Zum kulturellen Nachweis von M. hyopneumoniae am lebenden Tier ist die tracheobronchiale oder bronchoalveoläre Lavage (BAL) geeignet (SCHULLER 1986). Es können auch Lungenstücke der Spitzenlappen von frischem Sektionsmaterial und Bronchus oder Bronchialabstriche verwendet werden. Der kulturelle Nachweis des
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Erregers ist mit vielen Schwierigkeiten verbunden. Wegen des langsamen Wachstums, das bis zu 30 Tage dauern kann, ist die Kultur zeitaufwendig (WHITTLESTONE 1979;
SIMECKA et al. 1992). Zusätzlich ist die Isolierung durch die sehr hohen
Nährstoffansprüche von M. hyopneumoniae erschwert (ROLLE u. MAYR 1993).
M. hyopneumoniae benötigt komplexe Nährmedien, die unter anderem Glukose als Energiequelle, Peptone und Tryptone als Aminosäuren, Hefeexstrakte (Wachstumfaktoren) und DNA zur Unterstützung des Wachstums benötigen (RAZIN 1981; FREUND 1983). Begleitende mikrobielle Flora in der untersuchten Probe, wie z. B:
M. hyorhinis, die geringere Ansprüche an das Nährmedium und die Kultivierungsbedingungen stellt, unterdrückt das Wachstum von M. hyopneumoniae und führt zu falsch negativen Ergebnissen (ARMSTRONG 1994). Um das zu verhindern, hat sich der Zusatz des Antibiotikums Cycloserin und Antiserum gegen M. hyorhinis zum Kulturmedium bewährt (GODWIN 1976, ARMSTRONG 1994). Eine andere Möglichkeit, um die Vermehrung von M. hyopneumoniae zu unterstützen, ist die mindestens fünfmalige Subkultivierung in wöchentlichen Abständen (GOIS et al. 1975).
M. hyopneumoniae muss bis zur Adaption des Erregers in Flüssigmedium subkultiviert werden. Ein spezielles Nährmedium, das als Indikator für die Ansäuerung des Mediums Phenolrot enthält, wurde von FRIIS (1975) beschrieben. Der Farbumschlag im Flüssigmedium weist auf das Wachstum von M. hyopneumoniae, oder aber auch auf andere, das Medium ansäuernde Bakterien hin und bestimmt den optimalen Zeitpunkt für eine Subkultivierung. Diese kann in Flüssigmedium oder auf Festmedium erfolgen.
Auf festem Medium können frühestens nach 7-9 Tagen erste Kolonien beobachtet werden (WHITTLESTONE 1985). Die zuverlässige Beurteilung sollte frühestens nach vierwöchiger Inkubation und nach zusätzlichen serologischen Tests, wie z. B dem Wachstumshemmtest, getroffen werden (ARMSTRONG 1994).
2.2.8.2 Immunfluoreszenztest
DEL GIUDICE et al. (1967) entwickelten den Immunfluoreszenztest zunächst zur schnellen Identifizierung von Mykoplasmenkolonien auf Agar. Dieser Test wurde später dann auch an andere Probenarten adaptiert (MEYLING 1971 SCHULLER et al. 1976).
Beim Immunfluoreszenztest werden spezifische Antikörper gegen M. hyopneumoniae an einen sekundären Antikörper gekoppelt, der wiederum mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) konjugiert ist. Durch eine UV-Anregung des Farbstoffes werden die spezifischen Antigen-Antikörperkomplexe sichtbar gemacht. Mit diesem Test kann der Erreger direkt in Gefrierschnitten aus Spitzenlappen der Lungen, zumeist am Rand der Bronchien oder Bronchiolen nachgewiesen werden (MEYLING 1971, BINDER et al. 1990). Die Sensitivität dieser Methode hängt von der Anzahl der Mykoplasmen und somit vom Infektionsstadium ab. Nach WHITTLESTONE (1990) liegt die Nachweisgrenze in einem Bereich von 104-105 Erreger/g Gewebe. Bei einer niedrigeren Erregerdichte in frühen,
chronischen oder latenten Stadien der Erkrankung ist der Nachweis von M. hyopneumoniae mit dieser Methode daher oft nicht möglich (ARMSTRONG 1996,
SØRENSEN 1996). Die Sensitivität kann auch durch die Ausbildung lokaler Antikörper verringert sein, da diese zu einem „blocking-effect“ führen (MAES 1996). In diesen Fällen kann als Methode der Wahl der kulturelle Nachweis durchgeführt werden, der auch zur Absicherung im akuten Stadium, in dem die Sensitivität des Immunfluoreszenztestes auf bis zu 96 % ansteigt, empfohlen wird (BINDER et al 1989).
2.2.8.3 PCR
Die PCR ist eine Methode, die sich durch eine hohe Sensitivität und Spezifität auszeichnet. Es handelt sich um eine enzymatische Vervielfältigung einer spezifischen DNA-Sequenz, die von zwei Oligonukleotiden (Primern) begrenzt ist. Die Methode wurde von MULLIS (1986) entwickelt.
Die zyklisch verlaufende Reaktion basiert auf drei Teilschritten, die mit unterschiedlichen Temperaturen durchgeführt werden. Im ersten Schritt wird die doppelsträngige DNA bei 94 ° C denaturiert und dadurch in Einzelstränge aufgetrennt. Die Anlagerung (Hybridisierung) der spezifischen Primer an die komplementären Sequenzen der
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Stränge erfolgt nach Temperatursenkung, die für jedes Primerpaar charakteristisch ist.
Die Oligonukleotidmoleküle dienen als Startpunkte für die DNA-Polymerase, die von ihnen ausgehend durch Einbau von Desoxyribonukleotidtriphosphaten (dNTPs) neue, komplementäre DNA-Stränge synthetisiert. Die Elongation durch die DNA-Polymerase läuft bei einer Temperatur von 72° C ab. Mehrfache Wiederholungen des Zyklus aus Denaturierung, Hybridisierung und Strangsynthese führen zu einer exponentiellen Vermehrung der spezifischen, beidseitig von den Oligonukleotiden flankierten DNA-Sequenz. Durch Verwendung einer hitzestabilen Polymerase aus dem thermophilen Bakterium Thermus aquaticus, die die Temperatur der DNA-Denaturierung übersteht, wurde das PCR-Verfahren vereinfacht (MULLIS et al. 1986, LINZ u. DEGENHARD 1990, GASSEN et al. 1994, WINK u. WEHLER 1994). Die Amplifikationsprodukte lassen sich nach Gelelektrophorese mittels Ethidiumbromidfärbung oder durch Färbung mit anderen Fluoreszenzfarbstoffen darstellen (WINK u. WEHLER 1994). Sie können aber auch durch Hybridisierung mit DNA-Sonden nachgewiesen werden (MAHBUBANI u. BEJ 1994).
Die PCR ist eine sehr sensible Technik, die von vielen Faktoren beeinflusst werden kann. Dazu gehören: die Zusammensetzung und Konzentration der Reaktionskomponenten, die verwendeten Temperaturen, Menge und Qualität der eingesetzten Ziel-DNA und die Sequenzen der ausgewählten Primer (NEWTON u.
GRAHAM 1994). Um einen möglichst sensitiven und spezifischen Nachweis zu ermöglichen, müssen alle Komponenten angepasst werden (WINK u. WEHLER 1994).
Die Auswahl der verwendeten Primer hat große Bedeutung für die Spezifität und Sensitivität der Reaktion. Beide sollen die gleiche Schmelztemperaturen besitzen, keine Sekundärstrukturen aufweisen und nicht komplementär zueinander sein (BEJ et al.
1991, NEWTON u. GRAHAM 1994). Die Bildung von Primer-Dimeren konnte durch die Hot-Start-Methode verhindert werden. Diese Methode minimiert die Bildung unspezifischer Primer-Komplexe, die bei niedrigen Temperaturen während der ersten Erhitzungsphase entstehen (BERCHTOLD u. HÜBSCHER 1996). Mg2+-Ionen beeinflussen die Enzymaktivität der DNA-Polymerase und die Anlagerung der Primer.
Daher sollte für jede PCR die optimale Konzentration ermittelt werden (GASSEN et al.
1994, WINK u. WEHLER 1994). Desoxyribonukleotidtriphosphate, die aus gleichen Teilen von Desoxycytidintriphosphat (dCTP), Desoxyadenosintriphosphat (dATP), Desoxythymidintriphosphat (dTTP) und Desoxyguanosintriphosphat (dGTP) bestehen, können bei zu hohen Konzentrationen zu „Mispriming“ und zu Schreibfehlern der Polymerase führen (NEWTON u. GRAHAM 1994).
In der medizinischen Diagnostik ist die PCR zum Nachweis zahlreicher Krankheitserreger eingesetzt worden (BEJ et al. 1991, MAHBUBANI u. BEJ 1994). Der Vorteil der PCR liegt in der Schnelligkeit, der hohen Sensitivität und Spezifität, die durch Anwendung der so genannten nested-PCR noch gesteigert werden konnte (GASSEN et al. 1994, WINK u. WEHLER 1994). Bei dieser Methode handelt es sich um die Hybridisierung von inneren Primern innerhalb des Abschnittes, der von den ersten äußeren Primerpaaren vorgegeben wird. In der ersten PCR-Runde entstandene Amplifikate dienen als Matrize der zweiten PCR. Unspezifische Produkte, die bei dem ersten PCR-Schritt entstehen, besitzen nicht mehr genügend komplementäre Sequenzen für das innere Primerpaar. Auf diese Weise zeigt die nested-PCR im Vergleich mit der oben beschriebenen one-step-PCR eine höhere Spezifität.
Andererseits ist die Steigerung der Empfindlichkeit mit einer erhöhten Anfälligkeit gegenüber Kontaminationen verbunden.
Falsch positive Signale erfolgen durch den unbeabsichtigten Transfer von Ziel-DNA (sog.
„cross over“-Kontaminationen) von Probe zu Probe oder von der Positivkontrolle auf die Probe, der auch durch aerogene Übertragung innerhalb des Labors möglich ist (PERSING 1993). Um dies zu verhindern müssen folgende Vorsichtsmaßnahmen in Betracht gezogen werden (PERSING u. CIMINO 1993, WINK u. WEHLER 1994, NEWTON u. GRAHAM 1994) :
1. Räumliche Trennung:
Probenaufbereitung, Vorbereitung der PCR (Pipettieren des Reaktionsansatzes), Probenzugabe mit Amplifikationsschritt und gelelektrophoretischer Analyse in jeweils isolierten Bereichen.
2. Benutzung von Sterilwerkbanken für die Pipettierschritte nach dreißigminütiger Bestrahlung mit UV-Licht.
3. Autoklavieren der verwendeten Lösungen.
4. Verwendung von Einmalhandschuhen bei jedem neuen Arbeitsschritt, Einwegmaterialien, gestopfte Pipettenspitzen
Ein weiteres Problem stellen die Inhibitoren dar, die die Amplifikationseffizienz beeinflussen und zu falsch negativen Resultaten führen. Verschiedene Bestandteile von Körperflüssigkeiten oder Bakterienzellen, die keine Ziel-DNA besitzen, Nahrungsmittelbestandteile, aber auch Laborgegenstände, wie z. B. Laborplastikwaren können inhibitorische Wirkungen zeigen. Verschiedene Stoffe, wie Phenole, Hämoglobin und deren Abbau-Produkte wurden als PCR-Hemmstoffe identifiziert (ROSSEN et al.
1992, WIEDBRAUK et al. 1995). Die Konzentration der Hemmstoffe kann im einfachsten
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Fall durch Verdünnung der untersuchenden Proben oder mit Hilfe von mehr oder weniger aufwendigen Reinigungsverfahren herabgesetzt werden (HIGUCHI 1989).
Von dem Einsatz der PCR in der Diagnostik von M. hyopneumoniae erhofft man sich im Vergleich zu anderen Methoden eine Verbesserung der Spezifität, Sensitivität und Schnelligkeit des Nachweises. Für PCR Verfahren zum Nachweis von M. hyopneumonie wurde Probenmaterial von lebenden Tieren, wie z. B. Lungenspülproben (BLANCHARD et al. 1996; BAUMEISTER et al. 1998; VERDIN et al. 2000b; PABST et al. 2004) oder Nasentupfer (MATTSSON et al. 1995; SØRENSEN 1997; CALSAMIGLIA et al. 1999) verwendet. Postmortal sind Bronchialtupfer (SØRENSEN et a. 1994, CARON 2000) oder Lungengewebe (CARON et al. 2000) geeignet. M. hyopneumoniae konnte mittels nested-PCR auch in Luftproben erfolgreich nachgewiesen werden (STÄRK et al. 1998).
In der Literatur beschriebene PCR´s basieren auf dem Nachweis verschiedener DNA-Sequenzen von M. hyopneumoniae. Die Spezifität hängt von den gattungsspezifischen Primerpaaren ab, mit deren Hilfe DNA-Abschnitte amplifiziert werden, die einzeln (ARTIUSHIN et al. 1993, BLANCHARD et al. 1996) oder in mehreren Kopien im M. hyopneumoniae-Genom vorkommen (HARASAWA et al. 1991; STÄRK et al. 1998).
Es wurden verschiedene PCR`s entwickelt, die auf den Nachweis eines Segments des 16S rRNA-Gens basieren (STEMKE et al. 1985; MATTSSON et al. 1995; CALSAMIGLIA et al. 1999). Von diesem DNA-Abschnitt konnten gleichzeitig mit Hilfe von zwei speziesspezifischen Primern und einem gattungsspezifischen Primer andere Mycoplasma sp. wie z. B. M. flocculare oder M. hyorhinis vermehrt werden (STEMKE et al. 1997). Die Sensitivität der PCR bestimmt die Menge von M. hyopneumoniae-Zellen, die mit den entsprechenden Primern detektiert werden können. MATTSSON et al. (1995) entwickelten ein Primerpaar, das ein 649 bp Fragment amplifiziert. Mit Hilfe dieser PCR konnten 5 KbE von M. hyopneumonaie bei 10 untersuchten Feldisolaten nachweisen werden.
Das von BAUMEISTER et al. (1998) beschriebene Primerpaar, das ein für M. hyopneumoniae spezifisches, 853 bp großes Fragment amplifiziert, wurde zum
Nachweis von M. hyopneumonaie in Lungenspülproben eingesetzt. eine Reaktion der Primer mit der DNA von 11 anderen Bakterienspezies, die im Atmungssystem der Schweine vorkommen können, wurden nicht beobachtet. Die Nachweisgrenze lag beim Typstamm J bei 10 fg M. hyopneumoniae DNA pro PCR-Ansatz.
Auf der Basis der oben beschriebenen Primerpaare wurde eine Studie mit experimentell infizierten Schweinen durchgeführt (SØRENSEN et al. 1994). Die Autoren verglichen die Ergebnisse der kulturellen Untersuchung von Lungengewebe mit den Ergebnissen der
PCR aus Bronchialtupfern. Die Spezifität der PCR betrug im Vergleich zum kulturellen Nachweis 100 %, die Sensitivität nahm von 93 % bis 100 % am 14. Tag p. i. auf 19-49 % am 85. Tag p. i. ab.
Durch Etablierung der nested-PCR-Verfahren konnten noch geringere Menge von M. hyopneumonie detektiert werden. Im frühen Infektionsstadium konnten die Erreger vor einer Serokonversion in der Tracheobronchialflüssigkeit von natürlich infizierten Schweinen nachgewiesen werden (VERDIN et al. 1996), bzw. vor dem Auftreten von entzündlichen Lungenveränderungen (CALSAMIGLIA et al. 2000). STÄRK et al. (1998) etablierten eine nested-PCR zum Nachweis von M. hyopneumoniae in Luftproben von Schweinebeständen mit Erkrankungen des Respirationstraktes. Sie entwickelten zwei Primerpaare basierend auf 1023 bp großen repetitiven MHYP1-03-950 Fragment im M. hyopneumoniae-Genom, wovon bis zu sieben Kopien bei verschiedenen Stämmen vorkommen. Innerhalb des 913 bp großen Fragments der ersten Reaktion wurde während des zweiten Schrittes ein internes 808 bp großer Fragment amplifiziert.
Mit der von CALSAMIGLIA et al. (1999) entwickelten nested-PCR konnten bis zu 80 M. hyopneumonaie-Zellen nachgewiesen werden. Die zwei speziesspezifischen Primer binden an dem 16S rRNA-Gen. Dabei wurden keine Kreuzreaktionen mit anderen Mykoplasmenarten oder mit anderen im Respirationstrakt vorkommenden Mikroorganismen beobachtet.
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Tab. 1: Sensitivität der in der Literatur beschriebenen PCR´s zum Nachweis von M. hyopneumoniae.
1)Die erste Ziffer gibt die Größe des Amplifikationsproduktes der ersten PCR an
2) Die zweite Ziffer gibt die Größe des Amplifikationsproduktes der zweiten PCR an
AUTOR Zielsequenz
Verdin et al. (2000a/b) Unbekannte Sequenz