Tierärztliche Hochschule Hannover Klinik für Pferde
Prophylaxe der Rhodococcus equi-Pneumonie bei Fohlen durch Vakzination mit Rhodococcus equi-Impfstoff und
Adjuvans CpG X: Vergleich eines kurzen und langen Impfprotokolls
INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin
Doctor medicinae veterinariae
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Nicole Dittrich aus Niemtsch
Hannover 2008
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. E. Klug
1. Gutachter: Prof. Dr. E. Klug
2. Gutachter: Prof. Dr. P. Valentin-Weigand
Tag der mündlichen Prüfung: 15.04.2008
Aus Liebe und Dankbarkeit
meiner Mutter gewidmet
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung … ……… 11
2. Literaturübersicht ………... 13
2.1. Rhodococcus equi: der Erreger ……….. 13
2.1.1. Geschichte und Taxonomie ……….. 13
2.1.2. Morphologie und Kultivierung ……… 13
2.1.3. Virulenzfaktoren . ……… 14
2.1.4. Epidemiologie und Pathogenese ... 15
2.2. Rhodococcus equi-Erkrankung beim Fohlen ………... 16
2.2.1. Klinische Symptome ……….. 16
2.2.2. Pathomorphologische Befunde bei der R. equi-Pneumonie ………. 18
2.2.3. Labordiagnostische Befunde bei der R. equi-Pneumonie ……… 19
2.2.4. Bildgebende Verfahren ……….. 21
2.3. Prophylaxe der R. equi-Pneumonie des Fohlens ………. 22
2.3.1. Management und Haltungsbedingungen ……… 22
2.3.2. Mutterschutzimpfung ………. 23
2.3.3. Hyperimmunplasma bei Fohlen ……… 24
2.3.4. Impfung der Fohlen ……… 25
2.4. Das Immunsystem des Fohlens im Zusammenhang mit einer R. equi-Infektion ………... 26
2.5. Adjuvantien ……… 30
2.5.1. CpG-Motive ………. 30
2.5.2. CpG-Motive als Impfstoff-Adjuvantien ……… 31
2.6. Die intranasale Applikation von Impfstoffen ………. 33
3. Material und Methode ……….. 36
3.1. Material ………. 36
3.1.1. Probanden ………. 36
3.1.2. Haltung und Fütterung ………. 36
3.1.3. Impfung und Entwurmung ……… 37
3.1.4. Erstversorgung der Fohlen ……….. 37
3.1.5. Bedingungen für die Aufnahme in die Studie ……… 38
3.1.6. Einteilung der Probanden in Gruppen ……… 38
3.1.7. Rhodococcus equi-Impfstoff ……… 39
3.1.8. Impfung der Probanden ……… 40
3.2. Methode ………. 42
3.2.1. Klinische Untersuchung der Fohlen ……….. 42
3.2.2. Klinische Untersuchung des Respirationstraktes ……… 42
3.2.3. Labordiagnostische Untersuchung ……… 43
3.2.4. Spezielle Untersuchung des Respirationstraktes ……… 43
3.2.5. Beurteilung der Befunde der Fohlen ………. 45
3.3. Statistische Auswertung ………. 46
4. Ergebnisse ………. 47
4.1. Fohlen, die vorzeitig aus der Studie ausschieden …. ……….. 47
4.2. Das Auftreten von Lungenabszessen ………. 48
4.2.1. Morbidität ……….. 48
4.2.2. Erkrankungsalter ………. 49
4.3. Untersuchungsbefunde ………. 52
4.3.1. Klinische Symptome ……… 52
4.3.2. Anzahl der Blutleukozyten am Tag der Diagnose ………. 53
4.3.3. Ultrasonographische Lungenbefunde ……….. 54
5. Diskussion ……….. 59
5.1. Probanden ……… 59
5.1.2. Impfprotokoll……… 61
5.1.3. Klinische Wirksamkeit ……… 65
5.1.4. Morbidität und Befunde ………... 68
5.2. Schlussfolgerung ……… 70
6. Zusammenfassung ……… 72
7. Summary ………. 74
8. Literaturverzeichnis ………. 76
9. Anhang ………. 98
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
BALF bronchoalveoläre Lavage-Flüssigkeit BHV bovines Herpesvirus
bzw. beziehungsweise
°C Grad Celsius
ca. circa
CAMP-Phänomen nach den Entdeckern Christie-Aktins-Munch-Petersen
CD Cluster of Differentiation (System zur Bezeichnung von Differenzierungsantigenen)
cm Zentimeter
CpG Cytosin-Phosphat-Guanosin CTL cytotoxische T-Zelle
DNA Desoxyribonukleinsäure
EHV Equines Herpesvirus
ELISA enzym linked immunosorbent assay HIV humane immunodeficiency virus
Ig Immunglobulin
IL Interleukin
IFN Interferon
kDa Kilodalton
kg Kilogramm
KGW Körpergewicht
mg Milligramm
µg Mikrogramm
MHC major histocompatibility complex
ml Milliliter
µl Mikroliter
mm Millimeter
µm Mikrometer
NK-Zellen natürliche Killerzellen PCR polymerase chain reaction
p.o. per os
RNA Ribonucleinsäure
SD Standardabweichung
s.o. siehe oben
ssp. Subspezies
TBS Tracheobronchialsekret
Th T-Helferzelle
TLR Toll-like-Rezeptor
TNF Tumornekrosefaktor
Vap virulenz-assoziierte Proteine VLP virus-like particels
z.B. zum Beispiel
Die chemischen Elemente werden dem internationalen Periodensystem entsprechend abgekürzt.
1. Einleitung
Atemwegserkrankungen verursachen, neben Darminfektionen, bei Fohlen bis zu einem Alter von sechs Monaten am häufigsten wirtschaftliche Verluste. Eine besonders schwere Form der Pneumonie wird durch den Erreger R. equi verursacht.
Dieses Bakterium ist weltweit verbreitet und ubiquitär in der Umgebung von Pferden vorhanden. Es verbleibt und vermehrt sich intrazellulär in Makrophagen. In dieser Altersklasse führt es zu Bronchopneumonien und pyogranulomatösen Veränderungen der Lunge. Sowohl sporadisch als auch endemisch können diese Erkrankungen in der Fohlenaufzucht auftreten. Die Morbidität liegt zwischen 5-80%, wobei die Letalität bis 80% betragen kann.
Durch die relative Unempfindlichkeit von R. equi gegenüber Umwelteinflüssen, entstehen in Gestüten mit hoher Besatzdichte vermehrt Verluste in der Fohlenaufzucht. Je früher die Krankheitsursache diagnostiziert und eine gezielte antibiotische Therapie eingeleitet werden kann, desto günstiger ist die Prognose für die Fohlen. Durch eine gezielte antibiotische Therapie konnte die Überlebensrate von 20% auf fast 90% gesteigert werden. Die Therapie ist aber sehr kosten- und zeitintensiv und darüber hinaus mit erheblichen Nebenwirkungen für die Fohlen verbunden. Daher ist der Bedarf an einer Prophylaxe sehr groß. Bisher konnten jedoch weder die Vakzinierung von Mutterstuten, noch eine aktive oder passive Immunisierung der Fohlen einen Schutz der Jungtiere bewirken.
Da es Hinweise dafür gibt, dass bei Fohlen die humorale Immunantwort keinen Schutz gegen die R. equi-Pneumonie darstellt, wird die zelluläre Immunantwort beim Neonaten als ein Ansatz zur Vorbeugung der Rhodokokkose diskutiert.
In der Human- und Veterinärmedizin liegen Hinweise aus Untersuchungen in vivo und in vitro dafür vor, dass Bestandteile bakterieller DNA, die so genannten Oligodeoxynukleotide, die zelluläre Immunantwort steigern. Entscheidende Strukturelemente der Oligodeoxynukleotide sind bestimmte Cytosin-Guanosin- Sequenzen, die so genannten CpG-Motive (KRIEG, 2002).
Das schleimhautassoziierte Immunsystem von Wirbeltieren verfügt über einen zum Teil unabhängigen vom restlichen Immunsystem arbeitenden Schutzmechanismus gegenüber bestimmten Erregern, wie z.B. R. equi. Unter anderem werden bei wiederholter Auseinandersetzung mit einem Agens Gedächtniszellen gezielt an die betroffene Schleimhautregion gelenkt (JANEWAY u. TRAVERS, 2002).
In der vorliegenden Studie wurde die klinische Wirksamkeit eines intranasal applizierten R. equi-Impfstoffs mit dem Adjuvans CpG X bei Fohlen in Bezug auf ein kurzes und langes Impfprotokoll untersucht. Diese Untersuchung erfolgte in Anlehnung an eine vorangegangene Studie von HULLMANN (2006) mit den gleichen Untersuchungsbedingungen. Der Einsatz wurde in einem endemisch mit Rhodokokkose verseuchten Gestüt durchgeführt.
2. Literaturübersicht
2.1. Rhodococcus equi: der Erreger
2.1.1. Geschichte und Taxonomie
MAGNUSSON identifizierte 1923 erstmals Rhodococcus equi als ursächlichen Erreger einer purulenten Bronchopneumonie bei Fohlen und nannte ihn damals Corynebacterium equi. Darauf folgten weitere Beschreibungen des Keims durch MIESSNER und WETZEL (1923) in Hannover. Anfänglich herrschte über die taxonomische Einordnung keine Einigkeit. Erst durch bessere Untersuchungsmethoden konnten in der Zellwand dieses Bakteriums N-glykosilierte Muraminsäurereste nachgewiesen werden, die als spezifisch für Nocardien, Mykobakterien und Rhodokokken gelten. Durch neuere DNA- und RNA- Untersuchungen zur Unterscheidung der verschiedenen Keime erfolgte eine genauere Zuordnung des Erregers und eine endgültige Umbenennung in Rhodococcus equi (SUZUKI et al., 1981).
2.1.2. Morphologie und Kultivierung
Das Rhodococcus equi (R. equi) Bakterium hat ein pleomorphes Erscheinungsbild, lässt sich grampositiv anfärben, bildet keine Sporen, ist unbeweglich und umhüllt von einer Polysaccharidkapsel. Nach 24 Stunden aerober Bebrütung bei 37°C auf festem, nicht selektivem Nährboden, wie Blutagar, erscheinen kleine, feucht glänzende, schleimige, grau-weiße Kolonien. Nach 48 Stunden sind die Kolonien rötlich lachsfarben, haben einen erdigen Geruch, sind ca. 1-4 mm groß und haben die Tendenz zu konfluieren (MAGNUSSON, 1923; PRESCOTT, 1991). Für die gezielte Anzüchtung von R. equi haben sich Selektivmedien z.B. das so genannte NANAT- Selektivmedium (Nalidixin-Acid-Novobiocin-Acid-Tellurit) oder CAZ-NB-Medium (Ceftazidim-Novobiocin-Agar) bewährt (WOOLCOCK et al., 1979; BARTON u.
HUGHES, 1981; MARTENS et al., 1982; TAKAI u. TSUBAKI, 1985; VON GRAEVENITZ u. PÜNTER-STREIT, 1995).
2.1.3. Virulenzfaktoren
Da R. equi in den meisten Pferdebeständen nachzuweisen ist, es aber nicht überall zu Krankheitsausbrüchen kommt, wird angenommen, dass es Stämme mit höchst unterschiedlichen Virulenzfaktoren gibt. So sind Isolate klinisch erkrankter Fohlen virulenter als solche aus der Umwelt (ROONEY et al., 1966) und Stämme, die aus Bodenproben endemisch betroffener Betriebe isoliert werden, weit virulenter als solche aus Gestüten ohne R. equi-Vorgeschichte (BOWLES et al., 1987; TAKAI et al., 1991). Die unterschiedliche Virulenz der R. equi-Stämme beruht auf dem Vorhandensein so genannter Virulenzfaktoren (TAKAI, 1997).
Virulenzfaktoren können Kapselpolysaccharide sein, die die Leukozytenfunktion hemmen, oder auch andere Zellwandbestandteile, die vermutlich an der Granulombildung im Lungengewebe des Wirtes beteiligt sind (HONDALUS, 1997).
Ebenso können Enzyme wie z.B. die Cholesteroloxidase, die Cholinphosphohydrolase und das Exoenzym Phospholipase C die Membranstabilität beeinflussen.
Als wichtigster Virulenzfaktor von R. equi hat sich ein 15 - 17 kDa großes Protein erwiesen, das an der Oberfläche des Bakteriums expremiert wird, das so genannte VapA (Virulence associated proteinA) (TAKAI et al., 1995; HONDALUS, 1997;
GIGUÈRE et al., 1999; LÜHRMANN et al., 2004). Das vapA-Gen ist auf einem 80 - 85kb großen Plasmid lokalisiert (TAKAI et al., 1991; GIGUÈRE et al., 1999). R. equi- Stämme, die dieses Plasmid nicht besitzen, sind nicht fähig, sich in Makrophagen zu vermehren und sind daher avirulent für Fohlen (HONDALUS und MOSSER, 1994;
HONDALUS, 1997; WADA et al., 1997; GIGUÈRE et al., 1999; MEIJER und PRESCOTT, 2004).
Auch aus R. equi-Stämmen infizierter Schweine konnte ein Plasmid isoliert werden, das ein 20 kDa großes Protein, das VapB, kodiert (TAKAI et al., 2000; MAKRAI et al., 2002). In Mäusen sind Isolate vom Schwein, die VapB enthalten, allerdings weniger virulent als solche vom Fohlen, die VapA exprimieren (TAKAI et al., 1996;
LÜHRMANN et al., 2004). Sieben weitere extrazelluläre Proteine aus der Vap- Familie sind bis heute bekannt, VapC, D, E, F, G, H und I (TAKAI et al., 1991;
BYRNE et al., 2001; POLIDORI und HAAS, 2006). Die Expression der vap-Gene ist temperatur- und pH-Wert-abhängig, sie steigt bei höherer Temperatur (37 °C) und niedrigerem pH (6,5) (TAKAI et al.1996; MEIJER und PRESCOTT, 2004). Auch eine
niedrige Eisen-Konzentration wirkt förderlich auf die Genexpression (JORDAN et al., 2003; REN et al., 2003).
Ein Transkriptionsrepressor, der die eisenabhängige Genexpression reguliert, ist IdeR (Iron-Dependent-Regulatory-Protein). Es unterdrückt die Transkription in Gegenwart von Eisen, indem es an eine verwandte Bindungsstelle bindet. Da die Promotorregion des vapA-Gens eine für IdeR übereinstimmende Bindungsstelle besitzt, ist anzunehmen, daß die eisenabhängige VapA-Expression durch das ideR- Gen kontrolliert wird (REN et al., 2003; MEIJER und PRESCOTT, 2004). Ein weiteres Gen, das für die Virulenz von R. equi eine Rolle spielt, ist die Isocitratlyase (aceA), die für die Assimilation von Fettsäuren und Acetat erforderlich ist (KELLY et al., 2002; WALL et al., 2005).
2.1.4. Epidemiologie und Pathogenese
Bei der R. equi-Pneumonie des Fohlens handelt es sich um eine weltweit verbreitete Erkrankung mit wachsender wirtschaftlicher Bedeutung. Mit Streptococcus equi ssp.
zooepidemicus ist R. equi der häufigste Infektionserreger bei Atemwegserkrankungen des Fohlens im Alter von vier Wochen bis sechs Monaten (BARTON u. HUGHES, 1980; GIGUÈRE u. PRESCOTT, 1997; ALTHAUS, 2004;
COHEN et al., 2005). In betroffenen Gestüten werden bei Fohlen Erkrankungsraten von 40 bis 80 % und eine Letalität von 5 bis 17 % beobachtet (MARTENS et al., 1982).
Insgesamt kommen R. equi-Erkrankungen in einigen Gestüten endemisch und in anderen nur sporadisch vor. Die R. equi-Pneumonie wird in einigen Gestüten in manchen Jahren saisonal gehäuft diagnostiziert (CHAFFIN et al., 2003). Laut TAKAI et al. (1991, 1994) korreliert die Krankheitshäufigkeit allerdings nicht mit dem Keimdruck, sondern mit dem Vorhandensein des Virulenzproteins A.
Besonders in warmen, trockenen und windigen Sommern wird der Großteil der Fälle diagnostiziert, da in dieser Zeit ein besonders staubiges Klima herrscht. Obwohl R.
equi keine Sporen bildet, besitzt der Keim eine große Widerstandsfähigkeit (MAGNUSSON, 1923; ELLENBERGER u. GENETZKY, 1986), vor allem gegenüber Trockenheit, UV-Strahlung, Säuren und Basen (TAKAI et al., 1991). In feuchter Umgebung verläuft die Vermehrung des Erregers weniger effektiv (BARTON u.
HUGHES, 1984; HUGHES u. SULAIMAN, 1987).
Bei R. equi handelt es sich um einen ubiquitär vorkommenden Bodensaprophyten (SMITH, 1966) mit hoher Tenazität und mit geringen Wachstums- und Nährstoffansprüchen. Der Keim vermehrt sich im Kot von Pferden, Rindern, Schafen, Ziegen, Hunden, Katzen, Hühnern und Tauben. (BARTON u. HUGHES, 1984).
Dabei kommt es bei anderen Tierarten, im Gegensatz zu Pferden, nur vereinzelt zu den charakteristischen Erkrankungsformen des Atmungstraktes (CARMAN u.
HODGES, 1987).
Als Infektionswege kommen vor allem die Aufnahme von Kot und das Einatmen von R. equi-haltigem Staub in Frage. Auch kontaminierte Ställe sind ein hoher Risikofaktor (MUSCATELLO et al., 2006). Es wird aber auch die Möglichkeit einer omphalogenen oder intrauterinen Infektion diskutiert (BARTON und HUGHES, 1980;
BEECH und SWEENEY, 1991). Danach entwickeln Fohlen vorwiegend Lungenläsionen in den cranioventralen Lungenarealen (MARTENS et al., 1982;
BARTON u. EMBURY, 1987; ALTHAUS, 2004).
Die orale Infektion bzw. das Abhusten und anschließende Herunterschlucken des Erregers führten bei etwa 50% der Fohlen, bei denen in der Sektion eine R. equi- Pneumonie diagnostiziert wurde, auch zu intestinalen Veränderungen (ZINK et al., 1986; TAKAI et al., 1995). Makroskopisch sichtbare Darmläsionen treten nur dann auf, wenn Fohlen große Keimmengen über längere Zeit oral aufgenommen haben (ZINK et al., 1986).
Im Gegensatz zu der hohen Prävalenz bei Fohlen, werden Erkrankungen durch den Erreger R. equi bei adulten Pferden nur in Einzelfällen beschrieben (PRESCOTT, 1991). In diesen seltenen Fällen liegt meistens eine andere Erkrankung vor, die das Immunsystem schwächt, wie ein Tumor oder eine Pneumonie. Allerdings kann es bei der Stute bei Infektionen des Genitaltraktes zu Fertilitätsproblemen und Aborten kommen (BRUNER et al., 1939; SIPPEL et al., 1968; SZEREDI et al., 2006).
2.2. Rhodococcus equi-Erkrankung beim Fohlen
2.2.1. Klinische Symptome
Die Pneumonie ist die häufigste durch R. equi verursachte Erkrankungsform. Dabei entwickeln betroffene Fohlen eine chronisch eitrige, abszedierende
Bronchopneumonie mit eitriger Lymphadenitis (MARTENS et al., 1982). Die Rhodokokkose kann klinisch perakut oder akut verlaufen. Am häufigsten wird diese Erkrankung bei den Fohlen jedoch in der chronischen Form diagnostiziert.
In der perakuten Verlaufsform treten plötzliche Todesfälle innerhalb weniger Tage auf. Es kommt zu akuter Atemnot und plötzlich hohem Fieber, ohne dass Symptome einer respiratorischen Erkrankung vorangegangen sind. Trotz intensiver Behandlung versterben diese schwer erkrankten Fohlen.
In der akuten Phase zeigen die Fohlen Inappetenz, Apathie, Tachykardie, Tachypnoe und erhöhte Körperinnentemperatur bis 41°C, sowie Husten und bilateralen mukopurulenten Nasenausfluss. Bei der Auskultation von Lunge und Trachea werden Rasseln und Giemen festgestellt (MARTENS et al., 1982; FALCON et al., 1985; GIGUÈRE u. PRESCOTT, 1997).
Im späteren Verlauf kann es zu einer erhöhten Atem- und Pulsfrequenz kommen. Die Fohlen werden lethargisch und anorektisch. Aufgrund von Dyspnoe und kardialer Schwäche versterben sie (HARAKAWA u. MORITA, 1949; FALCON et al., 1985;
KNOTTENBELT, 1993).
Die chronische Verlaufsform der R. equi-Pneumonie zeigt gleiche Symptome wie die akute Form, jedoch deutlich schwächer. Weiterhin sind Abmagerung, struppiges Fell und trockener Husten als Begleiterscheinungen bei den Fohlen zu beobachten.
In endemisch betroffenen Beständen, in denen regelmäßig Untersuchungen der Fohlen zur Früherkennung der R. equi-Pneumonie stattfinden, fallen bereits einige Fohlen durch erhöhte Leukozyten- oder Fibrinogenwerte im Blut auf, bevor klinische Symptome zu beobachten sind. Häufig sind weder Blutparameter verändert, noch sind klinische Krankheitsanzeichen bei Fohlen festzustellen, obwohl bei diesen sonographisch Lungenabszesse darstellbar sind (ALTHAUS, 2004). Die Fohlen zeigen erste Krankheitsanzeichen erst in einem Stadium, in dem das Lungengewebe bereits stark geschädigt ist (MARTENS et al., 1982). Eine Tachypnoe ist erst dann zu beobachten, wenn die Fohlen zur Bewegung angeregt werden oder bei erhöhter Umgebungstemperatur (PRESCOTT u. HOFFMAN, 1993).
Neben Atembeschwerden durch Lungenveränderungen, ist auch Durchfall ein weiteres klinisches Symptom einer R. equi-Erkrankung. Dieser tritt vor allem als Folge von ulzerativen Darmläsionen auf (BARTON u. HUGHES, 1980; AINSWORTH, 1999). Diese Erkrankungsform beginnt als pyogranulomatöser Prozess, der sich ulzerierend von den Peyerschen Platten bis hin zu den lokalen Lymphknoten ausbreitet (JOHNSON et al., 1983; WEISS u. RUDOLPH, 1988).
Außerdem können Osteomyelitiden und septische, aber auch aseptische Arthritiden, beobachtet werden. Durch Immunkomplexablagerungen kommt es zu aseptischen Arthritiden, die ebenso zu Uveitis, Hypopyon und Anämie führen können. Bei hämatogener Streuung kann es in seltenen Fällen zu Abszessen in Leber- und Nierenparenchym kommen. Hautabszesse, Serositiden wie Peritonitis, Pleuritis und Pericarditis wurden ebenfalls vereinzelt bei Fohlen mit einer R. equi-Erkrankung beschrieben (CHAFFIN u. MARTENS, 1997; AINSWORTH, 1999).
2.2.2. Pathomorphologische Befunde bei der R. equi-Pneumonie
Bei der chronischen Verlaufsform der Lungenentzündung durch R. equi beim Fohlen zeigt die Lunge eine bilaterale abszedierende Bronchopneumonie mit Atemwegsobstruktionen und Parenchymverdichtungen (AINSWORTH, 1999). Größe und Verteilung der Lungenabszesse sind sehr variabel. Multifokale Abszesse von miliarer Größe bis zu Abszessen mit einem Durchmesser von sieben Zentimeter zeigen sich eher im ventralen Lungenbereich. In den caudalen Lungenlappen treten die Abszesse nur vereinzelt auf. Ebenfalls können Abszesse generalisiert verstreut über die ganze Lunge vorkommen (ZINK et al., 1986).
Der Abszessinhalt stellt sich von graurot bis gelb und zähflüssig bis krümelig, käsig sowie in einem unangenehmen Geruch dar (AINSWORTH, 1999). Das umgebende Lungengewebe der Abszesse ist verdichtet oder eingeschmolzen, während die Pleura nur selten am Entzündungsgeschehen beteiligt ist (BARTON u. HUGHES, 1980; ELLENBERGER u. GENETZKY, 1986). An der Schnittfläche der betroffenen Lungenbereiche tritt mukopurulentes Sekret aus den Bronchien aus (BARTON u.
HUGHES, 1980). Im weiteren Verlauf werden die Bronchial- und Mediastinal- lymphknoten in das Geschehen mit einbezogen, die in diesen Fällen stark vergrößert sind und durch eine ödematöse oder nekrotische Schnittfläche auffallen (ZINK et al., 1986).
Des Weiteren können bei der Sektion des erkrankten Tieres multifokale ulzerative Enteritiden im Dickdarm, Blinddarm und Dünndarm beobachtet werden. Ebenso erscheinen die dazugehörigen Mesenterial- und Darmlymphknoten vergrößert (ZINK et al., 1986). Außerdem treten entzündliche Veränderungen in den Gelenken auf. Bei der systemischen Verbreitung des Erregers können Abszesse in Leber, Niere und Haut oder Serositiden festgestellt werden (AINSWORTH, 1999; ZINK et al., 1986).
Bei der histologischen Untersuchung ist zu beobachten, dass erkrankte Lungenbereiche einen pyogranulomatösen Charakter aufweisen (ELLENBERGER u.
GENETZKY, 1986). Im Zentrum der Abszesse befindet sich nekrotisches Zellmaterial, das umgeben ist von zugrunde gehenden neutrophilen Granulozyten. Die Peripherie ist stark infiltriert von Makrophagen. Das die Abszesse umgebende Lungenparenchym ist hyperämisch und ödematös. Im nekrotischen Abszessinhalt, in den Alveolen, im Zytoplasma der Makrophagen und in den neutrophilen Granulozyten sind unterschiedlich viele grampositive Stäbchenbakterien zu erkennen (HILLIDGE, 1986). Nur wenige Rhodokokken werden extrazellulär nachgewiesen (MARTENS et al., 1982).
2.2.3. Labordiagnostische Befunde bei der R. equi-Pneumonie
Hämatologie
Labordiagnostische Parameter haben sich zur Früherkennung der R. equi- Pneumonie als dienlich erwiesen (GIGUÈRE et al., 2003; ALTHAUS, 2004).
Im Blut von an Rhodokokkose erkrankten Fohlen wird häufig eine neutrophile Leukozytose und eine Hyperfibrinogenämie beobachtet. Daher sollte bei Fohlen eines Bestandes mit endemischer R. equi-Pneumonie ab einem Wert von 13.000 Leukozyten/µl Blut der Verdacht einer Lungenentzündung erhoben und infolgedessen weitere Untersuchungen eingeleitet werden (GIGUÈRE et al., 2003).
Eine Blutleukozytenzahl unter 13.000 Zellen/µl schließt allerdings eine R. equi- Pneumonie keineswegs aus. Dies zeigten Ergebnisse einer Studie an 66 Fohlen mit sonographisch bestätigter abszedierender Pneumonie, in der bei 75% der Tiere ein Blutleukozytenwert von unter 13.000/µl bestimmt wurde (ALTHAUS, 2004).
Parallel mit der Leukozytenzahl wird bei an R. equi-Pneumonie erkrankten Fohlen ein erhöhter Plasmafibrinogengehalt über 400 mg/dl ermittelt. In einigen Fällen treten diese Veränderungen der Blutwerte bereits vor den klinischen Symptomen auf (GIGUÈRE et al., 2003).
Mikrobiologische Verfahren
Die sichere Diagnose einer R. equi-Pneumonie kann nur aus dem Tracheobronchialsekret durch kulturelle Anzucht des Erregers (HILLIDGE, 1987;
GIGUÈRE u. PRESCOTT, 1997; MEYER-HAMME, 2004) oder durch zytologische Untersuchungen mit Hilfe der Gramfärbung (SWEENEY et al., 1987) oder Immunfluoreszenztechnik gestellt werden (ANZAI et al., 1997).
Dazu werden Tracheobronchialsekretproben verwendet (TBS), die aus den tiefen Atemwegen der Patienten gewonnen wurden. Durch postmortale Untersuchungen an erkrankten Fohlen wurde R. equi deutlich seltener in den Atemwegen, als im Abszessmaterial nachgewiesen (HILLIDGE, 1987; WEIMAR, 2006).
Die kulturelle Isolierung erfolgt auf verschiedenen Selektivnährböden. Aus Tracheobronchialsekret oder Blut kann der Nachweis über die PCR durch Amplifizierung bestimmter Gensequenzen des Erregers schnell durchgeführt werden (TAKAI et al., 1995; SELLON et al., 1997). Die Methode scheint spezifisch zu sein, ist aber bei kranken Fohlen wenig sensitiv (TAKAI et al., 1998; HEYERS, 2005).
Die Befunde der kulturellen- und der PCR-Untersuchung hinsichtlich R. equi sollten infolge der verschiedenen Untersuchungsergebnisse stets im Zusammenhang mit den klinischen Symptomen und den klinischen Laborparametern betrachtet werden.
Dabei kann die PCR die kulturelle Untersuchung nicht ersetzen, sondern lediglich bestätigen. Bei der kulturellen Untersuchung können evtl. noch andere pathogene Keime, die für das Krankheitsgeschehen verantwortlich sind, nachgewiesen werden (GIGUÈRE, 2001; SELLON et al., 2001).
Serologie
Für die Diagnostik von R. equi Erkrankungen bei Fohlen wurden bisher zahlreiche Verfahren zur Bestimmung der Antikörperkonzentrationen getestet und eingesetzt. In einer Studie an Fohlen, die klinische Befunde einer Pneumonie zeigten, erlaubte die
Agargel-Immundiffusion (AGID) eine Aussage darüber, welche Fohlen exponiert gegenüber R. equi gewesen waren. Dafür gab es aber keine Übereinstimmung mit dem kulturellen Nachweis aus Tracheobronchialsekret (HOFFMAN et al., 1993).
Mehrere Enzym-linked-immuno-sorbent-assays (ELISA) sind zur Diagnostik der Fohlen-Rhodokokkose entwickelt worden. Die Antikörperkonzentration eignet sich nicht zur sicheren Differenzierung zwischen gesunden und an R. equi erkrankten Fohlen, wie durch Studien gezeigt werden konnte (MARTENS et al., 2002;
TRISKATIS, 2004; PAUL, 2005).
Ebenso kann anhand des ELISA-Ergebnisses nicht zwischen einer Infektion mit virulenten und avirulenten Stämmen differenziert werden, sofern nicht gezielt der Nachweis von Antikörpern gegen einen Virulenzfaktor geführt wird (PRESCOTT u.
SWEENEY, 1985; TAKAI et al., 1985; PRESCOTT et al., 1996; GIGUÈRE, 2001).
Vielmehr liegt der Nutzen serologischer Tests mehr in der Aussage einer generellen Exposition eines Bestandes gegenüber R. equi, als in der Einzeltierdiagnostik (GIGUÈRE u. PRESCOTT, 1997; AINSWORTH, 1999). Ein serologischer Nachweis bedeutet nicht zwingend eine Erkrankung, sondern weist nur auf eine Infektion mit dem Erreger und auf eine darauf folgende Reaktion des Immunsystems hin.
2.2.4. Bildgebende Verfahren
Die sonographische und röntgenologische Untersuchung haben sich als bildgebende Diagnostik für Atemwegserkrankungen bei Fohlen bewährt. Bei der sonographischen Untersuchung stellen sich pleuranahe Lungenveränderungen sowohl mit einem Sektor- als auch einem Linearscanner mit einer Frequenz von 5 bis 7,5 MHz gut dar.
Die Abszesse erscheinen im Ultraschallbild als umschriebene, schallleitende, anechogene bis echogene Bereiche, die häufig von einer echogenen Kapsel umgeben sind. Bei älteren, in Abheilung befindlichen Abszessen, zeigt sich eine bienenwabenartige durchbaute, echogene Struktur (REIMER, 1990; REEF, 1991). Im Gegensatz zur sonographischen Methode ermöglicht die radiologische Untersuchung die Darstellung auch tief liegender Lungenveränderungen und deren Ausdehnung im Lungengewebe. Abszesse zeigen sich im Röntgenbild als lokal umschriebene Verschattungen.
Es wird vermutet, dass bei älteren Fohlen der Erreger Streptococcus equi ssp.
zooepidemicus ähnliche röntgenologische Veränderungen wie R. equi hervorruft
(RAMIREZ et al., 2004). Nur bei sehr jungen Fohlen sind diese Röntgenbefunde, wie z.B. Lungenabszesse pathognomonisch für eine R. equi-Erkrankung (HILLIDGE, 1986). Der sonographischen Untersuchung wird eine höhere Sensivität als der röntgenologischen Untersuchung in diesem Bereich zugesprochen, da sich sonographisch auch kleinere pneumonische Veränderungen, Verdichtungen des Lungenparenchyms oder Pleuraergüsse erfassen lassen (RAMIREZ et al., 2004;
WALTHER, 2006).
2.3. Prophylaxe der R. equi-Pneumonie des Fohlens
2.3.1. Management und Haltungsbedingung
In Gestüten mit einer hohen Anzahl an Zuchtstuten und Fohlen, sowie einem erhöhtem Durchgangsverkehr mit Landmaschinen und Tieren, besteht ein höheres Risiko, dass die Rhodokokkose zu einem Bestandsproblem wird. Daher gilt es in diesen Betrieben die Haltung und das Management zu optimieren, um die Fohlen vor einer Infektion mit dem Erreger zu schützen. Durch eine frühe gezielte Behandlung erkrankter Fohlen soll die Ausscheidung von R. equi und folglich die Kontamination in der Umwelt reduziert werden. Langfristig soll dadurch der Infektionsdruck gesenkt werden (COHEN et al., 2002; CHAFFIN et al., 2003).
Früherkennungsprogramme haben sich hinsichtlich der Reduktion von Fohlenverlusten bewährt. In Zuchtbetrieben mit endemischer Rhodokokkose wird empfohlen, jedes Fohlen regelmäßig zu untersuchen. Dazu gehört eine Adspektion des Tieres, die Lungenauskultation, die Temperaturkontrolle, die Bestimmung der Blutleukozytenzahl und des Plasmafibrinogengehaltes, sowie eine röntgenologische- und sonographische Lungenuntersuchung (COHEN et al., 2000; GIGUÈRE et al., 2003). Werden bei diesen Untersuchungen auf eine R. equi-Erkrankung hinweisende Befunde erhoben, (z.B. vermehrt gefüllte Gelenke, Lethargie, Nasenausfluss)sollte schnellstmöglich mit der Therapie begonnen werden, um die Letalität zu senken (PRESCOTT et al., 1989).
In Gestüten mit endemischer R. equi-Pneumonie sind Hygienemaßnahmen, ein konsequentes Impfprogramm gegen Herpes, Influenza und Tetanus sowie ein Entwurmungsprogramm als sinnvoll zu sehen (CHAFFIN et al., 2003), obwohl COHEN et al. (2005) diesen Maßnahmen keine entscheidende Bedeutung zuspricht.
Es ist auf jeden Fall empfehlenswert erkrankte Fohlen mit den Mutterstuten separat zuhalten, da sich der Erreger im Fohlenkot vermehren kann (GIGUÈRE, 2001;
COHEN et al., 2002). Darum sollte grundsätzlich in diesen Betrieben Staub durch Beregnung der Treibwege und durch Pflege der Grasnarbe vermieden werden. Auch die Reduzierung der Herdengröße, ein Rotationssystem auf den Weiden und ein Auskoffern von kontaminierten Paddocks werden empfohlen (FALCON et al., 1985;
COHEN et al., 2002; CHAFFIN et al., 2003). Insgesamt kann aber durch Optimierung von Haltung und Management das Auftreten von R. equi-Pneumonien bei den Fohlen eines Gestütes mit endemischer Rhodokokkose nicht verhindert werden (CHAFFIN et al., 2003). Daher ist die Entwicklung einer Prophylaxe, bei der die Fohlen eine Immunität gegen den Erreger R. equi aufbauen könnten, von großem Interesse. Dies wurde bereits mit unterschiedlichem Erfolg versucht durch die Übertragung schützender Antikörper an die Fohlen oder durch eine aktive Immunisierung der Fohlen in vereinzelten Berichten.
2.3.2. Mutterschutzimpfung
Versuche, die Mutterstuten zu impfen, um über die kolostrumvermittelten R. equi- spezifischen Antikörper die Fohlen vor einer Rhodokokkose zu schützen, ergaben unterschiedliche Ergebnisse. Durch Impfung von Stuten mit einem R. equi- Totimpfstoff wurde der spezifische Antikörpergehalt im Kolostrum der Mutterstuten erhöht. Bei den dazugehörigen Fohlen wurde dann ebenfalls ein hoher Gehalt an spezifischen Antikörpern im postkolostralem Serum ermittelt, welche jedoch die Fohlen nicht vor einer R. equi-Pneumonie schützen konnten (MADIGAN et al., 1991;
TRISKATIS, 2004). Nach Impfung der Mutterstuten mit einem Lebendimpfstoff zeigte sich ebenso ein Anstieg der R. equi-Antikörper beim Fohlen. Nach experimenteller Infektion konnte aber auch hier kein signifikanter Unterschied von Erkrankungs- und Überlebungsraten zwischen der Kontrollgruppe und den Fohlen von geimpften Mutterstuten festgestellt werden (MARTENS et al., 1992).
Bei einer über mehrere Jahre laufenden Studie wurden 800 Mutterstuten mit einem R. equi-Totimpfstoff geimpft. Es konnte in der Zeit von 1992 bis 1995 dadurch die
Letalität von 3 auf 1,2 % gesenkt werden (BECÙ et al., 1997). Aus diesen Studien ist allerdings nicht zu erfahren, in welcher Weise die Haltung und das Management der Tiere auf den verschiedenen Gestüten erfolgte.
2.3.3. Hyperimmunplasma bei Fohlen
Die Verabreichung von Anti-R. equi-Hyperimmunplasma an Fohlen als Prophylaxemaßnahme wurde bereits von den Erstbeschreibern der Fohlenrhodokokkose untersucht (MIESSNER u. WETZEL, 1923).
Dabei besteht die Möglichkeit Serum von adulten Pferden, die bereits eine Infektion mit R. equi erfolgreich überstanden haben, zu gewinnen (SCHMIEDHOFFER u.
LAPOK, 1922), oder von erwachsenden Pferden, die mit einem R. equi-Tot- oder - Lebendimpfstoff immunisiert wurden. Weiterhin wurde beobachtet, dass infundiertes Hyperimmunplasma Fohlen einen besseren Schutz bei einer experimentellen Infektion bietet, als die Immunisierung durch Kolostrum (MARTENS et al., 1989, 1992; MADIGAN et al., 1991). In einer klinischen Studie wurde sieben Fohlen ein kommerzielles Hyperimmunplasma transfundiert und weiteren elf Fohlen ein spezifisches Anti-R. equi-Hyperimmunplasma mit aufgereinigten Immunglobulien gegen die Virulenzfaktoren VapA und VapC verabreicht. Beide Versuchsgruppen zeigten weniger klinische Symptome und in der Sektion geringere Lungenveränderungen als die Kontrollgruppe. Aus diesen Ergebnissen ist abzuleiten, dass den virulenz-assoziierten Proteinen eine besondere Bedeutung in der Infektiösität von R. equi eingeräumt werden sollte (HOOPER-McGREVY et al., 2001).
Ebenso wichtig wie der Inhalt des Hyperimmunplasmas, scheinen auch der Zeitpunkt und die Häufigkeit der Infusion ausschlaggebend zu sein. Die Infusion des Hyperimmunplasmas sollte vor der ersten Exposition mit dem Erreger stattfinden.
Dazu wurde in einer Untersuchung in einem Gestüt mit endemischer Rhodokokkose eine einmalige Infusion von Hyperimmunplasma bis zum 60. Lebenstag als ausreichend angesehen (MADIGAN et al., 1991). Für Gestüte mit hoher Prävalenz von R. equi-Erkrankungen und hoher Letalität wird eine Infusion mit Hyperimmunplasma am ersten Lebenstag und in der dritten Lebenswoche vorgeschlagen (COHEN et al., 2000). Die Infusion eines Hyperimmunserums am ersten und zehnten bis zwölften Lebenstag hatte keinen Einfluss auf die Erkrankungsrate (SCHULTE, 2005). Für eine endgültige Aussage über die Wirksamkeit von Hyperimmunplasma bei Fohlen gibt es bislang keine größere Studie mit standardisierten Geburtsbedingungen. Das gilt auch für die Zusammensetzung des angewendeten Plasmas. Denn sowohl Plasma als auch Serum enthalten neben den Antikörpern auch unspezifische immunologisch wirksame Faktoren (wie z.B.
Interferon, Lymphokine, Fibronectin, Komplementfaktoren) die zur Ausbildung einer Schutzwirkung gegen eine Erkrankung mit R. equi-Erregern beitragen (MARTENS et al., 1989).
2.3.4. Impfung der Fohlen
Eine wirksame Impfung gegen R. equi beim Fohlen ist zurzeit nicht verfügbar. Über die prophylaktische Wirksamkeit von spezifischem Hyperimmunplasma gegen die Rhodokokkose der Fohlen liegen auch bei der aktiven Immunisierung von Fohlen unterschiedliche Ergebnisse vor. Der Einsatz eines Totimpfstoffs bei Fohlen wird als wirkungslos beschrieben (BECÙ et al., 1997; PRESCOTT et al., 1997b).
VARGA et al. berichten 1997 in einer Feldstudie über zwölf Monate an 38 Fohlen und Stuten von einem Formalin-inaktivierten R. equi-Impfstoff allein und in Kombination mit einer Equines-Herpes-Virus-2-Vakzine (EHV-2). Die Stuten wurden sechs und zwei Wochen vor der Geburt mit drei Milliliter des entsprechenden Impfstoffes intramuskulär (i.m.) geimpft. Die dazugehörigen Fohlen wurden drei, fünf und sieben Wochen nach der Geburt mit der gleichen Impfstoffzusammensetzung i.m. geimpft. Dabei kam es zur Reduzierung von Morbidität und Letalität bei den Fohlen. Die geimpften Fohlen zeigten gegenüber der Kontrollgruppe keine klinischen Symptome einer R. equi-Pneumonie und serologisch wurde ein höherer Antikörpertiter im Blut der Fohlen festgestellt.
Mit einem oral verabreichten R. equi-Lebendimpfstoff konnte keine Immunität erreicht werden, die bei experimenteller Infektion sowohl eine Erkrankung verhinderte als auch eine schnelle Beseitigung des Erregers aus der Lunge bewirkte (CHIRINO- TREJO et al., 1987). In einer weiteren Studie wurden vier Fohlen durch orale Applikation mit zwei Milliliter eines Lebendimpfstoffes mit dem virulenten Stamm ATCC 33701 am zweiten, siebten und 21. Lebenstag geimpft. Danach erfolgte eine intratracheale Infizierung mit einem virulenten R. equi-Stamm. Die Fohlen der Kontrollgruppe erkrankten an der R. equi-Pneumonie innerhalb von 14 Tagen nach der Infektion. Dagegen zeigten die immunisierten Tiere keine klinischen Symptome und zwei Wochen nach der Infektion auch keine pathologischen Lungenbefunde.
Damit wurde gezeigt, dass der orale Weg für eine Immunisierung mit virulenten R.
equi-Stämmen nicht immunsuppressiv wirkt und dass Fohlen im Alter von drei
Wochen eine schützende Immunantwort aufbauen können (HOOPER-McGREVY et al., 2005).
Es gibt Bedenken gegen den Einsatz von Lebendimpfstoffen in endemischen mit R.
equi belasteten Gestüten, da es im Fohlendarm möglicherweise zu einer Vermehrung des Erregers kommen kann. Um dieses Risiko zu minimieren, ist es notwendig schwach virulente Mutanten zu entwickeln, die dennoch einen ausreichenden Schutz den Fohlen bieten können.
Im Mittelpunkt der Entwicklung neuer Impfstoffe stand in den letzten Jahren das virulenz-assoziierten Protein A (VapA), das im Mäusemodell eine verstärkte Th1- Antwort hervorruft (PRESCOTT et al., 1997a). Darüber hinaus induziert VapA in Pferden die Bildung schützender VapA-Antikörper, die in experimentell mit R. equi infizierten Mäusen zu einer dosisabhängigen Eliminierung des Erregers aus allen Geweben führt (FERNANDEZ et al., 1997).
Eine DNA-Vakzine kombiniert mit VapA, die bei erwachsen Ponys gleichzeitig intradermal und intranasal verabreicht wurde, führte zum Anstieg von Antikörpern gegen VapA im Serum und in der Bronchoalveolären-Lavage-Flüssigkeit (BALF) (LOPEZ et al., 2003). Zellen aus der BALF zeigten in vitro eine signifikant höhere Proliferationsrate nach einer erneuten Auseinandersetzung mit dem VapA als nach der Infektion mit unspezifischen R. equi-Antigen. Dieser Impfstoff steigert bei Fohlen nicht die zelluläre Immunität sondern erhöht den Antikörpergehalt gegen VapA im Serum und in der BALF. Im Vergleich zu einem Lebendimpfstoff, bewirkten aber weder die DNA-Vakzine noch das VapA in Mäusemodellen einen ausreichenden Schutz bei einer experimentellen Infektion.
2.4. Das Immunsystem des Fohlens im Zusammenhang mit einer R. equi- Infektion
Vom Immunsystem des Fohlens, insbesondere von der Immunreaktion auf eine R.
equi-Infektion sind noch nicht alle Aspekte bekannt. Vor allem ist noch unklar, welche Besonderheiten des Immunsystems bei Fohlen im Alter bis zu sechs Monaten zur Anfälligkeit für diesen Erreger führen. Lange Zeit wurde ein kausaler und zeitlicher Zusammenhang zwischen dem Schwinden maternaler Antikörper, der noch
unvollständig ausgeprägten humoralen und zellulären Immunität und der R. equi- Erkrankung der Fohlen vermutet. Diese Hypothese ist mehrfach revidiert worden.
Zelluläre Immunantwort
Die zelluläre Immunantwort ist für den Schutz vor einer R. equi-Erkrankung besonders wichtig, da der Erreger sich intrazellulär im Wirt aufhält.
In vitro zeigten neutrophile Granulozyten von Fohlen eine ähnliche Phagozytose- Aktivität- und Abtötungsrate von R. equi, wie neutrophile Granulozyten von adulten Pferden (YAGER, 1987). Weiterhin wurde festgestellt, dass Fohlen, die in den ersten sechs Lebensmonaten an einer R. equi-Pneumonie erkranken, in der zweiten und vierten Lebenswoche signifikant weniger neutrophile Granulozyten im Serum aufweisen als gesunde Fohlen (CHAFFIN et al., 2004). Daraus ergibt sich, dass phagozytierende Zellen bei Fohlen zwar einsatzfähig sind, aber ihre chemotaktischen und phagozytierenden Eigenschaften aufgrund der geringen Anzahl von Opsoninen im Serum begrenzt sind (GIGUÈRE u. POLKES, 2005).
In einem Mäuseversuch zeigte sich, dass R. equi abgetötet wird, wenn das Zytokin Interferon-γ (IFN-γ) vorliegt (DARRAH et al., 2000). Werden Makrophagen durch das von T-Zellen sezernierte INF-γ und durch den von Makrophagen selbst produzierten TNF-α aktiviert, sind diese Zellen in vitro in der Lage, Stickstoff- und Sauerstoffderivate, die sich zu Peroxynitrit verbinden, zu synthetisieren. Durch die freigesetzten Sauerstoff- und Stickstoffradikale werden intrazellulär Bakterien, wie R.
equi abgetötet (DARRAH et al., 2000).
In einem Versuch konnte bei Fohlen, die experimentell mit einem virulenten R. equi- Stamm infiziert waren, aus den Bronchiallymphknoten CD4+-T-Zellen (T-Helferzellen) isoliert werden. Dabei war erkennbar, dass virulente Rhodokokkenstämme bei erkrankten Fohlen die Zytokinexpression beeinflussen, insbesondere die IFN-γ- Produktion durch CD4+ T-Lymphozyten unterdrücken, aber auch einen Anstieg der Konzentration des IL-10 verursachen (GIGUÈRE et al., 1999). Hingegen zeigte eine Studie an erwachsenen Pferden eine andere Reaktion der Lymphozyten auf die Auseinandersetzung mit R. equi. Es wurden aus der BALF (Bronchoalveolären- Lavage-Flüssigkeit) adulter Pferde, die 14 Tage zuvor durch Inhalation mit R. equi infiziert worden waren, Lymphozyten isoliert und anschließend mit R. equi-Antigen oder mit VapA inkubiert. Diese Zellen zeigten eine signifikant höhere INF-γ-
Produktion als Zellen, die nicht in vitro mit dem Erreger in Kontakt kamen (LOPEZ et al., 2002). Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Eliminierung von virulentem R.
equi bei experimentell infizierten erwachsenen Pferden mit einer erhöhten Anzahl von IFN-γ produzierenden CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten im Blut verbunden ist (HINES et al., 2003).
Weiterhin zeigten R. equi-spezifische CD8+-zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) die Eigenschaft, die Zellen zu zerstören, die mit dem intrazellulär persistierenden Erreger infiziert sind, während nicht infizierte Zellen unversehrt blieben. Dabei wurde festgestellt, dass die Antigenpräsentation unabhängig vom üblichen MHC-1-Weg, der bei der Reaktion intrazellulärer Erreger wie Viren abläuft, geschieht, und dass CD1+- Zellen für die Antigenpräsentation und damit die Stimulierung der CTLs verantwortlich sind (PATTON et al., 2004). Bei einer erneuten Auseinandersetzung mit dem Erreger R. equi beruht die Eliminierung des Keims bei immunkompetenten adulten Pferden auf einem starken lokalen Übertritt von antigen-spezifischen T- Gedächtniszellen aus den betroffenen Lymphknoten der Lunge (PATTON et al., 2005). Dagegen können die CTLs der Fohlen, die kurz nach der Geburt und im Alter von drei Wochen aus dem Blut gewonnen wurden, nicht die infizierten Zellen zerstören. Die Fohlen zeigten aber nach etwa acht Wochen eine CTL-Aktivität, die mit der von adulten Tieren vergleichbar ist. PATTON et al. (2005) vermuten, dass es zu einer verstärkten Anfälligkeit der Fohlen gegenüber R. equi kommt, weil die Stimulierung des Immunsystems über Toll-like Rezeptor-2 in diesem Alter unzureichend ist.
Humorale Immunantwort
Über die Aufgabe der humoralen Abwehr bei einer R. equi-Infektion liegen gegensätzliche Meinungen vor. Besonders kontrovers wird die passive Immunisierung von Fohlen gesehen. Einige Studien geben Hinweise auf eine gute Wirksamkeit von Hyperimmunplasma und der Muttertierschutzimpfung zur Prophylaxe an (ZINK et al., 1985; HIETALA u. ARDANS, 1987). MARTENS et al.
(1989) messen der humoralen Abwehr von R. equi eine große Bedeutung bei, seitdem sie die Wirksamkeit eines Hyperimmunplasmas zur Prophylaxe in einem Betrieb an nur zwölf Fohlen bestätigten. Gleichzeitig räumen sie aber auch ein, dass unspezifische Faktoren wie Fibronektin, Komplementfaktoren, Interferon und
Lymphokine zur Wirksamkeit beigetragen haben können. Nach experimenteller Infektion von Fohlen mit R. equi zeigt sich, dass die Immunantwort aus einer Produktion spezifischer Antikörper, einer vermehrten Reifung von B-Lymphozyten und einer erhöhten Phagozytose-Aktivität der Alveolarmakrophagen besteht (ARDANS et al., 1986). In vitro wurde durch eine erhöhte Konzentration spezifischer R. equi-Antikörper, die Opsonisierung der Erreger und die Verschmelzung der Phagolysosomen in den Makrophagen verbessert. Die Makrophagen stammten von juvenilen oder adulten Pferden, die zuvor mit R. equi infiziert wurden (HIETALA u.
ARDANS, 1987). Neben der Menge eines Immunglobulins wird die Opsonierungsrate von der Antigenspezifität und dem Isotyp bestimmt (JANEWAY et al., 2002).
Andere Autoren zweifeln an einer schützenden Wirkung der Antikörper im Rahmen der R. equi-Infektion oder halten sie für dosisabhängig (FERNANDEZ et al., 1997).
Das bedeutet, dass ein Fohlen bei einer starken Exposition in endemisch infizierten Gestüten bereits eine große Menge spezifischer Antikörper im Blut aufweisen muss, um einer Invasion durch R. equi standzuhalten.
Weiterhin konnte beobachtet werden, dass sich bei Fohlen und adulten Pferden, die sich erfolgreich mit virulenten Feldstämmen von R. equi auseinandergesetzt hatten und bei erkrankten Fohlen, eine unterschiedliche Aufteilung in der IgG-Fraktion zeigte. Bei den gesund gebliebenen Tieren eines endemisch betroffenen Gestütes lagen im Verhältnis mehr Antikörper des Isotyps IgGa (IgG1) vor und weniger IgGb (IgG4) oder IgGT (IgG3/IgG5), während bei den Fohlen, die an einer R. equi- Pneumonie erkrankten, der Gehalt der Isotypen IgGb (IgG4) und IgGT (IgG3/IgG5) erhöht war (HOOPER-McGREVY et al., 2003). Da die erfolgreiche Eliminierung von R. equi mit einer Th1-Antwort einhergeht, spiegelt IgGa (IgG1) möglicherweise den Th1-Charakter einer Immunantwort wider und IgGb (IgG4) und IgGT (IgG3/IgG5) die Polarisierung in Richtung einer Th2-Antwort. In einer späteren Studie konnte diese Verteilung der Isotypen allerdings nicht mehr beobachtet werden (HOOPER- McGREVY et al., 2005). Vielmehr zeigten die Fohlen, die einmal mit einer Lebendvakzine immunisiert wurden und nach experimenteller Infektion klinisch gesund blieben, vor allem einen signifikant erhöhten Gehalt an IgGT (IgG3/IgG5).
Daraus ergab sich für die Autoren, dass die isotypenspezifische Antikörper-Antwort nicht als allgemeingültiger Indikator für einen Schutz angesehen werden kann. Im Gegenteil, die isotypenspezifische Antikörper-Antwort ist abhängig vom
Infektionsweg und davon, ob die Infektion experimentell oder auf natürlichem Weg erfolgt.
2.5. Adjuvantien
Impfstoffe bestehen aus gereinigten Antigenen, die selten allein immunogen sind.
Die klinisch wirksame Immunreaktion wird erst durch einen Zusatz von besonderen Hilfsstoffen, den Adjuvantien erreicht. Diese Adjuvantien sind unspezifische wirksame Substanzen, die in Kombination mit Antigenen einen verstärkten, schnelleren und länger anhaltenden Immunisierungseffekt bewirken. Diese Wirkstoffe spielen besonders bei der Applikation von Totvakzinen, Peptidvakzinen und Spaltvakzinen eine große Rolle. Größere Bedeutung haben z.B. anorganische Kolloide, wie Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, ferner Mineralöl, Saponin und abgetötete Mykobakterien, sowie abgetötete Bordetella pertussis-Bakterien, bakterielle Polysaccharide, bakterielle Hitzeschockproteine und bakterielle DNA. Der immunisierende Effekt wird durch die langsamere Resorption des Antigens von der Injektionsstelle und die daraus resultierende längere Verweildauer an der Injektionsstelle (Depotwirkung) begünstigt. Weiterhin beruht die Adjuvanswirkung auf der Aktivierung von Makrophagen, die partikuläre Adjuvans-Antigen-Präparationen stärker phagozytieren und Cytokine freisetzen, welche die spezifische Lymphozytenantwort verstärken (WIESNER u. RIBBECK, 2000).
Wiederum wirken Adjuvantien verhältnismäßig schwach, wenn sie nicht Bakterien oder deren Produkte enthalten. Bakterielle Zellwandbestandteile oder abgetötete Bakterien weisen den Nachteil auf, dass sie selbst als Antigene erkannt werden und damit zu ungewollten Immunantworten führen können und folgend unerwünschte Nebenwirkungen verursachen. Moderne Adjuvantien, wie CpG-Motive rufen solche unerwünschten Reaktionen aufgrund der geringen Molekülgröße und der Erkennung durch spezifische Rezeptoren (TLR) nicht hervor (JANEWAY et al., 2002).
2.5.1. CpG-Motive
Seit den achtziger Jahren des letzten Jahrhunderts ist die stimulierende Wirkung bakterieller DNA in Bezug auf das Immunsystem von Säugetieren bekannt. Die
tumorunterdrückende Wirkung einzelsträngiger DNA wird durch die erhöhte Produktion von IFN-α, -β und -γ und die gesteigerte Vermehrung der natürlichen Killerzellen (NK)-Zellen erklärt (TOKUNAGA et al., 1988). Als entscheidendes Strukturelement für die immunstimulierende Wirkung dieser Oligodeoxynukleotide wurde ein zentraler Cytosin-Guanosin-Kern erkannt (KRIEG et al., 1995). Cytosin- Phosphat-Guanosin-Motive (CpG-Motive) sind einzelstrangige DNA-Sequenzen, die in 5-3-Richtung ein Cytosin-Phosphat-Guanosin-Dinukleotid (CpG-Dinukleotide) besitzen, wobei am C5-Atom des Cytosins keine Methylgruppe gebunden ist. Die stimulierende Wirkung der Oligodeoxynukleotide wird aufgehoben durch ihre Methylierung oder der Umkehrung zu Guanosin-Cytosin (HAECKER et al., 2002).
Die DNA von Wirbeltieren besitzt diese Wirkung nicht, da sie in der Regel in methylierter Form vorliegt. Es bestehen speziesspezifische Unterschiede bezüglich der optimalen Sequenz und der zwei flankierenden Nukleinsäuren in 3- und in 5- Richtung. Außerdem bewirkt eine zunehmende Sequenzlänge, d.h. die Anzahl der CpG-Dinukleotide, eine verstärkte Immunantwort, so dass heute die eingesetzten synthetischen Sequenzen zum Teil aus über 20 Nukleotiden bestehen (HAECKER et al., 2002). Die flankierenden Basen werden aufgrund ihrer Wirkung in immun- stimulatorische und in immun-neutralisierende Sequenzen eingeteilt. In den Genomen von Wirbelsäulentieren überwiegen die immun-neutralisierenden Sequenzen. Hingegen in der DNA von Bakterien finden sich hauptsächlich immun- stimulatorische Sequenzen. Dies erklärt zusätzlich, warum vor allem bakterielle DNA Einfluss auf das Immunsystem hat (KRIEG et al., 1998a) In der Humanmedizin wurde in vitro, als Effekte synthetischer CpG-Motive, die B-Zell-Proliferation, die Aktivierung von dendritischen Zellen, Makrophagen und Monozyten und zusätzlich die verstärkte Abwehr der natürlichen Killerzellen bisher beobachtet. In vivo verstärken CpG-Motive die CD4+T-Zell-Antwort, die in Th1-Richtung abläuft (KRIEG, 2002).
2.5.2. CpG-Motive als Impfstoff-Adjuvantien
Ein weiterer Vorteil von CpG-Motiven ist die besonders gesteigerte zelluläre Abwehrreaktion, neben der insgesamt verstärkten Immunantwort. Im Rahmen einer Impfung von juvenilen Rindern gegen das bovine Herpesvirus-1 (BHV-1) bewirkte der Einsatz von synthetischem Oligodeoxynukleotide mit nichtmethylierten CpG
Dinucleotide (CpG ODN) eine starke und ausgeglichene Immunantwort gegen diese Zielspezies (IOANNOU et al., 2002a). Auch im Vergleich zu anderen TLR-Liganden erzeugen CpG-Motive einen besseren Schutz, der auf der gesteigerten Aktivität der spezifischen zytotoxischen T-Zellen beruht, die im Zusammenhang mit intrazellulären Erregern von entscheidender Bedeutung ist (SCHWARZ et al., 2003).
Im Gegensatz zu Aluminiumverbindungen besitzen CpG-Motive den Vorteil, dass sie weniger oder keine Gewebsirritation erzeugen (RANKIN et al., 2002; VLEUGELS et al., 2002). In einem Versuch an Schweinen mit dem Impfstoff BioThrax gegen die Milzbranderkrankung konnte gezeigt werden, dass der Impfstoff mit dem Zusatz von nichtmethylierten CpG-Motiven im Vergleich zu dem Impfzusatz mit Aluminiumverbindungen, in einer geringeren Dosis eingesetzt werden konnte (GU et al., 2007). Des Weiteren wurde durch eine subkutane Injektion an Schafen beobachtet, dass eine Kombination von CpG-Motiven mit Adjuvantien auf Basis von Mineralöl im Vergleich zum alleinigen Zusatz von Mineralöladjuvantien eine ausgeglichenere Th1:Th2-Antwort erzielt wurde und eine geringere Konzentration verwendet und damit die Nebenwirkungen herabgesetzt werden konnten (IAONNOU et al., 2002b).
Darüber hinaus wurde in Mäusemodellen beobachtet, dass bei hohen Dosierungen von CpG-Motiven von 50 bis 100 µm pro Tier sich Nebenwirkungen wie Splenomegalie oder Lymphadenopathien zeigten (JOSEPH et al., 2002; STORNI et al., 2004). Eine weitere kritische Beobachtung ist die Zersetzung der CpG-Motive durch DNAsen des Körpers, womit die von manchen Autoren beobachtete kurze Wirkungsdauer erklärt werden kann. Daher wurde getestet, ob sich CpG-Motive zusammen mit Antigen in Vesikel verpacken lassen und eine niedrigere Dosis in einer einmaligen intramuskulären oder intranasalen Applikation die gleiche Th1- Antwort auslöst. Diese Formulierung löste in Mäusen mit niedriger Dosierung schon nach einmaliger, sowohl intramuskulärer als auch intranasaler Applikation, die gleiche Th1-Antwort aus, wie die 50-fache Menge des löslichen CpG-Motives (JOSEPH et al., 2002).
Zu ähnlichen Ergebnissen führte die Applikation von CpG-Motiven, die in so genannten virus-like particles (VLPs) aus dem Bakteriophagen Qß untergebracht wurden (STORNI et al., 2004). Die gleichzeitige Verpackung von CpG-Motiven und dem Antigen, gegen das die Tiere immunisiert werden sollen, in ein solches Vesikel,
wies im Mäusemodell keinerlei Nebenwirkungen auf und konnte sogar eine T-Zell- Antwort erzeugen, die mit der eines Lebendimpfstoffes vergleichbar ist.
2.6. Die intranasale Applikation von Impfstoffen
Die Schleimhautoberflächen des Körpers sind, wie die äußere Haut, direkt mit der Umgebung verbunden und daher einer großen Zahl von Krankheitserregern ausgesetzt. Neben mechanischen (tight junctions der Epithelzellen), chemischen (Enzyme, niedriger pH-Wert) und mikrobiologischen Barrieren (kommensale Mikroflora) befindet sich in der Nähe der Oberflächen das Immunsystem der Schleimhaut, das als MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) bezeichnet wird (JANEWAY et al., 2002). Dieses lymphoide Netz der adaptiven Immunantwort ist weitestgehend unabhängig von den lymphatischen Geweben des restlichen Körpers (TIZARD, 2000). Durch so genannte homing-Rezeptoren wandern die Lymphozyten aus den regionalen Lymphknoten gezielt zu der betroffenen Schleimhautoberfläche, wodurch das Geschehen lokal begrenzt bleibt (JANEWAY et al., 2002).
Ein besonderes Kennzeichen der Schleimhautoberfläche ist das vermehrte Aufkommen von Immunglobulin A (IgA), das durch Neutralisation das Interagieren von eingedrungenen Krankheitserregern mit den Epithelzellen verhindert. Diese präzise lokale Immunantwort zeigen auch die Gedächtniszellen. Auf diesem Infektionsweg kann ein Einsatz von intranasalen Impfungen der diesen nachahmt, als sinnvoll erscheinen. Inaktivierte Antigene allein sind bei dieser Impfung wirkungslos, da sie ähnlich wie Proteine der Nahrung oder viele Bestandteile der Umgebungsluft von spezifischen T-Zellen erkannt werden, aber bei Ausbleiben der Costimulierung keine Antwort des adaptiven Immunsystems auslösen. Dagegen zeigen intranasal applizierte Lebendimpfstoffe, wie unter anderem gegen die bovine oder feline Rhinotracheitis (TIZARD, 2000) oder gegen Pseudomonas aeruginosa (PRIEBE et al., 2002), die Ausbildung einer schützenden Immunität. Totimpfstoffe zeigten bisher nur in der Kombination mit Adjuvantien einen Impferfolg, wie z.B.
Choleratoxin (WU et al., 1997), Protoxin von Bacillus thuringiensis (MORENO- FIERROS et al., 2003) oder CpG-Motive (McCLUSKIE et al., 2002; JIANG et al., 2003). Dabei wurde der IgA-Spiegel signifikant erhöht oder die Proliferationsrate der antigenspezifischen Lymphozyten verbessert. In einer Studie an Katzen wurde ein
Impfstoff FIV p24Gag gegen das Feline immunodeficiency virus (FIV) allein oder mit dem schleimhautspezifischen Adjuvans LT (R192G) intranasal verabreicht. Dabei erhöhten sich bei den Tieren, die mit der schleimhautspezifischen Adjuvans geimpft wurden, signifikant der IgG-Spiegel im Serum und der IgA-Spiegel im Speichel.
Zusätzlich entwickelten die Katzen eine starke systemische und mucosale Immunität aus (LEAVELL et al., 2005).
Da Mycobacterium tuberculosis und Rhodococcus equi die Eigenschaft haben im Wirt intrazellulär zu verbleiben, sind Impferfolge von großer Bedeutung. In einer weiteren Studie wurde Rindern der Impfstoff Mycobacterium bovis BCG mit dem Protein Ag85B-ESAT-6 appliziert und mit Hilfe der mucosalen Adjuvans CTA1- DD/ISCOMs stieg die Th1-Antwort an und INF-γ wurde vermehrt sezerniert. Dabei erlangten die geimpften Tiere gegenüber den Tieren die nicht geimpft wurden, einen Impfschutz und es wurde das Vorkommen des bakteriellen Erregers in der Lunge reduziert (ANDERSEN et al., 2007).
Bei Pferden wurde nach Abheilung einer Erkrankung mit Streptococcus equi ssp.
equi ein signifikant höherer Antikörpertiter im Serum gegen drei Proteine FNZ (cell surface-bound fibronectin binding protein), EAG (alpha2-macroglobulin, albumin und Immunglobulin G (IgG) binding protein) und SFS (secreted fibronectin binding protein) ermittelt. Daraufhin wurden Mäuse mit diesen Proteinen intranasal oder subcutan und einem Adjuvans EtxB, einem Bestandteil aus dem hitzstabilen Enterotoxin von Escherichia coli, immunisiert. Dabei ergab sich nach der intranasalen Applikation ein signifikant höherer IgA-Titer in der Schleimhaut und IgG-Titer im Serum gegen FNZ und EAG als nach der subcutanen Injektion. Nach der Impfung mit den beiden Proteinen EAG und FNZ in Kombination mit dem Adjuvans EtxB erfolgte ein sicherer Schutz der Pferde gegen Streptococcus equi ssp. equi (FLOCK et al., 2004).
In einer klinischen Studie an Fohlen eines Gestütes mit endemischer Rhodokokkose wurde ein Totimpfstoff mit einem Adjuvans CpG XXXX zur Prophylaxe gegen Rhodococcus equi eingesetzt (HULLMANN, 2006). Die Studie erfolgte mit 108 Fohlen in einem Warmblutgestüt, die unter gleichen Fütterungs- und Haltungsbedingungen gehalten wurden. Die Fohlen wurden am ersten und am 21.
Lebenstag intranasal mit einem bestandsspezifischen Totimpfstoff geimpft. Eine Fohlengruppe wurde mit dem Totimpfstoff in Verbindung zum Adjuvans CpG XXXX geimpft. Die zweite Fohlengruppe bekam nur den Totimpfstoff und die Fohlen der dritten Gruppe erhielten einen Placebo, bestehend aus 0,9 % Kochsalzlösung. Bei
allen Fohlen erfolgte 14-tägig eine klinische Allgemeinuntersuchung bis zu einem Alter von vier Monaten. In der Gruppe mit dem Impfstoff und dem Adjuvans CpG XXXX erkrankten 13 Fohlen an einer R. equi-Pneumonie und damit signifikant weniger, als die Fohlen der anderen beiden Gruppen mit 22 und 21 Fohlen mit sonographisch darstellbaren Lungenabszessen (HULLMANN, 2006).
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die beschriebenen Mechanismen des mukosalen Immunsystems durch eine intranasale Impfung zu nutzen und mit Hilfe des Adjuvans CpG XXXX die Vakzinierung in die Th1-Richtung zu polarisieren.
Dabei wurde das Protokoll der vorangegangen Arbeit von HULLMANN (2006) geändert. Es sollte untersucht werden, ob ein mehrmaliges Impfen zu einem vollständigen und länger anhaltenden Impfschutz bei den Fohlen führt.
3. Material und Methoden
In dieser Studie sollte die klinische Wirksamkeit eines R. equi-Impfstoffs mit und ohne Adjuvans zur Prophylaxe von Lungenabszessen bei Fohlen eines Gestüts mit endemischer Rhodokokkose untersucht werden. Es handelte sich um eine kontrollierte und randomisierte Blindstudie, in der die Fohlen in festgelegten und unterschiedlichen Zeitabständen geimpft wurden. Die Fohlen wurden über fünf Monate wöchentlich klinisch und gegebenenfalls ultrasonographisch untersucht.
3.1. Material
3.1.1. Probanden
In der vorliegenden Untersuchung wurden 220 Fohlen in dem Zeitraum von Mitte Mai bis Anfang Juli 2006 geimpft und standen bis zum Alter von fünf Monaten (150.
Lebenstag) zur Verfügung. Die Tiere wurden in einem Warmblutgestüt geboren, in dem seit Jahren endemisch, durch R. equi verursachte Pneumonien bei Fohlen auftreten. Bei den 220 Probanden handelte es sich um 115 Stutfohlen und 105 Hengstfohlen unterschiedlicher Warmblutrassen, die unter gleichen Management-, Fütterungs- und Haltungsbedingungen aufwuchsen.
3.1.2. Haltung und Fütterung
Während der Wintermonate wurden die tragenden Stuten in großen Laufhallen mit Stroh und betonierten Außenpaddocks und im Sommer Tag und Nacht auf der Weide gehalten. Vier Wochen vor dem errechneten Geburtstermin wurden die Mutterstuten in einen separaten Abfohlbereich verbracht. Dort wurden sie entweder auf Stroh oder auf Spänen in einer 3x4 Meter großen Abfohlbox gehalten.
Post partum blieben die Stuten mit ihren Fohlen mindestens acht Tage in der Einzelbox und wurden dann in überdachte Gruppenlaufställe, die mit Stroh eingestreut und mit einem betonierten Außenpaddock verbunden waren, verbracht.
Vor einer Neubelegung wurden diese Bereiche ebenfalls wie die Einzelboxen im Abfohlstall gesäubert, mittels Hochdruckreiniger gereinigt und mit Neopredisan 4 %
(Menno-Chemie, Norderstedt, Deutschland) desinfiziert. Ab Mitte Mai 2006 begann die Weidesaison. Dabei wurden alle Fohlen, die älter als vier Wochen waren, mit den Stuten auf die Weide gefahren. Ab Ende September wurden alle Tiere wieder in die Laufställe aufgestallt.
Erkrankte ein Fohlen im Rahmen der wöchentlichen Untersuchung, so wurde die Stute mit ihrem Fohlen in einen Laufstall verbracht und das Fohlen wurde behandelt oder regelmäßig beobachtet.
3.1.3. Impfung und Entwurmung
Die Mutterstuten wurden zweimal jährlich sowohl gegen das Equines Herpesvirus 1 und 4 (EHV 1 und EHV 4) als auch gegen Influenza geimpft und jährlich wurde eine Tetanusimpfung durchgeführt. Bei den Stuten erfolgte alle drei Monate eine Behandlung mit Anthelminthikas. Die Fohlen erhielten das erste Mal am zehnten Lebenstag und anschließend all vier Wochen eine Behandlung gegen den Befall von Helminthen (Nematoden, Zestoden, Trematoden). Die Grundimmunisierung der Fohlen begann mit sechs Monaten gegen Influenza, Tetanus, EHV 1 und EHV 4.
3.1.4. Erstversorgung der Fohlen
Die tragenden Stuten wurden Tag und Nacht von geschultem Personal überwacht.
Direkt nach der Geburt wurde der Nabel versorgt und die Fohlen erhielten zur Prophylaxe gegen Rota- und Coronavirusinfektionen eine einmalige orale aktive Immunisierung mit Scourguard (Fa. Pfizer GmbH, Karlsruhe). Anschließend wurde die IgG-Konzentration des Stutenkolostrums mit einem Refraktometer (Digital Handheld ´Pocket´ Refraktometer PAL-1, Fa. ATAGO CO, LTD, Tokio, Japan) ermittelt. Wenn das Kolostrum einen Berechnungsindex von unter 25% betrug, entsprechend einem IgG-Gehalt von unter 50g/l, wurde dem Fohlen etwa 250 ml gutes Kolostrum per Flasche eingegeben (MARKUS, 2005).
Nach acht bis zehn Stunden erfolgte die erste tierärztliche Untersuchung des Fohlens. Dabei wurde eine klinische Allgemeinuntersuchung durchgeführt mit Auskultation von Herz, Lunge und Trachea, einer Temperaturkontrolle, Palpation und wiederholter Desinfektion des Nabels und Untersuchung auf eventuelle
Missbildungen. Ebenso erfolgte eine Blutentnahme aus der Vena jugularis, zur Bestimmung der Blutleukozytenzahl und der IgG-Konzentration mittels eines so genannten IgG-Testes (Snap Foal IgG-Test, IDEXX GmbH, Wölstadt). Lag der IgG- Gehalt des Fohlens unter 800 mg/dl wurde hochwertiges Kolostrum aus der betriebseigenen Kolostrumbank per Nasenschlundsonde eingegeben.
Im weiteren Verlauf wurden die Fohlen zweimal täglich sieben Tage lang untersucht.
Die Nabelpflege erfolgte täglich bis der Nabel trocken und unauffällig war.
3.1.5. Bedingung für die Aufnahme in die Studie
In die Studie wurden nur klinisch gesunde neonate Fohlen aufgenommen. Außerdem sollten deren Mutterstuten keine erheblichen Störungen des Allgemeinbefindens zeigen und die Trächtigkeitsdauer die physiologischen Grenzen von 315 bis 355 Tagen nicht unter- oder überschreiten und die Geburt sollte weitgehend ungestört verlaufen sein.
Der IgG-Gehalt im Blut der Fohlen sollte mindestens 800 mg/dl betragen, um von einer ausreichenden Kolostrumaufnahme ausgehen zu können. Zum Ausschluss aus der Untersuchung kam es, wenn die Fohlen in den folgenden Wochen schwere Störungen des Allgemeinbefindens zeigten, die unabhängig von der Entstehung einer R. equi-Pneumonie waren (z.B. Kolik, Fraktur, Polyarthritis).
3.1.6. Einteilung der Probanden in Gruppen
Die Fohlen, die nach der Geburt als klinisch gesund beurteilt wurden, sind abwechselnd in sechs Gruppen eingeteilt worden. Der Versuch wurde als Blindstudie durchgeführt und der Inhalt der mit Impfstoff oder mit Placebo gefüllten Flaschen wurde erst nach Beendigung der Studie vom Hersteller (Wirtschaftsgenossenschaft deutscher Tierärzte eG Garbsen, Serumwerk Mensen) des Impfstoffes vermittelt.
Die Fohlen wurden in drei Gruppen eingeteilt:
Gruppe A = Impfstoff A Gruppe B = Impfstoff B Gruppe C = Impfstoff C
