Vergleich der one step-PCR mit der nested-PCR

Für schwer kultivierbare Erreger, zu denen M. hyopneumoniae gehört, wird die PCR in steigendem Maße eingesetzt. Die wesentlichen Unterschiede zwischen den verschiedenen PCR-Systemen liegen in der Spezifität und Sensitivität (SACHSE u. FREY 2002).

Eine zentrale Rolle bei der PCR spielt die Probenaufbereitung. Um die Ziel-DNA stabilisiert und frei von Inhibitoren zu erhalten, sollten die verschiedenen klinischen Proben und die Aufbereitungsmethoden aneinander angepasst werden (GREENFIELD u. WHITE 1993, WILSON 1997, MAUEL et al 1999). In Rahmen diese Arbeit wurden zwei Probenaufbereitungsmethoden aus Reinkulturen von M. hyopneumonaie getestet.

Die Beurteilung wurde nach dem berechneten Reinheitsquotienten ermittelt (SAMBROOK et al. 1989). Eine höhere DNA-Konzentration wurde mit dem kommerziellen DNeasy™ Tissue Kit erreicht, das auf der Lyse von Zellen, Ausfällung durch Ethanol und spezifischer Bindung der DNA an die Membran der im Kit enthaltenen Säulen basiert. Diese Methode wies die höchste Sensitivität für die Aufbereitung der untersuchten Proben auf. Die mögliche Anwesenheit PCR-hemmender Substanzen in den untersuchten Proben wurde durch die in jedem Ansatz mitgeführten internen Kontrollen ausgeschlossen.

BIRCHEN et al. (2003) empfehlen eine standarisierte Extraktionsmethode, die auf der

Ausfällung mittels Ethanol basiert. Sie ist geeignet zum Nachweis von M. hyopneumoniae und weist gegenüber der Aufkochen/Einfrier-Methode eine höhere

Sensitivität auf. Bei der Aufkochmethode können einerseits nicht ausreichend hemmende Substanzen entfernt werden, andererseits macht der niedrige Reinheitsquotient zahlreiche Zentrifugationsschritte notwendig, die zu einem Verlust an Ziel-DNA führen.

Ein quantitatives Kriterium zur Beurteilung eines diagnostische Tests ist die Sensitivität, die über die Nachweisgrenze definiert wird. Die Spezifität hängt im Wesentlichen vom gewählten Primerpaar ab, mit dessen Hilfe die spezifischen Abschnitte der Ziel-DNA amplifiziert werden (WINK u. WEHRLE 1994, GASSE et al. 1994). Die detektierte Zielsequenz sollte dabei nicht innerhalb einer Spezies variieren (PERSING 1993).

Auf der Basis des von BAUMEISTER et al. (1998) beschriebenen Primerpaares, das an eine unbekannte Sequenz im Genom von M. hyopneumoniae bindet, wurde versucht die Nachweisgrenze zu bestimmen. Das Amplifikationsprodukt besteht aus einem 853 bp-Fragment, welches von den Autoren bei drei M. hyopneumoniae-Stämmen nachgewiesen werden konnte. Um die Nachweisgrenze zu erhöhen, wurden in der vorliegenden Arbeit Optimierungsversuche durchgeführt. Dazu wurden die Auswirkungen von Veränderungen der Reaktionskomponenten, der Amplifikationszeiten, der Temperaturen und der Anzahl der Zyklen an immer demselben M. hyopneumoniae Typstamm J überprüft. Zur Verbesserung der Spezifität wurde zusätzlich HotStarTaq™

DNA Polymerase verwendet, die eine unspezifische Anlagerung und Extension der Primer vermindern sollte (PERSING 1993). Die Sensitivität wurde zunächst mit extrahierter DNA des M. hyopneumoniae Typstammes J aus Flüssigkulturen ermittelt.

Die extrahierte DNA, mit der noch eine spezifische Amplifikation beobachtet wurde, konnte bis zu 10^-3 verdünnt werden, was einem DNA-Gehalt von 0,1 ng/Ansatz entspricht. Da 1,2 fg DNA mit einem Organismus der Gattung Mycoplasma korreliert (CALSAMIGLIA et al. 1999), wurde in der one-step-PCR eine Nachweisgrenze von 8,3x10⁴ M. hyopneumoniae-Zellen erreicht.

Die nested-PCR nach STÄRK et al. (1998) konnte schon im ersten Anlauf etabliert werden. Spezifische Amplifikate wurden bei 14 Feldisolaten nachgewiesen (STÄRK et al.

1998). Bei dieser nested-PCR lag die Nachweisgrenze bei 5 fg DNA/Ansatz, was etwa vier M. hyopneumoniae-Zellen entspricht. Die Ausgangs-DNA konnte bis 10^-7 verdünnt und noch detektiert werden. Während die one-step-PCR nach BAUMEISTER et al.

(1998) nach den Modifikationen eine hohe Sensitivität beim Stamm J aufwies, konnte in keiner von 30 untersuchten klinischen Proben (Bronchialtupfer) M. hyopneumoniae nachgewiesen werden. In denselben Bronchialtupfern konnten mittels nested-PCR nach STÄRK et al. (1998) in 83 % M. hyopneumoniae-DNA amplifiziert werden. Bei parallel

Diskussion 90

durchgeführten Untersuchungen an der Abteilung für Epidemiologie, Veterinärmedizinische Fakultät der Universität Las Palmas, Spanien, mit 8 dieser Proben wurde mittels nested-PCR nach CALSAMIGLIA et al. (1999), eine 100 %ige Übereinstimmung mit der nested-PCR nach STÄRK et al. (1998) gezeigt. In der one-step-PCR nach MATTSSON et al. (1995) waren in der gleichen Untersuchung, die in einem anderen Labor durchgeführt wurde, nur drei von 8 Proben positiv. Diese Ergebnisse lassen sich nach den hier durchgeführten Untersuchungen durch eine zu geringe Sensitivität der one-step-PCR nach BAUMEISTER et al. (1998) erklären.

Offensichtlich wurden durch das eingesetzte Primerpaar zwar der Typstamm J, jedoch, im Gegensatz zu allen anderen PCR-Verfahren, keiner der untersuchten Feldstämme erkannt. Die unzureichende Sensitivität der one-step-PCR nach BAUMEISTER et al.

(1998) lässt sich durch eine ungeeignete Wahl der Primer erklären, die dazu führt, dass zwar der Typstamm J erkannt wird, nicht jedoch die Mehrzahl der Feldstämme von M. hyopneumoniae. In einer nested-PCR unter Verwendung der von BAUMEISTER et al.

(1998) publizierten Primer, wurden nur in 16 % von 199 untersuchten Lungenproben M. hyopneumoniae-Genomsequenzen nachgewiesen (BIRCHEN et al. 2003) anstatt in 30-80 %, die zu erwarten gewesen wären (ROSS 1999).

5.2 Prävalenz von M. hyopneumoniae bei Schlachtschweinen

5.2.1 Kulturelle Untersuchung bei Schlachtschweinen

Kulturell konnte bei keiner Lungenprobe von Schlachtschweinen M. hyopneumoniae nachgewiesen werden. Bereits GANTER et al. (1993) sowie RUNGE et al. (1996) war es nur ausnahmsweise gelungen kulturell M. hyopneumoniae nachzuweisen. Dagegen betrachtet FRIIS (1975) die kulturelle Untersuchung auf Mykoplasmen grundsätzlich als

„Golden Standard“ auch bei M. hyopneumoniae. Die Gründe weshalb die Anzucht nicht gelang, wurden bereits von anderen Autoren diskutiert. Unabhängig von den speziellen Problemen bei der Anzucht von M. hyopneumoniae halten DOSTER et al. (1985) den kulturellen Nachweis, im Gegensatz zu FRIIS (1975) nicht für eine ausreichend sensitive Methode für einen „Golden Standard“, weil sie mindestens 10³-10⁶ Mikroorganismen/ml für einen erfolgreichen Nachweis benötigt (DOSTER et al. 1985).

Bei den eigenen Untersuchungen wurde durch Verwendung kommerzieller Spezialnährmedien für die Flüssigkultur sowie durch spezielle kommerzielle feste Nährböden versucht die kulturelle Untersuchung auf M. hyopneumoniae zu optimieren.

Während die Kultur des Typstammes J problemlos gelang, konnten aus Bronchialtupfern von Schlachtschweinen in keinem Falle M. hyopneumoniae nachgewiesen werden.

Obwohl die Kultur anderer Mykoplasmen mit diesen Medien gelang, wie z. B.

M. conjunctivae aus Augentupfern von Schafen (CHRUSCIEL et al 2002). Jedoch konnten die Ergebnisse der kulturellen Untersuchungen auf M. hyopneumoniae in der hier vorliegenden Arbeit nicht als „Golden Standard“ verwendet werden.

M. hyopneumoniae ist hinsichtlich des Kulturmediums sehr anspruchvoll und aus diesem Grund schwer anzüchtbar (ROSS 1992). Die Anwesenheit anderer Mycoplasma sp.,

insbesondere von M. hyorhinis, können sich störend auf die Isolierung von M. hyopneumoniae auswirken (FRIIS 1975). Auch durch Zusatz von anti-M.

hyorhinis-Serum konnte nicht immer das Wachstum von M. hyorhinis unterdrückt werden (WHITTLESTONE 1973). Hierbei könnte die normale Begleitflora des Respirationstraktes des Schweines, wie z. B. Zellwand-tragende Bakterien, die Kontaminationen verursachen, das Wachstum von M. hyopneumoniae unterdrücken und zu falsch negativen Ergebnissen führen. Ursache für negative kulturelle Befunde können auch unkultivierbare Stämme sein, sowie die Anwesenheit toter oder beschädigter Organismen. In diesen Fall wäre das Wachstum in den Kulturmedien nicht möglich, aber die spezifischen DNA-Abschnitte könnten in der PCR detektiert werden (CALSAMIGLIA et al. 1999).

5.2.2 Korrelation zwischen den Lungenveränderungen und M. hyopneumoniae-Infektionen

Spitzenlappenpneumonien wurden als typische Läsionen bei EP beschrieben (BERTSCHINGER et al. 1972, ROSS 1992). In der Schweiz kommen oben genannte Lungenveränderungen, bei ca. 21 % der Schlachtschweine vor (GREST et al. 1997). In Deutschland weisen ca. 50-80 % der Mastschweine Spitzenlappenpneumonien am Schlachtband auf (EICH u. SCHMIDT 2000).

108 von 115 der untersuchten Schweine zeigten hier makroskopisch pathologische Lungenveränderungen, die auf M. hyopneumoniae-Infektionen hinweisen können.

Diskussion 92

In dieser Gruppe war die Nachweishäufigkeit von M. hyopneumoniae signifikant höher als bei Schweinen ohne makroskopische Lungenveränderungen. Allerdings lassen sich die für EP typischen Lungenveränderungen nicht eindeutig einem positiven oder negativen Ausfall der Untersuchung auf M. hyopneumoniae zuordnen (SIMON et al.

1994). Aufgrund der pathomorphologischen Veränderungen können keine erregerspezifischen Diagnosen gestellt werden (ARMSTRONG et al. 1984, FELLSTRÖM u. WALLGREN 1992). Spitzenlappenpneumonien können auch durch andere Erreger wie z.B. Pasteurella multocida oder Haemophilus parasuis verursacht werden (PLANOIT

1988, SØRENSEN et al. 1997), obwohl die Häufigkeit des Nachweises von M. hyopneumoniae mittels nested-PCR eng mit dem Auftreten der makroskopischen

Lungenveränderungen korreliert (SIBILA et al. 2004 a). M. hyopneumoniae kann aus unveränderten Lungen seltener nachgewiesen werden, obwohl die Anwesenheit des Erregers nicht ausgeschlossen werden kann. Erste Lungenläsionen treten bei Infektionsversuchen nach ca. 1 Woche auf (PIRIE 1991) und aus diesem Grund sind in frühen Infektionsphasen die pathologischen Veränderungen zum Zeitpunk der Schlachtung noch nicht sichtbar. Bei M. hyopneumoniae-Infektionen sind auch spontane Regenerationen beobachtet worden (LIVINGSTON et al. 1972, FEENSTRA et al. 1994).

Nach ca. 60 Tagen kommt es bei unkomplizierten M. hyopneumoniae-Infektionen zur Regenerationen des Lungengewebes (WALLGREN et al. 1994, WALLGREN u.

SCHWAN 1994). In diesen Fällen können Lungenveränderungen schon abgeheilt sein, der Erreger oder Antikörper gegen den Erreger können aber noch detektiert werden (CALSAMIGLIA et al. 2000, CALSAMIGLIA et al 2001). Zusätzlich beschränken sich die Veränderungen nach Infektionen mit M. hyopneumoniae nicht allein auf Spitzenlappenpneumonien. Das variable pathomorphologische Bild der Lungenveränderungen bei M. hyopneumoniae-Infektionen und damit das Krankheitsgeschehen, wird beeinflusst von Umweltfaktoren, Management und Sekundärerregern (YAGIHASHI et al. 1993). Eine wesentliche Rolle spielt auch die Virulenz der M. hyopneumoniae Stämme. Die Variabilität der Feldisolate führt zu einem unterschiedlichen klinischen Bild und variablen makroskopischen und histopathologischen Veränderungen, die sich in unterschiedlichen Lungenläsionsgraden äußern (VICCA et al. 2002).

Die hier ermittelte Prävalenz innerhalb der 115 untersuchten Bronchialtupfer mittels nested-PCR nach STÄRK et al (1998) war 56 %. Allerdings ist diese Prävalenzschätzung vorsichtig zu beurteilen und hält einer Beurteilung nach statistischen Kautelen nicht stand, da nur eine geringe und unbekannte Zahl von Beständen beprobt

wurde und die Anzahl der Proben pro Bestand variabel war. Aus der Literatur liegen Schätzungen auf der Basis serologischer Tests vor, die zu einer Prävalenz von 85 % kommen (HORST et al. 1997). Da serologisch positive Reaktionen auch durch eine Impfung hervorgerufen werden können, sind seit der Einführung der M. hyopneumoniae-Vakzinen in Deutschland im Jahre 1994 Prävalenzschätzungen auf der Basis serologi-scher Befunde nicht mehr aussagekräftig. Die Impfung gegen M. hyopneumoniae gilt inzwischen als die am häufigsten angewandte Impfung beim Schwein.

Eine Unterscheidung zwischen durch Feldinfektionen oder durch Impfung induzierte Antikörpern ist serologisch bislang nicht möglich. Auf Grund dessen unterscheidet sich die mittels serologischen Verfahren ermittelte Prävalenz von der Prävalenzschätzung mittels direktem Erregernachweis. Bei der Untersuchung von Einzeltieren kann der Erregernachweis mittels PCR der serologischen Untersuchung sogar überlegen sein.

M. hyopneumoniae konnte bei umgeimpften Tieren in frühen Infektionsstadien aber auch bei subklinischen Erkrankungen detektiert werden.Hierzu werden die Antikörper noch nicht oder in nicht ausreichender Menge gebildet und würden dadurch bei der serologi-schen Untersuchung von Blut oder Kolostralmilch unterhalb der definierten Nachweis-grenze liegen (KURTH et al 2002). In Fällen mit nicht eindeutigem pathologischen Bild erwies sich die PCR in Vergleich zur Serologie und dem Immunfluoreszenztest als Methode mit der höchsten Sensitivität (VERDIN et al. 2000a, b, CALSAMIGLIA et al.

2001).