Prophylaxe der Rhodococcus equi-Pneumonie bei Fohlen durch Vakzination mit Rhodococcus equi-Impfstoff und Adjuvans
CpG XXXX
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Axel-Günther Hullmann
aus Leer
Hannover 2006
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.- Prof. Dr. E. Klug
1. Gutachter: Univ.- Prof. Dr. E. Klug
2. Gutachter: Prof. Dr. M. Hoedemaker
Tag der mündlichen Prüfung: 29.05.2006
Meinen Eltern Johann-Gerhard und Christa Hullmann
gewidmet.
1 Einleitung... 11
2 Literaturübersicht... 13
2.1 Rhodococcus equi... 13
2.1.1 Taxonomie ... 13
2.1.2 Morphologie und Kultur ... 14
2.1.3 Epidemiologie und Pathogenese... 14
2.1.4 Virulenzfaktoren ... 16
2.1.5 Klinische Symptome... 18
2.1.6 Pathologie ... 19
2.1.6.1 Makroskopisch ... 19
2.1.6.2 Histologisch... 20
2.1.7 Labordiagnostik... 21
2.1.7.1 Hämatologie... 21
2.1.7.2 Mikrobiologie... 22
2.1.7.3 PCR ... 23
2.1.7.4 Nachweis von Antikörpern ... 24
2.1.8 Bildgebende Verfahren ... 26
2.1.9 Therapie... 27
2.1.10 Prophylaxe ... 28
2.1.10.1 Mutterschutzimpfungen... 29
2.1.10.2 Impfung der Fohlen ... 29
2.1.10.3 Impfstudien ... 30
2.1.10.4 Hyperimmunplasma ... 31
2.1.10.5 Sonstige Prophylaxemaßnahmen ... 33
2.2 Das Immunsystem beim Fohlen im Zusammenhang mit R. equi... 33
2.2.1 Die humorale Abwehr... 34
2.2.2 Die zelluläre Immunität... 36
2.2.2.1 Toll-like-Rezeptoren (TLRs) ... 37
2.2.2.2 Die zelluläre Abwehr im Zusammenhang mit R. equi... 37
2.3 Adjuvantien ... 40
2.3.1 CpG-Motive ... 41
2.3.1.1 CpG-Motive als Impfstoff-Adjuvantien... 42
2.3.1.2 CpG-Motive in der Therapie... 44
2.4 Die intranasale Applikation von Impfstoffen ... 45
3 Material und Methode... 47
3.1 Probandengut... 47
3.1.1 Haltung... 47
3.1.2 Impfungen und Entwurmungen ... 48
3.1.3 Erstversorgung der Fohlen... 48
3.1.4 Bedingungen für die Aufnahme in die Studie ... 49
3.1.5 Einteilung der Probanden in Gruppen ... 50
3.2 Rhodococcos equi-Impfstoff... 50
3.3 Serumprobe und Impfung... 51
3.4.1 Klinische Untersuchung des Respirationstraktes ... 53
3.4.2 Labordiagnostische Untersuchung... 54
3.4.3 Weiterführende Untersuchung des Respirationstraktes ... 54
3.5 Der Rhodococcus equi-ELISA... 57
3.5.1 Das Antigen... 57
3.5.2 Chargenprüfung und Antigenauswertung... 57
3.5.3 Herstellung der Rhodococcus equi-ELISA-Testplatten ... 57
3.5.4 Durchführung des ELISA ... 58
3.5.5 Auswertung des ELISA ... 59
3.6 Statistische Auswertung ... 61
4 Ergebnisse... 63
4.1 Das Auftreten von Lungenabszessen... 63
4.1.1 Morbidität ... 63
4.1.2 Erkrankungsalter ... 64
4.2 Klinische Symptome und Leukozytenkonzentration im Blut ... 68
4.3 Ultraschallbefunde... 70
4.4 Ergebnisse der ELISA-Untersuchungen... 72
4.4.1 Vergleich des Anti-R. equi-IgG-Gehalts aller Fohlen... 72
4.4.2 Vergleich zwischen erkrankten und gesunden Fohlen ... 74
4.4.3 Einfluss der maternalen Antikörper ... 76
5 Diskussion... 78
5.1 Diskussion von Material und Methode... 78
5.1.1 Probanden ... 78
5.1.2 Impfprotokoll... 79
5.1.3 Untersuchungen der Fohlen... 81
5.2 Ergebnisse ... 83
5.2.1 Morbidität und Befunde ... 83
5.2.2 Untersuchung des Anti-R. equi-IgG-Gehalts im Fohlenserum ... 87
5.3 Schlussfolgerungen... 91
6 Zusammenfassung... 93
7 Summary... 95
8 Literaturverzeichnis... 97
9 Anhang... 115
Abb. Abbildung
AGP Agargel-Präzipitation
BALF bronchoalveoläre Lavage-Flüssigkeit
BHV bovines Herpesvirus
bzw. beziehungsweise
°C Grad Celsius
ca. Circa CAMP-
Phänomen nach den Entdeckern Christie-Atkins-Munch-Petersen
CD
Cluster of Differentiation (System zur Bezeichnung von Differenzierungsantigenen)
cm Zentimeter
CpG Cytosin-Phosphat-Guanosin
CTL zytotoxische T-Zelle
DNA Desoxyribonukleinsäure dl Deziliter
EHV Equines Herpesvirus
ELISA enzyme linked immunosorbent assay
EU Elisa Units
g Erdbeschleunigung (g = 9,81 m/s2) HIV humane immunodeficiency virus H-Ketten schwere Ketten
i.e. id est
Ig Immunglobulin IL Interleukin IFN Interferon kDa Kilodalton kg Kilogramm KGW Körpergewicht kV Kilovolt
L-Ketten leichte Ketten
LPS Lipopolysaccharid
MALT mucosa-associated lymphoid tissue mAs Milliampère-Sekunde mg Milligram
µg Mikrogramm
MHC major histocompatibility complex MHz Megahertz
ml Milliliter µl Mikroliter mm Millimeter µm Mikrometer MTP Mikrotiterplatte NK-Zellen natürliche Kilerzellen
OD Optische Dichte
O.I.E. Office International des Epizooties PAMP pathogen-associated molecular patterns PCR polymerase chain reaction
p.o. per os
PRR pattern recognition receptors R. equi Rhodococcus equi
RNA Ribonucleinsäure SD Standardabweichung
SDS-Page Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese
s.o. siehe oben
ssp. Subspezies
TBS Tracheobronchialsekret TBST-Puffer Tris buffered saline Tween®20-Puffer Th T-Helferzelle
TLR Toll-like-Rezeptor TNF Tumornekrosefaktor
Vap virulenz-assoziierte Proteine
Die chemischen Elemente werden dem internationalen Periodensystem entsprechend abgekürzt.
1 Einleitung
Eine Vielzahl von Krankheitserregern, die adulte Säugetiere ohne das Auftreten von klinischen Symptomen erfolgreich eliminieren können, lösen in juvenilen Individuen schwere Erkrankungen aus. Die Gründe für dieses Phänomen liegen nicht nur in den Fähigkeiten der Erreger dem Immunsystem zu entgehen, sondern auch in der unzureichenden Immunantwort der Jungtiere. In der Humanmedizin gilt als erwiesen, dass Neugeborene ebenso immunkompetent sind wie Erwachsene, ihr Immunsystem jedoch von einer Polarisierung in Richtung der humoralen Immunantwort bestimmt wird (KOVARIK u. SIEGRIST 1998).
Rhodococcus equi ist ein Krankheitserreger, der intrazellulär überleben kann und bei Fohlen in den ersten vier bis sechs Lebensmonaten lebensbedrohliche pyogranulomatöse Lungenentzündungen hervorruft, während klinische Fälle bei adulten Pferden die Ausnahme sind. Da die Erkrankungen durch Rhodococcus equi eine kosten- und zeitintensive Therapie erfordern, die darüber hinaus erhebliche Nebenwirkungen hervorrufen kann, ist der Bedarf an einer Prophylaxe sehr groß.
Bisher konnten jedoch weder die Vakzinierung der Mutterstuten noch eine aktive oder passive Immunisierung der Fohlen einen reproduzierbaren Schutz der Fohlen bewirken.
Sowohl erwachsene als auch juvenile Pferde, die sich erfolgreich mit Rhodococcus equi auseinandergesetzt haben, weisen in der bronchoalveolären Lavage-Flüssigkeit einen signifikant höheren Gehalt an IFN-γ sezernierenden T-Lymphozyten auf als erkrankte Fohlen (HINES et al. 2003). Durch den Nachweis dieses Zytokins wird die Dominanz der zellulären Abwehr bei den nicht erkrankten Tieren und ihre entscheidende Rolle in der Bekämpfung von Rhodococcus equi deutlich. In der Human- und Veterinärmedizin liegen Erkenntnisse aus Untersuchungen in vivo und in vitro vor, dass Bestandteile bakterieller DNA, die Oligodeoxynukleotide, das Immunsystem so beeinflussen können, dass die zelluläre Komponente der Antwort gesteigert wird. Entscheidende Strukturelemente der Oligodeoxynukleotide sind Cytosin-Guanosin-Sequenzen, so genannte CpG-Motive (KRIEG 2002). Beim Pferd
deuten bisher vor allem Studien an isolierten Leukozyten die Wirkung verschiedener CpG-Motive an (RANKIN et al. 2001, WATTRANG et al. 2005).
In der Auseinandersetzung mit Erregern, die vor allem über die Schleimhäute aufgenommen werden, wie im Fall von Rhodococcus equi, verfügen Wirbeltiere mit dem schleimhautassoziierten Immunsystem über einen Schutzmechanismus, der zum Teil unabhängig vom restlichen Immunsystem arbeitet. Unter anderem werden bei wiederholter Auseinandersetzung mit einem Agens Gedächtniszellen gezielt an die betroffene Schleimhautregion gelenkt (JANEWAY u. TRAVERS 2002). Die intranasale Applikation eines Rhodococcus equi -Impfstoffs mit einem CpG-Motiv als Adjuvans wurde beim Fohlen in der Literatur bisher nicht beschrieben.
In der vorliegenden Untersuchung sollen die Mechanismen des mukosalen Immunsystems durch eine intranasale Impfung genutzt und mit Hilfe des Adjuvans CpG XXXX besonders die zelluläre Komponente stimuliert werden, um eine schützende Immunität gegen Rhodococcus equi aufzubauen.
2 Literaturübersicht
2.1 Rhodococcus equi 2.1.1 Taxonomie
Rhodococcus equi (R. equi) wurde erstmals 1923 in Schweden von MAGNUSSON beschrieben. Da es sich um ein grampositives, unbewegliches pleomorphes nicht sporenbildendes Bakterium handelte, das sowohl zur Gelatineverflüssigung als auch zur Indolbildung führte, ordnete MAGNUSSON (1923) den Erreger der eitrigen Pneumonie des Pferdes der Gattung Corynebakterien zu und bezeichnete ihn als Corynebacterium equi. Darauf folgten weitere Beschreibungen des Keims durch MIESSNER und WETZEL (1923), BULL (1924) sowie von RAJAGOPALAN (1936).
Über die Taxonomie des Erregers wurde anfänglich kontrovers diskutiert, wobei sowohl von JENSEN (1934) als auch von KRASIL`NIKOV (1966) aufgrund der Ähnlichkeit mit Mykobakterien die Bezeichnung Mycobacterium equi vorgeschlagen wurde. HOLTH und AMUNDSEN (1936) gelang es, das Bakterium aus tuberkulös veränderten Lymphknoten des Schweins als „spezifisches, säurefestes kokko- bazilläres Bakterium“ nachzuweisen, so dass 1940 von PLUM die Bezeichnung Corynebacterium Magnusson-Holth vorgezogen wurde. GORDON (1966) befürwortete die Benennung Mycobakterium rhodococcus. Jedoch nach der Feststellung, dass das Bakterium N-glykolierte Muraminsäurereste enthält, was für Nokardien, Mykobakterien und Rhodokokken spezifisch ist, schlugen GOODFELLOW und ALDERSON (1977) vor, den Erreger den Rhodokokken zuzuordnen. Weitere Resultate von DNA- und RNA-Analysen unterstrichen den Unterschied zu Mykobakterien und Corynebakterien (SUZUKI et al. 1981), so dass die Bezeichnung Rhodococcus equi etabliert wurde. Der Name Rhodococcus leitet sich von den morphologischen Veränderungen während der Wachstumsphase ab, einem Zyklus aus filamentartigen und kokkoiden Formen „rod to coccus“
(PRESCOTT 1991). Aufgrund verschiedener Antigen-Strukturen auf der Polysaccharidkapsel werden 27 Serotypen unterschieden, die regional getrennt voneinander auftreten, aber nicht mit der Einteilung in virulente und avirulente Stämme übereinstimmen (NAKAZAWA et al. 1987). Schließlich wurde R. equi zusammen mit Mycobacterium ssp., Corynebacterium ssp. und weiteren Gattungen
in die phylogenetische Gruppe der nokardioformen Actinomyceten eingeordnet (PRESCOTT 1991).
2.1.2 Morphologie und Kultur
Nach 24- bis 48-stündiger, aerober Bebrütung von R. equi auf festem, nicht selektivem Nährboden z.B. Blutagar zeigen sich unregelmäßige ein bis vier Millimeter große, runde Kolonien mit glattem Rand (PRESCOTT 1991). Die Kolonien sind feucht, glatt, glänzend, schleimig mit konfluierender Tendenz, lachsfarbener Pigmentierung und weisen einen erdigen Geruch auf (MAGNUSSON 1923, PRESCOTT 1991). Das Temperaturoptimum liegt bei etwa 30 °C (TAKAI et al.
1987). Charakteristisch für R. equi kann auf Schafsblutagar ein CAMP-ähnliches Phänomen (nach den Entdeckern Christie-Atkins-Munch-Petersen) mit Staphylococcus aureus beobachtet werden. Dabei kommt es durch das Zusammenwirken des Equi-Faktors von R. equi und dem Hämolysin von Staphylococcus aureus zu einer halbmondförmigen Zone vollständiger Hämolyse (SELBITZ 2002). Beim Equi-Faktor handelt es sich um ein Exoenzym mit membranolytischen Eigenschaften, das unter anderem aus der Cholesteroloxidase und der Phospholipase C besteht (PRESCOTT 1991).
Um den kulturellen Nachweis von R. equi zu verbessern, hat sich der Einsatz von Selektivmedien, die sich neben den idealen Wachstumsbedingungen für R. equi vor allem durch die Hemmung unerwünschter Begleitflora auszeichnen, bewährt (WOOLCOCK et al. 1979, BARTON u. HUGHES 1981, MARTENS et al. 1982, TAKAI u. TSUBAKI 1985, VON GRAEVENITZ u. PÜNTER-STREIT 1995).
Unter dem Mikroskop zeigt sich R. equi als grampositiver, pleomorpher, unbeweglicher Keim (SELBITZ 2002).
2.1.3 Epidemiologie und Pathogenese
R. equi tritt weltweit auf und stellt vor allem für Fohlen im Alter von zwei Wochen bis sechs Monaten einen der wichtigsten Infektionserreger dar (BARTON u. HUGHES 1980, GIGUÈRE u. PRESCOTT 1997). In diesem Altersabschnitt werden auf betroffenen Gestüten eine Morbidität von 40 bis 80 % und die Mortalität von 5 bis
17 % beobachtet (MARTENS et al. 1982). Fohlen im Alter unter zwei Wochen zeigen sich für eine experimentelle Infektion besonders anfällig (MARTENS et al. 1989).
Sowohl die induzierte (MARTENS et al. 1982) als auch die natürliche Infektion führen zu Lungenläsionen vorwiegend im cranioventralen Bereich (MARTENS et al. 1982, BARTON u. EMBURY 1987). Die Manifestation in den genannten Lungenarealen und das gehäufte Auftreten bei staubiger Umgebung in den Sommermonaten (CHAFFIN et al. 2003) geben Hinweise dafür, dass die klassische R. equi- Pneumonie durch die aerogene Aufnahme des Erregers verursacht wird (BARTON u.
EMBURY 1987, AINSWORTH 1999). Zu vernachlässigen ist der orale, intrauterine oder omphalogene Infektionsweg ebenso wie das Eindringen des Erregers durch Hautwunden oder durch wandernde Parasitenlarven (BARTON u. HUGHES 1980).
Die orale Infektion bzw. das Abhusten und anschließende Herunterschlucken des Erregers führen in einigen Untersuchungen bei etwa 50 % der Fohlen, bei denen in der Sektion eine R. equi-Pneumonie diagnostiziert wurde, zu einer intestinalen Manifestation (ZINK et al. 1986, TAKAI et al. 1995). Für das Auftreten von makroskopisch sichtbaren Darmläsionen ist die Aufnahme von großen Keimmengen über längere Zeit Voraussetzung (ZINK et al. 1986).
Bei der Beurteilung der Rennleistung eines Fohlenjahrgangs fiel auf, dass nur 54 % der nach einer R. equi-Pneumonie wieder genesenen Fohlen mindestens ein Rennen laufen, was sich im Vergleich zum Durchschnitt der gesamten Fohlenpopulation, von der pro Jahr 65 % ins Rennen gehen, signifikant unterscheidet (AINSWORTH et al. 1998). Die Fohlen jedoch, die ins Rennen gehen, zeigen die gleiche Leistung wie Fohlen, die nicht erkrankt waren.
Im Gegensatz zu der hohen Prävalenz bei Fohlen werden Erkrankungen durch R.
equi bei adulten Pferden nur in Einzelfällen beschrieben (PRESCOTT 1991).
VENGUST et al. (2002) identifizierten R. equi in einer Trachealsekretprobe als Ursache bei einem an Pneumonie erkrankten Wallach und ZINK et al. (1986) beschreiben, dass eine Infektion mit R. equi nur sehr selten ursächlich für die Infertilität von Stuten verantwortlich ist.
Rhodococcus equi besitzt eine hohe Tenazität in der Umwelt: Er überlebt bei direkter Sonneneinstrahlung im Boden über 12 Monate (MAGNUSSON 1938) und ist unempfindlich gegenüber einigen Desinfektionsmitteln, wie z.B. Hypochlorsäure (MAGNUSSON 1938, BARTON u. HUGHES 1980). GOODFELLOW und MINNIKEN (1977) zählen Rhodokokken zu den obligat aeroben Saprophyten, die sich besonders gut in trockenen, sandigen Böden vermehren (BARTON u. HUGHES 1984). Im frisch rektal entnommenen Kot von Pferden endemisch betroffener Betriebe kann R. equi stets isoliert werden. Jedoch liegen die Keimzahl und die Isolierungsrate deutlich unter denen in am gleichen Ort genommenen Bodenproben (TAKAI u. TSUBAKI 1985). Daraus wird geschlossen, dass der Gastrointestinaltrakt nicht das natürliche Habitat von R. equi ist, sondern er in einem Zyklus zwischen den Tieren und dem Boden ihrer Umgebung lebt (TAKAI u. TSUBAKI 1985). Das Vorkommen von R. equi im Boden auch unabhängig von der Pferdehaltung unterstützt diese These (WOOLCOCK et al. 1980, BARTON u. HUGHES 1984). Der Keim kann im Kot von allen Herbivoren mit Weidegang nachgewiesen werden, wohingegen er im Hunde- und Katzenkot nur selten vorkommt (CARMAN u.
HODGES 1987). Allerdings führt er bei anderen Tieren als Pferden nur vereinzelt zu den charakteristischen Erkrankungsformen an Lunge und Lymphknoten (CARMAN u.
HODGES 1987).
In der Humanmedizin tritt eine R. equi-Erkrankung ausschließlich bei immunsupprimierten Personen wie HIV-positiven Patienten oder während einer Glykokortikoid-Behandlung auf (TAKAI et al. 1994, ARLOTTI et al. 1996). Das typische Krankheitsbild wird wie in der Veterinärmedizin durch eine eitrige, abszedierende Pneumonie und selten durch intracerebrale, paraspinale und subcutane Abszesse geprägt. In der Anamnese wird häufig der Kontakt der erkrankten Person mit Pferden genannt (TAKAI et al. 1994).
2.1.4 Virulenzfaktoren
Die unterschiedliche Virulenz der R. equi-Stämme beruht auf dem Vorhandensein so genannter Virulenzfaktoren, die von den pathogenen Stämmen getragen werden (TAKAI 1997). Zu ihnen zählen die Kapselpolysaccharide, die die phagozytierenden
Leukozyten hemmen, das Exoenzym Cholesteroloxidase, das Einfluss auf die Lysosomenmembran ausübt und Zellwandbestandteile, die im Zusammenhang mit der Granulombildung gesehen werden. (HONDALUS 1997). Auf der Bakterienoberfläche präsentierte Proteine, deren Genom extrachromosomal auf Plasmiden codiert wird, stellen weitere Virulenzfaktoren dar (HONDALUS 1997). R.
equi-Stämme, die nicht aus erkrankten Tieren, sondern aus Bodenproben isoliert werden, enthalten selten diese Plasmide (SELLON et al. 2001). Auf einem 85 bis 90 kDa großen Plasmid liegen die Gene für eine Familie von sieben so genannten virulenz-assoziierten Proteinen (Vap): Vap A und C bis H (TAKAI et al. 2000). Die genaue Reaktionsweise der meisten 15-17 kDa großen Proteine ist noch nicht bekannt, aber einigen konnte durch Deletion der Gene eine Wirkung zugeordnet werden. Wird das VapA aus virulenten Bakterien entfernt, so verlieren sie ihre Fähigkeit, innerhalb von Makrophagen zu überleben oder Pneumonien in Fohlen auszulösen (HONDALUS u. MOSSER 1994, WADA et al. 1997, JAIN et al. 2003).
VapA expremierende R. equi-Stämme zeigen in vitro eine bis zu 70 % stärkere zytotoxische Wirkung an Mäusemakrophagen als die Stämme, denen dieses Protein fehlt (LUEHRMANN et al. 2004). Mit Hilfe von Elektronenmikroskopie, Western Blotting und anderen Verfahren wird der nekrotische Charakter des Zelltods erkannt.
Das Gen für VapB liegt auf einem weiteren Plasmid und wurde bei an R. equi erkrankten HIV-positiven Menschen isoliert. Dagegen wurde es bisher beim Fohlen kaum entdeckt und zeigt im Mäusemodell eine deutlich geringere Virulenz als VapA (LUEHRMANN et al. 2004).
Die Expression der Virulenzproteine zeigte in vitro eine Abhängigkeit von den Inkubationsbedingungen: Nur bei Temperaturen zwischen 34 und 41 °C und nur in nährstoffarmen Medien können die Virulenzproteine mit Hilfe von SDS-Page ermittelt werden (TAKAI et al. 1991). Da die Bildung von VapA vor allem bei einem sauren pH-Wert und einer Temperatur von 38 °C nachzuweisen ist, vermuten TAKAI et al.
(1995), dass die Virulenzfaktoren insbesondere in den Phagolysosomen exprimiert werden, in denen solche Bedingungen vorherrschen.
2.1.5 Klinische Symptome
Die klassische R. equi-Pneumonie der Fohlen verursacht die klinischen Symptome einer chronischen eitrigen, abszedierenden Bronchopneumonie (MARTENS et al.
1982). Da Fohlen in der Lage sind, den Verlust an funktionellem Lungengewebe sehr lange zu kompensieren (GIGUÈRE u. PRESCOTT 1997), treten zunächst unspezifische Symptome, wie erhöhte Körperinnentemperatur, Niedergeschlagenheit oder geringgradige Erhöhung der Atemfrequenz auf (MARTENS et al. 1982, FALCON et al. 1985, ALTHAUS 2004). Eine Tachypnoe kann solange unentdeckt bleiben bis die Fohlen durch Umgebungstemperatur, Zwangsmaßnahmen oder Bewegung belastet werden (AINSWORTH 1999). Das spätere Krankheitsbild wird durch deutlichere Anzeichen wie hohes Fieber bis 41,5 °C, hochgradige Tachypnoe mit dadurch bedingter verstärkter Bauchatmung (MARTENS et al. 1982), mittel- bis hochgradigen, produktiven Husten oder bilateralen, mukopurulenten Nasenausfluss geprägt (FALCON et al. 1985). Der progradiente Krankheitsverlauf führt zur Hyperventilation und zyanotischen Maulschleimhäuten (MARTENS et al. 1982, FALCON et al. 1985), wobei der Tod schließlich aufgrund von Asphyxie und kardialer Schwäche eintritt (HARAKAWA u. MORITA 1949). Das plötzliche Eintreten des Todes wird nur selten beschrieben, während das Sterben, begleitet von Husten, mukopurulentem Nasenausfluss und stark erhöhter Atemfrequenz, innerhalb weniger Tage trotz intensiver Betreuung und Therapie die Regel ist (MARTENS et al. 1982, BEECH u. SWEENEY 1991).
Neben der chronischen R. equi-Pneumonie kann selten auch eine akute bis subakute Verlaufsform auftreten, die sich durch akute Atemnot und eine Körperinnentemperatur von über 40 °C und ein schnell eintretender Tod ohne vorangegangene respiratorische Symptome darstellt (MARTENS et al. 1982).
Sowohl bei der chronischen als auch bei der akuten Verlaufsform sind die Befunde der Lungenauskultation nicht eindeutig: Sind bei gering- bis mittelgradigen Erkrankungen über den betroffenen Lungenarealen ein in- und expiratorisches Giemen und Knistern zu hören, werden in schweren Fällen nur tracheobronchiale Geräusche wahrgenommen, da die peripheren Lungenbereiche bereits verdichtet
sind (GIGUÈRE u. PRESCOTT 1997). Darüber hinaus führen hochgradige entzündliche Veränderungen der Lunge, insbesondere ausgedehnte periphere Abszesse, sogar zu einer vollständigen Dämpfung der Lungengeräusche (GIGUÈRE u. PRESCOTT 1997). Da die Befunde nicht unbedingt mit dem Schweregrad der Pneumonie korrelieren, bietet sich die Auskultation alleine für den Untersucher nicht als zuverlässiges Diagnostikum an, sondern muss mit anderen klinischen Befunden und weiterführenden Untersuchungen betrachtet werden (FALCON et al. 1985).
Neben den pulmonalen Erscheinungsformen tritt vor allem Durchfall als Folge von ulcerativen Darmläsionen auf (BARTON u. HUGHES 1980, AINSWORTH 1999). An zweiter Stelle stehen durch Osteomyelitiden sowie durch septische und aseptische Arthritiden bedingte Bewegungsstörungen (AINSWORTH 1999). Aseptische Arthritiden werden durch Immunkomplexablagerungen verursacht, die auch zur Entwicklung von Uveitis, Hypopyon und Anämie führen können (KENNEY 1994, AINSWORTH 1999). Selten kommt es zur Bildung von Hautabszessen (AINSWORTH 1999) oder Serositiden wie Peritonitis, Pleuritis und/oder Perikarditis (ZINK et al. 1986).
2.1.6 Pathologie
2.1.6.1 Makroskopisch
Das typische Sektionsbild einer mit R. equi infizierten Lunge wird geprägt von einer subakuten bis chronischen eitrigen Bronchopneumonie mit Abszessbildung und assoziierter suppurativer Lymphadenitis (ELLENBERGER u. GENETZKY 1986, AINSWORTH 1999). Multifokale Abszesse miliarer Größe bis hin zu sieben Zentimeter Durchmesser befinden sich vor allem im ventralen Bereich (MARTENS et al. 1982, FALCON et al. 1985, AINSWORTH 1999), während sie in caudalen Lungenlappen nur vereinzelt anzutreffen sind (ZINK et al. 1986). In etwa 20 % der Fälle sind die Abszesse generalisiert über die Lunge verstreut. Zu einem gleichen Anteil wird der pathologische Befund von einzelnen Abszessen bestimmt (ZINK et al.
1986). Der Abszessinhalt weist eine zähflüssige bis käsige Konsistenz, eine graurote bis gelbliche Farbe und einen unangenehmen Geruch auf (AINSWORTH 1999). Das die Abszesse umgebende Lungengewebe ist verdichtet oder eingeschmolzen
(BARTON u. HUGHES 1980), während die Pleura nur selten in das Entzündungsgeschehen einbezogen wird (ELLENBERGER u. GENETZKY 1986). An der Schnittfläche der betroffenen Lungenbereiche tritt mukopurulentes Sekret aus den Bronchien aus (BARTON u. HUGHES 1980). Im fortgeschrittenen Verlauf der Infektion findet sich häufig eine Lymphadenitis im Hals- und Thoraxbereich, wobei die Lymphknoten durch eine bis zu achtfache Größenzunahme und eine ödematöse oder sogar nekrotische Schnittfläche auffallen (SMITH u. JANG 1980, ZINK et al.
1986).
Bei experimenteller Infektion wurde festgestellt, dass die Lungenschäden mit der Infektionsdosis korrelieren (WADA et al. 1997).
In etwa der Hälfte der Sektionsfälle werden multifokale ulzerative Enteritiden in absteigender Häufigkeit im Colon, Caecum und Dünndarm beobachtet. In dreiviertel der Fälle sind die zugehörigen Mesenterial- und Darmlymphknoten vergrößert und zeigen in Einzelfällen eine abszedierendene Entzündung (ZINK et al. 1986). Etwa ein Drittel der Sektionstiere zeigen darüber hinaus entzündliche Veränderungen der Gelenke. Bei einer seltenen systemischen Verbreitung von R. equi können Abszesse in Leber, Nieren und Haut (MARTENS et al. 1982, AINSWORTH 1999) oder Serositiden gefunden werden (ZINK et al. 1986).
2.1.6.2 Histologisch
Histologisch weisen die von R. equi ausgelösten Pneumonien primär einen pyogranulomatösen Charakter auf (ELLENBERGER u. GENETZKY 1986). Das Zentrum der Abszesse enthält nekrotisches Zellmaterial und ist umgeben von zugrunde gehenden neutrophilen Granulozyten, während die Peripherie massenhaft von Makrophagen infiltriert ist. Selten sind einzelnen Riesenzellen und Lymphozyten zu finden. Das Abszess umgebende Lungenparenchym ist hyperämisch und ödematös. Sowohl im nekrotischen Abszessinhalt, in den Alveolen als auch im Zytoplasma der Makrophagen und neutrophilen Granulozyten sind unterschiedlich viele grampositive Stäbchenbakterien zu erkennen (HILLIDGE 1986). Im Verlauf der Erkrankung prägen zunehmend nekrotische Makrophagen das histologische Bild (LUEHRMANN et al. 2004). Ferner werden histologisch neben der
pyogranulomatösen Pneumonie eine akute purulente Bronchitis und Peribronchitis diagnostiziert: In den Alveolen sind eingewanderte Makrophagen und neutrophile Granulozyten und in den Bronchien Fibrin- und selten Eiterablagerungen zu erkennen (ELLENBERGER u. GENETZKY 1986).
2.1.7 Labordiagnostik
Der Einsatz von Antibiotika erfordert immer eine exakte Diagnose basierend auf einer klinischen und erforderlichenfalls weiterführenden labordiagnostischen Untersuchungen (UNGEMACH et al. 2000). Im Fall von R. equi ist eine unterstützende Labordiagnostik besonders wichtig, weil die klinischen Symptome erst in Erscheinung treten, wenn die Schädigung der Lunge weit fortgeschritten ist (AINSWORTH 1999). An jedes Testsystem zum Nachweis einer Infektion mit R. equi wird die Forderung sowohl einer hohen Sensitivität (i.e. der Anteil der Falschnegativen ist möglichst gering) als auch einer hohen Spezifität (i.e. der Anteil der Falschpositiven ist möglichst gering) gestellt, um entweder durch rechtzeitiges Erkennen die Prognose zu verbessern oder zu hohe Kosten und unnötige Nebenwirkungen der Therapie zu vermeiden (COHEN et al. 2000, MARTENS et al.
2002).
2.1.7.1 Hämatologie
Die Bestimmung der Blutleukozytenkonzentration als unspezifischer Entzündungsparameter ist auf Gestüten mit endemischer Rhodokokkose im Rahmen eines Überwachungsprogrammes bei den jungen Fohlen hilfreich. Da zu Beginn einer Infektion mit R. equi nahezu alle Fohlen eine Leukozytose entwickeln (GIGUÈRE et al. 2003b, CHAFFIN et al. 2004), sollten ab einer Konzentration von 13.000 Leukozyten/μl Blut weitergehende spezifische Untersuchungen wie Sonographie oder Radiologie durchgeführt werden (GIGUÈRE et al. 2003b). Zu erwähnen ist jedoch, dass in einer Studie, die 66 an abszedierender Pneumonie erkrankte Fohlen umfasste, bei 75 % der Tiere, die bei der Ultraschalluntersuchung Lungenabszesse aufwiesen, die Konzentration der Leukozyten unter 13.000/μl Blut lag (ALTHAUS 2004).
In der Früherkennung einer R. equi-Pneumonie an 165 Fohlen war die Bestimmung der Leukozytenzahl gegenüber einer Messung der Fibrinogenkonzentration von signifikant höherem diagnostischen Nutzen, wobei als Referenz der positive kulturelle Nachweis von R. equi aus der trachealen Lavage diente (GIGUÈRE et al.
2003b). Die Bestimmung der Leukozytenzahl wies bei einem Grenzwert von 13.000 Zellen pro μl Blut eine Sensitivität von 95,2 % und eine Spezifität von 61,2 %, bei einem Grenzwert von 15.000 Zellen pro μl Blut eine Sensitivität von 78,6 % und eine Spezifität von 90,8 % auf. Demgegenüber zeigte die Messung der Fibrinogenkonzentration bei einem Grenzwert von 400 mg/dl eine Sensitivität von 91 % und eine Spezifität von 51 %, bei einem Grenzwert von 500 mg/dl eine Sensitivität von 63 % und eine Spezifität von 68 % im Vergleich zum kulturellen Nachweis von R. equi.
2.1.7.2 Mikrobiologie
Das für R. equi spezifische kulturelle Wachstumsverhalten lässt eine sichere Identifizierung des Erregers zu. Am lebenden Tier kann der Erreger aus dem Nasentupfer oder dem Tracheobronchialsekret (TBS) isoliert werden. Auf einem Gestüt mit endemischer Rhodokokkose gelang nur bei 52 von 217 Fohlen (24 %), die bei der Ultraschalluntersuchung Lungenabszesse oder Pneumonien aufwiesen, die Isolierung des Erregers aus dem Nasentupfer (MEYER-HAMME 2004). Dagegen konnte R. equi aus 120 derselben 217 Proben (54 %) des TBS nachgewiesen werden. Diese Quote konnte auf demselben Gestüt ein Jahr später bestätigt werden (HEYERS 2005). MARTENS et al. (1982) schätzten ebenfalls den Erregernachweis aus dem TBS aufgrund nicht konstant positiver Ergebnisse bei erkrankten Fohlen als unsicher ein. Kulturell negative Befunde werden von SELLON et al. (2001) kritisch diskutiert, da obligat intrazelluläre Keime schwer anzuzüchten sind und das Wachstum von R. equi außerdem durch eine schneller wachsende Begleitflora gehemmt werden kann. In einer weiteren Studie allerdings konnte der Erreger neun Tage nach experimenteller Infektion durch Inhalation von R. equi aus dem TBS aller Fohlen kulturell nachgewiesen werden (ANZAI et al. 1997). GIGUÈRE und PRESCOTT (1997) berichten über die Möglichkeiten einer falschen Diagnose, wenn R. equi über kontaminierten Staub eingeatmet und im TBS nachgewiesen wird, aber
keine Manifestation in der Lunge stattfindet. Ein Nachweis des Erregers ohne Zusammenhang mit einer Erkrankung wurde auch von HEYERS (2005) beschrieben.
R. equi wurde bei 30 % der 40 Fohlen aus dem TBS isoliert, bei denen weder durch die klinische noch die sonographische Untersuchung pathologische respiratorische Befunde erhoben wurden. Zu bedenken bleibt allerdings, dass aufgrund der physikalischen Gegebenheiten die sonographische Untersuchung Abszesse, die medial von belüfteten Lungenbereichen liegen, nicht darstellen kann (COHEN et al.
2000). Zuverlässig ist dagegen der kulturelle Nachweis von R. equi aus Sektionsmaterial wie Lymphknoten oder Lungenabszessen (MARTENS et al. 1982).
2.1.7.3 PCR
Die Polymerase-Kettenreaktion (englisch Polymerase Chain Reaction, PCR) ist gegenüber der Kultur schneller und ermöglicht auch den Nachweis von abgetöteten Erregern oder ihren Bestandteilen (PERSING et al. 1993).
Für den Nachweis von R. equi sind verschiedene PCR-Methoden entwickelt worden.
BELL et al. (1996) konzentrierten sich auf eine in allen R. equi-Stämmen vorkommende Gensequenz, die keine Differenzierung zwischen virulenten und avirulenten Stämmen ermöglichte. Um die Stämme unterscheiden zu können, wurde eine PCR-Methode entwickelt, mit der das Gen amplifiziert wird, das für das Virulenz- assoziierte Protein A (VapA) codiert (TAKAI et al. 1998). Mit diesem Verfahren gelang es OLDFIELD et al. (2004) in allen von erkrankten Pferden stammenden R.
equi-Proben, das für VapA codierende Genom zu isolieren. Dagegen wurde mit der VapA-PCR bei experimentell infizierten Fohlen in nur 51 % der Proben aus dem Tracheobronchialsekret (TBS) R. equi nachgewiesen, während dieselben Proben in der Kultur zu 100 % einen positiven Erregerbefund ergaben (ANZAI et al. 1997). In einer Studie von HEYERS (2005) wies die Kultur mit 52 % ebenfalls eine höhere Sensitivität im Vergleich zu zwei PCR-Varianten (AceA500- und IdeR500-PCR) mit 40 % bzw. 33 % auf. Hinsichtlich der Spezifität zeigten sich beide PCR-Varianten mit je 83 % der Kultur mit 70 % überlegen. Als Erklärung für das insgesamt zu niedrige Niveau der Sensitivität vermutet der Autor das Vorhandensein von Inhibitoren im TBS und die zum Teil sehr hohe Viskosität des Sekrets, welche die Präparation von
bakterieller DNA beeinträchtigen kann. Weitere Entwicklungen im Bereich der PCR beruhen auf der Identifizierung der Gene anderer Virulenzfaktoren wie zum Beispiel die PCR für das Gen der Cholesteroloxidase (LADRON et al. 2003).
2.1.7.4 Nachweis von Antikörpern
Der indirekte Erregernachweis beruht auf der Bindung von Antikörpern an spezifischem Antigen, so dass es möglich ist mit einem bekannten Reaktionspartner das Vorhandensein des jeweils anderen in einer Probe nachzuweisen. Durch die Etablierung von quantitativen Testverfahren und die Erstellung von Referenzwerten können Aussagen sowohl über die Immunkompetenz als auch über eine aktuelle Krankheitssituation eines Patienten getroffen werden. Die für die Diagnose von R.
equi entwickelten Antikörpernachweise beruhen auf der Agargel-Präzipitation (AGP), der Hämolysehemmungsreaktion und vor allem auf dem enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Bei der AGP werden Antigen und Antikörper in löslicher Form auf eine Agar-Gel-Platte gegeben. Im Kontaktbereich entstehen durch die Antigen-Antikörper-Komplexe so genannte Präzipitationslinien. Anhand dieser Linien kann eine semiquantitative Aussage über das Vorliegen von Antikörpern gemacht werden. Der Antikörpernachweis durch die Hämolysehemmungsreaktion beruht auf der Hemmung der Exoenzyme des Equi-Faktors durch die gesuchten Antikörper. Auf der Grundlage der ELISA-Technik fanden die meisten Entwicklungen statt, dem folgendes Prinzip zu Grunde liegt: R. equi-spezifisches Antigen wird auf der Oberfläche einer Mikrotiterplatte (MTP) fixiert und dient als Fänger-Antigen. Sind im Serum entsprechende Antikörper vorhanden, kommt es zur Bildung von Antigen- Antikörper-Komplexen. Nach einer Inkubationszeit werden nicht gebundene Antikörper von der Platte gewaschen und enzymmarkierte Sekundärantikörper, die gegen equines IgG gerichtet sind, aufgetragen. Wiederum werden nicht gebundene Antikörper von der MTP gespült. Das an die Sekundärantikörper gekoppelte Enzym setzt ein hinzugefügtes, farbloses Substrat in ein farbiges Produkt um. Die Intensität der entstandenen Färbung kann anschließend photometrisch als Extinktion gemessen werden. Durch den Vergleich mit einem Kontrollserum erfolgt die Berechnung der Konzentration in der zu untersuchenden Probe. Die verschiedenen
ELISA-Methoden, die im Zusammenhang mit R. equi etabliert wurden, unterscheiden sich vor allem in der Art und in der Präparation des Fängerantigens.
Für den ersten veröffentlichten ELISA wurde das Rhodococcus equi-Antigen aus einem erkrankten Fohlen isoliert (ELLENBERGER et al. 1984). Zunächst wurde die Probe mit einer Pufferlösung verdünnt, anschließend autoklaviert und zentrifugiert, so dass das Antigen aus dem Überstand gewonnen werden konnte. Ein Jahr später folgten der so genannte „California-ELISA“ von HIETALA et al. (1985) und der ATCC-6939-ELISA von TAKAI et al. (1985), die beide auf einer vergleichbaren Antigenpräparation basieren. HIETALA et al. (1985) erhielten das von ihnen verwendete Antigen aus R. equi-Kulturen, die auf Mueller-Hinton-Agar angezüchtet wurden. Mit Phosphatpuffer wurden die Kulturen vom Nährboden gelöst, und das Antigen nach Zentrifugation aus dem Überstand gewonnen. Das Antigen für den ATCC-6939-ELISA wurde durch Tween 20® aus dem apathogenen Stamm ATCC 6939 entwickelt, dem er seinen Namen verdankt (TAKAI et al. 1985). Dieser Stamm weist eine hohe Kreuzreaktivität mit anderen R. equi-Stämmen und damit eine hohe Sensitivität auf. Für den Einsatz des ELISAs in der Diagnostik geben TAKAI et al.
(1985) an, dass der Nachweis positiv ist, wenn die optische Dichte (OD) den Wert 0,3 überschreitet. In Kombination mit einer klinischen Überwachung beurteilten HIGUCHI et al. (1997a) den ATCC-6939-ELISA als geeignet für die Früherkennung einer R. equi-Infektion. Sie stellen darüber hinaus zur Diskussion, auf Gestüten mit endemischer Rhodokokkose bei allen Fohlen im Alter von 35 bis 65 Tagen generell den Antikörpergehalt zu untersuchen, da einige Fohlen mit einer OD über 0,9 in der Sektion eine weit fortgeschrittene Erkrankung mit R. equi in der Lunge und im Intestinaltrakt zeigten. In einer weiteren Studie, in der bei klinisch auffälligen Fohlen sowohl ein kultureller Erregernachweis aus dem Tracheobronchialsekret als auch eine Antikörpermessung im Serum durchgeführt wurde, bestätigten HIGUCHI et al.
(1997b) die hohe Sensitivität des ELISAs, da von den 21 Fohlen mit positivem kulturellem Erregernachweis nur eins mit einer OD unter 0,3 auffiel. Allerdings wies der ATCC-6939-ELISA eine mäßige Spezifität auf, da unter den zehn kulturell negativen Tieren drei falsch positive mit einer OD über 0,3 waren. TAKAI et al.
(1996) etablierten ein ELISA-Verfahren, das in der Präparation des Antigens mit dem
ATCC-6939-ELISA übereinstimmt, aber das Antigen eines virulenten Stammes enthält und nach diesem ATCC 33701-ELISA genannt wird. Um den Antikörpernachweis weiter zu verfeinern, präparierten PRESCOTT et al. (1996) das in allen virulenten Stämmen enthaltene virulenzassoziierte Protein A (VapA) als Fängerantigen.
Die Möglichkeiten der ELISA-Techniken in der Diagnostik werden in der Literatur kritisch beurteilt. Schon bei der klinischen Erprobung der ersten ELISA-Methoden wurde festgestellt, dass es keine Korrelation zwischen dem Antikörpergehalt und dem Schweregrad der Erkrankung gibt (ELLENBERGER et al. 1984, HIETALA et al.
1985). Ähnlich kritisch fällt das Ergebnis einer Studie aus, in der ein Vergleich des ATCC-6939-ELISAs nach TAKAI et al. (1985), des ATCC-33701-ELISAs nach TAKAI et al. (1996), des VapA-ELISA nach PRESCOTT et al. (1996), der Agargel- Präzipitation und der Hämolysehemmungsreaktion durchgeführt wurde (MARTENS et al. 2002). Die Fragestellungen waren, ob es möglich sei aus dem Ergebnis einer einzigen Serumprobe bereits vor dem Auftreten von klinischen Erscheinungen eine Erkrankung mit R. equi zu diagnostizieren. Weiter sollte ermittelt werden, ob die Genauigkeit der ersten Frage durch eine gepaarte Serumprobe zu verbessern sei, und schließlich, ob es serologisch möglich sei, infizierte von gesunden Fohlen zu unterscheiden. Die Ergebnisse zeigten, dass kein Verfahren in der Lage war, auch nur eine der Anforderungen befriedigend zu erfüllen. In einem weiteren Vergleich der etablierten ELISA-Techniken und einer Agargel-Präzipitation lieferte der „California- ELISA“ bei einem Grenzwert von 40 % die besten Ergebnisse hinsichtlich Sensitivität (59 %) und Spezifität (88 %) (GIGUÈRE et al. 2003a). Die Schlussfolgerungen fielen jedoch ebenfalls negativ aus, da keine serologische Methode in der Lage war, gesunde von tatsächlich erkrankten Fohlen zu unterscheiden und daher ein Einsatz als alleiniges Diagnostikum ausgeschlossen wird.
2.1.8 Bildgebende Verfahren
Um die Diagnose einer R. equi-Pneumonie weiter abzusichern, stehen als bildgebende Verfahren die Röntgen- und die sonographische Untersuchung zur Verfügung. Beim Fohlen sind für die transkutane sonographische Untersuchung der
Lunge sowohl Sektor- als auch Linearscanner mit einer Frequenz von 5 bis 7,5 MHz geeignet (O´BRIEN u. BILLER 1997). Besonders Veränderungen im peripheren Bereich der Lunge können mittels Sonographie dargestellt werden (COHEN et al.
2000, ALTHAUS 2004), wobei der Sonographie eine höhere Sensitivität als der röntgenologischen Untersuchung in diesen Bereichen zugesprochen wird (COHEN et al. 2000). Jedoch ermöglicht die Sonographie weder eine Darstellung der Befunde, die medial von belüftetem Lungengewebe liegen, noch lässt sie eine exakte Aussage über die Ausdehnung von Lungenveränderungen in die Tiefe zu (GIGUÈRE u.
PRESCOTT 1997). Um solche pathologischen Veränderungen bildlich darzustellen, ist die radiologische Untersuchung der Lunge erforderlich, für deren Durchführung bei Fohlen im Alter von einem Monat eine Einstellung von 70 bis 74 kV und 0,14 mAs bei einer Film/Folien-Kombination mit einer Empfindlichkeit von 400 empfohlen wird (COHEN et al. 2000). Bei Fohlen älter als drei Monate können im Röntgenbild darstellbare Lungenabszesse nicht nur von R. equi hervorgerufen werden, sondern unter anderem auch von Streptococcus equi ssp. zooepidemicus (LAVOIE et al.
1994, RAMIREZ et al. 2004). Dagegen sind solche Befunde bei sehr jungen Fohlen pathognomonisch für eine Infektion mit R. equi (HILLIDGE 1986). Darüber hinaus sehen FALCON et al. (1985) im Röntgenbild darstellbare schwerwiegende noduläre und kavernöse Läsionen als Kennzeichen für ein weit fortgeschrittenes Stadium der Erkrankung, da sie mit einer letalen Entwicklung häufiger einhergehen als mit einer Genesung der Fohlen. Ebenso erkannten AINSWORTH et al. (1998), ausgehend von einem selbst erstellten Score von eins bis vier, dass Fohlen ab einem Röntgen-Score von drei oder höher signifikant geringere Überlebensraten aufweisen. In einer retrospektiven Studie über die Untersuchung von 17 an R. equi-Pneumonie erkrankten Fohlen bezeichnen RAMIREZ et al. (2004) nach Abwägung der Vor- und Nachteile die Sonographie als eine angemessene Alternative zur Röntgenuntersuchung.
2.1.9 Therapie
Das Hauptaugenmerk in der Therapie einer Erkrankung mit R. equi liegt, wie bei jedem bakteriellen Erreger, auf der Bekämpfung der Ursache durch eine geeignete Antibiotikagabe. Die Eigenschaften von R. equii, sowohl innerhalb der Makrophagen
zu überleben als auch granulomatöse Veränderungen mit verkäsendem Inhalt im Lungengewebe hervorzurufen, schränken die Auswahl der Chemotherapeutika erheblich ein (HONDALUS u. MOSSER 1994). Als wirkungsvollste Therapie gegen R. equi wurde die Kombination von dem aus der Ansamycingruppe stammenden Rifampicin mit dem zu den Makrolidantibiotika gehörenden Erythromycin entdeckt (SWEENEY et al. 1987). Mit einer Dosierung von 25 mg/kg KGW p.o. Erythromycin dreimal täglich und 5 mg/kg KGW p.o. Rifampicin zweimal täglich konnte ein Therapieerfolg von 88 % erreicht werden (HILLIDGE 1987). Die Nachteile dieses Therapieprotokolls liegen in den hohen Kosten und den Nebenwirkungen, die bei den Fohlen als Diarrhöe und Hyperthermie und bei den Stuten als schwere Kolitis auftreten können (GIGUÈRE u. PRESCOTT 1997). Mit Azithromycin wurde ein weiteres Antibiotikum für die Rhodokokkentherapie entdeckt (JACKS et al. 2001), das sich alleine eingesetzt als ebenso wirksam wie die Kombination aus Erythromycin und Rifampicin zeigte (PILTZ 2004). Der Einsatz von Tulathromycin, ein weiteres Makrolidantibiotikum, befindet sich in der Erprobungsphase (KERTH 2005, HÖHENSTEIGER 2005).
Über die Antibiotikagabe hinaus verbessert die Verwendung von nichtsteroidalen Antiphlogistika das Allgemeinbefinden eines erkrankten Fohlens (AINSWORTH 1999). Zur Verringerung des Atemwiderstandes und zur Erhöhung der mukozilliären Clearence können Bronchodilatatoren eingesetzt werden (COHEN 2000). Sollte sich der Allgemeinzustand drastisch verschlechtern oder sich eine Atemnot einstellen, wird eine Sauerstoffinsufflation notwendig (5 l/min) (COHEN 2000). Um geeignete Umgebungsverhältnisse zu schaffen, sollten die Fohlen in einen gut belüfteten und temperierten Stall gebracht werden. Daneben sollte sowohl auf Pflege als auch auf ausreichende Nahrungs- und Flüssigkeitsaufnahme geachtet werden (GIGUÈRE u.
PRESCOTT 1997).
2.1.10 Prophylaxe
Da R. equi ubiquitär vorkommt und die von ihm ausgelösten Erkrankungen eine zeit- und kostenintensive Therapie erfordern, die Nebenwirkungen induziert, ist die Entwicklung einer Prophylaxe von großem Interesse. Es werden insbesondere Strategien verfolgt, um eine Immunität in den Fohlen aufzubauen, die entweder auf
der Übertragung schützender Antikörper an die Fohlen oder auf einer aktiven Immunisierung der Fohlen selbst beruhen.
2.1.10.1 Mutterschutzimpfungen
Die Vakzinierung der Mutterstuten, um so die Fohlen vor einer Erkrankung durch R.
equi zu schützen, führte zu unterschiedlichen Studienergebnissen. Ein R. equi- Totimpfstoff erhöhte den spezifischen Antikörpergehalt im Kolostrum der geimpften Stuten und im postkolostralen Serum der zugehörigen Fohlen, blieb aber für die Fohlen ohne Schutzwirkung gegen die R. equi-Pneumonie (MADIGAN et al. 1991).
In einer weiteren Studie zeigten die Fohlen von mit Lebendimpfstoff vakzinierten Stuten ebenfalls eine signifikant erhöhte Antikörperkonzentration gegenüber der Kontrollgruppe, unterschieden sich jedoch nach experimenteller Infektion weder hinsichtlich der Erkrankungs- noch der Überlebensrate von den Fohlen ungeimpfter Tiere (MARTENS et al. 1992). In einer mehrjährigen Studie hingegen konnte durch Immunisierung von fast 800 Mutterstuten mit einem R. equi-Totimpfstoff in der Zeit von 1992 bis 1995 die Mortalität von 3 auf 1,2 % deutlich reduziert werden (BECÚ et al. 1997). CAUCHARD et al. (2004) verglichen die Mutterschutzimpfung durch eine VapA-Antigen-haltige Vakzine, der ein wasserlösliches Nanopartikel-Adjuvans (Montanide IMS 3012) zugesetzt wurde, mit der Verabreichung eines formalin- inaktivierten Ganzzell-Impfstoffs. Die gemessenen Antikörper der VapA-Gruppe zeigten sowohl hinsichtlich der Konzentration im Fohlenserum am 30. und am 45.
Lebenstag als auch in der Opsonisierungsaktivität im Fohlen- und im Stutenserum gegenüber den Antikörpern der anderen Impfgruppe bzw. der Kontrollgruppe ein signifikant besseres Ergebnis. Hier schienen allerdings die Antikörper beider Impfgruppen eine Schutzwirkung zu übertragen, da nur in der Kontrollgruppe vier der 15 Fohlen eine Pneumonie entwickelten.
2.1.10.2 Impfung der Fohlen
Ebenso wie bei der Mutterschutzvakzinierung führt die Verwendung eines R. equi- Totimpfstoffs bei der aktiven Immunisierung der Fohlen nicht zu einheitlichen Ergebnissen. Manche Autoren beschreiben den Einsatz eines Totimpfstoffs als wirkungslos (BECÚ et al. 1997, PRESCOTT et al. 1997b). In einer Studie wird von
der Reduzierung der Morbidität und der Letalität durch einen formalin-inaktivierten R. equi-Impfstoff sowohl alleine als auch in Kombination mit einer EHV-2-Vakzine in Bezug auf eine Feldinfektion berichtet (VARGA et al. 1997). Ein oral verabreichter R.
equi-Lebendimpfstoff führte zu einer Immunität, die bei experimenteller Infektion sowohl eine Erkrankung verhinderte als auch eine schnelle Beseitigung des Erregers aus der Lunge bewirkte (CHIRINU-TREJO et al. 1987). Jedoch gilt der Einsatz eines Lebendimpfstoffs auf endemisch mit R. equi betroffenen Gestüten aufgrund der möglichen Vermehrung des Erregers im Fohlendarm als zu gefährlich. Der Aufbau einer schützenden Immunität durch einen Lebendimpfstoff konnte später durch HOOPER-McGREVY et al. (2005) bestätigt werden, die vier Fohlen im Alter von 2 Tagen, einer Woche und drei Wochen oral mit dem virulenten Stamm ATCC 33701 immunisierten und am Tag der letzten Impfung intratracheal infizierten. Weder in der klinischen Beobachtung noch in der zwei Wochen nach Infektion durchgeführten Sektion wurden in der Impfgruppe Hinweise auf eine Pneumonie gefunden. Darüber hinaus war im Lungengewebe der immunisierten Tiere der Erregergehalt signifikant geringer als bei der Kontrollgruppe, in der alle Fohlen eine Pneumonie mit deutlichen klinischen Erscheinungen und Sektionsbefunden entwickelten. Damit wurde gezeigt, dass der orale Weg für eine Immunisierung mit virulenten R. equi-Stämmen nicht immunsuppressiv ist und dass Fohlen im Alter von drei Wochen eine schützende Immunantwort aufbauen können (HOOPER-McGREVY et al. 2005). Es wird jedoch, um die Risiken im Einsatz eines Lebendimpfstoffs zu minimieren, die Erforschung schwach virulenter Mutanten, die dennoch einen ausreichenden Schutz bieten können, für notwendig gehalten.
2.1.10.3 Impfstudien
Im Mittelpunkt der Entwicklung neuer Impfstoffe stand in den letzten Jahren das virulenz-assoziierte Protein A (VapA), das im Mäusemodell eine auf einer verstärkten Th1-Antwort beruhende Immunität hervorruft (PRESCOTT et al. 1997a). Darüber hinaus induziert VapA in Pferden die Bildung schützender VapA-Antikörper, die in experimentell mit R. equi infizierten Mäusen zu einer dosisabhängigen Eliminierung des Erregers aus allen Geweben führen (FERNANDEZ et al. 1997). Eine DNA- Vakzine auf der Grundlage des Genoms, das für VapA codiert, induzierte nach
gleichzeitiger intradermaler und intranasaler Verabreichung in erwachsenen Ponies eine Erhöhung der Antikörper gegen VapA sowohl im Serum als auch in der bronchoalveolären-Lavage-Flüssigkeit (BALF) (LOPEZ et al. 2003). Des Weiteren zeigten aus der BALF entnommene Zellen in vitro eine signifikant höhere Proliferationsrate auf eine erneute Konfrontation mit dem VapA als auf ein unspezifisches R. equi-Antigen. Bei Fohlen steigerte dieser Impfstoff zwar nicht die zelluläre Aktivität, aber sowohl im Serum als auch in der BALF zeigten zwei von fünf Tieren erhöhte spezifische Antikörpergehalte gegen VapA. Sowohl eine DNA- Vakzine auf der Basis des VapA als auch das VapA selbst wurden im Mäusemodell getestet (VANNIASINKAM et al. 2005). Beide Reagenzien induzierten eine deutliche Th1-Antwort, die im Fall der DNA-Vakzine durch Zugabe von Interleukin 12 (IL-12) noch verstärkt werden konnte. IL-12 spielt eine Schlüsselrolle bei der Differenzierung von omnipotenten Lymphozyten in Th1-Zellen und unterstützt somit die zelluläre Immunantwort (PARK u. SCOTT 2001). Im Gegensatz zu einem gleichzeitig im Mäusemodell getesteten Lebendimpfstoff bewirkte weder die DNA-Vakzine noch das VapA einen ausreichenden Schutz gegen eine experimentelle Infektion. Eine protektive Immunität wurde jedoch später mit dem gleichen Versuchsaufbau beobachtet (HAGHIGHI et al. 2005). Mit einer DNA-Vakzine auf der Basis von VapA intramuskulär oder intraperitoneal immunisierte Mäuse zeigten im Vergleich zu Kontrolltieren eine signifikant höhere Eliminierung des Erregers vier Tage nach intravenöser Applikation einer R. equi-haltigen Lösung. Darüber hinaus erhöhte die Zugabe der DNA-Sequenz, die für IL-12 codiert, die Eliminierungsrate signifikant, reduzierte jedoch im gleichen Maße den spezifischen Antikörpergehalt, ein Phänomen, das bereits bei DNA-Impfungen gegen Mycobacterium tuberculosis und Mycobacterium avium beobachtet wurde.
2.1.10.4 Hyperimmunplasma
Das Serum von Tieren, die eine Infektion mit R. equi erfolgreich überstanden haben, an junge Fohlen zu verabreichen ist eine Prophylaxemaßnahme, über die schon seit langem berichtet wird (SCHMIEDHOFFER 1922). In den neunziger Jahren des letzten Jahrhunderts wurde über den erfolgreichen Einsatz von Hyperimmunplasma berichtet, das von Spendertieren gewonnen wurde, die mit einem R. equi-
Lebendimpfstoff oder einem inaktivierten R. equi-Stamm immunisiert wurden (MARTENS et al. 1989, 1992, MADIGAN et al. 1991). Die Beobachtung, dass das infundierte Plasma einen besseren Schutz bietet als die passive Immunisierung durch Kolostrum wird auf im Kolostrum nur in geringen Konzentrationen vorhandene Faktoren der humoralen Abwehr wie Komplement, Interferone, Zytokine und Fibronektin zurückgeführt (MARTENS et al. 1989, 1992, MADIGAN et al. 1991).
Unterstützt wird diese Ansicht von der Erkenntnis, dass Serum von immunkompetenten Pferden, ohne gesteigerten R.-equi-Antikörpergehalt, ebenso wirksam ist wie Hyperimmunplasma (PERKINS et al. 2001). An 28 Fohlen wurde ein handelsübliches Hyperimmunplasma mit einem Plasma verglichen, das nur aufgereinigte Immunglobuline gegen die Virulenzfaktoren VapA und VapC enthielt (HOOPER-McGREVY et al. 2001). Dass beide Präparate im Vergleich zur Kontrollgruppe die klinischen Symptome und die Schäden in der Lunge reduzierten, wird mit der Schutzwirkung der Antikörper gegen VapA und VapC erklärt. Es wird aber auch nicht ausgeschlossen, dass trotz der Aufreinigung der Immunglobuline bisher noch nicht identifizierte Proteine in der Infusionslösung vorhanden waren (HOOPER-McGREVY et al. 2001). Neben einer unterschiedlichen Präparation des Hyperimmunplasmas werden unterschiedliche Zeitpunkte und Häufigkeiten der Infusionen angegeben. Solange sie vor der ersten Exposition mit dem Erreger stattfindet, wird eine einmalige Infusion bis zum 60. Lebenstag als ausreichend erachtet (MADIGAN et al. 1991). Für Gestüte mit hoher Prävalenz von R. equi- Erkrankungen und hoher Mortalität wird eine Infusion von einem Liter Hyperimmunplasma während der ersten Lebenstage und eine zweite von ebenfalls einem Liter in der dritten Lebenswoche vorgeschlagen (COHEN et al. 2000). Um die unterschiedlichen Präparationen (Lebend- oder Totimpfstoff) und Applikationszeiten bzw. –häufigkeiten vergleichbar zu machen, wurde die Wirksamkeit von verschiedenen Hyperimmunplasmen auf einem Gestüt mit endemischer Rhodokokkose überprüft (GIGUÈRE et al. 2002). Die Erkrankungsrate der 68 infundierten Fohlen fiel mit 19,1 % niedriger aus als die der 80 unbehandelten mit 30 %, wies damit aber keine signifikante Verbesserung auf. Trotz der identischen Präparation und nahezu gleichen Antikörpergehalten im Serum der Spendertiere wie MARTENS et al. (1992) konnten HURLEY und BEGG (1995) bei infundierten Fohlen
weder einen ausreichenden Schutz noch eine Abschwächung der Symptome beobachten. Der Einsatz von Hyperimmunplasma, das sieben Tage nach experimenteller Infektion zu therapeutischen Zwecken verabreicht wurde, zeigte keinen Einfluss auf die klinischen Erscheinungen oder den Krankheitsverlauf (CHAFFIN et al. 1991).
2.1.10.5 Sonstige Prophylaxemaßnahmen
Verbesserungen in Haltung und Management, um Fohlen vor einer Infektion mit R.
equi zu schützen, beziehen sich auf die epidemiologischen Eigenschaften des Erregers und insbesondere auf seine Verbreitungswege. Besonders Gestüte mit einer großen Zahl an Stuten bzw. Fohlen und mit viel Durchgangsverkehr zeigen ein erhöhtes Risiko, Rhodokokkose als Bestandproblem zu entwickeln (CHAFFIN et al.
2003). In die Überlegungen der Betriebsführung sollten Maßnahmen, die den Keimdruck senken, wie das Auskoffern von kontaminierten Paddocks, die Vermeidung von Staub durch Beregnung von Treibwegen, die Pflege der Grasnarbe, die Reduzierung der Herdengröße oder ein Rotationssystem auf den Weiden aufgenommen werden (COHEN et al. 2000, CHAFFIN et al. 2003). Um die Fohlen vor weiteren Agenzien zu schützen, die ihre Gesundheit beeinflussen können, wird ein konsequentes Impf- und Entwurmungsprogramm empfohlen (FALCON et al.
1985). Besonders auf Gestüten mit endemischen R. equi-Pneumonien wird der Aufbau eines Früherkennungsystems geraten, das je nach möglichem bzw.
erwünschtem Umfang aus Temperaturkontrolle, Lungenauskultation, Messung der Leukozytenzahl sowie Röntgen- und Ultraschalluntersuchung bestehen kann (COHEN et al. 2000, GIGUÈRE et al. 2003b).
2.2 Das Immunsystem beim Fohlen im Zusammenhang mit R. equi Neben uneinheitlichen Angaben zum Erfolg der Prophylaxe sind Erkenntnisse zur Reaktion des Immunsystems der Fohlen auf eine Infektion mit R. equi noch unvollständig und der Grund, warum Fohlen in dem Altersabschnitt bis sechs Monate eine besondere Anfälligkeit für diesen Erreger aufweisen, noch nicht geklärt. Erste Hypothesen für diese Prädisposition der Fohlen beriefen sich auf das zeitliche
Zusammentreffen der noch insuffizienten humoralen und zellulären Immunität im Alter von acht bis sechzehn Wochen (YAGER 1987, TAKAI et al. 1995) mit dem Schwinden maternaler Antikörper (AINSWORTH 1999).
2.2.1 Die humorale Abwehr
Mitte der neunziger Jahre des letzten Jahrhunderts wurde die Nomenklatur des equinen Immunglobulinsystems überarbeitet. Die Analyse der Organisation der Gensegmente für die konstanten Regionen der schweren Ketten (cH-Gene) der equinen Immunglobuline (WAGNER et al. 1998) ergab, dass das Pferd neben je einem IgM, IgE und IgA die genetische Information für mindestens sechs IgG Subtypen besitzt. Zur Vereinfachung wurde auf dem Immunglobulin und Fc-Rezeptor Workshop in Uppsala, Schweden (2001) eine neue Nomenklatur festgelegt, die der Tabelle 1 zu entnehmen ist.
Tab. 1: Nomenklatur des equinen Immunglobulinsystems Ig-Isotypen
alte Nomenklatur
Ig-Isotypen
neue Nomenklatur(a)
IGH Gene(b) GenBank
accession number
IgM IgM IGHM L49414
IgGa IgG1 IGHG1 AJ302055
IgG2 IGHG2 AJ302056
IgG(T) IgG3 IGHG3 AJ312379
IgGb IgG4 IGHG4 AJ302057
IgG(T) IgG5 IGHG5 AJ312380
IgGc IgG6 IGHG6 AJ312381
IgE IgE IGHE AJ305046
IgA IgA IGHA nt
(a)Immunoglobulin und Fc-receptor Workshop in Uppsala, Schweden (2001)
(http://medicine.uiowa.edu/CigW).
(b)Die offizielle Immunglobulin Heavy Chain Gene Loci (IGH)-Nomenklatur, festgelegt auf der internationalen ImMunoGeneTics database (IMGT) (http://imgt.cines.fr).
Etwa fünf bis zehn Wochen post natum erreichen die R. equi-Antikörper, die das Fohlen mit dem Kolostrum von der Stute erhält, ihre geringste Konzentration im
„California-ELISA“, während ein Anstieg der endogen gebildeten R. equi-Antikörper ab der sechsten bis neunten Woche in diesem Testsystem gemessen wird (HIETALA et al. 1985, PAUL 2005). PRESCOTT et al. (1996) beobachten im VapA-ELISA die
erste Serokonversion durchschnittlich im Alter von acht bis zehn Wochen. Bei der kontroversen Diskussion über die prophylaktischen Effekte von Kolostrum und Hyperimmunplasma konnte die Frage nach der Bedeutung der übertragenen Antikörper in vivo bisher nicht beantwortet werden (MADIGAN et al. 1991, MARTENS et al. 1992, HOOPER-McGREVY et al. 2001, PERKINS et al. 2001). In vitro verbessert eine erhöhte Konzentration spezifischer R. equi-Antikörper sowohl die Opsonisierung der Erreger als auch die Verschmelzung der Phagolysosomen in den Makrophagen, die von mit R. equi konfrontierten juvenilen oder adulten Pferden stammen (ARDANS et al. 1986, HIETALA u. ARDANS 1987). Jedoch variiert die Opsonisierungsaktivität zwischen Seren verschiedener Pferde, denn es wurden unterschiedliche Phagozytoseraten von Hefen durch neutrophile Granulozyten trotz einer nahezu gleichen Konzentration von IgG, das gegen ein Antigen aus der Zellwand von Hefen gerichtet war, beobachtet (GRÖNDAHL et al. 1997). Neben der Menge eines Immunglobulins wird die Opsonisierungsaktivität von der Antigenspezifität und dem Isotyp bestimmt (JANEWAY u. TRAVERS 2002). Auf einem Gestüt mit endemischer Rhodokokkose konnte kein Zusammenhang zwischen dem Auftreten einer Pneumonie und dem zu diesem Zeitpunkt im Serum gemessenen Antikörpergehalt festgestellt werden, da im Serum von 94 erkrankten und 21 nicht erkrankten Fohlen keine Unterschiede im „California-ELISA“ von HIETALA et al. (1985) nachgewiesen wurden (TRISKATIS 2004).
Immunkompetente adulte Pferde wiesen 14 Tage nach experimenteller Infektion mit R. equi einen signifikant höheren Gehalt an R. equi- und VapA-spezifischen IgGa (IgG1)- und IgGb (IgG4)-Antikörper als am Tag der Infektion im Serum auf (LOPEZ et al. 2002). HOOPER-McGREVY et al. (2003) stellten fest, dass sich zwischen juvenilen und adulten Pferden, die sich erfolgreich mit virulenten Feldstämmen von R. equi auseinandergesetzt hatten, und erkrankten Fohlen eine unterschiedliche Aufteilung in der IgG-Fraktion zeigte, die Antigen-Spezifitäten für die sieben virulenzassoziierten Proteine (Vap) A und C bis H besaßen. Bei den gesund gebliebenen Tieren lagen im Verhältnis mehr Antikörper des Isotyps IgGa (IgG1) vor und weniger IgGb (IgG4) oder IgGT (IgG3/IgG5), während bei den Fohlen, die eine Pneumonie entwickelten, der Gehalt der Isotypen IgGb (IgG4) und IgGT (IgG3/IgG5)
erhöht war. Da die erfolgreiche Eliminierung von R. equi mit einer Th1-Antwort einhergeht, spiegelt IgGa (IgG1) möglicherweise den Th1-Charakter einer Immunantwort wider und IgGb (IgG4) und IgGT (IgG3/IgG5) die Polarisierung in Richtung einer Th2-Antwort. In einer späteren Studie konnte diese Verteilung der Isotypen allerdings nicht mehr nachvollzogen werden (HOOPER-McGREVY et al.
2005). Die mit einer Lebendvakzine immunisierten und nach experimenteller Infektion klinisch gesund gebliebenen Fohlen zeigten vor allem einen signifikant erhöhten Gehalt an IgGT (IgG3/IgG5). Die Autoren schlossen aus dieser Beobachtung, dass die isotypenspezifische Antikörper-Antwort nicht als allgemeingültiger Indikator für einen Schutz angesehen werden kann, sondern sie abhängig sei sowohl vom Infektionsweg als auch davon, ob es sich um eine experimentelle Infektion handelt oder um eine natürliche.
2.2.2 Die zelluläre Immunität
Da für die Lymphozyten weder die Antigenspezifität ihrer Rezeptoren noch die Immunantwort, die in ihnen ausgelöst wird, falls ein Antigen an die Rezeptoren bindet, im Voraus festgelegt ist, sind diese Zellen auf weitere Aktivierungssignale angewiesen. Dadurch wird gewährleistet, dass eine Immunantwort nur dann ausgelöst wird, wenn das erkannte Antigen seinem Ursprung nach weder körpereigen noch von einem harmlosen Umweltkeim stammt (MEDZHITOV u.
JANEWAY 1997). Eine Aktivierung von T-Lymphozyten bedarf der so genannten Costimulierung durch die Expression von CD 80-Molekülen, die gleichzeitig von den Zellen durchgeführt wird, die auch das Antigen präsentieren. Für die Unterscheidung, ob das gebundene Antigen pathogenen oder apathogenen Ursprungs ist, haben die antigenpräsentierenden Zellen des angeborenen Immunsystems bestimmte Zielstrukturen. Sie nutzen Molekülmuster der Mikroorganismen, die essentiell für ihr Überleben und deshalb kaum Veränderungen wie Mutationen unterworfen sind.
Dazu zählt zum Beispiel die von allen gram-negativen Bakterien in ihrer Zellmembran getragenen Lipopolysaccharide (LPS). Für die Erkennung dieser Strukturen, die in der Literatur pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) genannt werden, besitzt das angeborene Immunsystem eine Reihe von Rezeptoren, die so genannten pattern recognition receptors (PRRs). Neben frei im Plasma zirkulierenden PRRs gibt
es auch zellgebundene Rezeptoren, zu denen die Toll-like receptors (TLR) zählen, die unter anderem auf antigenpräsentierenden Zellen wie den Dendritischen Zellen oder auf Makrophagen zu finden sind (MEDZHITOV u. JANEWAY 1997).
2.2.2.1 Toll-like-Rezeptoren (TLRs)
Der Name Toll-like-Rezeptoren stammt von der bei der Fruchtfliege Drosophila als erstes entdeckten Rezeptorfamilie „Toll“ ab, wo sie nach experimenteller Infektion die Bildung bakterizider und fungizider Proteine induziert (LEMAITRE et al. 1996). In Säugetieren löst die Bindung von spezifischen Liganden an TLRs die Expression von Zytokinen und costimulatorischen Molekülen aus, die für eine Aktivierung des erworbenen Immunsystems notwendig sind (UNDERHILL u. OZINSKY 2002). Nach Bindung der spezifischen Liganden finden verschiedene Enzymaktivierungen statt, die zur Bildung von Zytokinen wie TNFα, IFN-γ, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10 und IL-12 oder der oberflächlichen Expression von Molekülen wie CD 80 führen (KRUTZIK et al.
2001).
2.2.2.2 Die zelluläre Abwehr im Zusammenhang mit R. equi
Das Wissen über die Mechanismen der zellulären Immunität bei der Auseinandersetzung mit R. equi ist seit der Mitte der neunziger Jahre des letzten Jahrhunderts deutlich gewachsen. Die Anfälligkeit von Fohlen bis zum Alter von sechs Monaten wurde bis dahin mit der kurz nach der Geburt unzureichenden und erst mit zunehmendem Alter steigenden Phagozytoseaktivität der Alveolarmakrophagen begründet (ZINK et al. 1985). Mit der Erkenntnis, dass R. equi in der Lage ist, innerhalb dieses Zelltyps zu überleben (HIETALA u. ARDANS 1987), rückten andere Zellen ins Interesse der Forschung. Neutrophile Granulozyten sind in vitro in der Lage 99 % aller opsonisierten R. equi innerhalb von 15 Minuten zu phagozytieren (YAGER 1987). Fohlen, die im Untersuchungszeitraum bis zum sechsten Lebensmonat an einer R. equi-Pneumonie erkranken, weisen in der zweiten und vierten Lebenswoche signifikant weniger neutrophile Granulozyten in ihrem Serum auf als Fohlen, die gesund bleiben (CHAFFIN et al. 2004). Im Mäusemodell wurde darüber hinaus gezeigt, dass eine Inaktivierung dieses Zelltyps durch monoklonale Antikörper zu signifikant höheren Erregermengen in Leber, Milz
und Lunge gegenüber Kontrolltieren führt, wenn die Tiere einer experimentellen Infektion ausgesetzt werden (MARTENS et al. 2005).
Eine weitere Erklärung auf die Frage der Prädisposition für R. equi liefern Unterschiede der Leukozytenpopulationen in der Bronchoalveolären Lavage- Flüssigkeit (BALF) und im Blut adulter und juveniler Pferde. Bei Fohlen liegt in der Lunge eine deutlich geringere Konzentration der T-Lymphozyten vor, wobei sich insbesondere die Anzahl der CD4+- und CD8+T-Zellen auf niedrigerem Niveau bewegt, auch wenn die Menge der CD4+T-Zellen schneller das Niveau erwachsener Pferde erreicht (BALSON et al. 1997). Die Gesamtzahl der Lymphozyten im Blut steigt bis zum dritten Lebensmonat an und kann im Alter von ein bis sechs Monaten sogar die Werte der Adulten übertreffen, wobei der Anteil der B-Lymphozyten bei Fohlen deutlich erhöht ist (FLAMINIO et al. 1999). Ebenso weisen mit R. equi infizierte Fohlen ein in Richtung der B-Lymphozyten verschobenes Verhältnis der Lymphozytenfraktion im Vergleich zu gesunden Gleichaltrigen auf, woraus FLAMINIO et al. (1999) den Schluss ziehen, dass ein Mangel an zytotoxischen T- Zellen der Grund für die Anfälligkeit gegenüber R. equi in diesem Alter ist. Im Mäusemodell bewirkte die Übertragung von CD4+-T-Zellen, die aus mit R. equi infizierten adulten Pferden gewonnen wurden und Interferon (IFN)-γ sezernieren, sowohl eine vollständige Beseitigung des Erregers aus dem Körper als auch eine Vorbeugung von Lungenläsionen (KANALY et al. 1996). Virulente Rhodokokkenstämme greifen in erkrankten Fohlen auf die Zytokinexpression ein und unterdrücken die IFN-γ-Produktion von CD4+-T- Lymphozyten (GIGUÈRE et al.
1999). Die aus der BALF adulter Pferde, die 14 Tage zuvor durch Inhalation mit R.
equi infiziert wurden, isolierten und anschließend mit R. equi-Antigen oder mit VapA inkubierten Lymphozyten zeigten eine signifikant höhere IFN-γ-Produktion als Zellen, die vor der Auseinandersetzung mit dem Erreger entnommen wurden (LOPEZ et al.
2002). HINES et al. (2003) wiesen mit einer Durchflusszytometrie in der BALF immunkompetenter adulter Pferde als Antwort auf die Konfrontation mit virulenten R.
equi-Stämmen eine signifikant höhere Zahl von CD4+ und CD8+T-Zellen nach, die IFN-γ sezernieren. In einer in vitro Studie reagierten T-Lymphozyten, die aus der BALF von eine Woche zuvor durch Inhalation mit R. equi infizierten Pferden
entnommen wurden, auf die Inkubation mit VapC, VapD und VapE mit der Expression von IFN-γ (KOHLER et al. 2003). PATTON et al. (2004) zeigten, dass R.
equi-spezifische CD8+ zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) die Zellen zerstören, die mit dem intrazellulär persistierenden Erreger infiziert sind, während nicht infizierte unversehrt blieben. Dabei wurde festgestellt, dass die Antigenpräsentation unabhängig vom üblichen MHC-1-Weg geschieht, der bei der Reaktion intrazellulärer Erreger wie Viren abläuft, sondern dass CD1+-Zellen für die Antigenpräsentation und damit die Stimulierung der CTLs verantwortlich sind (PATTON et al. 2004). Bei einer erneuten Auseinandersetzung mit R. equi beruht die Eliminierung des Keims bei immunkompetenten adulten Pferden auf einem starken lokalen Übertritt von antigen- spezifischen T-Gedächtniszellen aus den betroffenen Lymphknoten in die Lunge (PATTON et al. 2005). Während die CTLs der Fohlen, die kurz nach der Geburt und im Alter von drei Wochen aus dem Blut gewonnen wurden, nicht in der Lage waren, infizierte Zellen zu zerstören, zeigt sich nach etwa acht Wochen eine CTL-Aktivität, die mit der adulter Tiere vergleichbar ist. Auf Gestüten mit endemischer Rhodokokkose zeigten im Untersuchungszeitraum an einer R. equi-Pneumonie erkrankte Fohlen sowohl mit zwei als auch mit vier Wochen im Verhältnis signifikant weniger CD4+- und mehr CD8+T-Lymphozyten als Gleichaltrige, die gesund blieben (CHAFFIN et al. 2004). Die Erkenntnisse von FLAMINIO et al. (1999) in Bezug auf die B-Lymphozyten konnten in der Studie von CHAFFIN et al. (2004) nicht nachvollzogen werden, da keine Differenzen zwischen kranken und gesunden Fohlen festgestellt wurden. Und schließlich stellten CHAFFIN et al. (2004) fest, dass nicht nur einzelne Zelltypen, sondern auch die Gesamtzahl der Leukozyten im Blut von Fohlen, die später im Untersuchungszeitraum eine Pneumonie entwickelten, im Alter von zwei und vier Wochen signifikant geringer war als bei denen, die gesund blieben. Die Autoren betonen, nicht der Beobachtung von GIGUÈRE et al. (2003b) zu widersprechen, die den Anstieg der Leukozytenzahl als gute Methode zur Früherkennung identifizierten, da in beiden Fällen zum Zeitpunkt der Diagnose einer Erkrankung mit R. equi eine Leukozytose vorliegt.
Werden Makrophagen durch das von T-Zellen sezernierte IFN-γ und durch den von Makrophagen selbst produzierten Tumornekrosefaktor-α aktiviert, sind sie in vitro in
