Etablierung und Validierung einer PCR in der Routinediagnostik zum Nachweis von Rhodococcus equi in Untersuchungsmaterial
aus dem Atemtrakt von Fohlen
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Nicole Lorenz
aus Essen
Hannover 2005
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Erich Klug
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Erich Klug 2. Gutachter: PD Dr. Korinna Huber
Tag der mündlichen Prüfung: 24.05.2005
Aus Liebe und Dankbarkeit
meinen Eltern gewidmet
1 Einleitung ... 9
2 Schrifttum ... 11
2.1 Rhodococcus equi... 11
2.1.1 Allgemeiner Überblick und Taxonomie... 11
2.1.2 Morphologie und Kultivierung... 12
2.1.3 Biochemische Eigenschaften... 13
2.1.4 Virulenzfaktoren... 14
2.1.5 Epidemiologie ... 16
2.2 Rhodokokkose... 17
2.2.1 Pathogenese und Krankheitsbild ... 17
2.2.1.1 Bronchopneumonie ... 17
2.2.1.2 Intestinale Manifestation ... 18
2.2.1.3 Nicht septische Polysynovitis... 18
2.2.1.4 Septische Arthritis und Osteomyelitis... 18
2.2.1.5 Weitere Manifestationen ... 19
2.2.1.6 Adulte Pferde... 19
2.2.2 Pathologie und Histologie ... 19
2.2.3 Immunologie ... 20
2.3 Diagnostischer Nachweis ... 21
2.3.1 Direkter Erregernachweis... 22
2.3.1.1 Kulturelle und zytologische Untersuchung ... 22
2.3.1.2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)... 23
2.3.1.2.1 VapA-PCR ... 23
2.3.1.2.2 16S-rRNA-PCR... 24
2.3.1.2.3 ChoE-PCR... 25
2.3.2 Indirekter Erregernachweis ... 26
2.3.2.1 Agar-Gel-Immunodiffusion (AGID)... 26
2.3.2.2 Synergistische Hämolysehemmung (SHI) ... 26
2.3.2.3 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)... 27
2.4 Behandlung und Prophylaxe der Rhodococcus equi-Pneumonie beim Fohlen... 27
2.4.1 Therapie... 27
2.4.2 Prophylaxe... 29
2.5.1 ChoE-Gen... 31
2.5.2 Weitere chromosomale Gene mit möglicher Bedeutung für die Virulenz von Rhodococcus equi... 31
2.5.2.1 IdeR-Gen ... 31
2.5.2.2 IupA-Gen... 32
2.5.2.3 SugE-Gen ... 33
2.5.2.4 AceA-Gen... 33
3 Material und Methoden ... 34
3.1 Material ... 34
3.1.1 Herkunft und Haltungsbedingungen der beprobten Tiere... 34
3.1.2 Vorangegangene Untersuchungen... 34
3.1.3 Probenmaterial ... 35
3.2 Methoden... 38
3.2.1 Rhodococcus equi-Isolate und Kultivierung von Rhodococcus equi... 38
3.2.1.1 Bestimmung der Lebendkeimzahl... 38
3.2.1.2 Mikroskopischer Nachweis von Rhodococcus equi in der Gramfärbung .... 39
3.2.2 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)... 39
3.2.3 Western-Blot ... 40
3.2.3.1 Transfer der Proteine auf Nitrozellulose ... 40
3.2.3.2 Nachweis von immunogenen Proteinen... 40
3.2.4 DNA-Extraktion des Probenmaterials mit dem E.Z.N.A®Tissue DNA Mini Kit (Safety-Line) ... 41
3.2.5 DNA-Präparationskontrolle ... 42
3.2.6 Primerauswahl... 42
3.2.7 Polymerase-Kettenreaktion ... 45
3.2.7.1 PCR-Kontrollen und Amplifikationskontrolle ... 45
3.2.7.2 PCR-Ansatz... 46
3.2.7.3 Optimierung der PCRs ... 47
3.2.7.4 Überprüfung der Spezifität der PCRs... 49
3.2.7.5 Bestimmung der Nachweisgrenze der PCRs... 50
3.2.7.6 Bestimmung der DNA-Konzentration ... 50
3.2.7.7 Sequenzierung ... 50
3.2.9 Parameter zur Bewertung diagnostischer Verfahren... 52
4 Ergebnisse ... 54
4.1 Überprüfung einiger Isolate in der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und im Western-Blot ... 54
4.2 Optimierung der PCRs ... 55
4.3 Überprüfung der Spezifität der verschiedenen PCRs... 56
4.4 Molekularbiologische Untersuchung von Nasentupfern und Tracheobronchialsekret auf Rhodococcus equi mit Hilfe der PCR... 57
4.4.1 Eignung der jeweiligen Primerpaare ... 57
4.4.1.1 ChoE-PCR... 57
4.4.1.2 16S-PCR... 59
4.4.1.3 VapA-PCR ... 64
4.4.1.4 IupA-PCR... 69
4.4.1.5 SugE-PCR ... 74
4.4.1.6 IdeR-PCR ... 79
4.4.1.6.1 IdeR396-PCR ... 80
4.4.1.6.2 IdeR500-PCR ... 85
4.4.1.7 AceA500-PCR... 90
4.5 Übersicht über die diagnostische Sensitivität und Spezifität der einzelnen PCRs gegenüber der klinischen und der kulturellen Untersuchungsmethode ... 95
4.6 Durchführung einer sogenannten „Duplex-PCR“ ... 100
5 Diskussion ... 101
5.1 Optimierung einer PCR... 101
5.2 Entwicklung einer PCR zum Nachweis von Rhodococcus equi auf chromosomaler Ebene ... 103
5.3 Vergleich der PCR mit dem kulturellen und klinischen Nachweis von Rhodococcus equi... 108
5.4 Vergleich von Tracheobronchialsekret und Nasentupfer hinsichtlich ihrer Eignung als diagnostisches Material ... 110
5.5 Vergleich der Ergebnisse aus dem Jahr 2003 und 2004... 111
5.6 Schlußfolgerung ... 111
6 Zusammenfassung... 113
9 Anhang ... 145
9.1 Tabellen... 145
9.2 Rezepte für Medien, Puffer und Lösungen ... 151
9.2.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-Page) ... 151
9.2.2 Coomassie®-Blau-Färbung... 152
9.2.3 Western-blotting... 152
9.2.4 DNA-Extraktion ... 154
9.2.5 Agarose-Gelelekrophorese ... 154
9.3 Chemikalien und Reagenzien... 155
9.4 Geräte und Hilfsmittel... 157
9.5 Abbildungsverzeichnis ... 158
9.6 Tabellenverzeichnis... 162
9.7 Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen ... 167
1 Einleitung
Rhodococcus equi (früher auch als Corynebacterium equi bekannt) ist ein weltweit verbreiteter Infektionserreger und eine der wichtigsten Ursachen für die Erkrankung von ein bis sechs Monate alten Fohlen. Die Erkrankung ist vornehmlich durch eitrige Bronchopneumonien mit ausgedehnter Abszessbildung charakterisiert (AINSWORTH 1999, MARTENS et al. 1982).
Häufig kann aus Zervikallymphknoten von Schweinen Rhodococcus equi isoliert werden.
Auch andere Haussäugetiere wie zum Beispiel die Ziege oder das Rind können durch Rhodococcus equi infiziert werden (TAKAI et al. 1996, TKACHUK-SAAD et al. 1998).
Sogar bei immunsuppressiven Menschen spielt Rhodococcus equi eine bedeutende Rolle (HARVEY et al. 1991).
Rhodococcus equi ist als Bodenorganismus ubiquitär verbreitet und besitzt eine hohe Tenazität hinsichtlich Trockenheit und UV-Strahlung (TAKAI et al. 1991). Infolgedessen kann der Erreger sowohl aus Boden- wie auch aus Kotproben von Pferden nachgewiesen werden (BARTON und HUGHES 1980, PRESCOTT et al. 1984b, WOOLCOCK et al. 1980).
Die Rhodokokkose tritt sowohl sporadisch wie auch endemisch auf, wobei die Morbidität durchschnittlich bei 5-17 % und die Letalität bei bis zu 80 % liegt (AINSWORTH 1999, ELLISADE et al. 1980, MARTENS et al. 1982).
Die großen Verluste, die letztendlich auch mit wirtschaftlichen Einbußen einhergehen, lassen sich durch die meist zu späte Erkennung der Erkrankung durch den Tierbesitzer und die meist fehlgeschlagene antibiotische Behandlung erklären.
Nicht nur aufgrund der hohen Mortalität, sondern auch hinsichtlich der langwierigen Behandlungen mit hoher finanzieller Belastung ist es erstrebenswert, die Früherkennung mit Hilfe diagnostischer Verfahren anzustreben und somit eine Verbesserung der Tiergesundheit insbesondere die der Fohlen zu gewährleisten.
Als diagnostische Methode zum direkten Erregernachweis ist nach wie vor die bakteriologische Untersuchung kombiniert mit einer zytologischen Untersuchung des Tracheobronchialsekretes (MARTENS et al. 1982) von großer Bedeutung. Vorteil dieser Methode ist die hohe Spezifität. Die Nachteile dieser Methode liegen jedoch zum einen an der im Untersuchungsmaterial vorliegenden Begleitflora, und zum anderen an dem relativ hohen Zeit- und Arbeitsaufwand und der niedrigen Sensitivität.
Die PCR findet als eine sehr schnelle und sensitive Methode immer häufiger Anwendung in der Routinediagnostik. Dabei kann der Nachweis von Rhodococcus equi sowohl aus Kot-, Blut- als auch aus Trachealspülproben erfolgen. SELLON et al. (1997) zeigte als erster, dass Rhodococcus equi-DNA aus Kot-, Blut- und Trachealspülproben mittels PCR nachweisbar ist.
Zumeist beruhen die PCR-Methoden von Rhodococcus equi auf der Amplifikation von 16s- RNA (SELLON et al. 1997), auf dem Nachweis von Virulenzplasmiden (TAKAI et al.
1995b) oder auf der Basis des ChoE-Genes (LADRON et al. 2003). Jedoch haben sie bisher noch keinen Eingang in die Routinediagnostik gefunden.
Ziel dieser Arbeit ist es, neben den beschriebenen PCR-Methoden eine PCR für den routinediagnostischen Einsatz zu etablieren, deren Target zudem möglicherweise mit der Virulenz des Erregers assoziiert ist und auf chromosomaler Ebene basiert. Bekannt ist mittlerweile, dass alle von jungen Fohlen isolierten virulenten Rhodococcus equi-Stämme ein 15-17 kDa großes Protein exprimieren (Virulenz-assoziiertes Protein A), das durch das Virulenzplasmid kodiert wird (TAKAI et al. 1991, TKACHUK-SAAD und PRESCOTT 1991) und dessen Gegenwart für das intrazelluläre Wachstum in Makrophagen des Wirtes essentiell ist (JAIN et al. 2003). Die genaue Funktion des VapA-Proteins ist jedoch noch nicht bekannt. Nachteil einer auf der Basis eines Plasmids etablierten PCR ist der mögliche Verlust des Plasmids durch verschiedene, insbesondere physikalische Faktoren (TAKAI et al. 1994).
Desweiteren liegen Vermutungen nahe, dass neben dem Plasmid auch Gene auf chromosomaler Ebene an dem Virulenzgeschehen des Rhodococcus equi beteiligt sind (BOLAND et al. 2000, HANTKE et al. 2001, MEIJER und PRESCOTT 2003). Eine PCR basierend auf der Amplifikation eines chromosomalen Genabschnittes, der in Verbindung mit der Virulenz des Erregers steht, könnte eine sensitive und zuverlässige Nachweismethode darstellen.
2 Schrifttum
2.1 Rhodococcus equi
2.1.1 Allgemeiner Überblick und Taxonomie
Rhodococcus equi, früher bekannt als Corynebacterium equi, wurde erstmals in Schweden im Jahre 1923 von MAGNUSSON als Erreger von eitrigen Bronchopneumonien bei jungen Fohlen beschrieben. Aufgrund charakteristischer biochemischer Eigenschaften ordnete dieser Autor das Bakterium der Gattung Corynebacterium zu. 1934 wurde das Corynebacterium equi von JENSEN aufgrund seiner Ähnlichkeit mit den Mykobakterien zum Mycobacterium equi umbenannt, während aber weitere Studien von GORDON (1966) zu einer Umbenennung des Erregers in Mycobacterium rodochrous führten. Rhodococcus equi-Stämme können nicht auf der Basis von Mykolsäuren oder Menachinonen von Stämmen des Genus Corynebacterium unterschieden werden, sondern, wie sich später herausstellt, hinsichtlich ihrer Fettsäuren und ihrer polaren Fettprofile (BARTON et al. 1989, MINNIKIN und GOODFELLOW 1978, 1980). Die Wände von Mykobakterien, Nokardien, Rhodokokken und echten Corynebakterien enthalten im Gegensatz zu den Brevibakterien Mykolsäuren, Arabinose und Galaktose (LECHEVALIER 1977, MINNIKIN und GOODFELLOW 1978, 1980, 1989). Weitere Untersuchungen zeigten, dass Rhodococcus equi gemeinsam mit den Mykobakterien und den Nokardien N-glykolysierte Muraminsäurereste enthält (UCHIDA und KO 1977).
Aufgrund dieser neuen Erkenntnisse schlugen GOODFELLOW und ALDERSON (1977) das neue Genus Rhodococcus mit der Spezies Rhodococcus equi vor, der phylogenetisch zu den nokardioformen Aktinomyzeten zählt. Charakteristisch für die Rhodokokken ist der Aufbau der Zellwand, deren Peptidglykangerüst sich aus N-Acetylglukosaminen, N-Glykolylmuraminsäure, D- und L-Alanin, D-Glutamin, Arabinose und Galaktose zusammensetzt. Die Phospholipide bestehen aus Diphosphatidylglycerol, Phosphatidylethanolaminen, Phosphatidylinositol und Phosphatidylinositolmannosid (FINNERTY 1992). Weitere wichtige Bestandteile sind die geradkettigen, ungesättigten Fettsäuren (LECHEVALIER et al. 1977), Mykolsäuren mit 32 bis 66 Kohlenstoffatomen (MINNIKIN und GOODFELLOW 1980) und die dihydrogenierten Menachinone mit 8 bis 9 Isopreneinheiten (COLLINS et al. 1982, GOODFELLOW 1986, 1989).
DNA-Untersuchungen und Sequenzierungen ermöglichten schließlich eine Unterscheidung der verschiedenen Keime und eine genaue Zuordnung des Erregers zu den Rhodokokken und die Identifizierung der Spezies Rhodococcus equi (MODARSKI et al. 1980 a und b, SUZUKI et al. 1981, YAMADA und KOMAGATA 1970).
2.1.2 Morphologie und Kultivierung
Rhodococcus equi gehört zu den grampositiven pleomorphen Bakterien (SELBITZ 2002a), der auf Blutagar bei einem Temperaturoptimum von 37°C ein gutes Wachstum zeigt, wobei er keine besonderen Ansprüche an den Nährstoffgehalt des jeweiligen Mediums stellt (PRESCOTT 1991, TAKAI et. al. 1994b, 1996).
MAGNUSSON stellte 1923 jedoch fest, dass sich ein schwach saures Medium (pH-Wert zwischen 6 und 8) besser auf das Wachstum des Rhodococcus equi auswirkt als ein alkalisches (BENOIT et al. 2000, TAKAI et al. 1996).
Rhodococcus equi bildet unter aeroben Bedingungen auf Blutagar zunächst feucht glänzende, schleimig grau-weiße, nach 48 Stunden rötliche bis lachsfarbene Kolonien, die einen Durchmesser von 2-3 mm zeigen (DAFAALA et al. 1960, LINTON und GALLAHER 1969).
Die Kolonien weisen eine Tendenz zur Konfluenz auf (PRESCOTT 1991). Abhängig von der Länge der Inkubationszeit verändert sich die Morphologie der Rhodokokken von bazillär bis kokkoid (MAGNANI et al. 1992, McNEIL und BROWN 1994, PRESCOTT 1991). Die Säurefestigkeit von Rhodococcus equi scheint sich nach Angaben verschiedener Autoren nur auf einige Stämme zu beziehen und zum Teil abhängig von dem Medium, dem Alter der Kultur und der Färbetechnik zu sein (BARTON und HUGHES 1980, PRESCOTT 1991, SCOTT et al. 1995).
Rhodococcus equi besitzt eine ausgeprägte antigen wirksame variable Polysaccharidkapsel, die die Basis für das kapsuläre Serotypensystem bereitstellt (PRESCOTT 1981, WOOLCOCK und MUTIMER 1979).
Bisher sind 27 verschiedene Serotypen identifiziert worden (NAKAZAWA et al. 1987), wobei der „Prescott-Kapselserotyp 1“ der weltweit bekannteste ist und die am weitesten verbreitete Prävalenz besitzt (MUTIMER und WOOLCOCK 1982, PRESCOTT 1981, TAKAI et al. 1981). Eine Beziehung zwischen Serotyp und Virulenz ist jedoch nicht erkennbar.
Auf NANAT-Medium (Nalidixin-Acid-Novobiocin-Acid-Tellurit) bildet Rhodococcus equi schwarze Kolonien. Die Bestandteile des NANAT-Selektivmediums sind Agar-Agar, TSB (tryptisch verdautes Sojaeiweiß als flüssiges Medium), Hefeextrakt, Aqua dest. und Zusätze von Kaliumtellurit, Novobiocin, Nalidixinsäure und Cycloheximid (WOOLCOCK et al.
1979).
In Flüssigmedien lässt sich bei einem Rhodococcus equi-Wachstum eine gleichmäßige Trübung der Bouillon feststellen, da der Erreger Filamente mit Ansätzen zu Verzweigungen bildet (DAFAALA et al. 1960).
2.1.3 Biochemische Eigenschaften
Ein zuverlässiges Identifikationsmerkmal für die Rhodokokken stellt die Reduktion von Nitrat und Urease (BARTON und HUGHES 1980, PRESCOTT et al. 1991), wie auch die katalasepositive Eigenschaft dar. Die Oxidase-Reaktion verläuft negativ. Desweiteren produziert Rhodococcus equi Lipasen und Phosphatasen (MUTIMER und WOOLCOCK 1983).
PRESCOTT et al. (1991) konnte an einigen Isolaten eine Hydrolyse von Äskulin und Hippurat beobachten. Zudem zeigten in einer Studie alle getesteten Isolate eine positive Leucin-Arylamidase-, eine positive Acid-Phosphatase- und eine positive Phosphamidase-Reaktion. Über 90 % wiesen eine positive Alpha-Glukosidase-, eine Esterase- und eine Valin-Amylamidase-Reaktion auf (PRESCOTT 1991).
Rhodococcus equi nutzt als Kohlenstoffquelle verschiedene Karbonsäuren und als Natriumquelle Ammoniumsulfat und Kaliumnitrat (PRADIP et al. 1966, YAGER 1987).
Ferner wird auf Schafblutagar ein CAMP-Phänomen ähnlich wie bei Streptococcus agalactiae mit Staphylococcus aureus beobachtet.
Ein weiteres Merkmal für Rhodococcus equi ist die Bildung löslicher Faktoren (Equi-Faktor), die mit der Phospholipase D von Corynebacterium pseudotuberculosis, dem ß-Toxin von Staphylococcus aureus und dem Hämolysin von Listeria monocytogenes einen Bereich vollständiger Hämolyse mit Schaferythrozyten bilden (BERNHEIMER und AVIGAD 1980, FRASER 1964).
2.1.4 Virulenzfaktoren
Mögliche Virulenzfaktoren sind Kapselpolysaccharide, die die Phagozytose des Wirtes hemmen, Exoenzyme wie Cholesteroloxidase oder Phospholipase C (MEIJER und PRESCOTT 2004). Das Auftreten des Equi-Faktors und die damit verbundene membranolytische Aktivität läßt nach bisherigen Erkenntnissen noch keinen genauen Zusammenhang zur Virulenz erkennen (BERNHEIMER et al. 1980, LINDER et al. 1982, PRESCOTT 1991).
Die Funktion der Mykolsäure enthaltenden Glykolipide ist nach bisherigem Wissensstand nicht eindeutig geklärt; bekannt ist lediglich eine sogenannte Promotorfunktion bei Granulombildungen. Mäuse, die mit Rhodococcus equi-Isolaten infiziert wurden, die Mykolsäuren mit langen Kohlenstoffketten sezernierten, bildeten mehr Granulome und starben eher als Tiere, die mit Isolaten mit kurzkettigen Mykolsäuren infiziert wurden (GOTOH et al. 1991, SAWAI et al. 1987).
Die Cholesteroloxidase wird in unterschiedlichen Mengen von den einzelnen Stämmen produziert, aber ob eine Korrelation zur Virulenz vorliegt, ist bisher nicht bekannt, denn sowohl avirulente wie auch virulente Stämme sezernieren dieses Enzym (LANGE 1992, MacLACHLAN et al. 2000, POLLEGIONI et al. 1999).
Das VapA-Plasmid ist bislang der einzige sicher identifizierte Virulenzfaktor von Rhodococcus equi. Virulente Rhodococcus equi-Isolate exprimieren ein 15 bis 17,5-kDa großes Protein, das bei apathogenen Stämmen nicht gebildet wird (CHIRINO-TREJO und PRESCOTT 1987, TAKAI et al. 1993a, YUYAMA et al. 2002). Auch TAKAI et al. (1991) zeigte an Mäusen, dass alle virulenten Stämme dieses Protein exprimieren. Unabhängig voneinander berichteten TAKAI et al. (1991) und TKACHUK-SAAD und PRESCOTT (1991) über ein 85 kb großes Plasmid bei den Rhodococcus equi-Isolaten, die ein 15-17 kDa Protein exprimieren. Dieses VapA-Gen wurde kloniert und die Lokalisation bestätigt (TAN et al. 1995). Es wird an der bakteriellen Oberfläche exprimiert, wobei die Expression Temperatur- und pH-abhängig ist. Eine Aufregulierung der Genexpression findet bei hohen Temperaturen (37°C - 41°C) und niedrigem pH-Wert (pH: 6,5) statt (MEIJER und PRESCOTT 2004, TAKAI et al. 1992, 1996).
Bis zum heutigen Zeitpunkt ist die Funktion des VapA-Genes nicht genau analysiert, bekannt ist nur, dass es essentiell für die Virulenz ist und das intrazelluläre Überleben des Erregers gewährleistet (BYRNE et al. 2000, HAITES 1997). Die Präsenz dieses Virulenzplasmids ist weiterhin essentiell für die Fähigkeit des Erregers eine Erkrankung der Fohlen herbeizuführen
(GIGUÈRE et al. 1999, WADA et al. 1997). Subkultivierungen dieser Stämme bei 37°C führen zu einem Verlust des Plasmids und zur Eliminierung des virulenten Phänotypes (TAKAI et al. 1994, 1995). Rhodococcus equi Stämme, die dieses Plasmid nicht besitzen, sind nicht fähig in vitro in Makrophagen zu überleben und sich dort zu vermehren. Sie sind für Fohlen und Mäuse avirulent (GIGUÈRE et al. 1999, HONDALUS et al. 1994, MEIJER und PRESCOTT 2004, WADA et al. 1997).
Auch submaxillare Lymphknotenisolate des Schweines weisen ein großes Plasmid auf, jedoch handelt es sich hierbei um ein 20 kDa großes Plasmid (VapB) (MAKRAI et al. 2002, OLDFIELD et al. 2003, TAKAI et al. 2000). Isolate aus Schweinen sind in Mäusen weniger virulent als Isolate aus Fohlen, die das VapA-Plasmid enthalten (TAKAI et al. 1996).
Rhodococcus equi-Isolate von Rindern und Ziegen besitzen kein Virulenzplasmid, humane Isolate jedoch weisen entweder das VapA, das VapB oder gar kein Plasmid auf (FLYNN et al.
2001, TAKAI et al. 1995b, TAKAI 1997, TKACHUK-SAAD et al. 1998). Desweiteren wurden noch drei weitere plasmidkodierte Gene analysiert (VapC, VapD, VapE), welche Mitglieder der VapA-Genfamilie und in allen Isolaten vorhanden sind, die das VapA Gen exprimieren (BYRNE et al. 2001, MEIJER und PRESCOTT 2004). VapC, VapD und VapE werden in ähnlicher Weise thermoreguliert wie das VapA-Plasmid. BENOIT und Mitarbeiter demonstrierten, dass das VapA und das VapG unter oxidativem Streß (H2O2) aufreguliert werden (BENOIT et al. 2002). REN und PRESCOTT (2003) testeten den Einfluß von Temperatur, Magnesiumchlorid und Eisen auf die Expression der Gene innerhalb der Pathogenitätsinsel. Ein Temperaturanstieg und ein Eisenmangel führte bei den sechs Vap- Genen zu einer Aufregulierung und eine niedrige Magnesiumkonzentration zu einer Herunterregulierung der Genexpression (REN et al. 2003). Bis heute wurden zwei Transkriptionsrepressoren, das Fur-Gen (Ferritin uptake regulatory protein) und das IdeR-Gen (Iron dependent regulatory protein), die die eisenabhängige Genexpression kontrollieren, identifiziert (HANTKE 2001, MEIJER und PRESCOTT 2004). Obwohl diese Proteine nicht miteinander verwandt sind, funktionieren sie in ähnlicher Weise. Beide unterdrücken die Transkription in Gegenwart von Eisen, indem sie an ihre verwandten Bindungsstellen binden.
In Abwesenheit von Eisen löst sich das Protein von der Bindungsstelle und die Unterdrückung der Transkription ist aufgehoben. Es zeigte sich, dass das IdeR-Protein von Rhodococcus equi ein funktionelles Protein ist; es bindet an die Erkennungssequenz und reguliert die Genexpression in Abhängigkeit von Fe2+ (BOLAND et al. 2000). Die Promotorregion des VapA-Gens enthält eine für das IdeR übereinstimmende Bindungsstelle. Daraus läßt sich schließen, dass die eisenabhängige VapA-Expression durch das IdeR-Gen kontrolliert wird
(REN et al. 2003). Da der Erreger Rhodococcus equi endemisch und auch sporadisch auftritt, ist die Annahme erlaubt, dass Virulenzfaktoren bei verschiedenen Stämmen oder unter bestimmten Umweltbedingungen unterschiedlich ausgebildet sind. Klinische Isolate erscheinen virulenter als Isolate aus der Umwelt (ROONEY et al. 1966), und Stämme, die aus Bodenproben von endemisch erkrankten Betrieben isoliert werden, sind virulenter als die, die von Betrieben ohne Rhodococcus equi Historie stammen (BOWLES et al. 1987, TAKAI et al.
1991b).
2.1.5 Epidemiologie
Rhodococcus equi ist ein ubiquitär vorkommender Bodensaprophyt mit geringen Wachstums- und Nährstoffansprüchen an den Boden. Er kann aus dem Kot von Herbivoren (vornehmlich Herbivoren mit Weidegang) wie Rind, Pferd, kleinen Wiederkäuern und Rehwild und Omnivoren wie dem Schwein isoliert werden (RAO et al. 1982, ROBERTS 1957). Selten nur gelingt eine Isolierung von Rhodococccus equi auch aus dem Kot von Hund, Katze und von Wildvögeln (CARMAN und HODGES 1987, WOOLCOCK et al. 1981). Ein Auftreten dieses Erregers wird zunehmend bei immunsuppressiven Menschen (AIDS-Patienten) beschrieben (MAGNANI et al. 1992, SCOTT et al. 1995). Rhodococcus equi wird vermehrt in heißen, trockenen und windigen Sommermonaten in Bodenproben nachgewiesen (PRESCOTT 1987).
Die Vermehrungsbedingungen im Boden sind abhängig vom Boden-pH (pH: 6-8), dem Vorhandensein von flüchtigen Fettsäuren im Dung und der Umgebungstemperatur. Unter 10°C allerdings verliert der Erreger die Fähigkeit sich zu vermehren (HUGHES und SULAIMAN 1987, TAKAI et al. 1986b, 1987).
Als Hauptübertragungswege gelten die Inhalation und die Aufnahme über den Verdauungstrakt (JOHNSEN et al. 1983, MARTENS et al. 1982). Aber sowohl der omphalogene als auch der intrauterine Weg wurden beschrieben, genauso auch die Übertragung durch wandernde Parasitenlarven (BARTON und HUGHES 1980).
Rhodococcus equi-Erkrankungen verlaufen in einigen Pferdebetrieben endemisch in anderen wiederum nur sporadisch (PRESCOTT 1987, ROONEY 1966). TAKAI et al. (1991) begründete dieses Auftreten durch unterschiedliche Umweltbedingungen und Virulenzunterschiede. In den oberflächlichen Bodenschichten ist Rhodococcus equi vermehrt anzutreffen. Eine Studie von BARTON und HUGHES (1981) zeigt eine höhere Isolierungsrate von Rhodococcus equi aus Dung als aus rektal entnommenen Kotproben.
Genauso konnte PRESCOTT et al. (1984b) darlegen, dass im Boden eine höhere Keimzahl als im Dung vorherrscht, wodurch die Vermutung aufkam, das sich Rhodococcus equi in mit Kot verunreinigtem Boden vermehrt. HUGHES und SULAIMAN (1987) konnten diesen Nachweis auch erbringen.
Bei der Rhodokokkose der Fohlen handelt es sich um eine weltweit verbreitete Erkrankung mit wachsender wirtschaftlicher Bedeutung. Sie geht mit einer Morbidität von 5-17 % einher (ALTHAUS 2004, ELLISADE et al. 1980, S∅LAND und OLSEN 1995, TAKAI et al.
1985a). Die Letalität liegt bei bis zu 80 %.
2.2 Rhodokokkose
2.2.1 Pathogenese und Krankheitsbild
Rhodococcus equi ist ein fakultativ intrazellulärer Erreger, der die Fähigkeit besitzt in Makrophagen zu persistieren, indem er die Fusion von Lysosomen mit Phagosomen verhindert (HIETALA und ARDANS 1987a, ZINK et al. 1987). Eine für eine Rhodococcus equi-Erkrankung typische Lungenläsion ist durch eine eitrig-granulomatöse Bronchopneumonie mit Abszessbildung gekennzeichnet, die mit einer starken Infiltration von neutrophilen Granulozyten einhergeht (PRESCOTT 1991). Die minimale infektiöse Dosis von Rhodococcus equi beträgt bei einem Fohlen 104 Keime/Fohlen.
2.2.1.1 Bronchopneumonie
In erster Linie erfolgt die Infektion über den Respirationstrakt. Klinisch erkrankt sind vor allem Fohlen im Alter von 1 bis 6 Monaten. Häufig manifestiert sich die Erkrankung als eine chronisch eitrige Bronchopneumonie mit starker Abszessbildung und einer Lymphadenitis (ZINK et al. 1986). Aufgrund der langsamen Ausbreitung der Lungeninfektion und der Fähigkeit des Fohlens die fehlende Lungenfunktion zu kompensieren, werden klinische Symptome meist erst spät erkannt. Leichtes Fieber, Rasseln bei der Auskultation der Trachea und der Lunge und ein Anstieg der Respirationsrate sind erste Anzeichen einer Erkrankung (ALTHAUS 2004). Im weiteren Verlauf kommt es zu einem Anstieg der Körpertemperatur auf 38,8 bis 41,5°C, Lethargie, Inappetenz, Tachypnoe und Dyspnoe mit vermehrter Bauchatmung (GIGUÈRE und PRESCOTT 1997). Auskultatorisch ist bei der Inspiration oder
auch Expiration ein pfeifendes Geräusch und ein Knacken vornehmlich im kranio-ventralen Bereich hörbar (ARDANS et al. 1986, BAIN 1963, FALCON et al. 1985).
Die Befunde bei der Auskultation korrelieren jedoch nicht mit dem Schweregrad der Erkrankung (FALCON et al. 1985).
Auch akut verlaufende Erkrankungen können beim Fohlen beobachtet werden. Nach plötzlicher hochgradiger Dyspnoe und Fieber verenden die Tiere innerhalb von 24 bis 48 Stunden (ROONEY 1966).
2.2.1.2 Intestinale Manifestation
Ungefähr 50 % der an Pneumonie erkrankten Fohlen weisen auch eine intestinale Infektion auf (ZINK et al. 1986), doch nur wenige Tiere zeigen klinische Symptome wie Abgeschlagenheit, Fieber, Anorexie, Koliken, Aszites, Diarrhoe und Gewichtsverlust. Der Rhodococcus equi induzierte Durchfall tritt jedoch häufig auf ohne dass Atemwegserkrankungen beobachtet werden (BALDWIN et al. 1992, ZINK et al. 1986).
2.2.1.3 Nicht septische Polysynovitis
Bei bis zu einem Drittel der an Pneumonie erkrankten Fohlen wird auf einigen Beständen eine immunvermittelte lymphoplasmatische Polysynovitis bevorzugt im Tibiotarsal- und in den steifen Gelenken erkennbar (SWEENEY et al. 1987). In seltenen Fällen zeigen sich Lahmheit oder steifer Gang.
2.2.1.4 Septische Arthritis und Osteomyelitis
Nach Invasion der Lunge oder des Gastrointestinaltraktes kann der Erreger sich nach bakterieller Streuung in den Gelenken ansiedeln und zu einer septischen Arthritis und Osteomyelitis führen (COLLATOS et al. 1990, DESJARDINS et al. 1990, FIRTH et al. 1980, 1993). Sogar vertebrale Osteomyelitiden wurden mit zunehmender Häufigkeit beschrieben (CHAFFIN et al. 1995, GIGUÈRE et al. 1994, MARKEL et al. 1986, ROONEY 1966). Die
Symptome gehen je nach Schweregrad mit Fieber, steifem Gang, Paresen, Ataxien und Paralysen einher.
2.2.1.5 Weitere Manifestationen
Bei Fohlen sind ein Auftreten von ulzerativen Lymphangitiden, subkutanen Abszessen, Nephritiden, wie auch Abszesse an Niere und Leber, Uveitis und Panophtalmie beschrieben (BEECH und SWEENEY 1991, BLOGG et al. 1983, DEWES 1972, 1989, ELLENBERGER et al. 1986, ZINK et al. 1986).
2.2.1.6 Adulte Pferde
Erwachsene Pferde können in ähnlicher Weise wie die Fohlen erkranken, doch tritt dies äußerst selten auf (ROBERTS et al. 1980).
2.2.2 Pathologie und Histologie
Zu den primär auftretenden pathologischen Befunden gelten insbesondere subakute bis chronische Bronchopneumonien mit bis zu hühnereiergroßen Abszessen und Lymphadenitis (YAGER 1987). Die Lungen stellen sich in der Sektion feucht, schwer und dunkel dar (SMITH und ROBINSON 1981). Frühe Lungenläsionen werden charakterisiert durch massives Eindringen von phagozytierenden Zellen in die Alveolarräume in Form von mehrkernigen Riesenzellen. Rhodococcus equi kann in großer Anzahl sowohl in Makrophagen wie auch in Riesenzellen nachgewiesen werden, selten auch in neutrophilen Granulozyten. Die interalveolaren Septen sind nicht betroffen (JOHNSON et al. 1983). Die Degeneration der Makrophagen koinzidiert mit der Entwicklung von lokalen lytischen Läsionen und der Zerstörung des Lungenparenchyms. Aus einigen Berichten ist zu entnehmen, dass die Hälfte der infizierten Fohlen eine multifokale ulzerative Kolitis und Typhlitis zeigen (CIMPRICH et al. 1977, JOHNSON et al. 1983, ROONEY 1966, ZINK et al. 1986). Die pathologischen Befunde im intestinalen Bereich beginnen als eitrig granulomatöse Veränderungen an den Peyerschen Platten und streuen in Form von Ulzerationen aus. Die lokalen Lymphknoten, wie die mesenterialen und die des Kolons, sind
vergrößert. Läsionen in der Leber und Milz sind selten anzutreffen (YAGER 1987, ZINK et al. 1986), vereinzelt wurde auch eine Peritonitis beschrieben.
Bei der arthritischen Form weist die Synovialflüssigkeit eine mononukleäre Pleozytose auf (SWEENEY et al. 1987). Histologisch läßt sich an der Synovialmembran eine lymphoplasmatische Synovitis erkennen (KENNEY et al. 1994, MADISON und SCARRATT 1988).
2.2.3 Immunologie
Frühe Studien an natürlich und experimentell infizierten Fohlen berichten von einem unregelmäßigen und niedrigen Gehalt an detektierbaren Antikörpern in der Agglutinationsreaktion, der Komplementbindungsreaktion oder der Präzipitation (CARTER und HYLTON 1974, NAKAZAWA et al. 1987, PRESCOTT et al. 1979, WILKS et al. 1982).
Die Ergebnisse dieser frühen Untersuchungen zeigen, dass der Schutz der Fohlen durch die humorale Immunantwort eher geringfügig ausgeprägt ist. Daraus wird geschlossen, dass die Immunität primär auf zellvermittelten Mechanismen beruht (WOOLCOCK et al. 1987). Der Gehalt an maternalen Antikörpern aus dem Kolostrum nimmt im Fohlen bis zur achten Lebenswoche ab. Ab der 4. Lebenswoche werden die Antikörper im Jungtier aktiv gebildet (JEFFCOTT 1974). Die Fohlen sind ab den ersten Lebenstagen und bis zum Alter von fünf Monaten für eine Infektion mit Rhodococcus equi sehr empfänglich (ALTHAUS 2004). In vitro ist die Adhäsion des Erregers an Mäuse-Makrophagen komplementabhängig und wird durch den Makrophagen-Komplement-Rezeptor CR3 ermöglicht. Die Expression des Rezeptors korreliert mit bakterieller Adhärenz (HONDALUS et al. 1993, 1997). Wie in vitro an humanen Zelllinien dargestellt werden konnte, stimuliert Rhodococcus equi die Ausschüttung von Zytokinen wie zum Beispiel den Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) oder das Interferon-γ (IFN-γ), die letztendlich die bakterizide Wirkung der Makrophagen aktivieren (FEINMAN et al. 1987, NATHAN et al. 1983). Milzzellen von nicht infizierten Mäusen zeigen bei der Inkubation mit Rhodococcus equi einen Anstieg des Tumornekrosefaktors-α.
Nach Behandlung von mit Rhodococcus equi infizierten Mäusen mit Antikörpern gegen TNF- α ist ein signifikanter Anstieg der Bakterien im Lungen-, Leber- und Milzgewebe zu beobachten (NORDMANN et al. 1993b).
ZINK et al. (1985) zeigte jedoch anhand von in vitro Studien mit Alveolarmakrophagen, dass Rhodococcus equi in Makrophagen persistieren kann. Weitere Untersuchungen ergaben eine
Korrelation zwischen einer intrazellulären Persistenz und einem Fehlen der Phagosomen- Lysosomen-Fusion (HIETALA und ARDANS 1987, ZINK et al. 1987). ELLENBERGER et al. (1986) demonstrierte in in vitro Versuchen, dass die bakterizide Wirkung von Makrophagen wie auch von polymorphkernigen Granulozyten durch Rhodococcus equi gehemmt wird. Ferner vermehren sich virulente Rhodococcus equi-Stämme in Makrophagen stärker als avirulente, wie HONDALUS und MOSSER (1994) nachwiesen.
Rhodococcus equi ist nachweislich toxisch für Makrophagen. Dabei werden viele Zellen irreversibel zerstört. Die Phagozyten-Degeneration tritt in vitro acht Stunden nach der Infektion ein (HIETALA und ARDANS 1987, ZINK et al. 1987).
2.3 Diagnostischer Nachweis
Um die klinische Verdachtsdiagnose der Rhodokokkose zu untermauern, wird häufig die bakteriologische Untersuchung kombiniert mit der zytologischen Untersuchung des Tracheobronchialsekretes zur Klärung einer Infektion als sogenannter Goldstandard eingesetzt (GIGUÈRE und PRESCOTT 1997, PRESCOTT 1991). Da jedoch Rhodococcus equi fakultativ intrazellulär lebt und nur periodisch ausgeschieden wird (MARTENS et al.
1982), ist dieser Keim nur bedingt kulturell nachweisbar (MEYER-HAMME 2004).
Bei den diagnostischen Untersuchungsmethoden muß zwischen dem direkten und dem indirektem Erregernachweis unterschieden werden. Weitere empfohlene diagnostische Tests sind Blutuntersuchungen, Fibrinogenmessung, röntgenologische und sonographische Untersuchungen (ALTHAUS 2004, FALCON et al. 1985, GIGUÈRE und PRESCOTT 1997).
Bei über 3 Monate alten Fohlen muß bei knotigen Veränderungen und Lymphadenopathien Streptococcus equi subsp. zooepidemicus in der röntgenologischen Untersuchung als Differentialdiagnose berücksichtigt werden (LAVOIE et al. 1994). Bei Fohlen mit einer durch Rhodococcus equi verursachten Pneumonie liegt meist eine Hyperfibrinogenämie, wie auch eine neutrophile Leukozytose und Monozytose vor (SWEENEY et al. 1987). Ein weiteres Charakteristikum für eine Rhodococcus equi-Infektion ist der erhöhte Gehalt an Thrombozyten (LEADON et al. 1988).
2.3.1 Direkter Erregernachweis
Bei einem direkten Erregernachweis wird entweder der gesamte Erreger, zum Beispiel mit Hilfe eines Mikroskops oder einer kulturellen Untersuchung, oder aber nur Teile des Erregers wie z.B. seine DNA mit Hilfe einer Polymerase- Kettenreaktion nachgewiesen.
2.3.1.1 Kulturelle und zytologische Untersuchung
Als häufig eingesetzter direkter Erregernachweis gilt nach wie vor, gemeinsam mit der zytologischen, die bakterielle Untersuchung von Tracheobronchialsekret (TBS), wie sie unter Kapitel 2.1.2. beschrieben wurde. Mit Hilfe der Endoskopie wird das vorliegende Sekret selektiv mit Hilfe eines Aspirationskatheters und einer Spritze abgesaugt. Das Material kann dann sowohl für die bakterielle als auch für die zytologische Untersuchung eingesetzt werden.
Die Ergebnisse hinsichtlich der Sensitivität der Kultur variieren stark. MARTENS et al.
(1982) beschrieb diesen direkten Nachweis als unzuverlässig, während MULLER und MADIGAN (1992) und LAVOIE et al. (1994) das Gegenteil bestätigten. In der Dissertation von MEYER-HAMME (2004) zeigte sich, dass der kulturelle Nachweis von Rhodococcus equi bei Fohlen mit sonographisch nachgewiesenen Bronchopneumonien sowohl von Nasentupfern als auch von TBS-Tupfern nicht zuverlässig zu einem Nachweis von Rhodococcus equi führt. Von 217 sonographisch positiven Fohlen konnte lediglich in 54 % aus TBS-Tupfern Rhodococcus equi kulturell isoliert werden, während der kulturelle Nachweis aus Nasentupfern nur in 24 % der Fälle gelang (MEYER-HAMME 2004). Folglich sollte, wie üblich in der Medizin, die Kultur nicht als alleiniger Infektionsparameter herangezogen werden, sondern nur in Kombination mit einem weiteren diagnostischen Verfahren.
Bei Fohlen, die keine klinischen Symptome haben, aber mit Rhodococcus equi kontaminierten Staub eingeatmet haben, kann Rhodococcus equi im TBS kulturell nachgewiesen werden (ARDANS et al. 1986).
SWEENEY et al. zeigten 1987, dass 61 % von 48 kulturell positiven TBS-Proben zytologisch als Rhodococcus equi identifiziert werden konnten. Bronchioalveoläre Lavage-Flüssigkeit (BALF) eignet sich für den kulturellen Nachweis nicht besonders gut, denn trotz eines positiven klinischen und zytologischen Befundes im TBS zeigten von 22 erkrankten Fohlen 50 % einen normalen zytologischen Befund in der BALF-Probe (ROSSIER et al. 1991).
Anhand dieser Studien wurde belegt, dass sich TBS-Material für zytologische Untersuchungen besser eignet als BALF.
Auch aus dem Kot von Pferden, die aus Betrieben ohne Rhodococcus equi-Historie stammen, ist der Erreger isolierbar (NAKAZAWE et al. 1983, TAKAI et al. 1986a, c). Die quantitative Kultur des Kotes in wöchentlichen Abständen galt als eine frühe Hilfe in der Rhodococcus equi bedingten Enteritis-Diagnostik. Die gezählten Bakterien pro Gramm Kot gaben Rückschluß auf die Klinik und deren Ausmaße (TAKAI et al. 1986c), doch viele erkrankten Fohlen wiesen kein kulturell positives Ergebnis im Kot auf (ARDANS et al. 1986).
2.3.1.2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Die Amplifikation einer spezifischen DNA-Sequenz durch die Polymerase-Kettenreaktion verspricht gegenüber der Kultur ein schnelleres Ergebnis. Auch langsam wachsende oder gar tote und deshalb nicht mehr vermehrungsfähige Erreger können mit dieser Methode nachgewiesen werden (PERSING et al. 1993). Somit gilt die Polymerase-Kettenreaktion als ein sehr sensitives Testverfahren.
2.3.1.2.1 VapA-PCR
Einige Autoren (HAITES et al. 1997, TAKAI et al. 1995a) entwickelten eine PCR auf der Basis des virulenzassoziierten Plasmids (VapA) mit einer Amplifikatgröße von 564 bp. Die Ergebnisse dieser PCR wurden mit Hilfe der Southern-Blot-Hybridisierung bestätigt (TAKAI et al. 1998). Die Spezifität wurde anhand von 13 verschiedenen im Respirationstrakt auftretenden Mikroorganismen überprüft. Die Nachweisgrenze dieser VapA-PCR lag bei 103 bis 104 Keime/ml Trachealflüssigkeit. Um falsch negativen Ergebnissen vorzubeugen, entwickelte TAKAI et al. (1998) zwei weitere PCR-Methoden auf der Basis des Plasmids:
eine nested-PCR und eine PCR in Kombination mit einer Anreicherungskultur in Selektivmedium. Alle PCR-negativen und Kultur-positiven Proben ergaben mit Hilfe der nested-PCR positive Ergebnisse. In einer weiteren Studie (OLDFIELD et al. 2003) wurde anhand von 35 Rhodococcus equi-Isolaten verschiedener Wirte eine PCR entwickelt, die eine selektive Amplifikation von VapA und VapB versprach. Alle Isolate von Pferden wiesen ein VapA-PCR positives Ergebnis auf. Die Isolate aus Schweinen ergaben in der VapB-PCR sowohl positive als auch negative Ergebnisse. Die VapA-PCR wies durchgehend negative
Ergebnisse auf. Die Isolate aus menschlichen Patienten ergaben zum Teil sowohl in der VapA- als auch in der VapB-PCR- positive Ergebnisse (OLDFIELD et al. 2003), was die Schlussfolgerung erlaubt, dass sowohl das VapA als auch das VapB-Plasmid beim Menschen vorkommen kann. Das Schwein verfügt jedoch nicht über das VapA-Plasmid sondern lediglich über das VapB-Plasmid.
2.3.1.2.2 16S-rRNA-PCR
BELL et al. (1996) beschrieb eine PCR zur Identifizierung von Rhodococcus equi auf der Basis von 16S-rRNA. Er untersuchte zehn verschiedene Rhodococcus equi Stämme, die alle ein positives PCR-Ergebnis erzielten. Andere Spezies erbrachten keine Amplifikate. Über die Herkunft der Stämme liegen keine Angaben des Autors vor. Das einzelsträngige 16S-rRNA Molekül ist ein Hauptbestandteil der kleinen ribosomalen Untereinheit und besteht aus 1700 Ribonukleotiden. Die 16S-rRNA ist ein Teil der ribosomalen Struktur und an der Proteinbiosynthese beteiligt. Die Sequenz der 16S-rRNA ist hochkonserviert und funktionell konstant und somit gilt die 16S-rRNA-PCR als Spezies-spezifisch (STRYER 1991).
1997 zeigte SELLON et al. anhand von Blut- und Trachealspülproben von an Rhodococcus equi infizierten Fohlen, dass die PCR als ein schneller Nachweis des Erregers in der Diagnostik eingesetzt werden kann. Zur Identifizierung von virulenten Stämmen wurde eine PCR auf der Basis des VapA-Plasmids und zur Absicherung der Spezies eine PCR auf der Basis von 16S-rRNA eingesetzt (SELLON et al. 1997).
SELLON et al. untersuchte 2001 von 53 an Pneumonie erkrankten Fohlen Trachealspülproben, Nasentupfer, sowie Blut- und Serumproben. Die Ergebnisse der unterschiedlichen diagnostischen Nachweisverfahren wie Kultur (Sensitivität 57,1 %), AGID als serologischer Nachweis (Sensitivität 62,5 %, Spezifität 75,9 %) und die PCR wurden in Bezug zur Klinik gestellt. Er verglich dabei zwei verschiedene PCRs miteinander, zum einen eine PCR die auf dem VapA-Gen basiert (VP-PCR) und zum anderen eine PCR, die auf 16S- rRNA (16s-PCR) basiert und somit Spezies-spezifisch ist. Die VapA-PCR anhand von Trachealspülproben zeigte eine Sensitivität von 100 % und eine Spezifität von 90,6 %, die 16S-PCR eine Sensitivität von 78,6 % und eine Spezifität von 68,8 %. Ergebnisse zwischen den EDTA-Proben und den Proben ohne Antikoagulantien variierten kaum. Hinsichtlich der Sensitivität und der Spezifität erwiesen sich die Trachealspülproben gegenüber den
Nasentupfern als geeigneteres Material: Die Sensitivität der VP-PCR aus 38 Nasentupfern gegenüber der Kultur lag bei 50 % und die Spezifität bei 88,9 %.
2.3.1.2.3 ChoE-PCR
Eine weitere PCR zur Detektion von an Rhodococcus equi infizierten Fohlen basiert auf dem ChoE-Gen, das für das Enzym Cholesteroloxidase kodiert (NAVAS et al. 2001). Dieses Enzym ist homolog zu von anderen Bakterien sezernierten Cholesteroloxidasen, wie sie im Brevibacterium sterolicum und Streptomyces spp. identifiziert wurden (LANGE 1992, POLLEGIONI et al. 1999). Ähnlichkeiten liegen auch zur Cholesteroloxidase des Mycobacterium tuberculosis vor. Die Cholesteroloxidase ist ein wichtiger membranolytischer Faktor, der an dem sogenannten Equi-Faktor beteiligt ist.
Die Frage, ob es sich bei diesem Enzym um einen Virulenzfaktor handelt, ist noch nicht genau geklärt. Doch man vermutet, dass neben dem virulenzassoziierten Plasmid noch weitere insbesondere chromosomale Virulenzfaktoren Einfluß auf die Rhodococcus equi-Infektion und deren Erkrankungen nehmen, da in einigen klinischen Isolaten kein Plasmid isoliert werden konnte (NAVAS et al. 2001). LADRON et al. (2003) testeten die von NAVAS et al.
(2001) entwickelte PCR anhand von 132 aus verschiedenen geographischen Gebieten stammenden Isolaten (Spanien, Deutschland, Australien, Dominikanische Republik). 34 Isolate stammten von an Pneumonie erkrankten Fohlen, 49 Isolate von AIDS-Patienten, 46 Isolate aus Bodenproben und 3 Isolate aus Kotproben von Fohlen. Alle Rhodococcus equi- Isolate ergaben ein positives PCR-Ergebnis, was schließlich auf eine hohe Konservierung des ChoE-Genes hinweist. Einige Isolate wiesen ein negatives Ergebnis in der ChoE-PCR auf, doch bei der Speziesüberprüfung mit Hilfe der 16s-RNA-PCR zeigte sich, dass es sich in diesen Fällen nicht um Rhodococcus equi-Isolate handelte. Alle Nicht-Rhodococcus equi- Isolate lieferten ein negatives PCR-Ergebnis auf der Basis des ChoE-Genes. Der einzig bekannte Stamm von Brevibacterium sterolicum (ATCC 21387) ergab ein 959 bp großes Amplifikat. Im Vergleich mit der 16s-PCR konnte dieser Stamm als Rhodococcus equi–Isolat identifiziert werden. Die Spezifität wurde mit Hilfe von 30 weiteren Isolaten von repräsentativen Aktinomyzeten überprüft.
2.3.2 Indirekter Erregernachweis
Ein indirekter Erregernachweis erfolgt serologisch durch die Bestimmung von Antikörpern im Blutserum mit Hilfe verschiedener Testsysteme.
2.3.2.1 Agar-Gel-Immunodiffusion (AGID)
Alle Rhodococcus equi-Stämme bilden membranolytische Exoenzyme, bekannt als Equi- Faktor (PRESCOTT et al. 1982, 1984a). Diese Exoenzyme bestehen aus Cholesteroloxidase und Phospholipase C. Der Agar-Gel-Immunodiffusionstest detektiert präzipitierende Antikörper gegen diese Exoenzyme. Da erwachsenen Pferde meistens keine präzipitierenden Antikörper aufweisen, können keine falsch positiven Ergebnisse bei den Fohlen aufgrund der maternalen Antikörper erzielt werden (GASKIN et al. 1990). Die früheste Detektion dieser Antikörper ist mit 26 Tagen gegeben. Studien hinsichtlich der Sensitivität und der Spezifität dieses Tests lieferten unterschiedliche Ergebnisse. Die Sensitivität der AGID gegenüber der Kultur lag bei HIETALA et al. (1985) bei 50 %, bei HOFFMAN et al. (1993) bei 60 % und bei NAKAZAWA et al. (1987) bei 100 %. Die Ergebnisse hinsichtlich der Spezifität streuten ähnlich. Derartige Resultate machten die Interpretation der Agar-Gel-Immundiffusion schwierig (GIGUÈRE und PRESCOTT 1997).
2.3.2.2 Synergistische Hämolysehemmung (SHI)
Die Exoenzyme der Rhodokokken führen zusammen mit der Phospholipase D des Corynebacterium pseudotuberculosis oder dem β-Toxin von Staphylococcus aureus zu einer Hämolyse der Erythrozytenmembran (LINDER und BERNHEIMER 1982). Das Vorliegen von Antikörpern gegen diese Exoenzyme führt zur Hämolysehemmung. Diese Reaktion wird diagnostisch zum quantitativen Nachweis von Antikörpern gegen Rhodococcus equi genutzt.
Die synergistische Hämolysehemmung ermöglicht es subklinische Infektionen in Fohlen zu erkennen (SKALKA 1987, SKALKA und SVASTOVA 1985).
2.3.2.3 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
Verschiedene ELISA-Tests wurden zur Bestimmung der humoralen Immunantwort in Serum- wie auch in Milchproben entwickelt. Die Verfahren basieren auf unterschiedlichen Antigenen.
Der California-ELISA (HIETALA et al. 1985) und der ELISA auf der Basis des Stammes ATCC 6939 (TAKAI et al. 1985a) finden Einsatz in der Diagnostik von Rhodococcus equi Infektionen. Bei beiden Tests handelt es sich um indirekte ELISA-Verfahren, wobei es sich bei dem Antigen um ein sogenanntes Tween-20 Extrakt handelt. Mit Hilfe des Detergenz Tween-20, das die Fähigkeit besitzt die Oberflächenspannung herabzusetzen, wurden Oberflächenantigene extrahiert. Der ELISA auf der Basis des Stammes ATCC 6939 (TAKAI et al. 1985a), zeigte gegenüber dem Agar-Gel-Immunodiffusionstest eine höhere Sensitivität.
PRESCOTT et al. entwickelten 1996 einen ELISA auf der Basis von Triton X-114. In diesem ELISA dominiert das fraktionierte virulenzassoziierte Protein (VapA). Dieser ELISA zeigte auch eine Serokonversion in klinisch gesunden Fohlen in einem Alter von 8 bis 10 Wochen.
Im Vergleich liefert der California-ELISA bezüglich der Sensitivität (59 %) und der Spezifität (88 %) die besten Ergebnisse (GIGUÈRE et al. 2003).
Der Antikörpergehalt weist letztendlich auch nur auf einen Kontakt mit dem Erreger hin. Dies bedeutet jedoch nicht, dass bei dem Patienten eine Erkrankung durch Rhodococcus equi vorliegt. Somit eignen sich serologische Tests besser für die Bestandsdiagnostik als für die individuelle Diagnose eines einzelnen Tieres. Erwartungsgemäß zeigten ELISA-Studien, dass eine Korrelation zwischen Antikörpergehalt und Klinik nicht gegeben ist (ELLENBERGER et al. 1984, HIETALA et al. 1985, TRISKATIS 2004).
2.4 Behandlung und Prophylaxe der Rhodococcus equi-Pneumonie beim Fohlen 2.4.1 Therapie
Da Rhodococcus equi fakultativ intrazellulär lebt und die Fähigkeit besitzt in Makrophagen zu überleben und sich darin zu vermehren (HONDALUS und MOSSER 1994), sind viele Therapeutika in vivo nicht wirksam. Aufgrund dieser Eigenschaften des Erregers sollte das einzusetzende Antibiotikum neben einer antimikrobiellen Wirkung in vitro zudem eine gute Verteilung und Aktivität in der Lunge sowie eine intrazelluläre Diffusion besitzen, um eine Eliminierung der Bakterien in den Makrophagen und in den neutrophilen Granulozyten zu gewährleisten (HILLIDGE 1986).
Gentamycin zeigt in vitro eine hohe Wirksamkeit gegen Rhodococcus equi (PRESCOTT 1981, SWEENEY et al. 1987, WOOLCOCK und MUTIMER 1980b), doch bilden sich in vivo die Abszesse nicht zurück (LARSON 1980).
Penicillin und Ampicillin gelingt es nur in geringem Maße die in den Makrophagen sitzenden Erreger zu eliminieren (PRESCOTT und SWEENEY 1985). Auch häufige Resistenzen von Rhodococcus equi gegenüber Penicillin konnten beobachtet werden (PRESCOTT 1981).
Zusätzliche Behandlungsmöglichkeiten bestehen aus den Gaben von nicht-steroidalen Antiphlogistika, von Bronchodilatatoren wie Aminophilline und β-2-adrenergen Substanzen.
Die Kombination von Erythromycin und Rifampicin wird zur Behandlung gegen Rhodococcus equi eingesetzt. Beide Antibiotika verhalten sich dosisabhängig bakteriostatisch oder bakterizid, und ihre Kombination führt zu einer synergistischen Wirkung (NORDMANN et al. 1992).
In vitro liegt meist eine Sensibilität gegenüber Aminoglycosiden (Amikacin, Gentamycin, Neomycin), Clindamycin, Erythromycin, Rifampicin wie auch Vancomycin vor (BURROWS et al. 1980, 1992, MEYER-HAMME 2004). PRESCOTT (1991) zeigte an eingehenden Untersuchungen verschiedener Autoren wie zum Beispiel KNIGHT und HIETALA (1978), PRESCOTT (1981b), WOOLCOCK und MUTIMER (1980b) hinsichtlich der Resistenzlage von Rhodococcus equi, dass eine Resistenz in vitro gegenüber Cephalosporinen der ersten und zweiten Generation vorliegt. Bei Penicillin G, Ampicillin und bei Tetracyclinen verhält sich der Erreger intermediär. Die Kombination von Gentamycin oder Amikacin mit Erythromycin oder Rifampicin zeigt in vitro ein starkes antagonistisches Verhalten im Vergleich zur Monotherapie (NORDMANN et al. 1992).
Erythromycin führt bei Pferden zu erheblichen Nebenwirkungen und kann in einzelnen Fällen bei Fohlen zu schwerer Diarrhöe und bei Mutterstuten zu einer lebensbedrohlichen Colitis führen (AINSWORTH 1999, BURROWS 1980, GIGUÈRE und PRESCOTT 1997, ROBERTS 1990). In heißen Sommermonaten wird weiterhin nach Applikation von Erythromycin bei den Fohlen schwere Tachypnoe und Hyperthermie beschrieben (TRAUB- DARGATZ et al. 1996). Erythromycin wird alle 6 bis 8 Stunden eine Dosis von 25 mg/kg Körpergewicht (KGW) oral verabreicht (BURROWS et al. 1992, HILLIDGE 1987).
WILSON berichtete 1992 über eine erfolgreiche Behandlung bei alleiniger Gabe von Erythromycin bei an Pneumonie erkrankten Fohlen, jedoch zeigte es in Mausmodellen keine Wirkung (NORDMANN et al. 1992). Bei einer Langzeittherapie mit Erythromycin kann es zur Resistenzentwicklung kommen (PRESCOTT und SWEENEY 1985).
Auch Rifampicin sollte, um eine mögliche Resistenzentwicklung zu verhindern, nicht als Monotherapie eingesetzt werden. Die empfohlene Dosierung von Rifampicin liegt bei 10 mg/kg alle 12 Stunden oral. Bei der Kombinationstherapie Erythromycin/Rifamicin wird eine Dosierung von zweimal täglich 5 mg/kg KGW oral empfohlen (HILLIDGE 1987, SWEENEY et al. 1987). Therapiedauer von vier bis neun Wochen werden von HILLIDGE (1987) beschrieben. PRESCOTT und SWEENEY (1985) berichten von Behandlungen bis zu fünf Monaten bzw. bis keine Befunde im Röntgen- oder Ultraschallbild mehr vorhanden sind und die Laborwerte (v. a. Leukozytenzahl und Plasmafibrinogengehalt) wieder im Referenzbereich liegen (PRESCOTT und SWEENEY 1985). In der Dissertation von PILTZ (2004) zeigte die Therapie mit Rifampicin/Trimethoprim/Sulfadiazin im Vergleich zu anderen Therapieformen ein verzögertes Abklingen sowohl der klinischen Symptome als auch der Lungenabszesse. Zudem traten bei dieser kostengünstigen Therapie häufig Rezidive auf.
Trimethoprim/Sulfonamid-Kombinationen weisen eine hohe Wirksamkeit gegen grampositive wie gramnegative Erreger auf (VAN DUIJKEREN et al. 1994). Nebenwirkungen in Form von gastrointestinalen Störungen sind selten zu beobachten (GUSTAFFSON et al. 1999).
Trimethoprim/Sulfonamid-Kombination zeigen jedoch eine geringe Wirksamkeit gegenüber intrazellulär lebenden Erregern und in verkäsendem Material auf (GIGUÈRE und PRESCOTT 1997). Einige Autoren (BARTON und FULTON 1980, GUSTAFFSON et al.
1999, PRESCOTT und SWEENEY 1985) konnten in in vitro Untersuchungen an Rhodococcus equi Isolaten häufig Resistenzbildungen gegenüber Trimethoprim/Sulfonamid- Kombination beobachten.
Die kostenintensivere Therapie mit Azithromycin stellt eine gute Alternative gegenüber Erythromycin/Rifampicin insbesondere hinsichtlich der Verträglichkeit, der Rezidivbildung und der Behandlungsdauer dar. Azithromycin wird einmal täglich in einer Dosierung von 10 mg/kg KGW oral verabreicht (DAVIS et al. 2002, JACKS et al. 2001, LAKRITZ und WILSON 2002, PILTZ 2004). Nebenwirkungen wurden nur bei einer schnellen intravenösen Injektion in Form von Gähnen, Zittern, Ataxie und Schwäche der Fohlen beobachtet (JACKS et al. 2001).
2.4.2 Prophylaxe
Die für Rhodococcus equi günstigen Umweltbedingungen wie Staub und Trockenheit sind eine häufige Ursache für die Verbreitung des Erregers unter den Fohlen eines Bestandes
(FALCON et al. 1985, TAKAI et al. 1986b, 1987). Die Haltungsbedingungen und das Manangement müssen so optimiert werden, dass der Keimdruck innerhalb des Betriebes gesenkt wird (AINSWORTH 1999, COHEN et al. 2000, 2002, GIGUÈRE u. PRESCOTT 1997). Die Ställe der Tiere sollten sauber, regelmäßig desinfiziert und gut ventiliert sein. Die Paddocks dürfen weder verkotet noch staubig-sandig sein. Besser gestalten sich grasbewachsene Flächen mit niedriger Populationsdichte (AINSWORTH 1999, COHEN et al.
2000, 2002). Das Auskoffern von kontaminierten Weiden und Paddocks wurde von COHEN et al. (2000, 2002) als eine aufwendige aber sehr erfolgreiche Methode beschrieben um den Keimdruck zu senken.
Weiterhin wird durch frühzeitige Erkennung und Behandlung von erkrankten Tieren der Ausbreitung des Erregers im Bestand vorgebeugt und somit Verluste durch erkrankte und verendete Tiere verringert. Regelmäßige Auskultation und sonographische Untersuchungen lassen frühzeitig erkrankte Tiere erkennen, doch stellt dies einen hohen Kostenaufwand für den Betrieb dar (ALTHAUS 2004, COHEN et al. 2000, 2002). GASKIN et al. (1990) und WILKENS et al. (1993) befürworteten eine Blutuntersuchung der Fohlen ab dem Zeitpunkt der Geburt bis zum Alter von 5 Monaten in zweiwöchigen Abständen mit Hilfe der Agar-Gel- Immundiffusion. HIGUCHI et al. (1997) schlug eine serologische Untersuchung der Fohlen im Alter von 30-45 Tagen mit Hilfe des Tween 20-ELISAs vor. Doch die Serokonversion zeigt lediglich einen Kontakt mit dem Erreger an. Über den Schutz vor einer Rhodokokken- Infektion durch passive Immunisierung durch eine parenterale Gabe von Hyperimmunplasma sowohl bei einer experimentellen (MARTENS et al. 1989, PERKINS et al. 2001) als auch während einer natürlichen Infektion (MADIGAN et al. 1991) herrscht noch keine einheitliche Meinung. CHAFFIN et al. (1991) zeigten, dass eine Verabreichung von Hyperimmunplasma nach Erkrankungsbeginn weder die klinischen Symptome lindert, noch den Verlauf oder die Dauer der Erkrankung beeinflußt. Auch HURLEY und BEGG (1995) berichteten von Mißerfolgen. Bei Gestüten mit hoher Prävalenz und hoher Mortalität wird von anderen Autoren die Verabreichung von Hyperimmunplasma empfohlen (COHEN et al. 2000, 2002).
VARGA et al. zeigten 1997 in einer Studie, dass die Kombination aus der Impfung von tragenden Stuten und von Fohlen in der 3. bis 7. Lebenswoche Schutz vor einer Rhodococcus equi Erkrankung bietet.
2.5 Ermittlung geeigneter Targets für eine diagnostische PCR zum Nachweis von klinisch relevanten und virulenten Rhodococcus equi-Stämmen
Neben den bislang veröffentlichten PCR-Methoden soll in der hier vorliegenden Arbeit eine Rhodococcus equi-spezifische PCR für den routinediagnostischen Einsatz etabliert werden.
Als bislang einziger nachweislicher Virulenzfaktor gilt das VapA-Plasmid. Weil jedoch ein möglicher Verlust des Plasmids durch verschiedene Faktoren (z.B. physikalische Faktoren) ein Nachteil der VapA-PCR ist, erscheint die Suche eines geeigneten Targets auf chromosomaler Ebene von großem Interesse. Desweiteren soll ein Target ausgewählt werden, das mit der Virulenz des Erregers assoziiert ist, jedoch nicht Plasmid-gebunden ist und somit eine Aussage über die Virulenz der jeweiligen Rhodococcus equi-Stämme erlaubt.
2.5.1 ChoE-Gen
Wie schon unter Kapitel 2.3.1.2.3 beschrieben wurde, entwickelte NAVAS et al. 2001 eine PCR auf der Basis der Cholesteroloxidase (ChoE-PCR). Da vermutet wird, dass neben dem Plasmid auch chromosomale Virulenzfaktoren Einfluß auf die Pathogenität von Rhodococcus equi nehmen, kam das ChoE-Gen als mögliches Target zum Einsatz (LANGE et al. 1992, MacLACHLAN et al. 2002, POLLEGIONI et al. 1999). Die Sequenz wurde in der NCBI- Datenbank (National Center for Biotechnology Information) hinterlegt (Accession no.
AJ242746).
2.5.2 Weitere chromosomale Gene mit möglicher Bedeutung für die Virulenz von Rhodococcus equi
2.5.2.1 IdeR-Gen
Für das Überleben der meisten Bakterien ist Eisen essentiell, da es als Kofaktor von Enzymen fungiert, die an der zellulären Lebensfunktion beteiligt sind. Im Organismus liegt Eisen in Gegenwart von Sauerstoff meist in unlöslichen Eisenkomplexen vor. In höher entwickelten Organismen ist Eisen meist an Eisenbindungs- und Speicherproteinen wie Laktoferrin, Transferrin und Ferritin gebunden (WEINBERG 1999). Zudem ist freies Eisen aufgrund der Fähigkeit die Fentonreaktion zu katalysieren und somit zu einer Bildung von toxischen
Sauerstoffradikalen zu führen, auch potentiell gefährlich (IMLAY 1988). Bei einer eisenreichen Umgebung veranlassen die Erreger eine Synthese von Eisenspeicherproteinen und von Schutzmechanismen gegenüber eisenvermittelten oxidativen Schäden. Der Eisenmetabolismus in Bakterien wird durch eine Kontrolle der Transkription von Genen, die an der Eisenaufnahme, dem Transport und der Speicherung beteiligt sind, reguliert (HANTKE 2001, MEIJER und PRESCOTT 2004, RODRIGUEZ et al. 2003). In Mykobakterien und in Rhodokokken wird dies durch eisenabhängige Regulatorproteine (iron dependent regulator (IdeR)) ausgeführt (BOLAND et al. 2000, JORDAN et al. 2003). Sie fungieren als Repressoren der Eisenaufnahme, als Aktivatoren der Eisenspeichergene und als positive Regulatoren auf oxidativen Streß (RODRIGUEZ et al. 2003).
Die Promotorregion des VapA-Gens enthält eine mit dem IdeR übereinstimmende Bindungsstelle. Daraus läßt sich schließen, dass die eisenabhängige VapA-Expression durch das IdeR kontrolliert wird (REN und PRESCOTT 2003). Somit ist das IdeR-Gen für die Entwicklung einer PCR interessant und zählt zu den möglichen Targets. Die Sequenz kann aus der NCBI-Datenbank entnommen werden (Accession no. AF277002).
2.5.2.2 IupA-Gen
Die Sequenz eines weiteren Genes von Rhodococcus equi, das IupA-Gen (iron uptake), ist ebenfalls in der NCBI-Datenbank hinterlegt (Accession no. AY426738). Das IupA-Gen codiert für Systeme, die zur Gruppe der ABC-Transportsysteme gehören, welche für die Häm- und Hämoglobinnutzbarmachung erforderlich sind (ABC steht für Adenosin- Triphosphat (ATP) -binding cassette). Ferner hat dieses ABC-Transportsystem eine hohe Affinität gegenüber Eisen. Bei den ABC-Transportern handelt es sich um konservierte Bereiche, die aus integralen und peripheren Membranproteinen bestehen, die ATP binden und hydrolysieren, und aus periplasmatischen Substratbindungsproteinen (JONES et al. 2003). Da auch dieses Gen am Eisenhaushalt beteiligt ist, kommt es als mögliches Target für eine PCR in die engere Auswahl. Über die Beteiligung des IupA-Gens am Eisenhaushalt und über den Einsatz des IupA-Genes für eine Rhodococcus equi spezifische PCR wurde bisher nichts beschrieben.
2.5.2.3 SugE-Gen
Desweiteren ist die Sequenz des SugE-Gens (Suppressorgen) von Rhodococcus equi in der NCBI-Datenbank (Accession no. AY394858) hinterlegt, doch auch hier liegen bisher noch keine weiteren Kenntnisse über den Einsatz dieses Genes für eine Rhodococcus equi spezifische PCR vor. Das SugE-Gen wurde als Suppressorgen von GroEL-Mutationen bei Escherichia coli und als Mitglied der „multidrug-resistance-protein“-Familie (MRP) beschrieben (CHUNG et al. 2002). „Multidrug-resistance“-Proteine dienen als Transporter chemischer und zum Teil toxischer Verbindungen aus der Bakterienzelle heraus. Der ATP - abhängige Transport der Substanzen wird durch diese Membranproteine vermittelt, wobei die zu transportierenden Verbindungen an Sulfat, Glucuronat oder Glutathion gebunden werden (KONIG et al. 1999). Das GroEL-Gen kodiert für ein zu der Gruppe der „heat-shock“- Proteine gehörendes Protein, die auch als hochkonservierte Helferproteine bezeichnet werden.
Sie sind sowohl an der Faltung oder Translokation von Proteinen wie auch an der Zusammensetzung von Proteinkomplexen beteiligt (VANNIASINKAM et al. 2003, ZÜGEL et al. 1999).
2.5.2.4 AceA-Gen
Auch die Sequenz der Isocitratlyase (AceA) von Rhodococcus equi ist der NCBI-Datenbank zu entnehmen (Accession no. AY044917). Die Isocitratlyase ist das erste Enzym des Glyoxylatzyklus, welches für die Assimilation von Fettsäuren und Acetat erforderlich ist und somit essentiell für den Erreger ist. Das Isocitrat wird durch dieses Enzym in Glyoxylat und Succinat gespalten. Rhodococcus equi weist eine hohe Aktivität der Isocitratlyase hinsichtlich des Wachstums auf Acetat und Laktat auf (KELLY et al. 2002, REINSCHEID et al. 1994).
Somit kann das AceA-Gen als ein weiteres mögliches Target für die Rhodococcus equi-PCR angesehen werden, doch liegen bisher noch keine Ergebnisse über den Einsatz dieses Genes in der Rhodococcus equi-PCR vor.
3 Material und Methoden
3.1 Material
3.1.1 Herkunft und Haltungsbedingungen der beprobten Tiere
Die beprobten Tiere stammen aus einem norddeutschen Warmblutpferde–Aufzuchtbetrieb, der innerhalb seiner Fohlenpopulation nachweislich in den vergangenen Jahren endemisch Rhodococcus equi-Pneumonien hatte. Die Stuten fohlten in einem mit Stroh bzw. Spänen eingestreuten Abfohlstall ab, der vor jeder Belegung gründlich gemistet, gereinigt und desinfiziert wurde (Neopredisan, Menno-Chemie, Norderstedt). Nach 4-6 Tagen wurden Gruppen von 8 bis 16 Tieren für 5 Wochen in Laufställen aufgestallt und nach diesem Zeitraum ab Mai bis Oktober ganztägig auf die Weiden gebracht. Die Beschaffenheit der Pferdeausläufe ist sandig und trocken. Die Fohlen befanden sich zur Zeit der Probenentnahme im Alter von 1 bis 6 Monaten.
Das Probenmaterial der klinisch unverdächtigen Tieren aus dem Jahr 2004 stammte zum einen von Pferden, die an die Pferdeklinik der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover überwiesenen wurden und zum anderen von Pferden aus verschiedenen privaten Pferdekliniken, die keine Hinweise auf zurückliegende oder gegenwärtige Rhodococcus equi- Infektionen aufwiesen.
3.1.2 Vorangegangene Untersuchungen
Im Jahr 2003 wurde im Rahmen anderer Dissertationen (B. MEYER-HAMME, S. SCHULTE und A.L. TRISKATIS) einmal wöchentlich bei jedem Fohlen des Bestandes eine klinische Allgemeinuntersuchung mit Blutentnahme und Temperaturmessung der Fohlen durchgeführt.
Bei Auftreten von rasselnden oder giemenden Atemgeräuschen, Blut-Leukozytenwerten über 14.000 Leukozyten/µl und einer Körpertemperatur von über 39°C wurde die Lunge der Fohlen sonographisch untersucht. Konnten Lungenabszesse dargestellt werden, wurde die endoskopische Untersuchung mit Entnahme von Tracheobronchialsekret (TBS) vorgenommen. Die mikrobiologische Untersuchung der TBS-Proben und die Erregerisolierung fand im Institut für Mikrobiologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover statt. Zur Etablierung einer Rhodococcus equi-PCR wurde dieses Probenmaterial
der Innovativen Veterinärdiagnostik (IVD)-GmbH, dem Aninstitut der Tierärztlichen Hochschule Hannover, zur weiteren Nutzung zur Verfügung gestellt. Die Proben wurden bei -20°C gelagert.
3.1.3 Probenmaterial
Im Rahmen der Dissertation von TRISKATIS (2004) wurde aus dem oben genannten Betrieb sowohl von zwei Fohlen als auch von zwei Stuten mit Rhodococcus equi-Historie Serum entnommen und dieser Studie zur weiteren Bearbeitung zur Verfügung gestellt. Die Seren der Stuten und der Fohlen wurden gepoolt und als positives Stuten- bzw. Fohlenserum eingesetzt.
Das Serum von drei aus Island stammenden Stuten wurde für den Einsatz als Negativserum gepoolt.
Im Rahmen der Dissertation von MEYER-HAMME wurden aus dem Jahr 2003 123 Rhodococcus equi-Isolate, die in der VapA-PCR zum Nachweis des Plasmids untersucht werden sollten, der vorliegenden Studie zur Verfügung gestellt. Im Zeitraum März bis September des Jahres 2003 wurden 55 TBS-Proben aus dem oben genannten Warmblutpferde-Aufzuchtbetrieb mit einem durch ein Endoskop geschobenen Katheter entnommen. Das in der Trachea befindliche Sekret wurde mit einem Katheter angesaugt und mit ca. 5 ml NaCl auf einen Tupfer ausgespült. 44 TBS-Tupfer stammten von klinisch und sonographisch erkrankten Tieren. Die restlichen 11 Proben von klinisch und sonographisch unverdächtigen Tieren. Im Institut für Mikrobiologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover konnte von den klinisch auffälligen Tieren aus 31 TBS-Tupferproben Rhodococcus equi isoliert werden (71 %). Von den 11 klinisch gesunden Tieren konnte in 10 Fällen der Erreger kulturell nicht nachgewiesen werden (91 %).
Tab. 1: Ergebnis der kulturellen Untersuchung von TBS-Proben von insgesamt 55 klinisch und sonographisch untersuchten Fohlen (Proben aus dem Jahr 2003)
klinische Untersuchung kultureller Nachweis des
Tracheobronchial-
sekretes (TBS) krank gesund
Erregernachweis 31 1
kein Erregernachweis 13 10
Das zweite Probenpanel von klinisch auffälligen Tieren (20 Tiere) wurde im Jahr 2004 aus demselben Aufzuchtbetrieb entnommen. Auch hier erfolgte als Indiz für die Rhodococcus equi-Pneumonie eine klinische und sonographische Untersuchung. Fohlen mit Lungenabszessen wurden daraufhin zur Entnahme von TBS endoskopiert. Das gewonnene Sekret wurde direkt in ein Reaktionsgefäß gefüllt. Dabei wurden von den klinisch auffälligen Fohlen insgesamt 59 Proben entnommen: 20 Nasentupfer sowohl als Trockentupfer als auch als Tupfer mit Medium und 19 TBS-Proben (siehe Tab. 2).
Von den 20 Fohlen aus Beständen ohne Hinweise auf zurückliegende oder gegenwärtige Rhodococcus equi-Infektionen wurden als sogenannte Negativkontrolle insgesamt 44 Proben entnommen: 20 trockene Nasentupfer, 12 Nasentupfer in Medium und 12 TBS-Proben (siehe Tab. 2)
Tab. 2: Anzahl der untersuchten Fohlen und der entnommenen Proben und Probenmaterialien (Proben von 2004)
Anzahl der Fohlen Probenmaterial Anzahl der Proben Nasentupfer
(Trocken) 20
Nasentupfer
(Medium) 20
20 klinisch auffällige
Tracheobronchialsekret
(TBS)-Proben 19
Nasentupfer
(Trocken) 20
Nasentupfer
(Medium) 12
20 klinisch unauffällige
Tracheobronchialsekret
(TBS)-Proben 12
Von den 20 erkrankten Fohlen des Jahres 2004, die aus dem oben genannten Warmblutpferde-Aufzuchtbetrieb stammen, wurde nur in 6 Fällen Rhodococcus equi isoliert (30 %). Das Probenmaterial der 20 klinisch negativen Tiere zeigte in allen Fällen ein kulturell negatives Ergebnis (100 %).
Tab. 3: Ergebnis der kulturellen Untersuchung von 40 klinisch untersuchten Fohlen (Proben aus dem Jahr 2004)
klinische Untersuchung kultureller Nachweis
krank gesund
Erregernachweis 6 0
kein Erregernachweis 14 20
3.2 Methoden
3.2.1 Rhodococcus equi-Isolate und Kultivierung von Rhodococcus equi
Zur Gewinnung einer Positiv- und einer Amplifikationskontrolle für den Einsatz in der PCR wurde genomische DNA von Rhodococcus equi extrahiert. Dafür wurde ein aus dem oben genannten Aufzuchtbetrieb stammendes Isolat, das bereits im Western-Blot und in der 16S- rRNA-PCR als Rhodococcus equi identifiziert wurde und in der VapA-PCR ein positives Amplifikat zeigte, ausgewählt und neu angezüchtet. Das bei -70°C gefrorene Isolat wurde nach dem Auftauen auf Columbia-Agar mit Schafblut (Oxoid, Wesel) fraktioniert ausgestrichen und für 48 Stunden bei 37°C/CO2 bebrütet. Die Koloniemorphologie wurde entsprechend den Angaben von BARTON und HUGHES (1980) als Rhodococcus equi- typisch beurteilt. Eine Öse der gut gewachsenen Rhodococcus equi-Kultur wurde in 500 µl Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (engl.: phosphate buffered saline (PBS)) resuspendiert und für 5 Minuten bei 100°C aufgekocht. Das Lysat wurde bei Raumtemperatur bei 10.000 g für 10 Minuten zentrifugiert. Im Anschluß daran konnte die DNA aus dem Pellet mit Hilfe des E.Z.N.A® Tissue DNA Mini Kit (peqlab, Erlangen), wie unter Kapitel 3.2.4 beschrieben, extrahiert werden.
Zur Anzucht von Rhodococcus equi in Flüssigmedien wurden im Vergleich PPLO (Pleuropneumonia-like Organism)-, Luria-Bertani- und Soja-Trypticase-Bouillon eingesetzt.
Es zeigte sich ein deutlich besseres Wachstum der Rhodokokken im PPLO-Medium als in den beiden anderen Medien.
3.2.1.1 Bestimmung der Lebendkeimzahl
Die Anzahl der vermehrungsfähigen Keime in Flüssigkultur (Kolonie bildende Einheiten (KBE)) wurde nach einer modifizierten Methode von ALBERS und FLETCHER (1982) durchgeführt. Hierfür wurde eine Öse mit Rhodococcus equi von einer Blutplatte in 10 ml PPLO gegeben und gemischt. 1 ml aus dieser Verdünnung wurden in 9 ml PPLO pipettiert und in weiteren 1:10er Schritten verdünnt. 100 µl der jeweiligen Verdünnungsstufe wurden auf drei Blutagarplatten ausgestrichen und für 48 Stunden bei 37°C/C02 bebrütet. Die Auszählung der Kolonien erfolgte mit dem bloßen Auge, wobei nur die Verdünnungsstufen ausgewählt wurden, die zwischen 10 und 200 Kolonien pro Inokulum aufwiesen.
