der Tierärztlichen Hochschule Hannover
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Etablierung und Evaluierung einer PCR
zum Nachweis von Mycoplasma hyopneumoniae in Schweinelungen
I N A U G U R A L – D I S S E R T A T I O N
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Dominika Chrusciel aus Warschau (Polen)
Hannover 2005
Wissenschaftliche Betreuung:
Univ. Prof. Dr. Martin Ganter
1. Gutachter: Univ. Prof. Dr. Martin Ganter
2. Gutachter: Univ. Prof. Dr. Peter Valentin-Weigand
Tag der mündlichen Prüfung: 24. Mai 2005
Meiner Mutter
in Liebe und Dankbarkeit gewidmet
1 EINLEITUNG ____________________________________________________________11 2 SCHRIFTTUM ___________________________________________________________12 2.1 Mykoplasmen ____________________________________________________________12 2.2 Mycoplasma hyopneumoniae________________________________________________13 2.2.1 Ätiologie ________________________________________________________13 2.2.2 Epidemiologie____________________________________________________14 2.2.3 Pathogenese ____________________________________________________17 2.2.4 Immunantwort auf die Mycoplasma hyopneumoniae- Infektion______________18 2.2.5 Klinische Symptome_______________________________________________19 2.2.6 Pathologische Veränderungen_______________________________________22 2.2.7 Wirtschaftliche Bedeutung der Enzootischen Pneumonie __________________23 2.2.8 Erregernachweise ________________________________________________23 2.2.8.1 Kultureller Nachweis ____________________________________________23 2.2.8.2 Immunfluoreszenztest ___________________________________________25 2.2.8.3 PCR _________________________________________________________25 2.2.9 Nachweis spezifischer Antikörper ____________________________________31 2.2.10 Bekämpfungsmaßnahmen __________________________________________32 2.1.6.1 Chemotherapie und Sanierung ____________________________________32 2.2.10.1 Immunprophylaxe ____________________________________________34 3 MATERIAL UND METHODEN_______________________________________________37 3.1 Chemikalien und Reagenzien ________________________________________________37 3.2 Geräte und Hilfsmittel ______________________________________________________38 3.3 Lösungen ________________________________________________________________41 3.3.1 Lösungen für den Immunfluoreszenztest _______________________________41 3.3.2 Lösungen für die Elektrophorese _____________________________________41 3.4 Nährmedien ______________________________________________________________42 3.5 Mykoplasmen_____________________________________________________________43 3.5.1 Kultivierung______________________________________________________43 3.5.2 DNA-Extraktion___________________________________________________43 3.5.2.1 Gewinnung von DNA aus Mykoplasmen _____________________________44 3.5.2.2 Isolierung und Aufreinigung der Mykoplasmen-DNA mit dem DNeasyTM
Tissue Kit _____________________________________________________44 3.5.2.3 Spektroskopische Bestimmung der DNA-Konzentration _________________45 3.6 Probenmaterial____________________________________________________________45 3.6.1 Laborvergleichsuntersuchung _______________________________________45
Inhaltverzeichnis
3.6.2 Bronchialtupfer und Lungenproben von Schlachtschweinen ________________46 3.6.3 Proben von Wildschweinen _________________________________________46 3.6.4 Bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit___________________________________47 3.7 Kulturelle Untersuchung_____________________________________________________47 3.8 Nachweis von M. hyopneumoniae mittels Polymerase-Kettenreaktion _________________48 3.8.1 One-step-PCR ___________________________________________________48 3.8.1.1 Primer und amplifiziertes Fragment _________________________________48 3.8.1.2 One-step-PCR _________________________________________________49 3.8.1.3 Optimierung der one-step-PCR ____________________________________50 3.8.1.4 Bestimmung der Nachweisgrenze der PCR __________________________50 3.8.2 Nested-PCR _____________________________________________________51 3.8.2.1 Bestimmung der Nachweisgrenze __________________________________54 3.8.3 Visualisierung der PCR-Produkt _____________________________________54 3.8.3.1 Agarosegelelektrophorese ________________________________________54 3.8.4 Einsatz der klinischen Proben _______________________________________55 3.9 Nachweis von Mycoplasma hyopneumoniae mittels indirektem Immunfluoreszenztest ____56 3.9.1 Optimierung der Reaktionsbedingungen _______________________________57 3.9.2 Proben-Aufbereitung ______________________________________________57 3.9.3 Immunfluoreszenztest _____________________________________________57 3.10 Statistische Auswertung____________________________________________________58 4 ERGEBNISSE ___________________________________________________________59 4.1 Etablierung einer PCR zum Nachweis von M. hyopneumoniae in klinischen Proben ______59 4.1.1 Optimierung der one-step-PCR ______________________________________59 4.1.2 Bestimmung der Nachweisgrenze ____________________________________61 4.2 Etablierung der nested-PCR _________________________________________________63 4.2.1 Bestimmung der Sensitivität_________________________________________63 4.2.2 Überprüfung der Probenaufbereitung _________________________________65 4.3 Nachweis von M. hyopneumoniae mittels verschiedener PCR-Verfahren ______________65 4.4 Prävalenz von M. hyopneumoniae bei Schlachtschweinen__________________________67 4.4.1 Vergleich der nested-PCR mit pathologischen und kulturellen Befunden ______67 4.5 Nachweis von M. hyopneumoniae bei Wildschweinen _____________________________77
4.5.1 Vergleich der Methoden zum Nachweis von M. hyopneumoniae bei
Wildschweinen ___________________________________________________81 4.5.1.1 Vergleich der mittels nested-PCR gewonnen Ergebnisse mit den Ergebnissen
des Immunfluoreszenztest an Lungenproben _________________________82
4.5.1.2 Vergleich der mittels nested-PCR gewonnenen Ergebnisse mit den
serologischen Ergebnissen _______________________________________84 4.6 Nachweis von M. hyopneumoniae in BALF von geimpften Läuferschweinen ____________85 5 DISKUSSION ____________________________________________________________88 5.1 Vergleich der one step-PCR mit der nested-PCR _________________________________88 5.2 Prävalenz von M. hyopneumoniae bei Schlachtschweinen__________________________90 5.2.1 Kulturelle Untersuchung bei Schlachtschweinen _________________________90 5.2.2 Korrelation zwischen den Lungenungenveränderungen
und M. hyopneumoniae-Infektionen ___________________________________91 5.3 M. hyopneumoniae bei Wildschweinen _________________________________________93 5.3.1 Vergleich der nested-PCR mit der Serologie und dem Immunfluoreszenztest __94 5.4 Nachweis von M. hyopneumoniae in Bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit (BALF) _______95 6 SCHLUSSFOLGERUNGEN_________________________________________________97 7 ZUSAMMENFASSUNG ____________________________________________________99 8 SUMMARY _____________________________________________________________101 9 LITERATURVERZEICHNIS ________________________________________________103
Abkürzungsverzeichnis 8
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
Aqua dest. destilliertes Wasser ( lat. Aqua destillata) BALF bronchoalveoläre Lavage Fluid
bp Basenpaare
chron. chronisch
diff. diffus
eitr. eitrige
ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
EP Enzootische Pneumonie
fg femtogram (10-15)
FITC Fluoresceinisothiocyanat gelbl. gelblich
ggr. geringgradig
hgr. hochgradig
IFT Immunfluoreszenztest
Ig Immunglobulin
IVD Innovative Veterinär Diagnostik kat. katarrhalisch
KbE Kolonie-bildenden Einheiten
LT Lebenstag
LW Lebenswoche
li. linke
M. Mycoplasma
mgr. mittelgradig
MIRD Mycoplasma Induced Respiratory Disease
ng nanogramm (10-9)
P. Pasteurella
PBS Phosphate-gepufferte Kochsalzlösung; phosphate buffered saline (engl.)
PCR Polymerase-Kettenreaktion; Polymerase Chain Reaction (engl.) PRDC Porcine Reproductive Disease Complex
re. rechte
RT Raumtemperatur p.i post infectionem (lat.)
RNA Ribonukleinsäure; Ribonucleic acid (engl.)
rRNA ribosomale RNA
s. siehe
SPF spezifisch pathogenfrei
Tab. Tabelle
TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer
TM Warenzeichen (engl. trademarke)
1 Einleitung
Die Enzootische Pneumonie (EP) der Schweine ist eine in der Regel chronisch verlaufende Erkrankung des unteren Respirationstraktes, deren Primärerreger Mycoplasma (M.) hyopneumoniae ist. Die EP stellt eine der am weitesten verbreitete Erkrankung von Mastschweinen dar (KOBISCH u. FRISS 1996). Die Mehrzahl der in Deutschland gezüchteten Mastschweine ist mit diesem Erreger infiziert. Bei 50 bis 80 % der Schlachtschweine kann bei der Schlachtung eine Spitzenlappenpneumonie festgestellt werden, die wahrscheinlich zumeist durch M. hyopneumoniae hervorgerufen wurde (EICH u. SCHMIDT 2000).
Die Diagnostik in den Beständen basierte in der Vergangenheit im Wesentlichen auf
serologischen Blutuntersuchungen zum Nachweis von Antikörpern gegen M. hyopneumoniae. Vor der Einführung von Impfstoffen gegen M. hyopneumoniae
betrug die Herdenprävalenz in Norddeutschland 96 % und die Intraherdenprävalenz 0,75 ± 0,27 (GANTER et al. 1999). Seit der kommerziellen Einführung und weiten Verbreitung verschiedener Impfstoffe gegen M. hyopneumoniae kann serologisch nicht mehr zwischen infizierten und geimpften Schweinen unterschieden werden. Der kulturelle Nachweis von M. hyopneumoniae ist in der Routine jedoch sehr aufwendig, langwierig und wird durch das schnelle Wachstum von M. hyorhinis erschwert, der als Begleitkeim stets vorhanden ist.
Um einen Überblick über die Verbreitung von M. hyopneumoniae in der Mastschweine- population zu erhalten, unter Berücksichtigung der Tatsache, dass ein großer Teil der Schweine geimpft wird, ist es sinnvoll eine schnelle, sensitive und spezifische Diagnostik zu etablieren. Während in der Hausschweinepopulation eine weite Verbreitung von M. hyopneumoniae vorliegt und seit langem bekannt ist, liegen über die Verbreitung dieses Erregers bei Wildschweinen, die als potentielle Vektoren in Frage kommen, bisher keine Erkenntnisse vor.
Ziel dieser Arbeit war es einerseits eine sensitive und spezifische Diagnostik zum Nachweis von M. hyopneumoniae mit Hinblick auf die inzwischen nahezu flächendeckende Impfung gegen den Erreger auf der Basis der Polymerase- Kettenreaktion (PCR) zu entwickeln. Die PCR sollte mit anderen Nachweismethoden
verglichen werden. Daneben sollte durch die Untersuchung von Lungenproben die Verbreitung dieses Erregers in der norddeutschen Wildschweinepopulation ermittelt werden.
Schrirttum 12
2 Schrifttum 2.1 Mykoplasmen
Mykoplasmen gehören zu der Ordnung Mycoplasmatales und zur Klasse Mollicutes (RAZIN et al. 1998). Mykoplasmen haben sich an die parasitische Lebensweise angepasst, was sich in der Reduktion verschiedener Zellstrukturen und Zellfunktionen äußert (BOVÉ 1993). Sie besitzen keine Zellwand und sind daher nur durch eine Zytoplasmamembran vom umgebenden Milieu abgegrenzt. Die Zellwandlosigkeit bedingt ihre pleomorphe Zellgestalt mit kokkoiden, ovoiden oder birnenförmigen Formen mit einem Durchmesser von 300 bis 850 nm. Sie können auch verzweigte Filamenten ausbilden (RAZIN u. FREUNDT 1994). Die meisten Mykoplasmen sind unbeweglich, nur einzelne Arten, wie z. B. M. gallisepticum oder M. pneumoniae, können eine gleitende Fortbewegung auf flüssigkeitsbedeckten Oberflächen zeigen (KIRCHHOFF 1992).
Im Vergleich zu anderem Prokaryonten haben Mykoplasmen ein sehr kleines Genom, bestehend aus einem zirkulären, doppelsträngigen DNA-Molekül, dessen Größe zwischen 577 und 2200 kbp liegt, mit einem vergleichsweise geringen Gehalt an Guanin und Cytosin. Diese geringe genetische Information ist auch mit limitierten biosynthetischen Möglichkeiten verbunden. Deshalb stellt die Kultur von Mykoplasmen hohe Ansprüche an das Nährmedium. Sie benötigen komplexe Nährmedien, bestehend aus Fettsäuren und Cholesterin in Form eines Serumzusatzes, Glukose
oder andere zur Energiegewinnung geeignete Kohlenhydrate sowie Pepton und Hefeextrakt, wobei die Zusammensetzung für jede Mykoplasmenart angepasst
werden muss (RAZIN u. FREUNDT 1984).
Ein wichtiger Pathogenitätsfaktor verschiedener Mykoplasmenarten, wie beispielsweise bei den humanpathogenen Spezies M. genitalium und M. pneumoniae, stellen Adhärenzmechanismen dar. Die Bindung an das Zielgewebe erfolgt über Adhäsine, die bei M. pneumoniae und M. gallisepticum als spezielle Adhärenzorganellen vorkommen (SIMECKA et al. 1992, KRAUSE 1996, MINION et al. 2000).
Verschiedene bei Schweinen vorkommende Mykoplasmen haben ätiologische Bedeutung als Krankheitserreger (ROSS 1985, PFÜTZNER 1993). Wie auch bei anderen Wirten besiedeln die Mykoplasmen bei Schweinen meist Zelloberflächen, vor
allem der Schleimhäute des Atem- und Genitaltraktes sowie von Gelenken
und stehen im Zusammenhang mit entsprechenden Krankheitsbildern.
Neben M. hyopneumoniae, der als Haupterreger der EP anzusehen ist, konnte M. hyorhinis bei Schweinen nachgewiesen werden. Meist wird dieser letztgenannte,
fakultativ pathogene Keim aus dem Respirationstrakt isoliert. Er kann aber auch bei jungen Schweinen eine mild verlaufende Polyserositis hervorrufen (ROSS 1992).
M. hyosynoviae ist als Ursache der Gelenkenentzündung in Form einer Polyarthritis verantwortlich, die bei infizierten Schweinen zu Lahmheiten führen
kann (LAHRAMANN K.-H. u. H. PLANOIT 1997). M. flocculare wurde ebenfalls aus Schweinen isoliert. Seine Pathogenität ist jedoch fraglich (BINDER 1990).
2.2 Mycoplasma hyopneumoniae 2.2.1 Ätiologie
M. hyopneumoniae wurde durch zwei unabhängige Forschungsgruppen 1965 erstmals isoliert. In England durch GOODWIN u. Mitarb. (1965) sowie in Amerika durch MARÉ u. SWITZER (1965) gelang der kulturelle Nachweis eines kokkoiden Organismus aus Schweinelungen, der wegen seiner Eigenschaften den Mykoplasmen zugeordnet
werden konnte. Die beiden Isolate, die zunächst als M. suipneumoniae und M. hyopneumoniae bezeichnet wurden, erwiesen sich 1967 als identisch (GOODWIN et.
al 1967). 1975 legte die Kommission für Systematik der Bakteriologie den Namen M. hyopneumoniae fest. Der Stamm J von GOODWIN et al. (1965) wurde als Typstamm benannt.
M. hyopnemoniae kommt ausschließlich bei Schweinen vor und wird als primäres ätiologisches Agens der EP angesehen (HODGES et al. 1969, FRIIS 1975,
WHITLESTONE 1979, RAZIN u. FREUND 1984, DUNGWORT 1993).
M. hyopneumoniae stellt hohe Ansprüche an Nährböden und Kulturbedingungen. Durch sein langsames Wachstum werden seine Kolonien häufig von schneller wachsender Begleitflora überwuchert, was wiederum das Wachstum von M. hyopneumoniae hemmt.
Auf Agarmedium bildet M. hyopneumoniae, im Gegensatz zu anderen Mykoplasmenarten, keine spiegeleiförmigen Kolonien aus (KOBISCH u. TILLON 1982), sondern sehr kleine Kolonien ohne zentrale Ausbuchtung mit einem Durchmesser von
0,2-1 mm. (ROSS 1992). Charakteristische biochemische Eigenschaften von M. hyopneumoniae sind unter anderem die Glukosefermentation, die fehlende Harnstoff-
und Argininhydrolyse und die Sterolabhängigkeit (BISPING u. AMTSBERG 1988).
Schrirttum 14
Die verschiedenen Stämme von M. hyopneumoniae zeigen deutliche Virulenzunter- schiede, die auf eine genetische Heterogenität zurückzuführen sind (FREY et al. 1992, ARTIUSHIN U. MINON 1996). Virulenzunterschiede zwischen Feldisolaten haben in klinisch infizierten Herden häufig Seroprävalenzunterschiede zur Folge (VICCA et al.
2002).
2.2.2 Epidemiologie
Die EP ist weltweit verbreitet und kommt in allen schweineproduzierenden Ländern vor (MAES et al. 1996, ROSS 1999). Der Anteil von seropositiven Beständen in Deutschland beträgt 75-100 % (PFÜTZNER u. BLAHA 1995, HORST et al. 1996, HORST 1997).
Von regionalen Unterschieden abgesehen, kann davon ausgegangen werden, dass die Mehrzahl der Tiere in Deutschland infiziert ist (BERNER 1995). In Sachsen erwiesen sich 67,8 % der untersuchten Schweine als M. hyopneumoniae-positiv (FLEISCHER et al. 1993). In Niedersachsen wurde eine Herden-Prävalenz von 84,36 % ermittelt (HORST et al. 1997). Ungeimpfte Mastbestände im Weser-Ems-Gebiet zeigten einen hohen Durchseuchungsgrad von 97,17 % innerhalb 106 untersuchten Betrieben (HILTERMANN-LINDEN 2004). In früheren Untersuchungen an Mastschweinen in dieser Region wurde festgestellt, dass fast 100 % der Tiere mit M. hyopneumoniae infiziert waren (PFÜTZNER u. BLAHA 1995).
Eine vergleichbare Herden-Prävalenz von 88 % zeigten belgische Schweinebetriebe (MAES et al. 1999b). Deutlich seltener kommt M. hyopneumoniae in Skandinavien vor.
Mit Herden-Prävalenzen von 30-40 %, wobei die geringere Schweinedichte in Betracht gezogen werden sollte (SØRENSEN et al. 1992a, b, RAUTIAINEN 1998). In der Schweiz und in Dänemark wurde die Reduktion der EP auf der Basis des SPF-Verfahrens durchgeführt. Die Häufigkeit von Reinfektionen liegt bei 5-10 % jährlich (PFÜTZNER u.
BLAHA 1995).
Wenngleich eine Übertragung von M. hyopneumoniae per Aerosol möglich ist (MORRIS et al. 1995, DONE 1996, STÄRK 1999), findet die Übertragung hauptsächlich durch direkten Kontakt zwischen infizierten und nicht infizierten Tieren statt (GOODWIN 1985, STRAW et al. 1999, HEGE et al. 2002). Eine vertikale Infektionsübertragung (die früheste Infektionsmöglichkeit) wird von der Sau auf ihre Ferkel beobachtet (PFÜTZNER 1993, BERNER 1995). Der Erreger kann sich auch auf horizontalem Weg ausbreiten. Dieser Übertragungsweg spielt insbesondere bei jungen, frisch abgesetzten
Tieren eine Rolle, die nach der Einstallung direkte oder indirekte Kontakte zu infizierten Tieren hatten (WALLGNER u. SCHWAM 1994, MAES et al. 2000). Daneben kommt eine mögliche indirekte Übertragung durch Vektoren in Frage (PFÜTZNER 1993). Weiterhin sollte auch Personenverkehr als eine weitere Übertragungsmöglichkeit in Betracht gezogen werden (BATISTA et al. 2004).
Die Überlebensrate von M. hyopneumoniae außerhalb des Wirtes ist von den Umweltbedingungen abhängig. Unter optimalen Bedingungen bleibt der Erreger bis zu 24 Stunden infektiös. In Regenwasser und bei niedrigen Temperaturen konnte der
Erreger erheblich länger lebensfähig bleiben (GOODWIN 1985, LAUBE 1996).
Bei günstigen Verhältnissen (nasskaltes Klima) können infektiöse Aerosole über Distanzen von mehreren Kilometern vorbereitet werden. Aus diesem Grunde ist eine saisonale Häufung der Erkrankungsfälle zwischen November und März zu beobachten (LAUBE 1996). Die anderen Faktoren, wie z. B. der Tierhandel mit subklinisch infizierten Schweinen, hat große Bedeutung für die regionale Verbreitung des Erregers (WHITTLESTONE 1985, PFÜTZNER 1993). In Betracht kommen auch Aerosolquellen, wie z. B. Schweinetransporte oder infizierte Herden, wenn der Abstand zum potenziellen Infektionsherd weniger als 3,2 km beträgt (GOODWIN 1985). Die Luftübertragung wird allgemein als wichtigster Übertragungsfaktor zwischen den Beständen angesehen (WHITLESTONE 1990, STÄRK 1991).
Alle Altersgruppen sind gleich empfindlich gegenüber einer Infektion mit M. hyopneumoniae, aber Erkrankungen treten meistens in chronisch infizierten Herden
bei Ferkeln und Läufern auf. Sie finden vor allem im Alter von drei bis zur sechsten Wochen statt (ROSS 1992, DONE 1996). Mit Hilfe der nested-PCR aus Nasen- Mandel-
und Bronchialtupfern konnte gezeigt werden, dass in infizierten Herden M. hyopneumoniae bei 15 bis 22 Wochen alten Tieren deutlich häufiger nachweisbar ist,
als bei jungen Ferkeln (SIBILA et al. 2004). In geschlossenen und infizierten Ferkelerzeugerbetrieben treten Infektionen in der Regel am Anfang der Absetzphase auf.
Dagegen werden Infektionen in „multiple side farms“ meist später in der Endmast beobachtet (CLARK et al. 1991, SIBILLA et al. 2004).
Das Auftreten klinischer Erkrankungen hängt von der Immunität der Tiere ab (PFÜTZNER 1993). Neugeborene Ferkel werden durch die mit dem Kolostrum aufgenommenen maternalen Antikörper zeitlich begrenzt passiv geschützt. Die Höhe der kolostralen Antikörperaktivität ist von der maternalen Immunität abhängig (MORRIS et al.
1994; RAUTAINEN u. WALLGREN 2001). Besonders gefährdet sind die Würfe von Jungsauen mit geringer Immunität und wenig Antikörpern gegen M. hyopneumoniae
Schrirttum 16
im Kolostrum. Im Gegensatz dazu sind die Ferkel von Altsauen, deren Antikörpermenge in der Regel höher ist, besser geschützt (PFÜTZNER 1993, BERNER 1995).
Nachkommen von acht bis drei Wochen ante partum geimpften Sauen, waren vor einer experimentellen M. hyopneumoniae-Infektion geschützt (KOBISCH et al. 1994).
RUIZ et al. (2003) untersuchten nach der Muttertierimpfung (zweimal, 5 und 3 Wochen ante partum) die Antikörperübertragung auf die Ferkel. Bei 80 % der geimpften Tiere
wurde die Bildung von Antikörpern gegen M. hyopneumoniae im Blutserum und Kolostrum nachgewiesen. Die übertragenen maternalen Antikörper führten jedoch
im Vergleich zur Kontrollgruppe lediglich in der ersten Woche post partum zu einer deutlichen Reduktion der Besiedelung der Schleimhäute mit M. hyopneumoniae. Auch Kolostrum mit hoher Antikörperaktivität schützte nicht immer vor der Infektion, obwohl es zu einem milderen Verlauf der durch die Infektion hervorgerufenen Lungenentzündungen führte (THACKER et al. 2000 a). Bei 18 Tage alten Ferkeln pluriparer Sauen konnte M. hyopneumoniae zwar nachgewiesen werden, aber zu diesem Zeitpunkt wurde noch
nicht ihre Anheftung an das zilientragende Epithel beobachtet (CALSAMIGLIA u. PIJOAN 2000).
Als kritischer Zeitpunkt wurde bei jungen Schweinen der Anfang der Mastperiode (ca. 70.
Lebenstag) beobachtet. In diese Zeit fällt das Absinken der maternalen Antikörperaktivitäten, wodurch sich das Risiko für eine M. hyopneumoniae-Infektion erhöht (LEON et al. 2001).
Hoch virulente M. hyopneumoniae-Stämme breiten sich schneller in Mastbeständen aus als weniger virulente Stämme. Allerdings ist die Ausbreitungsgeschwindigkeit im vergleich zu Virusinfektionen verhältnismäßig langsam. Nach 43 Tage p. i. wurden von MAEYNS et al. (2004) bei 87 % der mit einem hoch virulenten M. hyopneumoniae-
Stamm infizierten Mastschweine und bei 67 % der mit einem wenig virulenten M. hyopneumoniae-Stamm infizierten Schweine Serokonversionen nachgewiesen.
Unter Feldbedingung werden offenbar sehr viel geringere Erregermengen für eine Infektion benötigt, was sich durch ständige, enge Kontakte zwischen den Tieren erklären lässt (JERICHO 1986). Allerdings ist diese Übertragung sehr langsam. TOREMORELL et al. (2000) gehen davon aus, dass durch PCR M. hyopneumoniae-positiv getestete Ferkel ihre Buchtgenossen über mehr als 2 Wochen nicht infizieren. Sie gehen davon aus, dass der Erreger nicht kontinuierlich, sondern in Schüben ausgeschieden wird.
Unter diesen Bedingungen spielt auch die Architektur des Stalles und der Buchtenaufbau keine wesentliche Rolle für die Übertragung. In Untersuchungen von FANO et al. (2004) wurde die Infektionsdauer bei experimentell infizierten Tieren und die nachfolgende
Ausbreitung der Infektion durch direkte, natürliche Kontakte bei 3 Monate alten Schweinen untersucht. Bei allen Schweinen konnte M. hyopneumoniae mittels nested- PCR 42-185 Tagen p. i. nachgewiesen werden. SØRENSEN et al. (1997) gelang der Erregernachweis nur bis zum 85. Tag p. i. Die Unterschiede zwischen den beiden Untersuchungen beruhen im Wesentlichen auf der unterschiedlichen Sensitivität der verwendeten PCR (FANO et al. 2004).
2.2.3 Pathogenese
M. hyopneumoniae breitet sich auf bronchogenem Weg aus und besiedelt zuerst die Oberflächen der Schleimhautzellen von Trachea, Bronchien und Bronchiolen. Die Mykoplasmen heften sich an die zilientragenden Epithelzellen. Die Anheftung erfolgt durch strahlenförmige Fibrillen, die auf der äußeren Mykoplasmenmembranoberfläche lokalisiert sind (BLANCHARD et al.1992). Die spezielle Strukturen wurden als Adhäsin identifiziert (ZHANG et al. 1994, 1995, DJORDJEVIC et al. 2004) und als Protein P97 bezeichnet (HSU et al. 1997, HSU u. MINION 1998; MINION et al. 2000). Auf der Zilienoberfläche der Epithelzellen befinden sich Glykolipidrezeptoren, die als Verbindungsstrukturen für die Bakterien dienen (ZHANG et al 1994, MAES et al. 1996).
Das M. hyopneumoniae-Adhäsin bewirkt in vitro eine Anheftung an Erythrozyten und an Monolayer von Lungenfibroblasten sowie auch an Schweinenierenzellkulturen (YOUNG 1989, MESSIER u. ROSS 1991, ZIELINSKI u. ROSS 1993). Die Virulenz einzelner Stämme beruht auf der Fähigkeit zur Adhärenz, die von variablen Strukturen der R1-Region des Proteins P97 abhängig ist (MINION et al. 2000). Bei Feldisolaten wurde zusätzlich ein Zytotoxin nachgewiesen, das Läsionen an den Zilien verursacht
(GERY u. WALCZAK 1985). Bei nicht pathogenen Stämmen, zu denen der M. hyopneumoniae J gehört, wurde Zilienadhärenz und Zilienschädigung, im Gegensatz
zu virulenten Isolaten, die sich an die Flimmerepithelien des Respirationsstraktes anheften, nicht nachgewiesen (YOUNG et al. 2000).
In Anwesenheit von M. hyopneumoniae tritt in den Epithelzellen eine Veränderung der Produktion und Sekretion der Glykoproteine ein, was zu destruktiven Zilienveränderungen führt, die schließlich als Ablösung der Zilienepithelien bezeichnet werden (BLANCHARD et al. 1992, DeBEY et al. 1992, DeBEY u. ROSS 1994).
In Infektionsversuchen konnte ein bis zwei Wochen nach dem Eintritt der Erreger eine Assoziation der Mykoplasmen mit der Zilienoberfläche festgestellt werden (BLANCHARD
Schrirttum 18
et al 1992, KWON et al. 2001). JAQUES und Mitarbeiter (1992) haben schon fünf Tage nach dem Befall die degenerativen Zillienveränderungen sowie Zilienverlust beobachtet.
Zytopathische Effekte äußern sich in Form von Zilienverkürzung mit folgender Ziliostase und extensivem Zilienverlust (PFÜTZNER 1993, ROSS 1992, KOBISCH et al 1993). Alle Veränderungen führen zur Störung der mukoziliären Clearance und Desquamation der Alveolarephitelien. Durch Degeneration der Pneumozyten Typ II entsteht ein Surfaktantmangel. Bei Untersuchungen von ESCOBAR et al. (2002) wurde nach experimenteller M. hyopneumoniae-Infektion eine Erhöhung von TNF-α (engl. Tumor Necrosis Factor) (HARDING et al. 1997) und IL-1 im entzündlich veränderten Lungengewebe nachgewiesen (RODRIQUEZ et al. 2004). Eine direkte immunsuppressive Wirkung durch Aktivierung der T- Suppressorzellen hemmt die für die lokale Schleimhautimmunität wichtigen T-Lymphozyten (WENG u. LIN 1988).
Durch die Verminderung der Flimmerepithelfunktion und Unterdrückung der Phagozytoseaktivität der Alveolarmakrophagen wird die Besiedelung des Respirationstraktes mit weiteren pathogenen Keimen begünstigt (CARUSO u. ROSS 1990, ROSS 1996), wodurch zusätzlich die Schädigung der Lunge verstärkt wird.
Aufgrund dessen wird M. hyopneumoniae häufig als Wegbereiter für weitere Lungenerkrankungen bezeichnet (SCHULLER 1986).
2.2.4 Immunantwort auf die Mycoplasma hyopneumoniae- Infektion
Die Infektion mit M. hyopneumoniae induziert eine zelluläre Immunantwort (ADEGBOYE 1979), die mit großer Wahrscheinlichkeit Schutzwirkung hat und sowohl mit einer systemischen als auch lokalen humoralen Immunantwort verbunden ist (CORTHIER et al. 1980).
Ein lokaler Anstieg von B-Lymhozyten und antigenspezifischen Plasmazellen wurde in der Lunge und im tracheobronchealen Sekret sowie in den Lymphknoten ca. 2 Wochen p. i. festgestellt (SUTER et al. 1985, MESSIER et al. 1990). Sieben Tagen p. i. treten zunächst Antikörper der Immunglobulinklasse (Ig) M als Vertreter einer lokalen Immunantwort in Erscheinung. Innerhalb weiterer 7 Tage werden lokal IgA und IgG
gebildet. Am Anfang sind IgA und IgG in gleicher Menge nachweisbar, aber ca. 4 Wochen p. i. nimmt lokal die Konzentration von IgA gegenüber IgG deutlich zu, während sich das Verhältnis in den beiden darauf folgenden Wochen umkehrt. Gleichzeitig ist ein Konzentrationsanstieg beider
Immunglobulinklassen nachweisbar (SHELDRAKE u. ROMALIS 1992). Die lokalen IgA haben eine Schutzfunktion. Sie verhindern die Anheftung von M. hyopneumoniae an zillientragende Ephitelzellen (BLANCHARD et al. 1992).
Im Serum mit M. hyopneumoniae infizierter Schweine sind IgG nachweisbar (MESSIER et al. 1990). Systemische Antikörper können erstmals meist zusammen mit dem Auftreten von Husten oder ca. 10 Tage später bei infizierten Schweinen nachgewiesen werden (SØRENSEN et al. 1994, LEON et al.2001). Der Zeitpunkt der Serokonversion ist unter anderem von der Virulenz von M. hyopneumoniae abhängig.
Antikörper erscheinen früher bei Tieren, die mit hoch virulenten Stämmen infiziert sind, in Vergleich zu Tieren, die mit weniger virulenten M. hyopneumoniae- Stämmen infiziert sind (VICCA et al. 2003, MEYNS et al. 2004). Bei spezifisch pathogenfreien (SPF) Schweinen, konnte schon ab der 3. Woche p. i. ein Antikörperanstieg beobachtet werden (KOBISCH et al. 1993). Unter Feldbedingungen wird eine Serokonversion, in Abhängigkeit vom Managementsystem, nach 3 Wochen bis 3 Monaten p. i. beobachtet (MORRIS et al. 1995). Auch Schweine, die direkte Kontakte mit infizierten Tiere haben, serokonvertieren innerhalb von 2-3 Monaten (WALLGREN u. SCHWAN 1994). Bei experimentellen Infektionen können erste Antikörper gegen M. hyopneumoniae innerhalb von 8 bis 9 Tagen bis spätestens 5 Wochen p. i. bei allen infizierten Tieren nachgewiesen werden (SØRENSEN et al. 1997). Dabei steigt der Antikörperspiegel bis zur 11. Woche p. i. an (KOBISCH et al. 1993, MORRIS et al. 1995). Bei neugeborenen Ferkeln, ist die Zeit der Serokonversion nach Infektion mit M. hyopneumoniae von der Jahreszeit der Geburt, der maternalen Immunität oder/und vom Auftreten anderer Erreger abhängig (SIBILA et al. 2004). Bei Saugferkeln ist der Infektionszeitpunkt auf der Basis von Serumantikörpern nur schwer zu bestimmen. Bei 19 Tage alten Ferkeln detektierbare Antikörper sollten als maternale, kolostrale Antikörper interpretiert werden (BATISTA et al. 2004).
2.2.5 Klinische Symptome
Die EP verläuft meistens als chronische Erkrankung des unteren Atemtraktes der Schweine. Das klinische Bild kann sehr uneinheitlich sein und reicht von klinisch völlig unauffällig erscheinenden Schweinen bis zur Hinfälligkeit (ROSS 1992). Schwere Pneumonien, Pleuritiden und Perikarditiden mit Inappetenz, Entkräftung und Todesfällen können als Folge von Superinfektionen mit anderen Erregern vorkommen, sind aber
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meist auch auf ungünstige Umwelt- und Managementbedingungen zurückzuführen (CLARK et al. 1991, ROSS 1992).
Als typisches Anzeichen der M. hyopneumoniae-Infektion wird ein trockener, bellender Husten, der sich durch das Auftreiben der Tiere provozieren lässt, beschrieben. Dieser kann über Wochen oder Monaten andauern (PLANOIT 1988; ROSS 1996). Im Weiteren treten seröser Nasenausfluss und Atembeschwerden auf (ROSS 1992). Unkomplizierte Verlaufsformen der M. hyopneumoniae-Infektion weisen zwar eine hohe Morbidität, aber geringe Mortalität auf (KOBISCH et al. 1994, ROSS 1999 ). Unter günstigen Umweltbedingung sind kaum klinische Symptome zu beobachten (GOODWIN 1991, SCHUH 2001). Subklinische Infektionen zeichnen sich durch verringertes Wachstum und Kümmern, Verschlechterung der Futterverwertung (ROSS 1999) und um bis zu 60 g/Tag verringerte Zunahmen aus (RAUTIAINEN 2000).
Unter Feldbedingungen können unterschiedliche Inkubationszeiten beobachtet werden, die zwischen 10 und 16 Tagen liegen (ROSS 1999). Die Schwankungen hängen unter anderem von der Erregerdosis ab. Bei hohem Infektionsdruck können die ersten klinischen Symptome bereits ab dem 11. Tag p. i. beobachtet werden. Bei geringen Erregermengen kann die Inkubationszeit vier bis sechs Wochen betragen (STEVENSON 1998). Bei Infektionsversuchen wurden frühestens nach ca. 6 Tagen erste klinische Symptome beobachtet (KOBISCH et al. 1993; FENESTRA et al. 1994). Auch die Inkubationszeit ist von der Virulenz der M. hyopneumoniae-Stämme abhängig. Bei hoch virulenten Stämmen können nach experimenteller Infektion klinische Symptome ab dem 13. Tag p. i. festgestellt werden, während bei der Infektion mit einem gering virulenten Stamm diese ca. 5 Tage später auftreten (MEYNS et al. 2004).
In chronisch verseuchten Herden zeigen vor allem Ferkel und Läuferschweine klinische Symptome (DONE 1996, PFÜTZNER 1993, ROSS 1999). In Betrieben mit hohem Infektionsdruck können bereits Saugerferkel in den ersten beiden Lebenswochen infiziert werden, die danach ca. 14 Tagen p. i. klinische Symptome in Form eines schwachen,
trockenen Hustens zeigen (BERNER 1995). Neue Ausbrüche, in vorher M. hyopneumoniae-freien Herden, führen zum Auftreten von Husten in allen Alterklassen
(ZIMMERMANN et al. 1989), wobei die erwachsenen Tiere häufig schwerere Krankheitssymptome zeigen als die Jungschweine (KIRCHHOFF 1988).
Monoinfektionen in Form von katarrhalischen Bronchopneumonien mit mildem oder subklinischen Verlauf kommen unter Feldbedingungen sehr selten vor.
In der Regel wird die Erkrankung durch bakterielle Sekundärerreger verschlimmert (MAES et al. 1996, SØRENSEN et al. 1997). Dies ist der Grund dafür, weshalb die nach
der M. hyopneumoniae-Infektion durch Sekundärerreger ausgelösten klinischen Symptome in der Literatur als „Mycoplasma Induced Respiratory Disease“ (MIRD) bezeichnet werden (PFÜTZNER u. BLAHA 1995). Die Sekundärerreger begünstigen die Schädigung der Lunge (PFÜTZNER 1993; ROSS u. YOUNG 1993). Sie sind häufig verbunden mit schweren Pneumonien, Dyspnoe, starkem Husten und Fieber (ROSS 1992, 1999; BERNER 1995).
Zu den häufigsten Sekundärerregern, die die EP begleiten, gehört Pasteurella multocida (GROSSE BEILAGE 1999). Bei experimentell mit beiden Erregern infizierten Schweinen wurden chronisch verlaufende katarrhalisch, eitrige Bronchopneumonien mit meist ausgeprägten klinischen Symptomen, hohem Fieber über 41 ° C, Husten, Nasenausfluss und angestrengte Atmung beobachtet. Aber auch einzelne Fälle von Pleuropneumonien wurden beobachtet (CIPRIAN et al. 1988). Die Untersuchungen von AMASS et al. (1994)
und ähnliche von CLARK et al. (1994) beweisen, dass die Anwesenheit von M. hyopneumonie die Besiedlung mit P. multocida ermöglicht und die pathogene
Wirkung verstärkt. Die Doppelinfektion ist dementsprechend mit verstärkten klinischen Symptomen der EP verbunden. Tiere, die gegen M. hyopneumoniae geimpft waren und nur mit P. multocida infiziert wurden, entwickelten keine Krankheitssymptome oder nur milde klinische Erscheinungen. Weitere Keime, die das klinische Bild einer Infektion mit M. hyopneumoniae und die Lungenveränderungen komplizieren können, sind Bordetella bronchiseptica (MAYR 1993), Streptococcus suis (STEVENSON 1998) und Haemophilus parasuis. Bei Ausbrüchen der EP wird gelegentlich auch Actinobacillus pleuropneumoniae (A.pp.) isoliert (HOLMGREN et al. 1999), wobei A.pp. als primär pathogen angesehen wird. Die Anwesenheit von M. hyopneumoniae erhöht die Wahrscheinlichkeit einer A.pp. Infektion und kann die klinischen Symptome verstärken (YAGIHASHI et al. 1984, STEVENSON 1998).
M. hyopneumoniae ist zusammen mit viralen Erregern an dem „Porcine Respiratory Disease Complex“ (PRDC) beteiligt, der eine wichtige Ursache für die herabgesetzte Produktivität in der Endmast der Schweine darstellt (THACKER et al. 1999).
Koinfektionen von M. hyopneumoniae und Schweine-Influenzavirus (SIV) führen zur Verlängerung der Genesungszeit und verursachen einen größeren Grad an Lungenläsionen im Vergleich zu Monovirusinfektionen (THACKER et al. 2001, YAZAWA et al. 2004). Lungenschäden, verursachte durch das „Porcine Reproduktive and
Respiratory Syndrome Virus“ (PRRSV), werden durch eine Infektion mit M. hyopneumoniae und begleitende bakterielle Sekundärerreger verstärkt und führen zu
einem schlimmeren Verlauf der Pneumonie (THACKER et al. 1999) und einer
Schrirttum 22
Verschärfung der klinischen Symptome bei den betroffenen Tieren (van ALSTINE et al.
1996).
2.2.6 Pathologische Veränderungen
Eine Monoinfektion mit M. hyopneumoniae ist durch katarrhalische Bronchopneumonien gekennzeichnet. Die Läsionen treten an den Spitzenlappen und den kranioventralen Abschnitten von Herz- und Hauptlappen auf und sind 7-14 Tage p. i. sichtbar (KOBISCH et al. 1993, STEVENSON 1998). Im akuten Erkrankungsstadium zeichnen sich die Veränderungen als hellgraue, ödematöse und nicht gut abgegrenzte Bezirke aus, die bei subakuten Formen als atelektatische, blaßrote bis dunkelrote bis ins Violette verfärbte, teilweise eingesunkene, verfestigte und deutlich abgegrenzte Lungenareale ausgeprägt sind (ROSS 1992, FEENSTRA et al. 1994). In veränderten Lungenabschnitten kann ein katarrhalisches Exsudat aus den Bronchien herausgepresst werden. Die Bronchial- und Mediastinallymphknoten können geringgradig vergrößert sein (ROSS 1992). Eine spontane, makroskopische Regeneration konnte schon 5-6 Wochen p. i. beobachtet werden (LIVINGSTON et al. 1972). BERTSCHINGER et al. (1972) gaben an, dass eine Rückbildung ca. 8 Wochen p. i. sichtbar ist und bleibende Veränderungen nur als band- oder sternförmige Einziehungen auf der Lungenoberfläche zu erkennen sind. Bei Koinfektionen können eitrige oder nekrotische Pneumonieformen und Pleuritiden auftreten (YAGIHASHI et al. 1984, NOYES et al. 1990).
In Verlauf der M. hyopneumoniae-Infektionen verändert sich das histologische Bild.
Im ersten Monat p. i. ist in den Bronchiolen Zilienverlust und eine diffuse Ansammlung von Plasmazellen, Lymphozyten und Makrophagen im peribronchialen Gewebe zu beobachten. Es kommt zur lokalen Hyperplasie der Typ II-Pneumozyten und in den Alveolen treten Infiltrate, hauptsächlich bestehend aus Makrophagen, auf (KOBISCH et al. 1994, ROSS 1999). Infolge peribronchialer und perivaskulärer, lymphoretikulärer Hyperplasie entwickelt sich eine charakteristische follikuläre Lymphozytensammlung.
Danach treten neben kollabierten Alveolen alveoläre Emphyseme auf. Die zellulären Infiltrate in den Luftwegen gehen wieder zurück. Alveoläres Exsudat ist meistens in unkomplizierten Mykoplasmenmonoinfektionen nicht vorhanden (DONE 1996).
Es tritt jedoch bei Sekundärinfektionen abhängig vom jeweiligen Erreger auf (YAGIHASHI et al. 1984).
Wenn keine Komplikationen durch zusätzliche Infektionen entstehen, kann es zur vollständigen Restitution des Lungengewebes kommen (NOYES et al. 1990, ROSS 1992). In der Regel beginnend an den Spitzen der apikalen und kardialen Lungenlappen.
Es kommt zu einer Verminderung der alveolären Emphyseme und zur Reduzierung der Hyperplasie des Bronchialepithels (WHITTLESTONE 1985).
2.2.7 Wirtschaftliche Bedeutung der Enzootischen Pneumonie
Die ökonomischen Verluste, die durch die EP verursacht werden, sind das Resultat eines Zusammenwirkens von Mykoplasmeninfektionen, Koinfektionen und ungünstigem
Management und Umweltbedingungen (STRAW 1990, ROSS 1992, KOBISCH et al. 1994). Wirtschaftliche Schäden hängen von der Morbidität im Bestand, dem
Krankheitsgrad und der Verlaufsform ab und ergeben sich durch chronische Lungenerkrankung von allem in Leistungsdepression und relativ selten vorkommenden Todesfällen (ROSS 1992, PFÜTZNER 1993, MAES et al. 1996, BERNER 1996). Der dadurch notwendige Medikamenteneinsatz verursacht eine Erhöhung der Produktionskosten (BERNER 1996).
Die EP führt zur Verlängerung der Mast und zu einer Verringerung der täglichen Gewichtszunahme um bis zu 17 % (GOODWIN et al. 1965; STRAW et al. 1989;
BAKEBO et al. 1996 a, b) sowie bei Läuferschweinen zu einer bis zu 13 % schlechteren Futterverwertung (KIRCHHOFF 1988; GROSSE BEILAGE 1999; POINTON et al. 1985).
Der ökonomische Schaden im Hinblick auf die Mastleistung ist bei jungen Tieren gravierender (WALLGREN et al. 1994). In wesentlich geringerem Ausmaß werden die Leistungen älterer Schweine beeinflusst (NICKS et al. 1994).
2.2.8 Erregernachweise 2.2.8.1 Kultureller Nachweis
Zum kulturellen Nachweis von M. hyopneumoniae am lebenden Tier ist die tracheobronchiale oder bronchoalveoläre Lavage (BAL) geeignet (SCHULLER 1986). Es können auch Lungenstücke der Spitzenlappen von frischem Sektionsmaterial und Bronchus oder Bronchialabstriche verwendet werden. Der kulturelle Nachweis des
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Erregers ist mit vielen Schwierigkeiten verbunden. Wegen des langsamen Wachstums, das bis zu 30 Tage dauern kann, ist die Kultur zeitaufwendig (WHITTLESTONE 1979;
SIMECKA et al. 1992). Zusätzlich ist die Isolierung durch die sehr hohen
Nährstoffansprüche von M. hyopneumoniae erschwert (ROLLE u. MAYR 1993).
M. hyopneumoniae benötigt komplexe Nährmedien, die unter anderem Glukose als Energiequelle, Peptone und Tryptone als Aminosäuren, Hefeexstrakte (Wachstumfaktoren) und DNA zur Unterstützung des Wachstums benötigen (RAZIN 1981; FREUND 1983). Begleitende mikrobielle Flora in der untersuchten Probe, wie z. B:
M. hyorhinis, die geringere Ansprüche an das Nährmedium und die Kultivierungsbedingungen stellt, unterdrückt das Wachstum von M. hyopneumoniae und führt zu falsch negativen Ergebnissen (ARMSTRONG 1994). Um das zu verhindern, hat sich der Zusatz des Antibiotikums Cycloserin und Antiserum gegen M. hyorhinis zum Kulturmedium bewährt (GODWIN 1976, ARMSTRONG 1994). Eine andere Möglichkeit, um die Vermehrung von M. hyopneumoniae zu unterstützen, ist die mindestens fünfmalige Subkultivierung in wöchentlichen Abständen (GOIS et al. 1975).
M. hyopneumoniae muss bis zur Adaption des Erregers in Flüssigmedium subkultiviert werden. Ein spezielles Nährmedium, das als Indikator für die Ansäuerung des Mediums Phenolrot enthält, wurde von FRIIS (1975) beschrieben. Der Farbumschlag im Flüssigmedium weist auf das Wachstum von M. hyopneumoniae, oder aber auch auf andere, das Medium ansäuernde Bakterien hin und bestimmt den optimalen Zeitpunkt für eine Subkultivierung. Diese kann in Flüssigmedium oder auf Festmedium erfolgen.
Auf festem Medium können frühestens nach 7-9 Tagen erste Kolonien beobachtet werden (WHITTLESTONE 1985). Die zuverlässige Beurteilung sollte frühestens nach vierwöchiger Inkubation und nach zusätzlichen serologischen Tests, wie z. B dem Wachstumshemmtest, getroffen werden (ARMSTRONG 1994).
2.2.8.2 Immunfluoreszenztest
DEL GIUDICE et al. (1967) entwickelten den Immunfluoreszenztest zunächst zur schnellen Identifizierung von Mykoplasmenkolonien auf Agar. Dieser Test wurde später dann auch an andere Probenarten adaptiert (MEYLING 1971 SCHULLER et al. 1976).
Beim Immunfluoreszenztest werden spezifische Antikörper gegen M. hyopneumoniae an einen sekundären Antikörper gekoppelt, der wiederum mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) konjugiert ist. Durch eine UV-Anregung des Farbstoffes werden die spezifischen Antigen-Antikörperkomplexe sichtbar gemacht. Mit diesem Test kann der Erreger direkt in Gefrierschnitten aus Spitzenlappen der Lungen, zumeist am Rand der Bronchien oder Bronchiolen nachgewiesen werden (MEYLING 1971, BINDER et al. 1990). Die Sensitivität dieser Methode hängt von der Anzahl der Mykoplasmen und somit vom Infektionsstadium ab. Nach WHITTLESTONE (1990) liegt die Nachweisgrenze in einem Bereich von 104-105 Erreger/g Gewebe. Bei einer niedrigeren Erregerdichte in frühen,
chronischen oder latenten Stadien der Erkrankung ist der Nachweis von M. hyopneumoniae mit dieser Methode daher oft nicht möglich (ARMSTRONG 1996,
SØRENSEN 1996). Die Sensitivität kann auch durch die Ausbildung lokaler Antikörper verringert sein, da diese zu einem „blocking-effect“ führen (MAES 1996). In diesen Fällen kann als Methode der Wahl der kulturelle Nachweis durchgeführt werden, der auch zur Absicherung im akuten Stadium, in dem die Sensitivität des Immunfluoreszenztestes auf bis zu 96 % ansteigt, empfohlen wird (BINDER et al 1989).
2.2.8.3 PCR
Die PCR ist eine Methode, die sich durch eine hohe Sensitivität und Spezifität auszeichnet. Es handelt sich um eine enzymatische Vervielfältigung einer spezifischen DNA-Sequenz, die von zwei Oligonukleotiden (Primern) begrenzt ist. Die Methode wurde von MULLIS (1986) entwickelt.
Die zyklisch verlaufende Reaktion basiert auf drei Teilschritten, die mit unterschiedlichen Temperaturen durchgeführt werden. Im ersten Schritt wird die doppelsträngige DNA bei 94 ° C denaturiert und dadurch in Einzelstränge aufgetrennt. Die Anlagerung (Hybridisierung) der spezifischen Primer an die komplementären Sequenzen der DNA-
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Stränge erfolgt nach Temperatursenkung, die für jedes Primerpaar charakteristisch ist.
Die Oligonukleotidmoleküle dienen als Startpunkte für die DNA-Polymerase, die von ihnen ausgehend durch Einbau von Desoxyribonukleotidtriphosphaten (dNTPs) neue, komplementäre DNA-Stränge synthetisiert. Die Elongation durch die DNA-Polymerase läuft bei einer Temperatur von 72° C ab. Mehrfache Wiederholungen des Zyklus aus Denaturierung, Hybridisierung und Strangsynthese führen zu einer exponentiellen Vermehrung der spezifischen, beidseitig von den Oligonukleotiden flankierten DNA- Sequenz. Durch Verwendung einer hitzestabilen Polymerase aus dem thermophilen Bakterium Thermus aquaticus, die die Temperatur der DNA-Denaturierung übersteht, wurde das PCR-Verfahren vereinfacht (MULLIS et al. 1986, LINZ u. DEGENHARD 1990, GASSEN et al. 1994, WINK u. WEHLER 1994). Die Amplifikationsprodukte lassen sich nach Gelelektrophorese mittels Ethidiumbromidfärbung oder durch Färbung mit anderen Fluoreszenzfarbstoffen darstellen (WINK u. WEHLER 1994). Sie können aber auch durch Hybridisierung mit DNA-Sonden nachgewiesen werden (MAHBUBANI u. BEJ 1994).
Die PCR ist eine sehr sensible Technik, die von vielen Faktoren beeinflusst werden kann. Dazu gehören: die Zusammensetzung und Konzentration der Reaktionskomponenten, die verwendeten Temperaturen, Menge und Qualität der eingesetzten Ziel-DNA und die Sequenzen der ausgewählten Primer (NEWTON u.
GRAHAM 1994). Um einen möglichst sensitiven und spezifischen Nachweis zu ermöglichen, müssen alle Komponenten angepasst werden (WINK u. WEHLER 1994).
Die Auswahl der verwendeten Primer hat große Bedeutung für die Spezifität und Sensitivität der Reaktion. Beide sollen die gleiche Schmelztemperaturen besitzen, keine Sekundärstrukturen aufweisen und nicht komplementär zueinander sein (BEJ et al.
1991, NEWTON u. GRAHAM 1994). Die Bildung von Primer-Dimeren konnte durch die Hot-Start-Methode verhindert werden. Diese Methode minimiert die Bildung unspezifischer Primer-Komplexe, die bei niedrigen Temperaturen während der ersten Erhitzungsphase entstehen (BERCHTOLD u. HÜBSCHER 1996). Mg2+-Ionen beeinflussen die Enzymaktivität der DNA-Polymerase und die Anlagerung der Primer.
Daher sollte für jede PCR die optimale Konzentration ermittelt werden (GASSEN et al.
1994, WINK u. WEHLER 1994). Desoxyribonukleotidtriphosphate, die aus gleichen Teilen von Desoxycytidintriphosphat (dCTP), Desoxyadenosintriphosphat (dATP), Desoxythymidintriphosphat (dTTP) und Desoxyguanosintriphosphat (dGTP) bestehen, können bei zu hohen Konzentrationen zu „Mispriming“ und zu Schreibfehlern der Polymerase führen (NEWTON u. GRAHAM 1994).
In der medizinischen Diagnostik ist die PCR zum Nachweis zahlreicher Krankheitserreger eingesetzt worden (BEJ et al. 1991, MAHBUBANI u. BEJ 1994). Der Vorteil der PCR liegt in der Schnelligkeit, der hohen Sensitivität und Spezifität, die durch Anwendung der so genannten nested-PCR noch gesteigert werden konnte (GASSEN et al. 1994, WINK u. WEHLER 1994). Bei dieser Methode handelt es sich um die Hybridisierung von inneren Primern innerhalb des Abschnittes, der von den ersten äußeren Primerpaaren vorgegeben wird. In der ersten PCR-Runde entstandene Amplifikate dienen als Matrize der zweiten PCR. Unspezifische Produkte, die bei dem ersten PCR-Schritt entstehen, besitzen nicht mehr genügend komplementäre Sequenzen für das innere Primerpaar. Auf diese Weise zeigt die nested-PCR im Vergleich mit der oben beschriebenen one-step-PCR eine höhere Spezifität.
Andererseits ist die Steigerung der Empfindlichkeit mit einer erhöhten Anfälligkeit gegenüber Kontaminationen verbunden.
Falsch positive Signale erfolgen durch den unbeabsichtigten Transfer von Ziel-DNA (sog.
„cross over“-Kontaminationen) von Probe zu Probe oder von der Positivkontrolle auf die Probe, der auch durch aerogene Übertragung innerhalb des Labors möglich ist (PERSING 1993). Um dies zu verhindern müssen folgende Vorsichtsmaßnahmen in Betracht gezogen werden (PERSING u. CIMINO 1993, WINK u. WEHLER 1994, NEWTON u. GRAHAM 1994) :
1. Räumliche Trennung:
Probenaufbereitung, Vorbereitung der PCR (Pipettieren des Reaktionsansatzes), Probenzugabe mit Amplifikationsschritt und gelelektrophoretischer Analyse in jeweils isolierten Bereichen.
2. Benutzung von Sterilwerkbanken für die Pipettierschritte nach dreißigminütiger Bestrahlung mit UV-Licht.
3. Autoklavieren der verwendeten Lösungen.
4. Verwendung von Einmalhandschuhen bei jedem neuen Arbeitsschritt, Einwegmaterialien, gestopfte Pipettenspitzen
Ein weiteres Problem stellen die Inhibitoren dar, die die Amplifikationseffizienz beeinflussen und zu falsch negativen Resultaten führen. Verschiedene Bestandteile von Körperflüssigkeiten oder Bakterienzellen, die keine Ziel-DNA besitzen, Nahrungsmittelbestandteile, aber auch Laborgegenstände, wie z. B. Laborplastikwaren können inhibitorische Wirkungen zeigen. Verschiedene Stoffe, wie Phenole, Hämoglobin und deren Abbau-Produkte wurden als PCR-Hemmstoffe identifiziert (ROSSEN et al.
1992, WIEDBRAUK et al. 1995). Die Konzentration der Hemmstoffe kann im einfachsten
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Fall durch Verdünnung der untersuchenden Proben oder mit Hilfe von mehr oder weniger aufwendigen Reinigungsverfahren herabgesetzt werden (HIGUCHI 1989).
Von dem Einsatz der PCR in der Diagnostik von M. hyopneumoniae erhofft man sich im Vergleich zu anderen Methoden eine Verbesserung der Spezifität, Sensitivität und Schnelligkeit des Nachweises. Für PCR Verfahren zum Nachweis von M. hyopneumonie wurde Probenmaterial von lebenden Tieren, wie z. B. Lungenspülproben (BLANCHARD et al. 1996; BAUMEISTER et al. 1998; VERDIN et al. 2000b; PABST et al. 2004) oder Nasentupfer (MATTSSON et al. 1995; SØRENSEN 1997; CALSAMIGLIA et al. 1999) verwendet. Postmortal sind Bronchialtupfer (SØRENSEN et a. 1994, CARON 2000) oder Lungengewebe (CARON et al. 2000) geeignet. M. hyopneumoniae konnte mittels nested-PCR auch in Luftproben erfolgreich nachgewiesen werden (STÄRK et al. 1998).
In der Literatur beschriebene PCR´s basieren auf dem Nachweis verschiedener DNA- Sequenzen von M. hyopneumoniae. Die Spezifität hängt von den gattungsspezifischen Primerpaaren ab, mit deren Hilfe DNA-Abschnitte amplifiziert werden, die einzeln (ARTIUSHIN et al. 1993, BLANCHARD et al. 1996) oder in mehreren Kopien im M. hyopneumoniae-Genom vorkommen (HARASAWA et al. 1991; STÄRK et al. 1998).
Es wurden verschiedene PCR`s entwickelt, die auf den Nachweis eines Segments des 16S rRNA-Gens basieren (STEMKE et al. 1985; MATTSSON et al. 1995; CALSAMIGLIA et al. 1999). Von diesem DNA-Abschnitt konnten gleichzeitig mit Hilfe von zwei speziesspezifischen Primern und einem gattungsspezifischen Primer andere Mycoplasma sp. wie z. B. M. flocculare oder M. hyorhinis vermehrt werden (STEMKE et al. 1997). Die Sensitivität der PCR bestimmt die Menge von M. hyopneumoniae- Zellen, die mit den entsprechenden Primern detektiert werden können. MATTSSON et al. (1995) entwickelten ein Primerpaar, das ein 649 bp Fragment amplifiziert. Mit Hilfe dieser PCR konnten 5 KbE von M. hyopneumonaie bei 10 untersuchten Feldisolaten nachweisen werden.
Das von BAUMEISTER et al. (1998) beschriebene Primerpaar, das ein für M. hyopneumoniae spezifisches, 853 bp großes Fragment amplifiziert, wurde zum
Nachweis von M. hyopneumonaie in Lungenspülproben eingesetzt. eine Reaktion der Primer mit der DNA von 11 anderen Bakterienspezies, die im Atmungssystem der Schweine vorkommen können, wurden nicht beobachtet. Die Nachweisgrenze lag beim Typstamm J bei 10 fg M. hyopneumoniae DNA pro PCR-Ansatz.
Auf der Basis der oben beschriebenen Primerpaare wurde eine Studie mit experimentell infizierten Schweinen durchgeführt (SØRENSEN et al. 1994). Die Autoren verglichen die Ergebnisse der kulturellen Untersuchung von Lungengewebe mit den Ergebnissen der
PCR aus Bronchialtupfern. Die Spezifität der PCR betrug im Vergleich zum kulturellen Nachweis 100 %, die Sensitivität nahm von 93 % bis 100 % am 14. Tag p. i. auf 19-49 % am 85. Tag p. i. ab.
Durch Etablierung der nested-PCR-Verfahren konnten noch geringere Menge von M. hyopneumonie detektiert werden. Im frühen Infektionsstadium konnten die Erreger vor einer Serokonversion in der Tracheobronchialflüssigkeit von natürlich infizierten Schweinen nachgewiesen werden (VERDIN et al. 1996), bzw. vor dem Auftreten von entzündlichen Lungenveränderungen (CALSAMIGLIA et al. 2000). STÄRK et al. (1998) etablierten eine nested-PCR zum Nachweis von M. hyopneumoniae in Luftproben von Schweinebeständen mit Erkrankungen des Respirationstraktes. Sie entwickelten zwei Primerpaare basierend auf 1023 bp großen repetitiven MHYP1-03-950 Fragment im M. hyopneumoniae-Genom, wovon bis zu sieben Kopien bei verschiedenen Stämmen vorkommen. Innerhalb des 913 bp großen Fragments der ersten Reaktion wurde während des zweiten Schrittes ein internes 808 bp großer Fragment amplifiziert.
Mit der von CALSAMIGLIA et al. (1999) entwickelten nested-PCR konnten bis zu 80 M. hyopneumonaie-Zellen nachgewiesen werden. Die zwei speziesspezifischen Primer binden an dem 16S rRNA-Gen. Dabei wurden keine Kreuzreaktionen mit anderen Mykoplasmenarten oder mit anderen im Respirationstrakt vorkommenden Mikroorganismen beobachtet.
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Tab. 1: Sensitivität der in der Literatur beschriebenen PCR´s zum Nachweis von M. hyopneumoniae.
1)Die erste Ziffer gibt die Größe des Amplifikationsproduktes der ersten PCR an
2) Die zweite Ziffer gibt die Größe des Amplifikationsproduktes der zweiten PCR an
AUTOR Zielsequenz
Größe der amplifizierte n Fragmente
Sensitivität Anwendung One step-PCR
HARASAWA et al. (1991)
Unbekannte repetitive Sequenz
520 bp 5.000 fg DNA
Laborstamm von M. hyopneumoniae
ARTIUSHIN et al.(1993)
unbekannte
Sequenz 456 bp
1-10 000 fg DNA
40 Feldisolate
STEMKE at al. (1994)
Sequenz aus dem 16S rRNA-Gen
238 bp 3.000 fg DNA
Vier Feldisolaten von M. hyopneumoniae
MATTSSON et al. (1995) 16S rRNA 649 bp 100 fg DNA
Lungenproben und Bronchiallavagen von experimentell infizierten Schweinen und Nasentupfern von natürlich infizierten Schweinen
THOMSON et al. (1996)
Sequenz aus dem 16S rRNA-Gen
230bp 500 CFU
Lungenproben von natürlich infizierten Schweinen
BLANCHARD et al.(1996)
Unbekannte
Sequenz 1561 bp
500 fg DNA (4x102 Organismen)
BAL´s von experimentell infizierten Schweinen
BAUMEISTER et al.(1998)
Unbekannte
Sequenz 863 bp
10 fg DNA BAL´s von natürlich infizierten Schweinen Nested-PCR
STÄRK et al. (1998) 1023 bp repetitive Sequenz
913 bp1) 808 bp2)
1 CFU
Luftproben aus natürlich und experimentell infizierten Schweinebeständen
CALSAMIGLIA et al. (1999) 16S rRNA 649 bp 352 bp
80 CFU
Nasentupfer von experimentell infizierten Schweinen
Verdin et al. (2000a/b) Unbekannte Sequenz
1561 bp 706 bp
1 fg DNA
Tracheobronchiallavage Fluid von natürlich infizierten Schweinen
2.2.9 Nachweis spezifischer Antikörper
Für den serologisch Nachweis spezifischer Antikörper gegen M. hyopneumoniae hat sich neben dem Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), die Komplementbindungsre- aktion (KBR), etabliert von SLAWIK und SWITZER (1972) und die indirekte Hämagglutination (IHA) (LAM u. SWITZER 1971) als geeignet erwiesen. Die Anwendung der beiden letztgenannten Methoden wurde durch mögliche falsch-positive Ergebnisse infolge von Kreuzreaktionen mit M. hyorhinis und M. flocculare eingeschränkt (FREEMAN et al. 1984 a, b, ROSS 1992).
Der ELISA gilt in der Serodiagnostik von M. hyopneumoniae als empfindlichste und sensitivste Methode. Er ermöglicht den Nachweis der Infektion sowie ein schnelles Herdenscreening (SIMECKA et al. 1992, LEVONEN et al. 1999).
Der erste, von BRUGGMAN et al. (1977) entwickelte ELISA, wies Kreuzreaktionen mit anderen Mykoplasmenarten auf. Um die Spezifität zu steigern, wurden Modifikationen des ELISA´s, wie z.B. die Extraktion des Antigens mit Tween 20 durchgeführt (NICOLET et al. 1980, BOMMELI 1986), dennoch traten noch Kreuzreaktionen mit M. flocculare auf (BEREITER et. al 1990). Der später entwickelte Blocking-ELISA wurde als besonders sensitiv angesehen. Hier werden monoklonale Antikörpern gegen M. hyopneumonie- spezifische 40, 45 und 70 kDa große Proteine verwendet (FELD et al. 1992, LE POTIER
et al. 1994). Der indirekte ELISA, der inaktiviertes, mit Tween 20 gereinigtes M. hyopneumoniae-Antigen nutzt, zeigt eine Sensitivität von 95 % und eine Spezifität
von 98,8 % (BOMMELI u NICOLET 1983, FUTO 1992). Bei diesem ELISA wurden keine Kreuzreaktionen mit anderen Mykoplasmenarten nachgewiesen (SHELDRAKE u.
ROMALIS 1992).
Mit den verschiedenen ELISA-Methoden sind Antikörper gegen M. hyopneumoniae ab dem 8. Tag p. i. bis spätestens 24 Wochen p. i. (Le POTIER et al. 1992, KOBISCH et al.
1992, FUTO et al. 1995) nach der Infektion detektierbar und bis zu einem Jahr nachweisbar (ARMSTRONG et al. 1983, BEREITER et al. 1990). Durch Untersuchung von Kolostralmilchproben kann die Sensitivität des ELISA´s erhöht werden.
Kolostralmilchproben von Sauen erhalten um 71 % höhere IgG-Werte als die korrespondierenden Blutproben (YAGIHASHI et al. 1993, SØRENSEN et al. 1993, DJORDJEVIC et al. 1994, MORRIS et al. 1994, RAUTIAINEN u. WALLGREN 2001). Es gelingt damit auch eine Infektionen in subklinisch chronisch infizierten Herden nachzuweisen (NICOLET et al 1990, ZIMMERMANN 1991). Der Antikörpernachweis gelingt in Kolostralproben bei Sauen auch noch bis zu 3 Jahren p. i., weshalb
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RAUTIANEN et al. (2000) die Untersuchung von Kolostralmilchproben zum Herdenscreening empfehlen.
2.2.10 Bekämpfungsmaßnahmen
Zur Kontrolle der EP werden mehr oder weniger erfolgreiche Maßnahmen eingeschlagen, die den Infektionsdruck im Bestand senken sollen (WALLGREN et al.
1993, HORST et al. 1996). Neben der Verbesserung von Management und Umweltbedingungen wurden Chemotherapeutika sowohl therapeutisch, metaphylaktisch als auch prophylaktisch eingesetzt (KELLER 1996, WHITTLESTONE 1990). Daneben wurden weltweit verschiedene Programme zur Eradikation bzw. Reduktion der Erregerübertragung sowie prophylaktische Vakzinationen eingesetzt.
2.1.6.1 Chemotherapie und Sanierung
Chemotherapeutika wurden zur Behandlung und Prävention von M. hyopneumoniae- Infektionen eingesetzt. Eine Erregereliminierung aus infizierten Tieren ist durch medikamentelle Therapie nur schwer zu erreichen, obwohl in vitro Antibiotika eine inhibitorische Wirkung auf Mykoplasmen zeigen (CIPRIAN et al. 1994). In Herden mit einem hohen Risiko einer M. hyopneumoniae-Infektionen limitiert der Einsatz von Antibiotika über eine längere Zeit die Erregeransiedlung, die Erregerausbreitung innerhalb der Herden und reduziert die klinischen Symptome sowie den wirtschaftlichen Schaden (HENRY 1996).
Medikamentelle Behandlungen von Schweinebeständen erfolgen über das Trinkwasser oder Futter (VICCA et al. 2004), bei Tieren mit reduzierter Fresslust in Form intramuskulärer Injektionen (HELLWIG 2002).
Für einige M. hyopneumoniae-Stämme wurde die Minimale Hemmstoffkonzentration mit verschiedenen Antibiotika untersucht (YAMAMOTO et al. 1986, HANNAN et al. 1997, STIPKOVITS et al. 2004, VICCA et al. 2004).
Von VICCA et al. (2004) wurden 5 M. hyopneumoniae-Stämme auf ihre Empfindlichkeit gegenüber Lincomycin, Lincomycin/Spectomycin, Spectinomycin, Oxytetracyclin, Doxytetracyclin, Enrofloxacin, Flumeguine, Gentamicin, Florfenicol, Tiamulin, Tilmicosin und Tylosintartrat überprüft. Nur bei einem Stamm wurden Resistenzen gegen Tylosin,
Tiamulin und Linkosamide beobachtet. Flumequin zeigte keine Wirksamkeit. Auch bei
dieser Untersuchung konnte bestätigt werden, dass die Mehrzahl der M. hyopneumoniae-Stämme die höchste Empfindlichkeit gegenüber Valnemulin und
Tiamulin aufwiesen (STIPKOVITS et al. 2004).
Bei infizierten Schweinen konnte bei Anwendung von 55 g Tylosin oder 37,5 g Valnemulin pro Tonne Futter das Auftreten klinischer Symptome verhindert werden. Mit der doppelten Dosis Tylosin oder Valnemulin wurden zusätzlich Verbesserungen in den täglichen Zunahmen nachgewiesen (OLSEN u. BÄCKSTROM 2000, VELASQUEZ u.
VELASQUEZ 2004).
Chlortetracyclin, angewandt über 14 Tage in einer Dosis 550 mg pro kg Futter, führte zur Senkung der klinischen EP-Symptomatik bei experimentell Infizierten Schweinen (THACKER et al. 2000 b). Neben der Futter- und Trinkwassermedikation konnte auch mittels Injektionsbehandlung eine Verbesserung der klinischen Symptomatik der EP sowie eine Reduktion der wirtschaftlichen Verluste in zahlreichen Versuchen nachgewiesen werden (DEBANO et al. 1989, BLACKBALL et al. 1995, MATEUSEN et al. 2001, Mc KELVIE et al. 2004).
Der prophylaktische Einsatz von Chemotherapeutika führt zu besseren Resultaten als die therapeutische Anwendung (STIPKOVITS 1990). Prophylaktisch wurden am häufigsten Tiamulin und Chlortetracyclin (BAEKEBO et al. 1994) sowie Lincomycin (ZIMMERMANN u. WEISKOPF 1996) erprobt, obwohl bereits einige Feldisolate von M. hyopneumoniae Resistenzen gegen Makrolide und Linkosamide aufweisen (VICCA et al. 2004).
Zur Verminderung des ökonomischen Schadens in infizierten Herden sind vor allem Verbesserungen im Management und hier zuerst die konsequente Produktion im Rein- Raus-Verfahren geeignet (CLARK et al 1990). Verbesserungen im Management sind meist wirksam, wenn sie mit einer Verringerung der Tierdichte, Verbesserung der Stallklimas und Desinfektionsmaßnahmen verbunden sind. Auch eine Verminderung der Anzahl bzw. Quote der Jungsauen, Separation der Ferkel von der Sau zu einem möglichst frühen Zeitpunkt (Segregated early weaning, medicated early weaning) vor einer möglichen Erregerübertragung gelten als effektive Maßnahmen bei der Bekämpfung der M. hyopneumoniae-Infektion (ROSS 1992, CIPRIAN et al. 1994)
Um mykoplasmenfreie Herden aufzubauen, wurden verschiedene Sanierungsprogramme entwickelt. Das Medicated-early-weaning-Programm von ALEXANDER et al. (1980) basiert auf der Begrenzung der vertikalen Erregerübertragung, durch antibiotische Behandlung (z. B. mit Tiamulin) der Sauen in
