVS9+42 C>T statistisch signifikanten Unterschied zwischen dem untersuchten Gesamtkollektiv und demjenigen von Akbari (2009) können keine Aussagen über einen Zusammenhang mit Mammakarzinom abgeleitet werden. Der Unterschied zu den Allelfrequenzen im CEU Kollektiv ist nicht signifikant (p = 0,115). Vermutungen über eine Korrelation der Varianten in Intron 5, 9 und Exon 10 können mit den zur Verfügung gestellten HapMap Daten für diese Gruppe nicht erhärtet werden (vgl. Anhang 8.5).
Alle Varianten liegen außerhalb der Donor und Akzeptorspleißstellen, die mittels MaxEntScore geprüft werden können. Somit ergibt sich für diese Basenaustausche, auch nach manueller Überprüfung, kein Anhaltspunkt für alternatives Spleißen oder eine andere Beeinflussung des Genprodukts und in Zusammenschau mit den statistischen Daten kein Anlass zur Durchführung einer Fall Kontroll Studie. Allerdings könnten diese SNPs trotzdem mit dem Mammakarzinom assoziiert sein, wenn sie mit einer verursachenden Mutation im Kopplungsungleichgewicht stehen. Dieses zu prüfen sei weiteren Studien vorbehalten.
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Im Folgenden werden die entdeckten Varianten mit Hilfe epidemiologischer Methoden weiter diskutiert. Dazu richtete sich die Aufmerksamkeit auf die Kopplung von Polymorphismen, welche zur Identifizierung neuer, mit der Erkrankung einhergehender Haplotypen dienen kann. Die Analyse der Kopplung von SNPs führt zu Kopplungsgruppen, die durch einen SNP repräsentiert werden können. Dieser wird als tagSNP bezeichnet. Er soll hier herausgestellt werden, um für zukünftige Assoziationsstudien die Grundlage für eine effiziente Analyse zu bieten.
Die in Kap. 4.7.4 durchgeführte Kopplungsanalyse ergab einen starken Hinweis auf Kopplungsungleichgewicht von p.I76I (Exon 3) und p.T448T (Exon 9) mit D` = 1 und r² = 95 %. Für p. I76I (Exon 3) und IVS12 17 G>A (Intron 12) waren ebefalls D` = 1 und r² = 95 %. Die Korrelation zwischen p.T448T und IVS12 17 G>A war mit r² = 100 % und
) D` = 1 perfekt. He (2009) beschrieben eine Korrelation für diese SNPs von mehr als 80 % in dem untersuchten Kollektiv unselektierter Frauen. Für das CEU Kollektiv wird für das Kopplungsungleichgewicht von Exon 3 und Exon 9 D` = 1 und r² = 96,6 % angegeben und für das zwischen Exon 3 und Intron 12 D` = 1 und r² = 96,5 %. Zwischen Exon 9 und Intron 12 ist D` = 0,964 und r² = 93 %. Diese Angaben beziehen sich auf die Analyse von 60 Individuen von November 08. Somit ergibt sich durch den Vergleich der Kollektive kein Hinweis auf einen weiter zu erforschenden Unterschied. Bezüglich der Festlegung von tagSNPs genügt es, genau einen der drei SNPs dafür auszuwählen.
Für IVS5 42 A>T, IVS9+42 C>T und p.C511R kann ausschließlich auf die im Rahmen dieser Arbeit erhobenen Daten zurückgegriffen werden. Es besteht jeweils vollständiges Kopplungsungleichgewicht zwischen zweien der drei SNPs mit D`= 1 und r² = 100 %. Die Wahl eines der drei SNPs genügt als tagSNP. Die Korrelation der SNPs unterstützt die Bedeutung der Durchführung einer Fall Kontroll Studie.
Abschließend sei noch das Kopplungsungleichgewicht von p.P435L und p.I76I, p.T448T und IVS12 17 G>A genannt. Hier ist im untersuchten Kollektiv D` = 1 und r² = 20 % bzw. 21 %.
Diese Werte sind identisch mit denen des CEU Kollektivs für p.P435L und p.I76I bzw.
p.T448T (HapMap Data Hase III/Rel #2, Feb09). Somit zeigt sich hier unter der Berücksichtigung, dass IVS12 17 G>A zu 93 % mit p.T448T korreliert, kein Unterschied zu einem unselektierten Kollektiv.
Im folgenden sollen nun die Haplotypen im untersuchten und im CEU Kollektiv verglichen werden, um Hinweise auf eine Assoziation mit familiärem Mammakarzinom zu finden.
Die CEU Daten wurden aus den HapMap Data Rel22, Nov08 von 60 Individuen extrahiert.
Dabei ergaben sich folgende Haplotypen:
+ A Links: Haplotypen CEU Kollektiv (60 Individuen). Rechts: Haplotypen untersuchtes deutsch weißrussisches Gesamtkollektiv (46 Individuen).
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: Haplotypen mit einer Frequenz unter 2 % wurden nicht in den Vergleich aufgenommen. Es ergibt sich kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den gemeinsamen Haplotypen der Kollektive. Schließt man im untersuchten Gesamtkollektiv die vier SNPs mit einer Allelfrequenz unter 5 % aus den Betrachtungen aus, so fehlen in den oben betrachteten Haplotypen die SNPs in Intron 5 und Intron 9 im Vergleich, da für das CEU Kollektiv diesbezüglich keine Daten zur Verfügung standen. Die Studie von Rebbeck (2011) hat gezeigt, dass bestimmte Haplotypen der Gene des Deubiquitinierungskomplexes das Risiko für Mamma bzw. Ovarialkarzinom beeinflussen. Für einen Haplotypen, der mit ca. 18 % in seinem Kollektiv von bzw. positiven Frauen vertreten war, stellte er eine signifikante Senkung der „Hazard Ratio“ für Ovarialkarzinom fest (HR = 0,69; 95%KI 0,50 bis 0,97). Dieser Haplotyp enthält die Varianten p.P435L und p.C511R. p.P435L ist vom Wildtyp und p.C511R enthält die Variante. Das entspricht dem obigen Haplotypen TCACA, der zu 4,2 % vertreten ist. Es ergibt sich also kein Hinweis darauf, dass der von Rebbeck (2011) beschriebene Haplotyp das Mammakarzinomrisiko beeinflusst. In der beschriebenen Studie war dies auch nicht der Fall.
Da die Haplotypfrequenzen der gemeinsamen Haplotypen in dem CEU Kollektiv und im hier untersuchten Gesamtkollektiv statistisch gleich sind, ist eine Assoziation einer dieser Haplotypen mit familiärem Mammakarzinom zwar nicht vordringlich zu vermuten aber auch nicht ausgeschlossen. Der Haplotyp TTACA kommt nur im untersuchten Gesamtkollektiv und nicht im CEU Kollektiv vor (p = 0,095). Wollte man dies weiter untersuchen, wäre die Haplotypfrequenz zu bedenken. Mit den für eine Fall Kontroll Studie zur Verfügung stehenden 1000 Proben pro Gruppe, und einer Trägerfrequenz von 2,3 %, wäre mindestens eine OR = 3 nötig, um sie mit α = 0,05 und einer Power von 80 % absichern zu können. Bei einer Trägerfrequenz von 4,2 % müsste die „Odds Ratio“ größer als 2 sein. Die Sequenzierung weiterer Proben wäre notwendig, um besser abschätzen zu können, ob mit den Daten Signifikanz zu erreichen wäre. Ist dies für die seltenen Haplotypen der Fall, kann eine genaue Bestimmung auch der häufigen Haplotypen erwartet werden. Um sie ökonomisch zu bestimmen, reicht es aus, die Varianten in Exon 3 (oder Exon 9), 8 und 10 zu untersuchen.
Durch die Korrelation sind damit die Varianten in Exon 9 (bzw. Exon 3) und Intron 12 mit hinreichender Genauigkeit ebenfalls festgelegt. Für eine Fall Kontroll Studie mit weiteren deutschen und weißrussischen Proben wären durch die Korrelation von Exon 10 mit Intron 5 und 9 diese durch die oben genannten SNPs ebenfalls automatisch festgestellt.
; Sollten auch die seltenen Varianten mitbestimmt werden, so sind als tagSNPs, wie in Kapitel 4.7.4 erläutert, die SNPs in Exon 3, Intron 5, Exon 8 und Intron 11 zu wählen. Die korrelierenden SNPs könnten jeweils durch einander ersetzt werden.
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Zusammenfassend bleibt festzustellen, dass durch die präsentierten Untersuchungen sowohl auf molekulargenetischer als auch auf epidemiologischer Ebene kein überzeugender Hinweis auf eine Assoziation einer Veränderung in oder seinem Protein mit familiärem Mammakarzinom gegeben werden kann. Dennoch ist eine solche Assoziation nicht ausgeschlossen. Die Bestimmung der Haplotypen im Rahmen einer Fall Kontroll Studie bietet die Möglichkeit, eine Assoziation zu finden (vgl. Kap. 5.2.6). Da für die Haplotypbestimmung die Varianten in Exon 9 und 10 untersucht werden können, können diese Daten dann noch für genauere Aussagen über die Variante p.T448T, für die ein Zusammenhang mit alternativem Spleißen möglich wäre und die Variante p.C511R, für die eine signifikante Odds Ratio im Rahmen meiner Metaanalyse bestimmt wurde, ausgewertet werden.
Ergänzend wäre mit den Daten eines größeren Kollektivs die Untersuchung von Assoziationen zu einzelnen klinischen Parametern möglich. Die genetische Untersuchung von Mammakarzinompatientinnen mit positivem Trägerstatus bezüglich anderer Gene, die für die Entstehung von familiärem Mammakarzinoms verantwortlich gemacht werden, würde die Möglichkeit eröffnen, neue „modifier“ zu finden.
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Aus der Tabelle (vgl. Anhang 8.6) geht hervor, dass für in beiden Kollektiven eine synonyme Mutation p.K279K und fünf intronständige Varianten gefunden wurden. Alle Varianten wurden bereits in der NCBI Datenbank gelistet. Zusätzlich wurden dort eine weitere synonyme Mutation und eine „missense“ Mutation neben weiteren intronständigen Varianten genannt. Solyom konnten in ihrem finnischen Kollektiv von Frauen mit
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familiärem Mammakarzinom und hohem oder moderatem Risiko neben zwei intronständigen Varianten zusätzlich zur synonymen Mutation p.K279K zwei weitere und eine „missense“
Mutation finden, die nicht in der NCBI Datenbank zu finden waren (Solyom , 2010).
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Diese Variante (c.837G > A) wurde mittels ESEfinder 3.0 untersucht. Durch den Basenaustausch sinkt der Score für die Bindung von SRp40 auf ungefähr die Hälfte, was aber nicht quantitativ betrachtet werden darf (vgl. Kap. 4.4.3.2). In der Umgebung gibt es noch weitere Bindungsstellen für das Protein, so dass eine relevante Beeinflussung des Spleißvorgangs unwahrscheinlich erscheint. Somit ist eine Auswirkung auf die Funktion von MERIT40 nicht zu erwarten. Allerdings können synonyme Varianten in seltenen Fällen auch die Translationseffizienz oder die Proteinstruktur beeinflussen (Nackley 2007, Kimchi Sarfaty 2007, Tsai 2008). Eine solche Möglichkeit kann hier nicht ausgeschlossen werden.
Für die in der Tabelle (vgl. Anhang 8.6) aufgeführten Frequenzen zu p.K279K konnte für keine der gelisteten Studien ein statistischer Unterschied ermittelt werden. Insbesondere waren die Frequenzen des im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Gesamtkollektivs und des CEU Kollektivs statistisch gleich. Die angegebenen Heterozygotenfrequenzen waren in den untersuchten Kollektiven insgesamt geringer als in dem von Solyom untersuchten finnischen Kollektiv. Solyom führten für diese Variante eine Fall Kontroll Studie in ihrem Kollektiv durch und konnten bei 125 Fällen versus 192 Kontrollen für die Odds Ratio von 1,1 keinen statistisch gesicherten Unterschied zwischen den Gruppen finden (Solyom , 2010). Durch die im Rahmen dieser Arbeit ermittelten Daten ließ sich die Wahrscheinlichkeit für einen Zusammenhang mit dem familiären Mammakarzinom nicht erhärten.
Die von Antoniou (2010) durchgeführte und nach Abschluss meiner Arbeit veröffentlichte umfangreiche genomweite Assoziationsstudie kommt zu differenzierteren Ergebnissen. Hier konnte bei 6516 Kontrollen und 6353 Fällen die Odds Ratio von 1,07 ebenfalls nicht statistisch gesichert werden (95%KI von 0,89 bis 1,29 für die homozygote
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