Erarbeitung eines standardisierten Verfahrens zur antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung von Rhodococcus equi

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Tierärztliche Hochschule Hannover

Erarbeitung eines standardisierten Verfahrens zur antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung

von Rhodococcus equi

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin

DOCTOR MEDICINAE VETERINARIAE (Dr. med. vet.)

vorgelegt von

Anne Riesenberg Steinheim / Westfalen

Hannover 2016

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Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Stefan Schwarz

Friedrich-Loeffler-Institut (FLI), Institut für Nutztiergenetik, Neustadt-Mariensee PD Dr. Christiane Werckenthin

Niedersächsisches Landesamt für Verbaucherschutz und Lebensmittel- sicherheit (LAVES), Lebensmittel- und Veterinärinstitut Oldenburg, Oldenburg

1. Gutachter: Prof. Dr. Stefan Schwarz

Friedrich-Loeffler-Institut (FLI), Institut für Nutztiergenetik, Neustadt-Mariensee

PD Dr. Christiane Werckenthin

Niedersächsisches Landesamt für Verbaucherschutz und Lebensmittel- sicherheit (LAVES), Lebensmittel- und Veterinärinstitut Oldenburg, Oldenburg

2. Gutachter: Jun. Prof. Dr. Diana Meemken, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit, Hannover

Tag der mündlichen Prüfung: 09.05.2016

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Ergebnisse dieser Dissertation wurden in international anerkannten Fachzeitschriften mit Gutachtersystem (peer review) veröffentlicht oder sind zur Veröffentlichung angenommen:

1. RIESENBERG, A., A. T. FEßLER, C. FRÖMKE, K. KADLEC, D. KLARMANN, L. KREIENBROCK, C. WERCKENTHIN, S. SCHWARZ:

Harmonization of antimicrobial susceptibility testing by broth microdilution for Rhodococcus equi of animal origin.

J. Antimicrob. Chemother. 2013; 68, 2173-5.

2. RIESENBERG, A., A. T. FEßLER, E. EROL, E. PRENGER-BERNINGHOFF, I.

STAMM, R. BÖSE, A. HEUSINGER, D. KLARMANN, C. WERCKENTHIN, S.

SCHWARZ:

MICs of 32 antimicrobial agents for Rhodococcus equi isolates of animal origin.

J. Antimicrob. Chemother. 2014; 69, 1045-9.

3. RIESENBERG, A., H, KASPAR, A. T. FEßLER, C. WERCKENTHIN, S.

SCHWARZ:

Susceptibility testing of Rhodococcus equi: An interlaboratory test.

Vet. Microbiol. 2015 Nov 26, doi: 10.1016/j.vetmic.2015.11.029 [Epub ahead of print]

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Teilergebnisse dieser Dissertation wurden bei folgenden Fachtagungen im In- und Ausland in Form einer Posterpräsentation oder eines Vortrages präsentiert:

1. RIESENBERG, A.*, K. KADLEC, A. T. FEßLER, C. WERCKENTHIN, D.

KLARMANN, S. SCHWARZ (2012):

Development of guidelines for the susceptibility testing of veterinary pathogens.

Junior Scientist Symposium des Friedrich-Loeffler-Instituts, 10.–11.8.2012, Germany, Vortrag.

2. RIESENBERG, A., L. KREIENBROCK, A. T. FEßLER, K. KADLEC, D.

KLARMANN, S. SCHWARZ*, C. WERCKENTHIN (2013):

Development of susceptibility testing standards for Rhodococcus equi as a veterinary pathogen.

Meeting of the CLSI-Subcommittee on Veterinary Antimicrobial Susceptibility Testing (VAST), 10. - 11.01.2013, Tampa, FL, USA, Vortrag.

3. RIESENBERG, A.*, A. T. FEßLER, K. KADLEC, D. KLARMANN, S.

SCHWARZ, C. WERCKENTHIN (2013):

Revised recommendation for susceptibility testing of Rhodococcus equi.

16. Internationales Symposium der World Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, 05. - 08.06.2013, Berlin, Germany, Poster.

4. RIESENBERG, A.*, A. T. FEßLER, C. FRÖMKE, K. KADLEC, D. KLARMANN, L. KREIENBROCK, C. WERCKENTHIN, S. SCHWARZ (2013):

Revised recommendation for broth microdilution susceptibility testing of Rhodococcus equi from animals.

5th Symposium on Antimicrobial Resistance in Animals and the Environment (ARAE), 30.06. - 03.07.2013, Ghent, Belgium, Poster.

Revised recommendation for broth microdilution susceptibility testing of Rhodococcus equi from animals.

Junior Scientist Symposium des Friedrich-Loeffler-Instituts, 21. - 24.08.2013, Jena, Germany, Poster.

Development of a new protocol for antimicrobial susceptibility testing of Rhodococcus equi by broth microdilution.

Tagung der DVG-Fachgruppe "Bakteriologie und Mykologie", 26. - 28.05.2014, Freising, Germany, Poster.

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7. RIESENBERG, A.*, A. T. FEßLER, E. EROL, E. PRENGER-BERNINGHOFF, I.

STAMM, R. BÖSE, A. HEUSINGER, D. KLARMANN, S. SCHWARZ, C.

WERCKENTHIN (2014):

Minimum Inhibitory Concentrations of 200 Rhodococcus equi Isolates to 32 Antimicrobial Agents.

Tagung der DVG-Fachgruppe "Bakteriologie und Mykologie", 26.–28.05.2014, Freising, Germany, Poster.

8. RIESENBERG, A., A. T. FEßLER, E. EROL, E. PRENGER-BERNINGHOFF, I.

STAMM, R. BÖSE, A. HEUSINGER, D. KLARMANN, C. WERCKENTHIN, S.

SCHWARZ* (2014):

Susceptibility of 200 Rhodococcus equi isolates from North America and Europe to 32 antimicrobial agents.

Tagung “Antimicrobial Agents in Veterinary Medicine (AAVM)”, 16.–19.09.2014, Berlin, Germany, Vortrag.

9. RIESENBERG, A.*, C. WERCKENTHIN, A. T. FEßLER, C. FRÖMKE, H.

KASPAR, L. KREIENBROCK, S. SCHWARZ (2015):

Erarbeitung standardisierter Verfahren zur Empfindlichkeitsbestimmung von Rhodococcus equi, Trueperella pyogenes und Arcobacter spp.

34. Jahrestagung der DVG-Fachgruppe AVID, 09. - 11.09.2015, Bad Staffelstein, Germany, Vortrag.

* Präsentierender Autor

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Mr. X. has a sore throat.

He buys some penicillin and gives himself, not enough to kill the streptococci, but enough to educate them to resist penicillin.

He then infects his wife. Mrs. X gets pneumonia and is treated with penicillin.

As the streptococci are now resistant to penicillin, the treatment fails.

Mrs. X dies.

Sir Alexander Fleming

Nobel Lecture, December 11, 1945

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Inhaltsverzeichnis

KAPITEL 1 Einleitung……….………...09

KAPITEL 2 Harmonisierung der antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung mittels Bouillon-Mikrodilution von Rhodococcus equi tierischen Ursprungs………. 12

Harmonization of antimicrobial susceptibility testing by broth microdilution for Rhodococcus equi of animal origin KAPITEL 3 MHK-Werte von Rhodococcus equi-Isolaten tierischen Ursprungs für 32 Wirkstoffe... 13

MICs of 32 antimicrobial agents for Rhodococcus equi isolates of animal origin KAPITEL 4 Empfindlichkeitsprüfung von Rhodococcus equi: eine Laborvergleichsuntersuchung ……….…………... 14

Susceptibility testing of Rhodococcus equi: An interlaboratory test KAPITEL 5 Diskussion……… 15

5.1 Harmonisierung der antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung ……. 16

5.2 MHK-Werte von Rhodococcus equi in verschiedenen Studien... 18

5.3 Genetische Grundlagen der verminderten Empfindlichkeit gegenüber Rifampicin……….. 23

5.4 Laborvergleichsuntersuchung... 24

5.5 Anerkennung der Methode durch das CLSI……….25

KAPITEL 6 Schlußfolgerungen……….... 27

KAPITEL 7 Zusammenfassung………... 28

KAPITEL 8 Summary... 30

KAPITEL 9 Literaturverzeichnis... 32

KAPITEL 10 Tabellenverzeichnis... 37

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Abkürzungsverzeichnis

A. Arcobacter

BAL bronchoalveoläre Spülflüssigkeit

BHI Hirn-Herz-Glucose-Bouillon (engl. Brain Heart Infusion)

bp Basenpaare

CAMHB Kationen-angepasste Mueller Hinton Bouillon (engl. cation-adjusted Mueller Hinton broth)

CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute DIN Deutsches Institut für Normung

DNA Desoxyribonukleinsäure (engl. deoxyribonucleic acid) E. coli Escherichia coli

EUCAST Europäischer Ausschuss für Antimikrobielle Empfindlichkeitstestung (engl. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) FKS fetales Kälberserum

LHB lysiertes Pferdeblut (engl. laked horse blood) MHK Minimale Hemmkonzentration

NaCl Natriumchlorid

PCR Polymerase Kettenreaktion (engl. polymerase chain reaction) R. Rhodococcus

T. Trueperella spp. Spezies (Pl.)

Vap Virulenz-assoziiertes Protein

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Einleitung

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KAPITEL 1 Einleitung

Bakterielle Resistenz gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen stellt sowohl in der Veterinär- als auch in der Humanmedizin ein zunehmendes Problem dar, da sie mitunter fehlende therapeutische Optionen bei bakteriellen Infekten zur Folge haben kann. Daher wird das Thema nicht nur in Fachkreisen und Fachzeitschriften, sondern auch in den allgemeinen Medien thematisiert, indem immer wieder über ein Auftreten von resistenten Bakterien zum Beispiel in Krankenhäusern berichtet und das Thema damit in den Fokus der Öffentlichkeit gerückt wird. Um die Entstehung von Resistenzen zu vermindern und ihre Ausbreitung einzudämmen, existieren verschiedene Programme in Tier- und Humanmedizin. Mit den Antibiotika-Leitlinien ermahnt die Bundestierärztekammer die Tierärzteschaft, antimikrobielle Wirkstoffe sorgsam und zielgerichtet einzusetzen und den anzuwendenden Wirkstoff nebst anderen Faktoren aufgrund der Resistenzlage des ursächlichen Erregers auszuwählen (BTK 2015). Zur Ermittlung der Resistenzlage ist eine antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung unumgänglich. Während es für viele bakterielle Tier- und Humanpathogene bereits standardisierte Verfahren zur Empfindlichkeitsprüfung gibt (CLSI 2013), ist dies für andere bakterielle Infektionserreger von Tieren bisher noch nicht der Fall. Zur letzteren Gruppe gehört auch Rhodococcus (R.) equi.

Die Gattung Rhodococcus gehört zur Familie der Nocardiaceae innerhalb der Unterordnung Corynebacterineae der Ordnung Actinomycetales (http://www.bacterio.net/). Sie umfasst derzeit 49 Spezies (http://www.ncbi.nlm.nih.

gov/taxonomy), von denen die Mehrheit aus Umweltproben isoliert wurde. Während für die meisten Spezies der Gattung Rhodococcus keine pathogene Bedeutung bekannt ist, konnte ein schwedischer Forscher R. equi 1923 als ursächlichen Erreger einer Bronchopneumonie beim Fohlen identifizieren (MAGNUSSON 1923).

Rhodococcus equi kann auch bei anderen Säugetieren wie Schweinen, Wiederkäuern, Hunden und Katzen purulente Erkrankungen verursachen (CARMAN u. HODGES 1987, PRESCOTT 1991, TAKAI et al. 1986) und als zoonotischer Erreger sogar zu Infektionen immunsupprimierter Menschen führen (PRESCOTT u.

HOFFMAN 1993, KEDLAYA et al. 2001). Die Hauptzieltierart von R. equi ist allerdings das Pferd, bei dem Vertreter dieser Spezies in Fohlen purulente Bronchopneumonien mit teils letalem Ausgang hervorrufen können. Als Grund für die überwiegend bei Fohlen auftretenden Infektionen wird das noch unreife

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Einleitung

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Immunsystem angesehen (YAGER 1987, TAKAI et al. 1995). Pferde ab einem Alter von sechs Monaten erkranken nicht mehr an Rhodokokkose (WILSON 1955, YAGER 1987), können jedoch Träger des Erregers sein und somit zu seiner Ausbreitung beitragen. Da R. equi Teil der physiologischen Darmflora beim Pferd sein kann (PRESCOTT 1991) und der Erreger zudem eine hohe Tenazität in der Umwelt aufweist (PRESCOTT u. HOFFMANN 1993), ist R. equi nur schwer aus Beständen zu eliminieren und in einigen Zuchtbetrieben als endemisch anzusehen. Die Symptomatik bei Infektionen mit R. equi reicht von subklinischen Infekten über milde respiratorische Symptome bis hin zu schwerwiegenden fiebrigen Infekten mit teils letalem Ausgang (VENNER 2009). Die Gruppe der Virulenz-assoziierten Proteine (Vap), im Besonderen das VapA-Protein, spielt eine übergeordnete Rolle für die Pathogenität des Erregers (GIGUÈRE et al. 1999). Da die Symptomatik insgesamt wenig spezifisch ist (PRESCOTT u. HOFFMAN 1993), kann eine sichere Diagnose am lebenden Tier nur durch Anzucht des Erregers aus bronchoalveolärer Spülflüssigkeit (BAL) erfolgen (MEYER-HAMME 2004). Die Anzucht von R. equi erfolgt auf bluthaltigen Medien in aerober Atmosphäre, wobei der Erreger nicht hämolysierende, mukoide, grau-weiße Kolonien bildet. Mikroskopisch stellt sich R.

equi als grampositives, säurefestes, pleomorphes Stäbchen dar (WILSON 1955, WOOLCOCK u. MUTIMER 1980). Während subklinische Infektionen mit R. equi teils spontan ausheilen (VENNER 2009), ist bei einer klinischen Manifestation der Rhodokokkose eine antimikrobielle Therapie notwendig (SWEENEY et al. 1987). Sie erfolgt üblicherweise mit einer Kombination aus Rifampicin, welches zur Klasse der Ansamycine gehört, und einem Wirkstoff aus der Gruppe der Makrolide, wie Erythromycin, Clarithromycin oder Azithromycin (VENNER et al. 2013, GIGUÈRE et al. 2004). Zwar ist keine dieser Substanzen in Deutschland zur Anwendung beim Pferd zugelassen (www.vetidata.de), im Falle eines Therapienotstandes dürfen sie allerdings umgewidmet und bei nicht Lebensmittel liefernden Tieren eingesetzt werden.

Eine Monotherapie mit Rifampicin ist nicht empfehlenswert, da es im rpoB-Gen, welches für die β-Untereinheit der RNA-Polymerase kodiert, rasch zu Mutationen kommt, die zu einer verminderten Empfindlichkeit der Bakterien gegenüber Rifampicin führen können.

Um eine effiziente Therapie einleiten zu können, sollte vor Therapiebeginn die antimikrobielle Empfindlichkeit des ursächlich am Krankheitsgeschehen beteiligten

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Einleitung

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Erregers bestimmt werden. Die Bestimmung und Beurteilung der antimikrobiellen Empfindlichkeit von R. equi ist bisher jedoch nicht vereinheitlicht. Das Dokument M24-A2 des US-amerikanischen Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) enthält einige Informationen zur antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung von R.

equi-Isolaten von Menschen. Dieses Dokument definiert die Inokulumdichte sowie das zu verwendende Medium und die Inkubationstemperatur (CLSI 2011). Die Dauer der Inkubation wird mit 24-48 h, bei schlechtem Wachstum auch bis zu 5 Tagen, angegeben. Zudem haben einige Arbeitsgruppen über die letzten Jahre Studien zur Resistenzlage von R. equi veröffentlicht (BARTON u. FULTON 1980, BOWERSOCK et al. 2000, BOYEN et al. 2011, BUCKLEY et al. 2007, BURTON et al. 2013, CARLSON et al. 2010, HOLLBERG 2011, JACKS et al. 2003, NIWA et al. 2005, NORDMANN u. RONCO 1992, MCNEILL u. BROWN 1992, PRESCOTT 1981, ROTHAAAR 2006, WOOLCOCK u. MUTIMER 1980). Hierbei wurden diverse Agar- und Bouillon-basierte Methoden verwandt, um den Erreger auf seine Empfindlichkeit gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen zu testen. Die Methoden unterschieden sich hinsichtlich der Inkubationsdauer und -temperatur, sowie des verwendeten Mediums und seiner Zusätze. Somit sind die Ergebnisse dieser Studien nicht miteinander vergleichbar.

Ziele der hier vorliegenden Studie waren:

(1) ein für die veterinärmedizinische Routinediagnostik universell einsetzbares und gut ablesbares Testsystem auf der Grundlage der Bouillon-Mikrodilution zu entwickeln,

(2) dieses Testsystem an einer größeren Anzahl epidemiologisch unverwandter R. equi-Feldisolate zu überprüfen,

(3) dieses Testsystem in einer deutschlandweiten Laborvergleichsuntersuchung auf seine Praxistauglichkeit in verschiedenen Laboratorien zu untersuchen und (4) letztendlich die Anerkennung der neuen Methode seitens CLSI zu erlangen.

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MHK von 32 Wirkstoffen gegen Rhodococcus equi Isolate tierischen Ursprungs

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KAPITEL 2

Harmonisierung der antimikrobiellen Empfindlichkeits- prüfung mittels Bouillon-Mikrodilution

von Rhodococcus equi tierischen Ursprungs

Harmonization of antimicrobial susceptibility testing by broth microdilution for Rhodococcus equi of animal origin

Anne Riesenberg, Andrea T. Feßler, Cornelia Frömke, Kristina Kadlec, Dieter Klarmann, Lothar Kreienbrock, Christiane Werckenthin, Stefan Schwarz

Journal of Antimicrobial Chemotherapy (2013) 68: 2173-2175 doi: 10.1093/jac/dkt134.

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MHK von 32 Wirkstoffen gegen Rhodococcus equi Isolate tierischen Ursprungs

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KAPITEL 3

MHKs von 32 Wirkstoffen gegen Rhodococcus equi Isolate tierischen Ursprungs

MICs of 32 antimicrobial agents for Rhodococcus equi isolates of animal origin

Anne Riesenberg, Andrea T. Feßler, Erdal Erol, Ellen Prenger-Berninghoff, Ivonne Stamm, Reinhard Böse, Anton Heusinger, Christiane Werckenthin, Stefan Schwarz

Journal of Antimicrobial Chemotherapy (2014) 69: 1045-1049 doi: 10.1093/jac/dkt460

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Empfindlichkeitsprüfung von Rhodococcus equi: eine Laborvergleichsuntersuchung

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KAPITEL 4

Empfindlichkeitsprüfung von Rhodococcus equi: eine Laborvergleichsuntersuchung

Susceptibility testing of Rhodococcus equi: An interlaboratory test.

Anne Riesenberg, Heike Kaspar, Andrea T. Feßler, Christiane Werckenthin, Stefan Schwarz

Veterinary Microbiology (2015)

doi: 10.1016/j.vetmic.2015.11.029 [Epub ahead of print]

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Diskussion

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KAPITEL 5 Diskussion

Um bakterielle Infektionen sinnvoll zu therapieren ist der Einsatz von antimikrobiellen Wirkstoffen das Mittel der Wahl (SINGER et al. 2003). Antimikrobielle Wirkstoffe sind unverzichtbar für die Versorgung veterinär- und humanmedizinischer Patienten. Da die Wirkstoffe häufig systemisch eingesetzt werden, wirken sie jedoch nicht ausschließlich in dem von der Erkrankung betroffenen Organsystem, sondern im gesamten Organismus. Daher unterliegen nahezu alle Bakterien, die den behandelten Patienten besiedeln, einem Selektionsdruck, der die Entstehung und Ausbreitung von Resistenzen fördern kann (MEYER et al. 2013). Um den Selektionsdruck möglichst niedrig zu halten, muss eine zielgerichtete Antibiose erfolgen (BTK 2015). Zu diesem Zweck wird in vielen Fällen eine mikrobiologische Untersuchung inklusive eines Resistenztestes des Erregers vor Therapiebeginn notwendig sein. Allerdings müssen bei der Auswahl des antimikrobiellen Wirkstoffes auch andere Parameter, wie z.B. erreichbare Gewebespiegel oder der Immunstatus des Patienten, berücksichtigt werden.

Die verfügbaren Methoden zur antimikrobiellen Empfindlichkeitstestung können grob in Diffusions- und Dilutionsverfahren eingeteilt werden. Beim Agardiffusionstest wird der zu testende Erreger in definierter Dichte auf eine Agarplatte aufgebracht. Anschließend werden Testplättchen, die mit einer definierten Menge eines antimikrobiellen Wirkstoffs beschickt sind, aufgelegt. Die so präparierten Agarplatten werden bebrütet und anschließend die Hemmhöfe um die Testplättchen ausgemessen. Über den Vergleich mit klinischen Grenzwerten wird der Erreger dann als sensibel, intermediär oder resistent gegenüber dem jeweiligen Wirkstoff eingestuft. Da hierbei verschiedene antimikrobielle Wirkstoffe auf einer Agarplatte getestet werden können, wird der Agardiffusionstest in der Routinediagnostik nach wie vor eingesetzt. Allerdings erlaubt diese Methode keine quantitative Aussage und die ermittelten Hemmhofdurchmesser können auch nicht in Minimale Hemmkonzentrationen (MHK-Werte) „umgerechnet“ werden (SCHWARZ et al. 2010).

In der vorliegenden Studie wurden Dilutionsverfahren (Bouillon-Mikrodilution und -Makrodilution) zur antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung von R. equi verwendet. In diesen Verfahren wird die Wirksamkeit verschiedener

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Diskussion

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Konzentrationsstufen der Wirkstoffe auf den Erreger überprüft. Das Ergebnis der Testung wird als MHK-Wert angegeben. Der MHK-Wert ist die niedrigste Wirkstoffkonzentration in einer zweifachen Verdünnungsreihe (gemessen in mg/L), bei der kein sichtbares Erregerwachstum mehr zu verzeichnen ist (CLSI 2013). Im Gegensatz zur Agardiffusion liefern Reihenverdünnungstests wie Bouillon- Mikrodilution und Bouillon-Makrodilution quantative Ergebnisse, die es besser ermöglichen, eine Veränderung der antimikrobiellen Empfindlichkeit zu beurteilen.

Die Einstufung der Ergebnisse in die Kategorien sensibel, intermediär und resistent erfolgt für diese Methoden ebenfalls über den Vergleich mit klinischen Grenzwerten, die für jeden antimikrobiellen Wirkstoff und Erreger tierart- und indikationsspezifisch definiert werden (CLSI 2015).

5.1 Harmonisierung der antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung

Um ein standardisiertes Verfahren zur antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung von R. equi mittels Bouillon-Mikrodilution zu entwickeln, wurden zunächst Methoden aus verschiedenen Studien miteinander verglichen. Eine Literaturrecherche ergab, dass sich bisher nur wenige Autoren mit der Bouillon-Mikrodilution zur antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung von R. equi befasst haben. Die hierfür verwendeten Verfahren unterschieden sich hinsichtlich des verwendeten Mediums, der Inkubationstemperatur sowie der Inkubationsdauer (KAPITEL 2,Tabelle 1).

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Diskussion

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Tabelle 1: Übersicht über in der Literatur beschriebene Verfahren zur Empfindlichkeitsprüfung von R. equi mittels Bouillon-Mikrodilution

Referenz Medium Temperatur Bebrütungs-

dauer

CARLSON et al. 2010 CAMHB 35 °C 24-48 h

HOLLBERG 2011 CAMHB + 2 % (v/v) LHB 35 °C 24 h

BACH 2011 CAMHB + 2 % (v/v) LHB 35 °C 24 h

ROTHAAR 2006 CAMHB + 2 % (v/v) LHB 35 °C 24 h

BOWERSOCK et al. 2000 CAMHB 35 °C „overnight“

JACKS et al. 2003 CAMHB 37 °C 18-24 h

MCNEIL u. BROWN 1992 CAMHB 35 °C 24-48 h

PRESCOTT 1981 CAMHB 35 °C 36 h

FEY u. SCHMID 1995 Iso-Sensitest Bouillon 37 °C 24 h

GIACOMETTI et al. 1999 CAMHB 37 °C 18 h

SPARKS et al. 1988

Fildes-enriched Mueller- Hinton Bouillon + 2 % (v/v) LHB

37 °C 18 h

Da die meisten Autoren Verfahren auf der Basis von Kationen-angepasster Mueller Hinton Bouillon (engl. Cation-adjusted Mueller Hinton Broth, CAMHB) mit oder ohne Zusatz von lysiertem Pferdeblut (engl. laked horse blood, LHB) verwendet haben, wurden diese beiden Medien in unsere Vergleichsstudie einbezogen. Die vom CLSI für die Testung von humanen R. equi Isolaten vorgeschriebene Methode sieht die Verwendung von CAMHB ohne jedwede Medienzusätze vor (CLSI 2011).

Als Inkubationstemperatur wurde 35 ± 2 °C gewählt, da diese Temperatur in den meisten in der Literatur beschriebenen Studien verwendet wurde und vom CLSI für die Empfindlichkeitsprüfung verschiedener Erreger, inklusive R. equi von Menschen, empfohlen wird (CLSI 2013). Die Ablesung der MHK-Werte erfolgte sowohl nach 24 als auch nach 48 Stunden, um einen möglichen Einfluß der Inkubationszeit auf die Ergebnisse bewerten zu können.

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Diskussion

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Die Empfindlichkeitsprüfung in CAMHB mit und ohne 2 % LHB (v/v) bei einer aeroben Inkubation bei 35 ± 2 °C und Ablesung der MHK-Werte nach 24 h und 48 h wurde an sechs R. equi Feldisolaten sowie dem R. equi-Typstamm ATCC^®25729 jeweils sechsmal durchgeführt und die Ergebnisse statistisch ausgewertet (KAPITEL 2). Die Chance, exakt gleiche MHK-Werte zu erzielen, war am höchsten für CAMHB + 2 % (v/v) LHB mit Ablesung der MHK-Werte nach 24 h (0,648), gefolgt von CAMHB ohne Supplement mit Ablesung der MHK-Werte nach 48 h (0,463), CAMHB ohne Supplement mit Ablesung der MHK-Werte nach 24 h (0,427) und CAMHB + 2 % (v/v) LHB mit einer Ablesung der MHK-Werte nach 48 h (0,286).

Die statistische Auswertung zeigte demnach, dass die Testung von R. equi mittels CAMHB + 2 % (v/v) LHB bei einer aeroben Inkubation bei 35 ± 2 °C und einer Ablesung der MHK-Werte nach 24 h die zuverlässigste Methode zur antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung von R. equi ist (KAPITEL 2).

Neben den statistischen Ergebnissen soll bemerkt werden, dass die Ermittlung von MHK-Werten mit beiden Medien sowohl nach 24 h als auch nach 48 h möglich war, wobei aber der Einsatz von LHB zu einem deutlicheren Wachstum und somit zu einer besseren Ablesbarkeit führte.

5.2 MHK-Werte von Rhodococcus equi in verschiedenen Studien

Die im ersten Schritt etablierte Methode wurde im Anschluss an einem Stammkollektiv von 200 R. equi Feldisolaten verschiedenen Ursprungs auf ihre allgemeine Anwendbarkeit getestet (KAPITEL 3). Dabei wurden 29 Wirkstoffe aus verschiedenen Klassen mittels Bouillon-Mikrodilution getestet. Da Rifampicin sowie die beiden unter Umständen ebenfalls therapeutisch relevanten Makrolide Azithromycin und Clarithromycin nicht in den verfügbaren Mikrotiterplatten enthalten waren, wurden diese drei Wirkstoffe im Bouillon-Makrodilutionsverfahren getestet, wobei Medium und Inkubationsbedingungen analog zum vorab genannten Protokoll waren. Die Testung der Feldisolate verlief sowohl in der Bouillon-Mikrodilution als auch in der Bouillon-Makrodilution problemlos. Für die meisten der Wirkstoffe waren die MHK-Werte normalverteilt. Für Rifampicin wurden sechs Isolate mit erhöhtem MHK-Wert ermittelt, sowie ein weiteres Isolat mit erhöhten MHK-Werten für Azithromycin, Clarithromycin und Erythromycin.

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Diskussion

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Im Folgenden soll trotz der methodischen Abweichungen zwischen den verschiedenen in der Literatur beschriebenen Studien eine vergleichende Darstellung der Ergebnisse mit denen unserer Studie erfolgen.

Tabelle 2: MHK50- und MHK90-Werte von R. equi gegenüber Rifampicin und verschiedenen Makrolid-Antibiotika: Ergebnisse verschiedener Studien

Wirkstoff KAPITEL 3 JACKS et al. 2003 CARLSON et al. 2010 BOWERSOCK et al. 2000 PRESCOTT 1981 HOLLBERG 2011 BACH 2011 ROTHAAR 2006

Rifampicin MHK50 0,06 <0,5 <0,5 0,06 0,06 0,06

MHK90 0,125 <0,5 <0,5 0,06 0,06 0,06

Azithromycin MHK50 1 0,5 1 0,5 8 2

MHK90 1 1 2 4 8 4

Clarithromycin MHK50 0,06 <0,06 <0,06 <0,03 0,12 0,06

MHK₉₀ 0,06 0,12 0,12 0,06 0,12 0,06

Erythromycin MHK₅₀ 0,5 <0,5 0,5 <0,25 0,12 1 0,25 MHK90 0,5 <0,25 0,5 <0,25 0,5 1 0,5

Tulathromycin MHK50 64 >64 64 >1024

MHK90 64 >64 >128 >1024

Tilmicosin MHK50 32 32 16

MHK90 32 64 32

Anzahl getesteter Isolate (n) 200 64 77 103 51 110 21 127

Bei den therapeutisch wirksamen Substanzen aus der Gruppe Makrolidantibiotika und dem Ansamycin-Wirkstoff Rifampicin ergab der Vergleich mit anderen Studien relativ ähnliche MHK50- und MHK90-Werte (Tabelle 2). Allerdings konnten BACH (2011) und ROTHAAR (2006) für Azithromycin höhere Werte für MHK50 und MHK90 feststellen. BACH (2011) konnte auch für Clarithromycin und Erythromycin etwas höhere MHK-Werte feststellen als die anderen Studien. Für Tulathromycin ist die Abweichung der von BACH (2011) übermittelten MHK50- und MHK90-Werte deutlich. Diese Ergebnisse könnten auf eine verminderte Makrolidempfindlichkeit in der bei BACH (2011) und ROTHAAR (2006) untersuchten Populationen zurückzuführen sein. Die entsprechenden Isolate aus diesen Studien stammten allesamt von unterschiedlichen Tieren eines Bestandes mit endemischer Rhodokokkose, in dem auch Makrolide therapeutisch eingesetzt wurden. Für Erythromycin sind die von JACKS et al. (2003) und PRESCOTT (1981) publizierten

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Diskussion

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MHK50- und MHK90-Werte geringfügig niedriger als die der anderen Studien. Der Grund für die Abweichungen lässt sich nicht mit Sicherheit definieren. In Betracht kommt hier neben einer empfindlicheren Testpopulation auch die methodische Abweichung bei der Empfindlichkeitsprüfung; in beiden Studien wurde CAMHB ohne LHB als Supplement verwendet.

CARLSON et al. (2010) berichteten für Clarithromycin von vier Isolaten mit erhöhten MHK-Werten (0,5 - 4 mg/L); auch ROTHAAR (2006) konnte ein Isolat mit erhöhtem MHK-Wert (0,5 mg/L) gegenüber Clarithromycin identifizieren. Des Weiteren berichteten CARLSON et al. (2010) von Isolaten mit erhöhten MHK-Werten gegenüber Erythromycin, beschrieben jedoch keine Resistenz gegenüber mehreren Wirkstoffen. In unserer Studie (KAPITEL 3) wies lediglich ein Isolat moderat erhöhte MHK-Werte (jeweils 1 – 2 MHK-Stufen über den Werten der normalverteilten Population) gegen Clarithromycin, Azithromycin und Erythromycin auf.

Auch eine verminderte Empfindlichkeit von R. equi gegenüber Rifampicin ist bereits beschrieben worden. BUCKLEY et al. (2007) und BOYEN et al. (2011) konnten mittels E-Test auf Mueller Hinton Agar mit Blutzusatz für ihre Stammkollektive MHK-Werte gegenüber Rifampicin ermitteln. BUCKLEY et al. (2007) beobachteten über einen 10-Jahres-Zeitraum ein Anstieg der MHK-Werte von R.

equi gegenüber Rifampicin um zwei MHK-Stufen. BOYEN et al. (2011) haben bei zwei Isolaten eine verminderte Empfindlichkeit gegenüber Rifampicin (MHK 1 mg/L bzw. 8 mg/L) beschrieben. Auch im Rahmen unserer Studie wurden sechs Isolate mit verminderter Rifampicin-Empfindlichkeit nachgewiesen, deren MHK-Werte entweder 4-8 mg/L (n=3) oder 64-256 mg/L (n=3) aufwiesen (KAPITEL 3).

Für die β-Laktam-Antibiotika zeigen sich einige Abweichungen bezüglich der von den verschiedenen Autoren publizierten MHK50- und MHK90-Werte (Tabelle 3).

Für Ampicillin lagen die von JACKS et al. (2003) übermittelten Werte niedriger als in der Studie von PRESCOTT (1981) und auch niedriger al in unserer Studie (KAPITEL 3). Auch bei Ceftiofur und Penicillin haben JACKS et al. (2003) niedrigere MHK50- und MHK90-Werte ermittelt als die anderen Studien. CARLSON et al. (2010) konnten hingegen für Penicillin höhere MHK-Werte feststellen als die anderen Autoren. Bei BOWERSOCK et al. (2000) zeigte sich eine recht große Differenz zwischen den MHK50- und MHK90-Wertenfür Ceftiofur. Während dre MHK50-Wert sich mit dem von JACKS et al. (2003) ermittelten Wert deckt, ist der MHK90-Werteher vergleichbar mit den von CARLSON et al. (2000) und in unserer Studie ermittelten Werten (Kapitel 3).

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Diskussion

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Diese Unterschiede könnten durch die unterschiedlichen Testpopulationen bedingt sein, allerdings könnte ihr Ursprung auch in den methodischen Unterschieden zwischen den unterschiedlichen Studien liegen.

Tabelle 3: MHK50- und MHK90-Werte von R. equi gegen verschiedene β -Laktam- Antibiotika: Ergebnisse verschiedener Studien

Wirkstoff KAPITEL 3 JACKS et al. 2003 CARLSON et al. 2010 BOWERSOCK et al. 2000 PRESCOTT 1981

Ampicillin MHK50 4 1 8

MHK90 8 4 8

Ceftiofur MHK50 8 <0,5 4 0,5

MHK90 16 1 >8 8

Penicillin MHK50 4 0,25 16 4

MHK90 4 1 >16 8

Vancomycin MHK50 0,5 0,5

MHK90 0,5 0,5

Anzahl getesteter Isolate (n) 200 64 77 103 51

Bei den Wirkstoffen anderer Klassen zeigen sich abgesehen von der Wirkstoffkombination Trimethoprim/Sulfamethoxazol nur geringe Unterschiede zwischen den verschiedenen Studien (Tabelle 4). Für Clindamycin ist der von JACKS et al. (2003) übermittelte MHK50-Wert ein wenig niedriger als in unserer Studie (Kapitel 3), zum MHK90-Wert lässt sich kaum eine Aussage treffen, da JACKS et al.

(2003) nur bis zu einer Konzentration von 2 mg/L getestet haben. Für Tetrazyklin sind die MHK50- und MHK90-Werte, die PRESCOTT (1981) angibt, eine Stufe niedriger als bei den anderen Studien, die untereinander eine sehr gute Übereinstimmung zeigen. Bei Enrofloxacin schwanken die ermittelten MHK50- und MHK90-Werte geringfügig; CARLSON et al. (2010) konnten etwas höhere Werte feststellen als PRESCOTT (1981) und unsere Studie (KAPITEL 3), während der MHK50-Wert, den JACKS et al. (2003) feststellen konnten, etwas niedriger ist. Auch bei Gentamicin zeigen sich nur geringe Abweichungen. Bei der Kombination aus Trimethoprim und Sulfamethoxazol waren die Abweichungen hingegen deutlich. Die MHK50-und MHK90-Werte, die CARLSON et al. (2010) für diese Wirkstoffkombination ermittelten, liegen höher als die der anderen Studien. Einzig ROTHAAR (2006)

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Diskussion

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konnte vergleichbare für MHK50- und MHK90-Werte feststellen. Eine mögliche Erklärung für die höheren MHK-Werte ist eine unterschiedliche Beurteilung des Wachstumsverhaltens, da bei der Wirkstoffkombination Trimethoprim/

Sulfamethoxazol laut CLSI eine Wachstumshemmung von 80% als Endpunkt verwendet werden sollte (CLSI, 2011).

Tabelle 4: MHK50- und MHK90-Werte von R. equi gegen verschiedene Wirkstoffe:

Ergebnisse verschiedener Studien

Wirkstoff KAPITEL 3 JACKS et al. 2003 CARLSON et al. 2010 BOWERSOCK et al. 2000 PRESCOTT 1981 HOLLBERG 2011 BACH 2011 ROTHAAR 2006

Chloramphenicol MHK50 8 8 8 16

MHK90 16 16 16 16

Florfenicol MHK50 16 >8 16

MHK₉₀ 16 >8 32

Clindamycin MHK50 4 2

MHK90 8 >2

Doxyzyklin MHK50 1 0,5 1

MHK90 1 1 1

Tetrazyklin MHK50 4 4 4 2

MHK90 8 8 8 4

Enrofloxacin MHK50 1 0,5 2 1

MHK₉₀ 1 1 2 1

Gentamicin MHK50 0,5 <1 0,5 <0,25 _0,25 _0,5 _0,5

MHK90 0,5 <1 1 <0,25 0,5 1 0,5

Trimethoprim/

Sulfamethoxazol

MHK50 0,25/4,8 1/19 0,25/4,8 0,5/9,5 1/19

MHK90 0,5/9,5 4/76 0,5/9,5 0,5/9,5 2/38

Anzahl getesteter Isolate (n) 200 64 77 103 51 110 21 127

Die Unterschiede in den MHK-Werten, die von den verschiedenen Studien ermittelt wurden, sind teils deutlich, teils auch nur gering ausgeprägt. Die möglichen Gründe hierfür sind vielfältig. Möglich ist eine unterschiedliche Empfindlichkeit der jeweiligen Testpopulationen. Auch ein Einfluss der Methodik (Medium-Zusätze, Inkubationstemperatur und Inkubationsdauer) ist eine mögliche Erklärung. Die Verwendung von geeigneten Stämmen zur Qualitätskontrolle der verwendeten antimikrobiellen Wirkstoffe sowie die Anwendung einer einheitlichen, wie der von uns

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Diskussion

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publizierten und vom CLSI anerkannten Methodik (KAPITEL 2) sind notwendig, um durch die Methode bedingte Einflüsse ausschließen zu können.

5.3 Genetische Grundlagen der verminderten Empfindlichkeit gegenüber Rifampicin

Da sechs Isolate unseres Stammkollektivs eine verminderte Empfindlichkeit gegenüber Rifampicin aufwiesen, wurde der genetische Hintergrund hierzu näher untersucht. Von mehreren Autoren wurde über Mutationen im rpoB-Gen als Ursache für eine verminderte Empfindlichkeit gegenüber Rifampicin in verschiedenen bakteriellen Organismen berichtet (CRUCHAGA et al. 2003, KADLEC et al. 2011, ZACZEK et al. 2009). Auch bei R. equi sind Mutationen in diesem Gen bereits als Ursache für eine verminderte Empfindlichkeit gegenüber Rifampicin beschrieben worden (ASOH et al. 2003, FINES et al. 2001). ASOH et al. (2003) beschreiben die Mutationen Ser531Trp und His256Tyr als ursächlich für eine High-Level-Resistenz (MHK ≥ 128 mg/L), sowie Ser531Leu für eine Low-Level-Resistenz (MHK 8 mg/L).

Es macht laut ASOH et al. (2003) einen merklichen Unterschied, welche Aminosäure an Position 531 das Serin ersetzt.

In der Studie von FINES et al. (2001) wurde der Aminosäureaustausch His526Tyr mit einem MHK-Wert von ≥256 mg/L in Verbindung gebracht, während His526Asp einen MHK-Wert von 128 mg/L und His526Asn einen MHK-Wert von 8 mg/L zur Folge hatten. Auch hier hat demnach die das Histidin ersetzende Aminosäure einen deutlichen Einfluss auf die MHK-Werte gegenüber Rifampicin.

Mutationen Ser531Leu führten auch diesen Autoren zufolge zu einem MHK-Wert von 8 mg/L und eine Mutation Asp516Val zu einem Wert von 2 mg/L.

In unseren Untersuchungen (KAPITEL 3) konnten wir die Ergebnisse von FINES et al. 2001 bestätigen, denen zufolge eine Mutation His526Asp zu einem hohen MHK-Wert gegenüber Rifampicin (256 mg/L) führt. Ebenfalls bestätigen konnten wir die in derselben Studie beschriebene geringe Erhöhung des MHK- Wertes (4 mg/L) bei Vorliegen einer Mutation Asp516Val. Unsere Studie ergab darüber hinaus einen Zusammenhang zwischen einer Mutation Gln513Leu und einem Rifampicin-MHK-Wert von 64 mg/L. Eine Mutation an dieser Lokalisation ist bei R. equi bisher nicht beschrieben worden.

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Diskussion

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Auch konnten wir mit unserer Studie die Annahme von ASOH et al. 2003 bestätigen, dass die Mutation Ser531Leu eine verminderte Empfindlichkeit gegenüber Rifampicin bedingt. Zwei unserer Isolate mit erhöhten MHK-Werten gegenüber Rifampicin wiesen diese Mutation auf, ihre MHK-Werte waren jedoch unterschiedlich (8 bzw. 128 mg/L), sodass wir einen zusätzlichen, bislang unbekannten Resistenzmechanismus als Ursache für die unterschiedlich hohen MHK-Werte bei gleicher Mutation im rpoB-Gen vermuten. Die These eines weiteren, bisher unbekannten Resistenzmechanismusses wird vom Auftreten eines Isolates mit einem Rifampicin-MHK-Wert von 8 mg/L gestützt, bei dem keine Mutation im rpoB-Gen festgestellt werden konnte. Welcher Mechanismus zusätzlich bzw.

alternativ zu Mutationen im rpoB-Gen für die Erhöhung des MHK-Wertes gegenüber Rifampicin verantwortlich ist, konnte in dieser Studie nicht festgestellt werden.

5.4 Laborvergleichsuntersuchung

In einer deutschlandweiten Laborvergleichsuntersuchung wurde die erarbeitete Methode zur antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung von R. equi an zwei Isolaten (einem R. equi Feldisolat und dem Typstamm R. equi ATCC^® 25729) in 18 verschiedenen, in der Empfindlichkeitsprüfung bakterieller Erreger erfahrenen Laboratorien angewendet (KAPITEL 4). Als Qualitätskontrolle wurde der E. coli- Stamm ATCC^®25922 verwendet. Das Ziel der Laborvergleichsuntersuchung war es, zu überprüfen, ob die erarbeitete Methode für die Routinediagnostik praktikabel ist, und ob die von den verschiedenen Laboren übermittelten MHK-Werte innerhalb eines akzeptablen Bereiches liegen. Dieser akzeptable Bereich wurde - analog zur Studie von WALLMANN et al. (2006) - auf den am häufigsten angegebenen MHK- Wert ± 1 Verdünnungsstufe festgelegt.

In der Laborvergleichsuntersuchung zeigte sich, dass die Labore die von uns erarbeitete Methode problemlos anwenden konnten. Als Grenze für eine erfolgreiche Teilnahme der Labore wurde festgelegt, dass 80 % aller übermittelten MHK-Werte innerhalb des akzeptablen Bereiches liegen sollten (WALLMANN et al. 2006).

Insgesamt waren für den Qualitätskontrollstamm E. coli ATCC^®25922 98,3 % aller MHK-Werte im akzeptablen Bereich. Die beiden R. equi-Stämme wiesen

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Diskussion

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durchschnittlich 92,2 % (ATCC^® 25729) und 94,8 % (R. equi-Feldisolat) aller übermittelten MHK-Werte im akzeptablen Bereich auf. Für eines der Labore und den R. equi ATCC^®25729 lagen nur 72,2 % aller übermittelten Werte im akzeptablen Bereich. Da dieses Labor keine Probleme mit der Testung des R. equi-Feldisolates hatte (91,7 % der MHK-Werte im akzeptablen Bereich) und auch die Testung des E.

coli ATCC^® 25922 problemlos verlief (93,8 % der MHK-Werte im akzeptablen Bereich), ist die Ursache hierfür nicht geklärt.

Bei Betrachtung der Ergebnisse für die einzelnen Wirkstoffe ergab sich die schlechteste Übereinstimmung mit dem akzeptablen MHK-Bereich bei beiden R.

equi-Stämmen für Ceftiofur und Cefotaxim (R. equi ATCC^®25729 79,6 % und 75,9 %; R. equi-Feldisolat 88,9 % und 87,0 %). Die Testung des E. coli ATCC^® 25922 mit diesen Wirkstoffen verlief problemlos (100 % bzw 98,1 %); was zu den Problemen bei der Testung der R. equi-Isolate geführt hat, konnte retrospektiv nicht geklärt werden. Die beste Übereinstimmungen mit dem akzeptablen Bereich zeigten sich bei R. equi ATCC^®25729 für Gentamicin, Oxacillin und Vancomycin (jeweils 100

%). Für das R. equi-Feldisolat wiesen Enrofloxacin, Marbofloxacin, Oxacillin, Tylosin und Vancomycin die beste Übereinstimmung mit dem akzeptablen Bereich auf (jeweils 100 %).

Abschließend lässt sich sagen, dass die Laborvergleichsuntersuchung erfolgreich verlaufen ist; die Methode war problemlos von allen 18 Laboren anzuwenden und die von den Laboren übermittelten MHK-Werte wiesen verglichen mit den für den Qualitätskontrollstamm E. coli ATCC^®25922 übermittelten MHK- Werten eine gute Übereinstimmung mit den entsprechenden akzeptablen Bereichen auf.

5.5 Anerkennung der Methode durch das CLSI

Die im Rahmen der Studie vorgestellte Methode wurde dem CLSI-Subkomitee Veterinary Antimicrobial Susceptibility Testing (VAST) am 11.01.2013 vorgestellt. Die neue Methode der Testung unter Verwendung von CAMHB + 2 % (v/v) LHB und einer Inkubationszeit von 24 h wurde als neue Methode akzeptiert und wurde in die erste Auflage des neuen CLSI-Dokuments VET06-A („Methods for Antimicrobial

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Diskussion

26

Susceptibility Testing of Infrequently Isolated or Fastidious Bacteria Isolated from Animals“), das noch im Jahr 2016 erscheinen soll, aufgenommen.

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Schlußfolgerungen

27

KAPITEL 6 Schlußfolgerungen

Der Vergleich verschiedener in der Literatur beschriebener Medien für die antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung von R. equi mittels Bouillon-Mikrodilution zeigte, dass die bisher verwendeten Medien prinzipiell geeignet waren, um eine Empfindlichkeitsprüfung durchzuführen. Die Ablesbarkeit war bei beiden verwendeten Medien [CAMHB mit und ohne Zusatz von 2 % (v/v) LHB] sowohl nach 24 h als auch nach 48 h möglich, beim Einsatz von LHB aber deutlich besser. Die statistische Auswertung einer wiederholten Empfindlichkeitsprüfung zeigte, dass die Kombination aus einem Zusatz von 2 % (v/v) LHB zur CAMHB und einer Ablesung der MHK-Werte nach 24 h die homogensten Ergebnisse ergab.

Die Testung eines Stammkollektivs von 200 R. equi-Stämmen verschiedenen Ursprungs verlief mit dieser Methode problemlos. Die MHK-Werte für die meisten Wirkstoffe waren normalverteilt und nur wenige Isolate wiesen eine verminderte Empfindlichkeit gegenüber einem oder mehreren Wirkstoffen auf. Ein Isolat zeigte eine verminderte Empfindlichkeit gegenüber den Makrolid-Antibiotika Azithromycin, Clarithromycin und Erythromycin. Insgesamt sechs Isolate wiesen unterschiedlich stark erhöhte MHK-Werte gegenüber Rifampicin auf. Bei fünf dieser Isolate konnte eine Mutation im rpoB-Gen als Ursache für die verminderte Empfindlichkeit festgestellt werden. Jedoch zeigt die Studie, dass es neben Mutationen im rpoB-Gen mindestens einen weiteren Mechanismus geben muss, der die Empfindlichkeit von R. equi gegenüber Rifampicin beeinflusst.

Eine Laborvergleichsuntersuchung mit 18 teilnehmenden Laboren zeigte, dass die erarbeitete Methode für die Routinediagnostik geeignet ist. Die Ergebnisse der MHK-Testung in den verschiedenen Laboren zeigten eine gute Übereinstimmung.

Die im Rahmen dieser Arbeit ermittelte Methode wurde zudem dem CLSI vorgestellt, als Methode für die Empfindlichkeitstestung von R. equi anerkannt und in das neue CLSI-Dokument VET06-A aufgenommen.

(28)

Zusammenfassung

28

KAPITEL 7 Zusammenfassung

Anne Riesenberg: Erarbeitung eines standardisierten Verfahrens zur antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung von Rhodococcus equi

Als Erreger purulenter Bronchopneumonien beim Fohlen ist Rhodococcus equi schon lange bekannt. Da der Erreger beim Fohlen schwerwiegende Erkrankungen hervorruft und auch bei anderen Tierarten und beim Menschen Erkrankungen auslösen kann, ist eine erfolgreiche Therapie der Rhodokokkose von großer Bedeutung. Um einen Therapieerfolg sicherzustellen; sollte der Erreger vor Beginn der Therapie auf seine antimikrobielle Empfindlichkeit getestet werden. Dies ist insbesondere deshalb von Bedeutung, weil für das therapeutisch relevante Rifampicin, sowie die ebenfalls häufig verwendeten Makrolide, bereits Isolate mit verminderter Empfindlichkeit beschrieben wurden. Um die Ergebnisse verschiedener Studien zur Empfindlichkeitsbestimmung von R. equi vergleichen zu können, ist es notwendig, die Methodik der Testung zu standardisieren. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden zwei verschiedene in der Literatur beschriebene Medien [CAMHB mit und ohne Zusatz von 2 % (v/v) LHB] zur antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung von R. equi mittels Bouillon-Mikrodilution für eine vergleichende Empfindlichkeitsprüfung verwendet; die MHK-Werte wurden nach 24 und 48 Stunden abgelesen. Die statistische Auswertung der Ergebnisse wiederholter Empfindlichkeitsprüfungen zeigte, dass bei Verwendung von CAMHB mit 2 % (v/v) LHB und einer Ablesung der MHK-Werte nach 24 Stunden die Wahrscheinlichkeit, homogene MHK-Werte für das gleiche R. equi Isolat zu erzielen, am höchsten ist.

Mit dieser Methode wurde die Empfindlichkeit von 200 R. equi Isolaten gegenüber 32 antimikrobiellen Wirkstoffen und Wirkstoff-Kombinationen getestet. Es zeigten nur wenige Isolate erhöhte MHK-Werte für einige Wirkstoffe. Eines dieser Isolate wies für die therapeutisch relevanten Makrolid-Antibiotika Erythromycin, Clarithromycin und Azithromycin moderat erhöhte MHK-Werte auf. Weitere sechs Isolate zeigten eine unterschiedlich stark ausgeprägte verminderte Empfindlichkeit gegenüber Rifampicin. Bei der molekularen Untersuchung letzterer Isolate zeigte sich, dass es zusätzlich zu Mutationen im rpoB-Gen, die dafür bekannt sind, die

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Zusammenfassung

29

Empfindlichkeit von verschiedenen Bakterien gegenüber Rifampicin zu vermindern, einen weiteren Mechanismus geben muss, der die Empfindlichkeit von R. equi gegenüber Rifampicin vermindert.

Das Ergebnis einer Laborvergleichsuntersuchung, an der 18 deutsche Laboratorien beteiligt waren, bestätigte, dass die von uns publizierte Methode zur antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung probemlos von den Laboren angewendet werden kann. Die Ergebnisse der MHK-Testung der verschiedenen Labore zeigten eine gute Übereinstimmung.

Die antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung mittels Bouillon-Mikrodilution von R.

equi in CAMHB + 2 % (v/v) LHB mit Inkubation in aerobem Milieu bei 35 ± 2 °C für 24 h ist eine zuverlässige, praxistaugliche Methode. Sie wurde vom Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) für die Testung von R. equi Isolaten von Tieren anerkannt und stellt nach Aufnahme in das CLSI-Dokument VET06-A die künftige Standardmethode zur Empfindlichkeitsprüfung von R. equi dar.

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Summary

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KAPITEL 8 Summary

Anne Riesenberg: Development of a standardised method for the antimicrobial susceptibility testing of Rhodococcus equi

As a causative agent of purulent bronchopneumonia in foals, Rhodococcus equi is known a fairly long time. As the pathogen causes severe infections in foals and is furthermore capable of infecting other animals and humans, a successful therapy is of utmost importance. To ensure therapeutical success the pathogen should be tested for antimicrobial resistance before starting the treatment. This is of particular importance since isolates with a reduced susceptibility have been reported previously for the therapeutically relevant drug rifampicin as well as for the commonly used macrolides. In order to allow a comparison of the results from different studies, it is necessary to standardize the antimicrobial susceptibility testing of R. equi. To achieve this goal, two media that were described in literature (CAMHB with and without supplementation with 2 % (v/v) LHB) were used for antimicrobial susceptibility testing of R. equi via broth microdilution; MIC values were read after 24 and 48 hours. Statistical analysis of repeated susceptibility testing showed, that the probability to achieve homogenous MIC values was highest when using CAMHB with 2 % (v/v) LHB and reading the MIC values after 24 hours.

With this method we determined the susceptibility of 200 R. equi isolates against 32 antimicrobial agents and combinations of agents. Only few isolates showed elevated MIC values for one or few antimicrobial agents. One of these isolates displayed moderately elevated MIC values against erythromycin, clarithromycin and azithromycin. Further six isolates showed a reduced susceptibility to rifampicin. Investigation of the molecular background of these six isolates showed, that in addition to mutations in the rpoB-gene, that are well-known for their influence on the susceptibility of different bacteria against rifampicin, there must be an additional mechanism that influences the susceptibility of R. equi to rifampicin.

The results of an interlaboratory test, in which 18 German laboratories participated, confirmed that our standardized method for the antimicrobial susceptibility testing of R. equi could be applied without any problems and the results of the MIC testing showed a good concordance.

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Summary

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The antimicrobial susceptibility testing of R. equi via broth microdilution using CAMHB + 2 % (v/v) LHB and incubation in an aerobic atmosphere at 35 ± 2 °C für 24 hours is a reliable and applicable method. It has been approved by the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) for testing of R. equi from animal origin, will be included in the forthcoming CLSI-document Vet06-A and will therefore become the future standard method for antimicrobial susceptibility testing of R. equi.

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Literaturverzeichnis

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KAPITEL 9 Literaturverzeichnis

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