und Außenstelle für Epidemiologie
Untersuchungen zum Vorkommen
von Mycoplasma hyopneumoniae – Infektionen bei Ferkeln im Alter von 3 bis 6 Wochen
INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
Vorgelegt von Lars Moorkamp
(Oldenburg)
Hannover 2007
1. Gutachterinnen: Prof. Dr. Marion Hewicker-Trautwein PD Dr. Elisabeth große Beilage 2. Gutachterin: Prof. Dr. Martina Hoedemaker
Tag der mündlichen Prüfung: 14.11. 2007
Die Arbeit wurde gefördert von: Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG... 11
2 LITERATUR ... 13
2.1 Ätiologie ... 13
2.1.1 Mykoplasmen und porzine Mykoplasmen ... 13
2.1.2 M. hyopneumoniae... 14
2.1.2.1 Immunogene und Virulenz-assoziierte Regionen von M. hyopneumoniae... 15
2.1.2.2 Stämme von M. hyopneumoniae... 17
2.2 Pathogenese ... 19
2.2.1 Adhärenz und Ziliostase... 19
2.2.2 Oberflächenantigenvariation und Immunmodulation ... 20
2.3 Epidemiologie ... 23
2.3.1 Nachweis von M. hyopneumoniae bei Schweinen verschiedener Altersgruppen... 23
2.3.2 Zeitpunkt der Infektion und Ausbreitung von M. hyopneumoniae innerhalb von Herden ... 25
2.3.3 Verbreitung von M. hyopneumoniae zwischen Herden ... 28
2.4 Klinische Symptomatik ... 29
2.5 Immunität... 30
2.5.1 Das immunologische System der Lunge ... 30
2.5.2 Reaktionen des BALT bei M. hyopneumoniae-Infektionen... 32
2.6 Pathologie ... 33
2.6.1 Pathologisch-anatomische Veränderungen in der Lunge... 33
2.6.2 Histologische Veränderungen in der Lunge ... 33
2.7 Diagnose... 35
2.7.1 Direkter Erregernachweis... 35
2.7.1.1 Erregernachweis mittels Kultur... 35
2.7.1.2 Antigen-Nachweis mittels Immunfluoreszenztest ... 36
2.7.1.3 Antigen-Nachweis mittels Immunhistochemie ... 37
2.7.1.4 DNA-Nachweis mittels in situ Hybridisierung ... 38
2.7.1.5 DNA-Nachweis mittels PCR ... 39
2.7.2 Indirekter Erregernachweis ... 40
2.8 Bekämpfung ... 43
2.8.1 Kontrolle ... 43
2.8.1.1 Prophylaxe durch Impfung ... 43
2.8.1.2 Behandlung mit Antibiotika... 45
2.8.2 Erregereradikation... 47
3 MATERIAL UND METHODEN... 48
3.1 Auswahl von Beständen ... 49
3.1.1 Vorauswahl von Beständen (Auswahlstufe 1) ... 49
3.1.2 Voruntersuchung (Auswahlstufe 2) ... 50
3.1.2.1 Erhebungen von Bestandsdaten ... 50
3.1.2.2 Bronchoalveoläre Lavage ... 50
3.1.2.3 Kulturelle Untersuchung der Lavageflüssigkeit ... 51
3.1.2.4 Untersuchung der Lavageflüssigkeit auf Genomfragmente von M. hyopneumoniae... 52
3.1.3 Auswahl von Tieren für die histologischen und immunhistochemischen Untersuchungen (Auswahlstufe 3) ... 56
3.1.3.1 Pathologisch-anatomische Untersuchung der Lungen... 57
3.1.3.2 Postmortale Lavage und Untersuchung der Lavageflüssigkeit auf Genomfragmente von M. hyopneumoniae mittels PCR ... 57
3.1.3.3 Probenentnahme für die histologischen und immunhistochemischen Untersuchungen... 58
3.2 Histologische Untersuchungen ... 59
3.2.1 Probenaufbereitung für die Lichtmikroskopie und Immunhistochemie ... 59
3.2.2 Färbung der Paraffinschnitte mit Hämalaun-Eosin (HE-Färbung) ... 59
3.2.3 Auswertung und Dokumentation ... 59
3.3 Etablierung der Immunhistochemie für M. hyopneumoniae ... 60
3.4 Immunhistochemische Untersuchungen... 62
3.4.1 Antikörper... 62
3.4.2 Durchführung der Immunhistochemie zum Nachweis von M. hyopneumoniae... 62
3.4.3 Spezifitätskontrollen ... 64
3.4.3.1 Warthin-Starry-Färbung ... 65
3.4.4 Auswertung und Dokumentation ... 65
3.5 Statistische Auswertung ... 66
4 ERGEBNISSE ... 67
4.1 Auswahlverfahren... 67
4.2 Untersuchungen in Herden der Auswahlstufe 2 ... 68
4.2.1 Hygiene-, Haltungs- und Managementbedingungen ... 68
4.2.2 Vorkommen von Husten in Abhängigkeit vom Alter der Tiere ... 77
4.2.3 Nachweis von M. hyopneumoniae mittels PCR in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit... 78
4.2.4 Kulturelle Untersuchung der bronchoalveolären Lavageproben... 79
4.3 Tiere aus der Auswahlstufe 3 ... 81
4.3.1 Nachweis von M. hyopneumoniae mittels nPCR... 81
4.3.2 Immunhistochemische Befunde an Lungengewebeproben der für die Etablierung verwendeten Kontrolltiere... 83
4.3.3 Makroskopische, histologische und immunhistochemische Befunde der Lungen und Lungengewebeproben der Tiere aus Auswahlstufe 3 ... 84
4.3.3.1 Bestand A; Tiere 1 bis 12... 84
4.3.3.2 Bestand B; Tiere 13 bis 24... 85
4.3.4.3 Bestand C; Tiere 25 bis 36... 89
4.3.3.4 Bestand D; Tiere 37 bis 48... 92
4.3.3.5 Bestand E; Tiere 49 bis 60... 98
4.3.3.6 Bestand F; Tiere 61 bis 72 ... 101
4.3.3.7 Bestand G; Tiere 73 bis 84 ... 103
4.3.3.8 Bestand H; Tiere 85 bis 96... 107
4.3.4 Lokalisation und Ausdehnung der Reaktionsprodukte bei den immunhistochemisch positiven Ferkeln... 109
4.3.5 Korrelation zwischen den pathologisch-anatomischen und histomorphologischen Lungenveränderungen und dem Nachweis von M. hyopneumoniae in Lavageflüssigkeit... 117
4.3.6 Vergleich der direkten Erregernachweise mittels nPCR und IHC in Abhängigkeit vom Histopathologie Score... 120
4.4.4 Spezifitätskontrollen ... 123
4.4.4.1 Warthin-Starry-Färbung ... 123
5 DISKUSSION ... 124
5.1 Auswahlverfahren... 125
5.2 Nachweishäufigkeit von M. hyopneumoniae-Infektionen mittels nPCR 126 5.3 Bedeutung von M. hyopneumoniae-Infektionen bei Ferkeln bis zur 6. Lebenwoche (Auswahlstufe 3)... 127
5.4 Eignung der Immunhistochemie als Alternative oder Ergänzung zu den bisher angewandten diagnostischen Testverfahren ... 129
5.5 Korrelation des Nachweises von M. hyopneumoniae mittels nPCR in BALF mit dem Vorkommen typischer pathologisch-anatomischer und pathohistologischer Lungenveränderungen ... 131
5.6 Einfluss der Probenentnahmelokalisation auf die Nachweishäufigkeit von M. hyopneumoniae ... 132
5.7 Nachweishäufigkeiten bakterieller Erreger in bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit mittels Kultur (Auswahlstufe 2) ... 133
5.8 Einfluss von Hygiene-, Haltungs- und Managementbedingungen auf
die Infektion von Ferkeln mit M. hyopneumoniae bis zur
6. Lebenswoche ... 133
5.9 Schlussfolgerungen ... 138
6 ZUSAMMENFASSUNG ... 140
7 SUMMARY... 143
8 LITERATURVERZEICHNIS ... 146
Abkürzungsverzeichnis
A. Actinobacillus
ABC Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex AFLP amplified fragment-length polymorphism
AK Antikörper
APP Actinobacillus pleuropneumoniae
B. Bordetella
BB Bordetella bronchiseptica BAL bronchoalveoläre Lavage
BALF bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit BSA bovine serumalbumin (Rinderserumalbumin)
BALT bronchus associated lymphoid tissue (Bronchus-assoziiertes lymphatisches Gewebe)
CAR Bacillus cilia-associated respiratory bacillus (Zilien-assoziierte respiratorische Bazillen)
CNA Colistin und Nalidixinsäure
DAB 3,3`-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid DNA desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) EDTA Ethylendiamintetraacetat
ELISA enzyme-linked immuno sorbent assay
HE Hämalaun-Eosin
HEV high endothelial venules (postkapilläre Venulen)
H. Haemophilus
HP Haemophilus parasuis
HSP Hitzeschockprotein
IFT Immunfluoreszenztest
Ig Immunglobulin
IHA indirekter Hämagglutinationstest
IHC Immunhistochemie
IL Interleukin
INF Interferon
ISH in situ Hybridisierung
JS Jungsau
k. A. keine Angabe
kbp Kilobasenpaare
KBR Komplementbindungsreaktion
kDa Kilodalton
KGW Körpergewicht
KI Konfidenzintervall Lob. acc. Lobus accessorius
M. Mycoplasma
mAk monoklonaler Antikörper MH Mycoplasma hyopneumoniae
MHK Minimale-Hemmstoff-Konzentration
OD optische Dichte
OR Odds Ratio
P. Pasteurella
PBS phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Salzlösung) PCR polymerase chain reaction (Polymerasekettenreaktion) PCR-REA PCR-Restriktionsenzym Analyse
PCV-2 Porzines Circovirus Typ 2 p. i. post infectionem
PFGE Pulsfeldgelelektrophorese PM Pasteurella multocida
pMGA putative adhesion molecules of M. gallisepticum PRDC Porcine Respiratory Disease Complex
PRRS-Virus porcine reproductive and respiratory syndrome virus RNA ribonucleic acid (Ribonukleinsäure)
rRNA ribosomale RNA
RAPD random amplified polymorphic DNA
Sc. Streptococcus
SC Streptococcus suis
SDS-PAGE sodium dodecyl sulphate - polyacrylamid gel electrophoresis (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese)
SPF Spezifiziert Pathogen frei spp. Species (Plural)
TAE Tris-Acetat-EDTA-Puffer
TH T-Helferzelle
vlp variables Lipoprotein
vsp variable surface protein (variables Oberflächenprotein) VNTR variable number of tandem repeat
1 Einleitung
Die kausale Bedeutung von M. hyopneumoniae für die Entstehung der Enzootischen Pneumonie und die Beteiligung am porcine respiratory disease complex (PRDC) ist vielfach beschrieben (DONE 2002; KWON et al. 2002).
Die Infektion mit M. hyopneumoniae und die daraus resultierenden bzw. assoziierten Erkrankungen sind grundsätzlich in jedem Alter möglich (PIFFER u. ROSS 1984;
KOBISCH et al. 1993; THACKER 2006), die Häufigkeit von Infektionen bei Saug- und Absetzferkeln wird aber kontrovers diskutiert. Die genauere Charakterisierung von M. hyopneumoniae-Infektionen bei Ferkeln ist im Hinblick auf die Festlegung geeigneter Impfzeitpunkte von besonderem Interesse, da die Notwendigkeit von Impfungen in der ersten oder zweiten Lebenswoche mit der angeblich häufigen Ausbreitung der Infektion während der Säugezeit oder kurz nach dem Absetzen begründet wird.
Für die Diagnostik der M. hyopneumoniae-Infektion werden neben der sensitiven, aber wenig spezifischen Pathologie und Histopathologie (BUDDLE u. O`HARA 2005) hauptsächlich serologische Tests zum Nachweis von Antikörpern sowie PCR- Verfahren zum Nachweis von spezifischen Genomfragmenten durchgeführt. Die Interpretation serologischer Befunde ist bei Ferkeln mit erheblichen Unsicherheiten behaftet, da die Reaktion auf die Infektion mit M. hyopneumoniae weder von einer Reaktion auf eine Impfung noch von maternalen Antikörpern zu differenzieren ist. Die Interpretation des Nachweises von Genomfragmenten mittels PCR erweist sich ebenfalls als schwierig, da der Erregernachweis besonders bei geimpften Schweinen nicht zwangsläufig mit einer Erkrankung einhergehen muss.
Immunhistochemische Verfahren ermöglichen den direkten Nachweis von M.
hyopneumoniae im Zusammenhang mit der Beurteilung histologischer Veränderungen in demselben Präparat. Dieses Vorgehen erlaubt eine Differenzierung zwischen Besiedlungen ohne pathologische Veränderungen und Infektionen, die mit typischen pathohistologischen Veränderungen einhergehen.
Die vorliegende Arbeit verfolgt das Ziel, M. hyopneumoniae-Infektionen bei Ferkeln bis zur 6. Lebenswoche durch pathologisch-anatomische, histologische,
molekularbiologische und immunhistochemische Untersuchungen zu charakterisieren. Dabei wird besonders die Eignung der immunhistochemischen Untersuchung als Alternative oder Ergänzung zu den bisher angewandten diagnostischen Testverfahren geprüft. Darüber hinaus soll anhand des Erregernachweises mittels PCR in bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit geprüft werden, ob und in welchem Umfang der Erregernachweis mit dem Vorkommen typischer pathologisch-anatomischer und -histologischer Veränderungen korreliert.
Da unter Praxisbedingungen die Entnahme von bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit häufiger als Alternative zu Sektionen durchgeführt wird, ist es von Bedeutung, den Grad der Korrelation zwischen dem Erregernachweis aus Lavageflüssigkeit und dem Vorkommen von Läsionen zu kennen.
Im Zusammenhang mit der Auswahl geeigneter Ferkel, bei denen eine Infektion mit M. hyopneumoniae zu erwarten war, wurden Untersuchungen an 500 Ferkeln aus insgesamt 50 Schweineherden durchgeführt. Dabei wurden auch verschiedene Parameter zur Charakterisierung von Management, Hygiene und Haltung erfasst und anschließend einer statistischen Auswertung zur Identifizierung von Risikofaktoren unterzogen.
2 Literatur
2.1 Ätiologie
2.1.1 Mykoplasmen und porzine Mykoplasmen
Mykoplasmen sind mit einem Durchmesser von 0,3 bis 0,8 μm die kleinsten, sich selbständig vermehrenden Bakterien und unterscheiden sich von anderen Bakterien durch das Fehlen einer Zellwand (RAZIN 1992). Daraus resultiert eine pleomorphe, meist kokkoide bis ovoide Gestalt und eine natürliche Resistenz gegen β-Laktam- Antibiotika. Das Fehlen der Zellwand wird taxonomisch genutzt, so dass die Gattung Mycoplasma aus der Familie der Mycoplasmataceae und der Ordnung der Mycoplasmatales der Klasse Mollicutes (Lat.: mollis: weich, cutis: Haut) zugeordnet wurde (RAZIN et al. 1998). Phylogenetisch lässt sich der Ursprung der Mykoplasmen auf grampositive Bakterien zurückführen (TULLY et al. 1993).
Die geringe Genomgröße (580 – 1350 kbp) der Mykoplasmen hat eine niedrige Anzahl von Genen zu Folge. Zudem führt der extrem niedrige Guanin- und Cytosin- Gehalt des Genoms zu einer Limitierung der vorhandenen genetischen Information.
Daraus resultieren eine sehr reduzierte Enzymausstattung und eingeschränkte Stoffwechsel- und Biosynthesewege der Mykoplasmen (GARNIER et al. 2001).
Trotzdem sind sie in der Natur bei Menschen, Säugetieren, Reptilien, Fischen, Arthropoden und Pflanzen weit verbreitet. Ermöglicht wird dieses durch eine obligat parasitäre oder saprophytäre Lebensweise bei ausgeprägter Wirts- und Gewebsspezifität. Dadurch bedingt sich eine erschwerte Anzüchtung der Mykoplasmen aufgrund hoher Nährbodenansprüche (RAZIN 1992).
Das primäre Habitat für die mehr als 120 Mykoplasmen-Arten bei Wirbeltieren sind die Schleimhautoberflächen des Respirations-, Urogenital- und Gastro-Intestinal- Traktes und der Gelenke (TULLY 1996). Von den bekannten Mykoplasmen-Arten sind nur wenige als kausal-pathogene Krankheitserreger bei Mensch und Tier identifiziert worden, da deren Pathogenitätsmechanismen in der Regel nur unzureichend bekannt sind (ROSENGARTEN et al. 2001). Für das Schwein werden
neben apathogenen Kommensalen einige Mykoplasmen als pathogen eingestuft (Tab. 1).
Tab. 1: beim Schwein vorkommende Mykoplasmen-Arten und -Erkrankungen Mykoplasmen-Art Erkrankung Mycoplasma hyopneumoniae Enzootische Pneumonie
Mycoplasma hyorhinis Polyarthritis und –serositis Mycoplasma hyosynoviae Polyarthritis
Mycoplasma suis Eperythrozoonose Mycoplasma flocculare
Mycoplasma hyopharyngis Mycoplasma sualvi
Acholeplasma granularum (Ordnung: Acholeplasmatales)
apathogen
Der Vergleich der rRNA-Gen-Sequenzen, die zu den stabilsten genetischen Elementen gehören, hat eine enge Verwandtschaft von M. hyopneumoniae, M.
flocculare und M. hyorhinis gezeigt (STEMKE et al. 1994). Dabei weisen M.
hyopneumoniae und die apathogenen M. flocculare eine Homologie der 16S rRNA- Sequenzen von 95,6 % auf (STEMKE et al. 1992).
Der Genomvergleich zwischen diesen Arten und innerhalb der verschieden virulenten M. hyopneumoniae-Stämme bildet die Basis zur Identifizierung Virulenz- assoziierter Regionen (MINION et al. 2004; VASCONCELOS et al. 2005)
2.1.2 M. hyopneumoniae
M. hyopneumoniae gilt als der Primärerreger der weltweit verbreiteten Enzootischen Pneumonie. Eine Infektion und eine daraus resultierende Erkrankung sind
grundsätzlich in jedem Alter möglich (PIFFER u. ROSS 1984; KOBISCH et al. 1993;
ROSS 1999). Die Erkrankung ist durch Chronizität mit hoher Morbidität und geringer Mortalität gekennzeichnet (MAES et al. 1996). Zudem wird M. hyopneumoniae als eine Komponente des Porcine Respiratory Disease Complex (PRDC) angesehen (DONE 2002).
Infektionsversuche haben gezeigt, dass Monoinfektionen bei SPF-Tieren zu subklinischen oder leichten Symptomen bei meist trockenem Husten führen (KOBISCH et al. 1993; ROSS 1999). Unter Praxisbedingungen können durch eine Begünstigung von bakteriellen Sekundärinfektionen wie z.B. mit Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Streptococcus suis, Haemophilus parasuis und Actinobacillus pleuropneumoniae (DONE 1997) schwere Erkrankungsformen auftreten.
Klinik-erschwerende Interaktionen von M. hyopneumoniae mit viralen Erregern wie dem Porzinen Reproduktiven und Respiratorischen Syndrom-Virus (THACKER et al.
1999), dem Influenza-A-Virus (THACKER et al. 2001a) und dem Porzinen Circovirus Typ 2 (OPRIESSNIG et al. 2004) sind beschrieben.
2.1.2.1 Immunogene und Virulenz-assoziierte Regionen von M.
hyopneumoniae
Proteine auf der Zelloberfläche der Mykoplasmen sind aufgrund des Fehlens einer Zellwand für die Lebenserhaltung und Kolonisation im Wirt verantwortlich. Diese auf der Oberfläche präsentierten Proteine gehören zu den ersten Zielen in der Immunantwort des Wirtes (SCHMIDT et al. 2004).
Die Identifizierung und Charakterisierung dieser Spezies-spezifischen, immunogenen Proteine von M. hyopneumoniae ist notwendig in der Erforschung der Pathogenitätsmechanismen und in der Entwicklung von Diagnostika und Impfstoffen (MEENS et al. 2006). Sie bilden aber auch die Grundlage für den Einsatz phäno- und genotypischer Methoden in epidemiologischen Studien zur Entdeckung und
Erforschung neuer Stämme und zur Darstellung von Infektionsverläufen (STAKENBORG et al. 2005).
Für die exklusive Adhäsion an die Zilien des respiratorischen Epithels (MEBUS u.
UNDERDAHL 1977) als Voraussetzung für die Infektion sind als Adhäsionsmoleküle die Proteine P97 (HSU u. MINION 1998; MINION et al. 2000), P110 (CHEN et al.
1998), P146 und P159 (BURNETT et al. 2006) beschrieben. Das Adhäsin P97 enthält zwei repetitive Elemente (engl.: variable numbers of tandem repeats: VNTRs) (HSU et al. 1997) mit dem Namen RR1 und RR2. Das P97 RR1 ist als Zilien- bindendes Epitop identifiziert worden (HSU u. MINION 1998), und die Anzahl der Kopien variiert von 9 im nicht-adhärenten J-Stamm bis 15 im pathogenen Stamm- 232 (WILTON et al. 1998). Für die Variation in der Anzahl der Kopien des P97 RR1 wird eine unterschiedliche Größe von 95 bis 97 kDa des P97 in verschiedenen M.
hyopneumoniae-Stämmen verantwortlich gemacht. Eine Mindestanzahl von 8 Kopien wird als notwendig für eine Bindung an die Zilien angesehen. Allerdings reichen diese 8 Kopien des RR1 in vivo alleine nicht aus, um eine Bindung zu vermitteln, da z. B. der nicht-adhärente J-Stamm über 9 Kopien des P97 RR1 verfügt (HSU u.
MINION 1998; MINION et al. 2000; MINION 2002). Daher wird ein multifaktorieller Prozeß unter Beteiligung weiterer Moleküle wie Heparin oder sulfatierten Polysacchariden und weiterer Mechanismen für die Adhäsion am Wirtsepithel angenommen (JENKINS et al. 2006).
Eines der ersten beschriebenen Proteine der Zellmembran ist ein 54 kDA Protein (GEARY u. WALCZAK 1985), das in vitro nach Adhäsion an die Zilien einen zytopathischen Effekt zeigt (ROSS u. YOUNG 1993) und als Virulenzfaktor gilt.
Das Oberflächenprotein P65 (KIM et al. 1990) ist als lipolytisches Enzym identifiziert worden (SCHMIDT et al. 2004). Verwendung findet es in der serologischen Diagnostik von M. hyopneumoniae-Infektionen.
Ein weiteres immunogenes, allerdings zytosolisches Protein (P36) wurde als Laktat- Dehydrogenase erkannt (HALDIMANN et al. 1993). Dieses Protein induziert eine frühe Immunantwort bei Schweinen nach Feld- und experimenteller Infektion und zeigt eine sehr ähnliche Sequenz in verschiedenen M. hyopneumoniae-Stämmen und keine Kreuzreaktion mit anderen porcinen Mykoplasmen (STRASSER et al.
1991). SCHERM et al. (2002) bestätigten das Hitzeschockprotein Hsp60 als immunogenes Protein in Feldinfektionen. Dieses Protein wird bei mehreren Mykoplasmen-Arten inklusive M. hyopneumoniae nachgewiesen. YANG et al. (2005) halten außer dem P97 Proteine von 23, 30 und 56 kDa für immunogen.
Eine Reihe weiterer Spezies-spezifischer Proteine z.B. mit einer relativen Molekülmasse von 41, 50 und 64 kDa (YOUNG u. ROSS 1987), von 46, 60, 75, 86 und 145 kDa (ROSS u. YOUNG 1993), von 76, 78, 80 - 82, 94, 106, 114 und 200 kDa (DJORDJEVIC et al. 1996; SCARMAN et al. 1997) und ein heat shock protein 70, ein elongation factor TU und eine pyruvate dehydrogenase E1-beta subunit (PINTO et al. 2006) sind beschrieben. Allerdings unterscheiden sich die einzelnen Molekulargewichte in den verschiedenen Untersuchungen (ASSUNÇÃO et al. 2005), und es besteht bei den meisten Unklarheit über den diagnostischen und immunologischen Nutzen dieser Antigene.
2.1.2.2 Stämme von M. hyopneumoniae
Eine Vielzahl an genotypischen Methoden wie Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE), PCR-Restriktionsenzym Analyse (PCR-REA), Amplified Fragment-Length Polymorphism (AFLP), Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) und Sequenzvergleiche haben deutliche Unterschiede in der DNA verschiedener M.
hyopneumoniae-Stämme offenbart (FREY et al. 1992; ARTIUSHIN u. MINION 1996;
KOKOTOVIC et al. 1999; VASCONCELOS et al. 2005; STAKENBORG et al. 2005, 2006)
Ob die genomische Variabilität einen Einfluss auf die synthetisierten Proteine und somit auf die phänotypische Ausprägung der Antigene hat, wurde mittels SDS-PAGE und im Western Blot untersucht. Studien mit Antikörpern gegen das P97 Adhäsin (ZHANG et al. 1995), gegen die P36 Laktat-Dehydrogenase (ASSUNÇÃO et al.
2005), das P82, das P65 Oberflächenlipoprotein, das P70 (WISE u. KIM 1987) und gegen ein 43 kDa großes Membranprotein (SCARMAN et al. 1997) demonstrierten eine deutliche antigenetische Variabilität der untersuchten M. hyopneumoniae-
Stämme. Diese ist bereits von RO und ROSS (1983) beschrieben worden. Allerdings haben SCARMAN et al. (1997) und ASSUNÇÃO et al. (2005) mittels SDS-PAGE sehr homogene Protein-Muster bei verschiedenen M. hyopneumoniae-Feldisolaten finden können. CALUS et al. (2006) vermuten als Ursache eine geringere Sensitivität der verwendeten Färbe-Protokolle in den beiden zuletzt angeführten Studien und fanden eine hohe Heterogenität von Proteinen von bis zu 30 % zwischen verschiedenen M. hyopneumoniae-Stämmen.
LIN (2001) fand Größenunterschiede und Variationen im Protein- und im Glykoprotein-Profil in PCR-Produkten des VNTR`s RR1 des Adhäsins P97 von M.
hyopneumoniae. Der Autor folgert daraus eine zunehmende antigenetische Variabilität und vermutet in der Variabilität dieser immunogenen Oberflächenproteine eine Ursache in der unbeständigen Effektivität von Impfungen gegen M.
hyopneumoniae.
STAKENBORG et al. (2005) unterstützen diese Vermutung und beschreiben, dass einzelne Isolate von M. hyopneumoniae aus derselben Herde deutlich homologere PFGE-Muster aufweisen als Isolate aus verschiedenen Herden.
VICCA et al. (2003) vermuten zudem als Ursache einer unterschiedlich starken Ausprägung von klinischen Symptomen bei M. hyopneumoniae-Infektionen eine unterschiedliche Virulenz zirkulierender Feldstämme.
2.2 Pathogenese
M. hyopneumoniae bedingte Infektionen von Schleimhäuten des Respirationstraktes beginnen initial grundsätzlich mit der Adhäsion an die Zilien (ROSS u. YOUNG 1993).
Im Gegensatz zu anderen Mykoplasmen-Arten zeigen porzine Mykoplasmen-Arten keine gleitende Beweglichkeit. Aufgrund dieser fehlenden Motilität gelangen sie nur passiv an ihren Zielort.
Die klinischen Erscheinungen einer M. hyopneumoniae-Infektion werden dabei mehr durch Immun- und Entzündungsreaktionen des Wirtes als durch toxische Wirkungen von Komponenten der Zellmembran geprägt (RAZIN et al. 1998).
2.2.1 Adhärenz und Ziliostase
Die spezifische Bindung an das äußerste Ende der Zilien des Tracheal-, Bronchial- und Bronchiolarepithels als initialer Prozeß der Kolonisierung des respiratorischen Epithels wird als Tipstruktur bezeichnet. M. hyopneumoniae penetriert weder in das Lungenparenchym, noch ist eine Zellinvasion beschrieben (BLANCHARD et al. 1992;
KWON u. CHAE 1999). M. hyopneumoniae bindet spezifisch an Rezeptoren der Zilien des respiratorischen Epithels (ZHANG et al. 1994 a, b; PARK et al. 2002). Im Gegensatz zu anderen Mykoplasmen ist M. hyopneumoniae nur in der Lage, an diesen einen Zelltyp zu binden (MEBUS u. UNDERDAHL 1977; MINION 2002).
Diese spezifische Bindung wurde durch zahlreiche Untersuchungen in vivo und in vitro bestätigt (LIVINGSTON et al. 1972; MEBUS u. UNDERDAHL 1977; ZIELINSKI et al. 1990; ZIELINSKI u. ROSS 1990; DEBEY et al. 1992; BLANCHARD et al. 1992;
ZIELINSKI u. ROSS 1993; ZHANG et al. 1994 a; DEBEY u. ROSS 1994; YOUNG et al. 2000). Die Beteiligung sehr feiner Fibrillen und einer Polysaccharid-Kapsel sind beschrieben (TAJIMA u. YAGIHASHI 1982; BLANCHARD et al. 1992; SARRADELL et al. 2003).
Als Adhärenzmoleküle von M. hyopneumoniae sind an diesem Prozess, soweit bekannt, das Adhäsin P97 (RR1) und die Proteine P110, P146 und P159 beteiligt.
Ein Verlust der Bindungsfähigkeit, wie in vitro bei einer hohen Anzahl von Zellkulturpassagen beobachtet (ZIELINSKI u. ROSS 1990; CHEN et al. 1992;
DEBEY u. ROSS 1994; ZHANG et al. 1995), führt zu einem völligen Verlust der Infektiosität.
Nach der Bindung an die Zilien kommt es zur Ziliostase und über eine Verklumpung der Zilien letztendlich zur Deziliation. Folge ist ein Verlust der mukoziliären Clearance (DEBEY u. ROSS 1994). M. hyopneumoniae interferiert mit Membranrezeptoren oder verändert Transportmechanismen der Wirtszelle. Durch eine Unterbrechung des K+-Kanals des Zilien-tragenden Bronchialepithels kommt es zur Ziliostase (DEBEY u. ROSS 1994). Die Erhöhung des verfügbaren, intrazellulären Ca2+- Gehaltes der Zilien-tragenden Epithelzellen durch die Bindung von M.
hyopneumoniae wird als Signal für die Zelle zum Verlust der Zilien angesehen (DEBEY et al. 1993; PARK et al. 2002). HWANG et al. (2006) konnten unter Verwendung polyklonaler Antikörper gegen M. hyopneumoniae zur Unterdrückung der Adhäsion an die Zilien den intrazellulären Ca2+-Anstieg nicht verhindern und vermuten daher, dass nicht die Bindung von M. hyopneumoniae an die Zilien, sondern ein noch unbekannter Faktor diesen Anstieg induziert. Einen weiteren zytopathischen Effekt erreicht M. hyopneumoniae über eigene toxische Metabolite wie H2O2 und Superoxid Radikale. Einen ebenfalls zytopathischen Effekt in vitro zeigte ein membranständiges Protein mit einer relativen Molekülmasse von 54 kDa (ROSS u. YOUNG 1993).
2.2.2 Oberflächenantigenvariation und Immunmodulation
Antigenvariation bedeutet im Falle von M. hyopneumoniae die Möglichkeit, den antigenen Charakter seiner Oberflächenkomponenten zu verändern, um die Kolonisation des Wirtsgewebes zu erleichtern und einer Phagozytose zu entkommen (DRAMSI et al. 1993; RAINEY et al. 1993). Diese Oberflächenorganellen sind die
Hauptziele in der Antikörperantwort des Wirtes, und die konsequente und schnelle Veränderung der oberflächlichen antigenen Struktur behindert die adaptive Immunantwort (RAZIN et al. 1998).
Trotz der sehr limitierten genetischen Information der Mykoplasmen ist die Anzahl der an der Antigenvariation beteiligten Gene unerwartet hoch. Diese vielfach variablen Gene sind in so genannten Genfamilien organisiert. Ein hochfrequenter Wechsel in der Expression einer Antigenkomponente („on- “ und „off-switch“) führt in Verbindung mit der Fähigkeit der beteiligten Gene, unterschiedliche Größen des jeweiligen Produktes hervorzubringen, zu einem großen antigenetischen Potential.
Diese Genfamilien sind für M. hyorhinis (vlp-System), M. gallisepticum (pMGA- System) und M. bovis (vsp-System) beschrieben (ROSENGARTEN u. WISE 1990, 1991; YOGEV et al. 1991, 1994; ROSENGARTEN et al. 1993; WISE 1993;
BEHRENS et al. 1994; GARCIA et al. 1994; CITTI et al. 1997; CITTI u.
ROSENGARTEN 1997).
Als Antigene fungieren meist Lipoproteine, deren Gene VNTR´s enthalten. Für M.
hyopneumoniae sind VNTR´s für 12 Proteine beschrieben, darunter 4 bekannte Adhäsine wie z.B. das P97 (HSU u. MINION 1998; DJORDJEVIC et al. 2004;
MINION et al. 2004) und 7 Membran- oder mutmaßliche Membranproteine (VASCONCELOS et al. 2005). CASTRO et al. (2006) bestätigten die Vermutung von MINION et al. (2004), dass diese VNTR´s für die strukturelle, physikochemische und antigenetische Variation in den korrespondierenden Proteinen mitverantwortlich sind.
Für M. hyopneumoniae ist der vollständige Mechanismus, wie das Immunsystem des Wirtes umgangen wird und es zu einer chronischen Infektion kommt, nicht bekannt (THACKER 2001). Aber die Immunreaktionen des Wirtes spielen bei der Entstehung und Ausbreitung von Läsionen bei einer Mykoplasmen-Infektion eine Rolle (RAZIN et al. 1998).
Nach der Kolonisierung des respiratorischen Epithels stimuliert M. hyopneumoniae wahrscheinlich über antigene Oberflächenproteine (CHAMBAUD et al. 1999) die Produktion von pro-inflammatorischen Zytokinen wie dem Interleukin (IL) -1 α und β, IL-2, IL-4,IL-6, IL-8, IL-10, IL-18 und dem Tumor-Nekrose-Faktor α (ASAI et al. 1993;
RODRÍGUEZ et al. 2004; THANAWONGNUWECH et al. 2004; CHOI et al. 2006;
LORENZO et al. 2006; MEYNS et al. 2006; MUNETA et al. 2006). RODRÍGUEZ et al. (2007) beschreiben zudem einen immunmodulierenden Effekt von IL-12 und Interferon-γ. Diese Zytokine stammen vor allem von aktivierten (Alveolar-) Makrophagen und Monozyten und führen über eine nicht-spezifische, mitogene Aktivität auf Lymphozyten zu einer lokalen Entzündung. Besonders das IL-2 und das IL-4 üben diese Wirkung auf T-Lymphozyten aus. Eine induzierte Depletion der T- Lymphozyten verringert die Ausprägung von Lungenläsionen nach Infektion mit M.
hyopneumoniae (TAJIMA et al. 1984). Daher könnte eine lokale Überproduktion der Zytokine in der Lunge die direkten Auswirkungen von M. hyopneumoniae verschärfen und zu einer wirtsvermittelten Gewebeschädigung führen (CHOI et al.
2006). Nach Untersuchungen von SARRADELL et al. (2003) sind CD4-T-Zellen die am häufigsten nachweisbare T-Zell-Subpopulation im Bronchus-assoziierten lymphatischen Gewebe (engl.: bronchus-assocciated lymphoid tissue: BALT).
Innerhalb der T-Zell-Population kommt es bei einer Infektion mit M. hyopneumoniae zu einer Verschiebung der TH1-Zell-dominierten Immunantwort, die die Makrophagen zu Phagozytose und Eliminierung der Mykoplasmen stimulieren würde, zu einer TH2- Zell-dominierten Immunantwort, die diese Infektion weniger effektiv kontrolliert und beseitigt (THACKER 2001; YANG et al. 2005).
JENKINS et al. (2006) vermuten, dass die Fähigkeit von M. hyopneumoniae an Heparin zu binden, über die damit verbundene Möglichkeit, mit wirtseigenen Molekülen wie Fibronektinen, Vitronektinen, Zytokinen und Entzündungsmediatoren zu interagieren (DUENSING et al. 1999), zur Modulation der Immunantwort des Wirtes beiträgt.
Die Modulation der Immunantwort durch M. hyopneumoniae wird in Verbindung mit deren Antigenvariation als Ursache für die lange Persistenz im Wirt angenommen.
So konnte M. hyopneumoniae noch nach 185 Tagen p. i. in der Schweinelunge nachgewiesen werden (FANO et al. 2004).
2.3 Epidemiologie
2.3.1 Nachweis von M. hyopneumoniae bei Schweinen verschiedener Altersgruppen
M. hyopneumoniae ist in Regionen mit intensiver Schweineproduktion weltweit endemisch verbreitet (THACKER 2006). Die Herden-Prävalenz wird für Deutschland mit 0,75 (GANTER 1999), Belgien mit 0,88 für Mast- und 0,76 für Zuchtschweine (MAES et al. 2000), Schweden mit 0,70 (WALLGREN et al. 1993 a), Japan mit 0,79 (YAGIHASHI et al. 1993) und die USA mit 0,54 (ERLANDSON et al. 2002 a) angegeben.
Die Infektion mit M. hyopneumoniae kann grundsätzlich bei Schweinen jeden Alters vorkommen (HOLMGREN 1974), was aber keine Einschätzung des Infektionsrisikos für die verschiedenen Altersgruppen erlaubt (PIFFER u. ROSS 1984).
Die Möglichkeit Saug- und Absetzferkel mit M. hyopneumoniae zu infizieren wurde mehrfach anhand von Infektionsversuchen festgestellt (BASKERVILLE 1972;
UNDERDAHL et al. 1980; STRASSER et al. 1992; KOBISCH et al. 1993; KWON et al. 2002). Eine altersabhängige Empfänglichkeit konnte bei vergleichenden Untersuchungen an immunologisch naiven Tieren im Alter von 3 bis 12 Wochen nicht festgestellt werden (PIFFER u. ROSS 1984).
Serologische Verlaufsuntersuchungen in verschiedenen Herden lassen aber darauf schließen, dass sich M. hyopneumoniae-Infektionen vielfach erst bei älteren Schweinen ab der 10. bis 12. Lebenswoche ausbreiten. Der häufige Nachweis von Serokonversionen bei Schweinen im Alter von 18 bis 22 (24) Wochen gibt ebenfalls Hinweise auf die Ausbreitung von M. hyopneumoniae während der Mastphase (GROSSE BEILAGE 1999; ANDREASEN et al. 2000; BOSCH 2000; OHLINGER et al. 2000; LEON et al. 2001; VICCA 2002).
Die Häufigkeit von M. hyopneumoniae-Infektionen bei Saug- und Absetzferkeln ist dagegen bislang kaum systematisch untersucht (Tab. 2). In der Mehrzahl der Studien ist nur eine Herde (CALSAMIGLIA u. PIJOAN 2000; RUIZ et al. 2002 b, RUIZ u.
PIJOAN 2002; RUIZ et al. 2003; FANO et al. 2006, SIBILIA et al. 2007 a) und in zwei
Studien sind 10 resp. 12 Herden (VICCA et al. 2002; SIBILIA et al. 2004 a) untersucht worden. In eine Untersuchung aus Bayern gingen 294 Tiere verschiedener Altersgruppen aus insgesamt 54 Herden ein (PALZER et al. 2005);
dabei ist aber nicht nachvollziehbar, aus wie vielen Herden die 64 Saugferkel stammten. Die Untersuchungen zum Nachweis von M. hyopneumoniae bei Saug- und Absetzferkeln wurden mittels nested PCR resp. multiplex PCR durchgeführt, die sich hinsichtlich der Primer und der analytischen Sensitivität unterscheiden. Mit den genannten Untersuchungen wurde jeweils nur die Infektion mit M. hyopneumoniae festgestellt. Eine Differenzierung von Infektionen mit resp. ohne typische pathomorphologische Veränderungen wurde bei der Mehrzahl dieser Untersuchungen nicht durchgeführt.
Tab. 2: Nachweis (PCR) von M. hyopneumoniae bei Saug- und Absetzferkeln Autor
Her- den (n)
Tiere (n)
Land PCR
Tieralter;
M. hyopneumoniae Nachweis (%) SIBILIA et al.
(2007 a)
1 507 Spanien nested
(CALSAMIGLIA et al. 1999)
1. LW: 1,5%
3. LW: 3,8%
FANO et al.
(2006)
1 429 USA (Minnesota)
nested
(CALSAMIGLIA et al. 1999)
3. LW: 25%
PALZER et al.
(2005)
k.A. 144 Deutschland (Bayern)
Multiplex
(HARDER u.
HUEBERT 2004)
1. - 4. LW: 31%
5. - 10. LW: 5%
SIBILIA et al.
(2004 a)
12 704 Spanien nested
(CALSAMIGLIA et al. 1999)
1.-5. LW: 0-63%
6.-10. LW: 0-45%
Tab. 2: (Fortsetzung) Autor
Her- den
(n)
Tiere (n)
Land PCR
Tieralter;
M. hyopneumoniae Nachweis (%) RUIZ et al.
(2003)
1 152 (144)
USA
(Minnesota)
nested
(CALSAMIGLIA et al. 1999)
3. LW: 2,6/13,2%
(3. LW: 1,4/5,5%) RUIZ u.
PIJOAN (2002)
1 72 (72)
USA
(Minnesota)
nested
(CALSAMIGLIA et al. 1999)
3. LW:<15(<15)%
4.-10. LW: 65%
(55)%
RUIZ et al.
(2002 b)
1 72 (3x)
USA
(Minnesota)
nested
(CALSAMIGLIA et al. 1999)
4.-10. LW: je ≤10%
VICCA et al.
(2002)
10 200 Belgien nested
(STÄRK et al.
1992)
6. LW: 0 bzw. 16%
CALSAMIGLIA u. PIJOAN (2000)
1 125 (130)
USA
(Minnesota)
nested
(CALSAMIGLIA et al. 1999)
3. LW: 9,6 (7,7)%
2.3.2 Zeitpunkt der Infektion und Ausbreitung von M. hyopneumoniae innerhalb von Herden
Das Schwein ist der einzige bekannte Wirt für M. hyopneumoniae, so dass Infektionen grundsätzlich auch nur von dieser Tierart ausgehen können (WHITTLESTONE 1976; PFÜTZNER 1993). M. hyopneumoniae wird mit Sekreten des Respirationstraktes ausgeschieden und innerhalb von Herden primär durch direkten Tierkontakt oder kontaminierte Aerosole übertragen (STEVENSON 1998).
Das Risiko einer Serokonversion ist bei direktem Kontakt um den Faktor 7 gegenüber der Erregerübertragung durch indirekten Kontakt erhöht (MORRIS et al.
1995). Grundsätzlich wird M. hyopneumoniae vertikal von der Sau auf die Ferkel, horizontal zwischen den Schweinen einer Bucht oder eines Stalles oder von älteren Schweinen auf jüngere Tiere übertragen. Der letztgenannte Übertragungsweg ist ein besonderes Risiko bei kontinuierlicher Aufstallung (MORRISON et al. 1985).
Ein erhöhtes Risiko für eine vertikale Erregerübertragung (BOSCH 2000;
CALSAMIGLIA u. PIJOAN 2000; FANO et al. 2006; ROSS 1999; RUIZ et al. 2003;
THACKER 2006) soll besonders von Jungsauen und jüngeren Sauen ausgehen, die M. hyopneumoniae häufiger als Altsauen ausscheiden (MAES et al. 1996; FANO et al. 2006). CALSAMIGLIA und PIJOAN (2000) und SIBILA et al. (2006) konnten eine deutlich reduzierte Erregerausscheidung bei älteren Sauen anhand der Untersuchung von Nasentupfern aber nicht bestätigen.
Die horizontale Infektion während der Aufzuchtphase soll nach gegenwärtigen Vorstellungen wenige vertikal infizierte Ferkel als Ausgangspunkt haben (ROSS 1999). VICCA et al. (2002) zeigten Nachweishäufigkeiten von M. hyopneumoniae in Nasentupfern in der 6. bzw. 9. Lebenswoche in Herden mit guten Haltungs- und Managementbedingungen von 16 bzw. 24 % und in Herden mit schlechten Haltungs- und Managementbedingungen von 0 bzw. 12 %. MARTELLI et al. (2006) konnten eine zirkulierende Infektion zwischen Aufzuchtferkeln bei einem all-in/all-out System nicht bestätigen. Ergebnisse von RUIZ und PIJOAN (2002) deuten eine dynamische Ausscheidung von M. hyopneumoniae und unbeständige Infektionsmuster in off-site- Produktionssystemen an. MEYNS et al. (2004) haben die Ausbreitung von M.
hyopneumoniae-Infektionen unter experimentellen Bedingungen während der Aufzuchtphase untersucht und festgestellt, dass ein infiziertes Ferkel während der Aufzuchtsphase im Durchschnitt ein weiteres Ferkel derselben Bucht infiziert.
Bei kontinuierlicher Belegung in der Mast sind offensichtlich die jüngeren Tiere einem erhöhten Infektionsrisiko ausgesetzt (SHELDRAKE et al. 1990; CLARK et al. 1992, LEON et al. 2001), wie aus dem kontinuierlichen Anstieg der Antikörperkonzentrationen im Verlauf der Mast in chronisch infizierten Herden abzuleiten ist. Der langsame Anstieg der Antikörperkonzentrationen lässt auf eine eher langsame Erregerübertragung schließen (MAES et al. 1998; WALLGREN et al.
1998; MAES et al. 1999; MATEUSEN et al. 2002). Die zumindest bei einem Teil der Tiere über mehrere Wochen andauernde Erregerausscheidung (RUIZ u. PIJOAN 2002) unterhält dabei die Infektionskette. Der Einfluss von Umwelt- und Management-Faktoren auf den Infektionszeitpunkt und -verlauf wird kontrovers diskutiert (MAES et al. 2000; VICCA et al. 2002). Die konsequente Umsetzung des Rein-Raus-Verfahrens verlangsamt die Erregerübertragung (MAES et al. 2000;
STÄRK 2000; MARTELLI et al. 2006). CALSAMIGLIA et al. (2002) und SIBILA et al.
(2004 a) konnten mittels nPCR aus Nasentupfern tendenziell feststellen, dass die Infektion mit M. hyopneumoniae bei „one-“ und „two-site“ Produktionssystemen früher erfolgt als bei vollständiger örtlicher Trennung aller Produktionsbereiche („three-site“). Zudem konnte gezeigt werden, dass der Prozentsatz infizierter Tiere bei „one-“ und „two-site“ Produktionssystemen mit dem Alter der Tiere ansteigt. Bei Untersuchungen in „three-site“ Produktionssystemen fiel auf, dass die Nachweishäufigkeiten von M. hyopneumoniae mittels nPCR in Nasentupfern im Verlauf der Aufzucht sank und in der Mast wieder sprunghaft zunahm. Eine mögliche Ursache für diese Beobachtung wurde nicht angegeben.
Der Einfluss einer Vergrößerung der Herde (THOMSEN et al. 1992) und der Aufstallungsdichte, die Verminderung des Luftvolumens pro Tier, sowie Mängel des Lüftungs- und Fütterungssystems begünstigen die Erregerausbreitung (HURNIK et al. 1994; STÄRK 2000). Ein vermehrtes Risiko einer Erregerübertragung durch erhöhte Ammoniakkonzentrationen wird mit einer Herabsetzung der Zilien-Aktivität erklärt (DONHAM 1991). Als weitere Einflussfaktoren werden genetische Effekte diskutiert (RUIZ et al. 2002 a). Ein Einfluss schwach- und hochvirulenter Stämme von M. hyopneumoniae (VICCA et al. 2003) auf die Ausbreitung der Infektion zwischen experimentell infizierten Tieren und M. hyopneumoniae-freien Tieren derselben Bucht konnte wegen der geringen Anzahl experimentell infizierter Tiere bislang nicht quantifiziert werden (MEYNS et al. 2004). Hochvirulente Stämme von M.
hyopneumoniae zeigten aber in vivo ein höheres Vermehrungspotential, ein schnelleres Wachstum und induzierten einen schwerwiegenderen Entzündungsprozess als schwach-virulente Stämme (MEYNS et al. 2007).
2.3.3 Verbreitung von M. hyopneumoniae zwischen Herden
Die Erregerübertragung zwischen Herden erfolgt hauptsächlich mit dem Handel/Transport infizierter, klinisch unauffälliger Schweine (MAES et al. 2000;
THACKER 2006). Das höchste Risiko für den Erregereintrag haben Mastbestände, die eine hohe Anzahl an Schweinen zukaufen (MAES et al. 1996; STÄRK 2000).
Die Übertragung von M. hyopneumoniae mit der Luft ist möglich (STÄRK et al. 1998;
FANO et al. 2003; CARDONA et al. 2003); die Entfernung wird auf maximal 3,2 km geschätzt (GOODWIN 1985). Das Infektionsrisiko ist zudem mit der regionalen Schweinedichte und der Distanz zu benachbarten Schweinehaltungen assoziiert (ZUANG et al. 2002). Ein Einfluss der Jahreszeit konnte anhand der Häufung von Infektionen bei geringen Temperaturen und hoher Luftfeuchte ebenfalls festgestellt werden (JORSAL u. THOMSEN 1988; MAES et al. 1998).
Die Übertragung von M. hyopneumoniae durch Personenverkehr ist unter der Beachtung von Standard-Hygieneprotokollen weitgehend ausgeschlossen (BATISTA et al. 2002).
2.4 Klinische Symptomatik
Die Enzootische Pneumonie ist eine in der Regel chronische Erkrankung des unteren Respirationstraktes und durch eine hohe Morbidität und geringe Mortalität gekennzeichnet (MAES et al. 1996; THACKER 2006). Schweine sind grundsätzlich in jedem Alter empfänglich für eine Infektion mit M. hyopneumoniae (PIFFER u.
ROSS 1984; KOBISCH et al. 1993). M. hyopneumoniae-bedingte Erkrankungen treten bis zur 6. Lebenswoche üblicherweise nicht auf (JERICHO 1986; ROSS 1999).
Die Prävalenz der Erkrankung ist zwischen der 6. Lebenswoche und dem 3.
Lebensmonat gering und erreicht den Höhepunkt erst zum Ende der Mastperiode (DONE 1997).
Typisch für eine M. hyopneumoniae-Monoinfektion ist ein chronischer, nicht- produktiver Husten (ROSS 1999), der mehrere Wochen andauert und mit reduziertem Zuwachs und verminderter Futterverwertung einhergeht (DESROSIERS 2001; MAES et al. 1996). Die Inkubationszeit kann unter Feldbedingungen mit 14 Tagen bis hin zu mehreren Wochen sehr variabel sein (FANO et al. 2004).
Subklinische und milde Verlaufsformen können vorkommen. Die Dauer der Inkubationszeit wird wahrscheinlich von der infektiösen Dosis (STEVENSON 1998) und der Virulenz (MEYNS et al. 2007) beeinflusst.
Im Falle von Koinfektionen mit P. multocida, B. bronchiseptica, Sc. suis, H. parasuis oder A. pleuropneumoniae (DONE 1997) und/oder dem PRRSV (THACKER et al.
1999; THANAWONGNUWECH et al. 2004), dem Influenza-A-Virus (THACKER et al.
2001a) oder dem PCV-2 (OPRIESSNIG et al. 2004) können schwerwiegende, teils tödlich verlaufende Erkrankungen auftreten (KOBISCH 2000; DORR et al. 2007). In diesem Zusammenhang kann M. hyopneumoniae als eine der Hauptkomponenten des PRDC angesehen werden (DONE 2002).
2.5 Immunität
Eine Infektion mit M. hyopneumoniae induziert eine langsame Serokonversion und nur geringe Antikörperkonzentrationen im Respirationstrakt, so dass die Immunantwort als ineffektiv bewertet wird (DJORDJEVIC et al. 1997; THACKER et al. 1998, 2000).
Die Bildung von Antikörpern gegen M. hyopneumoniae ist eng mit dem Auftreten von Husten korreliert (MORRIS et al. 1995; GROSSE BEILAGE 1999; LEON et al. 2001;
GROSSE BEILAGE et al. 2005). Im Gegensatz dazu konnte bei einer Untersuchung von CALSAMIGLIA et al. (2002) keine Beziehung zwischen Husten, dem direkten Erregernachweis mittels nPCR in Nasentupfern und einer Serokonversion festgestellt werden.
Die Bedeutung der systemischen humoralen Immunantwort auf die Infektion mit M.
hyopneumoniae wird allerdings kontrovers diskutiert. Im Gegensatz zu LAM und SWITZER (1971) sowie SUTER et al. (1985) postulieren DJORDEJEVIC et al. (1997) und THACKER et al. (2000), dass die Anwesenheit von Antikörpern im Serum nicht mit einem Schutz korreliert ist. Aufgrund der Besiedlung der Oberfläche des respiratorischen Epithels vermuten SHELDRAKE et al. (1993) und SARRADELL et al. (2003), dass der Schutz vor allem auf einer zellvermittelten Immunantwort und der lokalen Sekretion von IgA-Antikörpern basiert. Der protektive Effekt von maternalen Antikörpern bei Saugferkeln im Sinne einer passiven Immunität ist allerdings vielfach beschrieben (WALLGREN et al. 1998; RAUTIAINEN u. WALLGREN 2001; RUIZ et al. 2003).
2.5.1 Das immunologische System der Lunge
Die Lunge spielt als nicht-lymphatisches Organ eine große Rolle in der Immunabwehr (BINNS 1992). Die Schweinelunge enthält eine große Zahl von T- und B-Lymphozyten in den fünf Kompartimenten Gefäßsystem, Interalveolarsepten,
BALT, Bronchialepithel und dem Bronchial- und Alveolarlumen (PABST u. BINNS 1994). Von den B-Zellen wird vorwiegend IgA synthetisiert (BIENENSTOCK 1984).
Im Gegensatz zu anderen Tierarten enthält die Schweinelunge intravaskulär mehr Lymphozyten als z.B. die Leber oder die Nieren (BINNS u. PABST 1988).
Lymphozyten und Lymphoblasten aus der Lunge zeigen eine Präferenz, immer in die Lunge zurückzukehren (BINNS 1992).
Eine Schlüsselrolle in der Erregerabwehr nehmen die Aveolarmakrophagen ein (STOCKHOFE-ZURWIEDEN 2002). Im Gegensatz zur Aktivität von Monozyten und Makrophagen in anderen Organen sind die Alveolarmakrophagen an der Regulation der Immunreaktion vorherrschend beteiligt (BASTA et al. 2000).
Der Begriff BALT bezeichnet eine follikelartige Akkumulation von Lymphozyten, die im Allgemeinen zwischen einem Bronchus bzw. einem Bronchiolus und einem Gefäß liegt (BIENENSTOCK 1984). Es wird angenommen, dass BALT wie beim Menschen in gesunden Lungen nicht vorhanden ist (JERICHO 1970; PABST u. GEHRKE 1990;
PABST u. BINNS 1994; TSCHERNIG u. PABST 2000), obwohl es in fetalen Schweinelungen nachweisbar sein kann (SMINIA et al. 1989).
Eine Ausbildung von BALT ist für die Tierarten Schwein, Rind, Ratte und Kaninchen schon 4 bis 14 Tage nach der Geburt in Form erster lymphatischer Aggregationen in der bronchialen Submukosa unterhalb der glatten Muskulatur beobachtet worden (GREGSON et al. 1979; SMINIA et al. 1989; PABST u. BINNS 1994; HEWICKER- TRAUTWEIN u. THOMASMEYER 2006). Für das Schwein wird eine antigenabhängige Weiterentwicklung des BALT´s angenommen. Im Gegensatz zu den genannten Tierarten ist das BALT des Schweines allerdings wesentlich geringer ausgeprägt.
Das BALT zeigt beim Schwein eine hohe morphologische und zelluläre Organisation.
Im follikulären Bereich sind vor allem Makrophagen und B-Lymphozyten enthalten;
gleiches gilt für ein evtl. Keimzentrum (TSCHERNIG u. PABST 2000; SARADELL et al. 2003). T-Lymphozyten sind am häufigsten im parafollikulären Bereich zu finden, dabei dominieren CD4-T-Zellen über CD8-T-Zellen. Ebenfalls im parafollikulären Bereich sind postkapilläre Venolen (engl.: high-endothelial-venules: HEV) zu finden.
Aus diesen immigrieren Lymphozyten in das BALT. Efferente Lymphgefäße erlauben
ein Auswandern von Lymphozyten. Der Bereich zwischen dem BALT und dem Epithel wird als „Dome area“ bezeichnet. Das respiratorische Epithel im Bereich der
„Dome area“ kann dabei sowohl unverändert (GREGSON et al. 1979), deziliiert und/oder kuboidal bis abgeflacht sein (SUDA et al. 1999).
Eine Zunahme von IgG- oder IgA- sezernierenden Plasmazellen in der Peripherie des BALT, in der Lamina propria der Bronchien und Bronchiolen, in den Interalveolarsepten und im Bereich der bronchialen Becherzellen ist im Falle einer M.
hyopneumoniae-Infektion zu beobachten (SARRADELL et al. 2003).
2.5.2 Reaktionen des BALT bei M. hyopneumoniae-Infektionen
Sowohl nach experimentellen als auch nach Feldinfektionen mit M. hyopneumoniae kommt es im Laufe des Krankheitsgeschehens zu einer teilweise massiven lymphatischen Hyperplasie des BALT (LIVINGSTON et al. 1972; MAES et al. 1996;
TAYLOR 1996; KWON et al. 2002; SARRADELL et al. 2003). Aber auch bei bakteriellen Infektionen anderer Genese ist eine Hyperplasie des BALT zu beobachten (DELVENTHAL et al. 1992).
Die Zytokin-Expression von IL-1, IL-2, IL-4, IL-6 und dem Tumor-Nekrose-Faktor-α ist im BALT von M. hyopneumoniae-infizierten Lungen höher als bei Kontrollguppen (RODRĺGUEZ et al. 2004). Das lässt die Vermutung zu, dass diese Zytokine eine wichtige Rolle bei der Hyperplasie des BALT einnehmen. Diese Zytokine könnten aber auch an der Entwicklung einer adäquaten humoralen und zellulären Immunantwort durch die Aktivierung von Makrophagen und Lymphozyten beteiligt sein (RODRĺGUEZ et al. 2004).
Welcher Mechanismus letztendlich zu der massiven BALT-Hyperplasie führt, ist noch weitgehend unklar. Vermutet wird, dass die Persistenz des Erregers als evtl.
Konsequenz der Antigenvariation und Immunmodulation hierzu beiträgt (MAES et al.
1996; THACKER 2001; THANAWONGNUWECH et al. 2001).
2.6 Pathologie
2.6.1 Pathologisch-anatomische Veränderungen in der Lunge
M. hyopneumoniae verursacht eine typische Bronchopneumonie in den cranio- ventralen Lungenbereichen. Betroffen sind vor allem die Spitzen- und der Mittellappen, der Lobus accessorius und die cranio-ventralen Bereiche der Hauptlappen (TAYLOR 1996). Dabei weisen die linken Spitzen- und die beiden Hauptlappen weniger häufig makroskopisch sichtbare Läsionen auf (LIVINGSTON et al. 1972; MAES et al. 1996).
Das Parenchym der betroffenen Lungenbereiche ist verdichtet und scharf von den nicht betroffenen Arealen demarkiert (THACKER et al. 1999). In der akuten Phase zeigen die Läsionen eine rot-violette Färbung, und die Oberfläche ist über unveränderte Bereiche erhaben. Chronische Veränderungen neigen zu einer gräulichen Färbung und einer eingesunkenen Oberfläche. Die Ausbildung einer Peribronchitis nodosa kann in einigen Fällen beobachtet werden. In den Bronchien und Bronchiolen kann ein muköses bis mukopurulentes Exsudat enthalten sein (TAYLOR 1996; THACKER et al. 1999). Bei einer experimentellen Infektion von Absetzferkeln beobachtete BASKERVILLE (1972) hochgradige Hyperplasien der bronchialen und mediastinalen Lymphknoten 13 Tage p. i.
Sekundärinfektionen führen zu einer größeren Ausdehnung der Lungenläsionen (DONE 1997).
Eine Abheilung der Lungenläsionen ist ca. 8 bis 12 Wochen p. i. möglich (FEENSTRA et al. 1994; SØRENSEN et al. 1997; IRIGOYEN et al. 1998; FANO et al. 2004).
2.6.2 Histologische Veränderungen in der Lunge
Die histologischen Veränderungen bei einer M. hyopneumoniae-Infektion konzentrieren sich auf die Bronchien und Bronchiolen. Erste histologische
Veränderungen sind eine Hyperplasie des respiratorischen Epithels und eine Infiltration der Lamina propria und submukosa mit Lymphozyten und Makrophagen.
Die interalveolären Septen sind häufig mit mononukleären Zellen infiltriert. Im weiteren Verlauf kommt es zu einer mukopurulenten Exsudation in das Lumen von Bronchien und Bronchiolen. Die angrenzenden Alveolen können als Folge der Obstruktion eine Atelektase aufweisen oder ebenfalls ein geringgradiges Exsudat aus Alveolarmakrophagen und neutrophilen Granulozyten enthalten (BASKERVILLE 1972; KWON u. CHAE 1999; TAYLOR 1996).
Im Folgenden kommt es zur Ausbildung von Peribronchitiden, Peribronchiolitiden und Perivaskulitiden. Typisch für eine M. hyopneumoniae-Infektion ist die massive Hyperplasie des BALT in Form einer follikelartigen Aggregation von Lymphozyten, meist zwischen einem Bronchus oder Bronchiolus und einem arteriellem Gefäß (BLANCHARD et. al. 1992; DUNGWORTH 1993; MAES et al. 1996). KWON et al.
(2002) beschreiben bei experimentell infizierten Schweinen eine ausgeprägte „cuff- Bildung“ um Bronchien, Bronchiolen und Blutgefäßen mit der Ausbildung von Keimzentren.
Eine Hyperplasie der Typ-II-Pneumozyten wird meist in chronischen Infektionsstadien beobachtet (TAYLOR 1996).
In elektronenmikroskopischen Untersuchungen wurde eine Zerstörung bis zum vollständigen Verlust der Zilien 2 bis 6 Wochen p. i. nachgewiesen (BASKERVILLE 1972; BLANCHARD et al. 1992). Dabei war M. hyopneumoniae in vivo und in vitro nur in unmittelbarer Nähe zum zilientragenden, respiratorischen Epithel nachweisbar (UNDERDAHL et al. 1980; TAJIMA u. YAGIHASHI 1982; DEBEY u. ROSS 1994).
2.7 Diagnose
THACKER (2001) bezeichnet die Diagnose von M. hyopneumoniae als „Quelle der Frustration“. Erschwert wird die Diagnose durch die unbekannten oder kontrovers diskutierten Zusammenhänge zwischen der Anwesenheit von M. hyopneumoniae, einem positiven Antikörper-Titer und der klinischen Erkrankung wie Husten, Pneumonie und verringerten Tageszunahmen (LEON et al. 2001; CALSAMIGLIA et al. 2002; FANO et al. 2004).
Die Diagnose von M. hyopneumoniae wurde häufig bei „Schlachtchecks“ anhand katarrhalisch-eitriger Bronchopneumonien der Spitzenlappen gestellt (DESROSIERS 2001). Hierzu sind mehrere Bewertungsmethoden mittels Lungenscore vorgeschlagen (HANNAN et al. 1982; MADEC u. KOBISCH 1982; MORRISON et al.
1985; STRAW et al. 1986; LIUM u. FALK 1991; HURNIK et al. 1993). Allerdings lassen die pathologisch-anatomischen Befunde keine ätiologische Diagnose zu (MAES et al. 2000), da viele andere Erreger gleichartige Läsionen hervorrufen.
Lediglich histologisch kann bei Vorliegen der typischen BALT-Hyperplasie die Verdachtsdiagnose M. hyopneumoniae gestellt werden (BASKERVILLE 1972).
Die eindeutige Diagnose durch M. hyopneumoniae verursachter Erkrankungen ist nur bei typischen histologischen Veränderungen und einem direkten Erregernachweis oder mittels gepaarter Serumproben möglich, da die verfügbaren Impfstoffe keine sterile Immunität erzeugen.
2.7.1 Direkter Erregernachweis
2.7.1.1 Erregernachweis mittels Kultur
Der kulturelle Nachweis wird als Gold-Standard in der Diagnostik von M.
hyopneumoniae-Infektionen angesehen (ROSS 1999; DESROSIERS 2001).
Allerdings stellen Mykoplasmen hohe Ansprüche an das Nährmedium und zeigen ein extrem langsames Wachstum, das Wochen bis Monate bis zum Auftreten sichtbarer
Kolonien in Anspruch nehmen kann (ROSS u. WHITTLESTONE 1983; THACKER 2001). Falsch-negative Ergebnisse aus Überwucherungen des Nährmediums durch schneller wachsende Mykoplasmen-Arten wie M. hyorhinis und M. flocculare sind häufig (MAES et al. 1996). Daher ist die Kultur nicht für die Routinediagnostik, sondern eher für Stammcharakterisierungen geeignet.
2.7.1.2 Antigen-Nachweis mittels Immunfluoreszenztest
Die Diagnostik von M. hyopneumoniae-Infektionen mittels Immunfluoreszenztest (IFT) erfolgt an Gefrierschnitten von direkt post mortem schockgefrorenen Lungen.
Gefrierschnitte sind methodisch bedingt dicker als Paraffinschnitte und weisen durch das Schockgefrieren Strukturveränderungen auf, wodurch die histologische Auswertung der Schnitte erschwert wird.
Die Detektion des M. hyopneumoniae-spezifischen Antigens mittels eines Fluoreszenzfarbstoffes und eines UV-Mikroskops erfolgt über poly- oder monoklonale Antikörper (L’ECUYER u. BOULANGER 1970; MEYLING 1971;
HOLMGREN 1974; CARON et al. 2000 a; CHEIKH SAAD BOUH et al. 2003; VICCA et al. 2003). Durch die Strukturveränderungen können bei Verwendung von polyklonalen Antikörpern unspezifische Bindungen an andere eng verwandte Mykoplasmen wie M. hyorhinis und M. flocculare auftreten (CHEIKH SAAD BOUH et al. 2003).
Für ein positives IFT-Signal sind ca. 104 bis 105 Mykoplasmen / g Lungengewebe notwendig (WHITTLESTONE 1990). Daher lassen nur akut infizierte Schweine, die hohe Erregermengen in der Lunge aufweisen, ein positives IFT-Signal erwarten.
VICCA et al. (2003) beobachteten eine höhere Immunfluoreszenz bei Schweinen, die mit hoch virulenten Stämmen von M. hyopneumoniae inokuliert wurden. Die Autoren vermuten daher, dass diese hoch virulenten Stämme eine bessere Bindungsfähigkeit an die Zilien oder eine höhere Vermehrungsrate haben könnten.
Aufgrund der insgesamt geringen Sensitivität und der sehr eingeschränkten histologischen Auswertbarkeit ist der IFT nur bedingt für die Routinediagnostik geeignet.
2.7.1.3 Antigen-Nachweis mittels Immunhistochemie
Unter Immunhistochemie versteht man verschiedene Immunperoxidase- Färbemethoden von meist Formalin-fixierten und in Paraffin-eingebetteten Organproben. Die Immunperoxidase-Technik hat gegenüber dem Immunfluoreszenztest vier entscheidende Vorteile. Der Schnitt kann wiederholt betrachtet werden, da ein permanentes Färbeprodukt entsteht. Da zur Auswertung ein Lichtmikroskop ausreicht, können die Lage des Antigens im Vergleich zu den einzelnen Zellen des Gewebes, die beteiligten Zelltypen und die histologischen Veränderungen zusammen beurteilt werden. Auch einzelne Erreger können dargestellt werden, und im Vergleich zum Immunfluoreszenztest treten weniger unspezifische Färbungen auf (HILL 1978; HALBUR 1997; CHEIKH SAAD BOUH et al. 2003).
Grundprinzip der verschiedenen Immunperoxidase-Färbemethoden ist wie bei dem Immunfluoreszenztest, dass im Zuge einer Antikörper-Antigen-Reaktion Markersubstanzen an das Antigen gebunden werden. Eine dieser Färbemethoden, die sog. Avidin-Biotin-Methode, basiert auf der Fähigkeit des Eiweißglykoproteins Avidin, 4 Moleküle des Vitamins Biotin zu binden. Als erstes bindet ein spezifischer Antikörper an das gesuchte Antigen. Ein zugefügter Zweit-Antikörper, der gegen den Erst-Antikörper gerichtet ist, ist mit Biotin konjugiert. Als drittes Reagenz wird ein Peroxidase-konjugierter Avidin-Biotin-Komplex hinzu gegeben. Das Biotin des Zweit- Antikörpers bindet an den freien Stellen des Avidinmoleküls. Das Avidin besitzt 4 Bindungsstellen für Biotin, allerdings binden aufgrund der molekularen Konfiguration in der Regel weniger als 4 Biotinmoleküle. Nach Zugabe eines Chromogens wie dem 3,3’-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid (DAB) fällt dieses durch Reaktion mit der Peroxidase des Avidin-Biotin-Komplexes zu einem braunen Reaktionsprodukt aus.
Damit ist das gesuchte Antigen indirekt sichtbar gemacht geworden. Durch die Bindung von Biotin an die freien Bindungsstellen des Avidins können mehrere Peroxidase-konjugierte Avidin-Biotin-Komplexe über Zweit- und Erst-Antikörper an das Antigen binden. Damit wird eine höhere Sensitivität erzielt (sogenannte „signal amplification“) (HAINES u. CHELAK 1991; RAMOS-VARA et al. 1999).
Immunperoxidase-Färbemethoden sind unter Verwendung polyklonaler (BRUGGMANN et al. 1977 b; GIGER et al. 1977; DOSTER u. LIN 1988;
SARRADELL et al. 2003; RIBEIRO et al. 2004) und monoklonaler (CHEIKH SAAD BOUH et al. 2003; OPRIESSNIG et al. 2004) Erst-Antikörper gegen M.
hyopneumoniae beschrieben. Die beiden Arbeiten mit monoklonalen Erst- Antikörpern (CHEIKH SAAD BOUH et al. 2003; OPRIESSNIG et al. 2004) wurden an experimentell infizierten Tieren durchgeführt. Die Verwendung eines monoklonalen Erst-Antikörpers erhöht dabei die Spezifität des immunhistochemischen Antigen- Nachweises (CHEIKH SAAD BOUH et al. 2003).
2.7.1.4 DNA-Nachweis mittels in situ Hybridisierung
Die in situ Hybridisierung (ISH) und die Immunhistochemie stellen aufgrund ihrer Sensitivität und Spezifität eine exzellente Alternative in der Diagnostik von Erregern dar, die nur aufwendig kulturell nachweisbar sind (SEGALÉS et al. 1999). In der ISH werden markierte Nukleinsäure-Sequenzen zur Detektion von Genomfragmenten gesuchter Erreger eingesetzt.
Digoxigenin- und Fluoreszein-markierte ISH-Techniken sind zum Nachweis von M.
hyopneumoniae in Formalin-fixierten und in Paraffin-eingebetteten Lungengewebeproben beschrieben (KWON u. CHAE 1999; BOYE et al. 2001;
KWON et al. 2002). KWON und CHAE (1999) konnten ein Hybridisierungs-Signal auf der Oberfläche des Bronchial- und Bronchiolarepithels, in Typ-I-Pneumozyten, in Alveolarmakrophagen und Makrophagen des Interstitiums bei Schweinen nach Feldinfektion nachweisen. Nach experimenteller Infektion fanden KWON et al. (2002) Hybridisierungs-Signale 7 bis 28 Tage p. i. auf der Oberfläche des Bronchial- und
Bronchiolarepithels und 14 bis 35 Tage p. i. in Typ-I-Pneumozyten, in Alveolarmakrophagen und Makrophagen des Interstitiums.
2.7.1.5 DNA-Nachweis mittels PCR
Die Polymerase-Kettenreaktion (engl.: Polymerase Chain Reaction: PCR) ist eine in situ-Methode zur Amplifikation einer spezifischen DNA-Sequenz, die von zwei Oligonukleotiden (Primern) begrenzt ist (BANGSOW et al. 2002).
Seit der ersten PCR zum Nachweis von Genomfragmenten von M. hyopneumoniae (HARASAWA et al. 1991) sind weitere Einzel-PCR (ARTIUSHIN et al. 1993;
SØRENSEN et al. 1994; STEMKE et al. 1994; MATTSON et al. 1995; BLANCHARD et al. 1996; BAUMEISTER et al. 1998; CARON et al. 2000 b), Multiplex-PCR (CARON et al. 2000 b), nested PCR (STEMKE 1997; STÄRK et al. 1998;
CALSAMIGLIA et al. 1999; CALSAMIGLIA et al. 2000 b; VERDIN et al. 2000 b;
KURTH et al. 2002), PCR mit interner Kontrolle (VERDIN et al. 2000 a; KURTH et al.
2002) und quantitative Real Time PCR (MINION et al. 2002; DUBOSSON et al.
2004; KUHNERT et al. 2004; SIBILA et al. 2004 d) beschrieben.
Zur Diagnostik von M. hyopneumoniae-Infektionen bietet die PCR den Vorteil, dass ein Ergebnis im Vergleich zur Kultur viel schneller verfügbar, sehr sensitiv und spezifisch ist. Darüber hinaus kann eine PCR aus verschiedenen Probematerialien wie Nasentupfern (MATTSON et al. 1995; SØRENSEN et al. 1997; CALSAMIGLIA et al. 1999; BOSCH et al. 2000; CARON et al. 2000 b; OHLINGER et al. 2000;
BATISTA et al. 2002; KURTH et al. 2002; RUIZ et al. 2002 a, b, 2003; VICCA et al.
2002; MARTELLI et al. 2006; SIBILA et al. 2006), Bronchialtupfern (SØRENSEN et al. 1994; CALSAMIGLIA et al. 2000 b; CARON et al. 2000 b; KURTH et al. 2002), Trachealtupfern (KURTH et al. 2002; RUIZ et al. 2002 a), Tonsillentupfern (KURTH et al. 2002) und bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit (BALF) (MATTSON et al. 1995;
BLANCHARD et al. 1996; BAUMEISTER et al. 1998; VERDIN et al. 2000 b; KURTH et al. 2002; PABST 2004) und Lungengewebe (MATTSON et al. 1995; CARON et al.
2000 b; THONGKUMKOON et al. 2000; KURTH et al. 2002; MEYNS et al. 2004;
MAROIS et al. 2007) durchgeführt werden. Somit kann dieser direkte Erregernachweis mittels PCR prinzipiell auch von lebenden Schweinen geführt werden.
Für die Diagnostik von M. hyopneumoniae-Infektionen mittels PCR ist die Untersuchung von BALF und Bronchialtupfern im Vergleich zu anderen Probeentnahme-Lokalisationen geeigneter (KURTH et al. 2002; MAROIS et al.
2007); vor allem für frühe Infektionsstadien (SIBILA et al. 2004 b, c; MOORKAMP et al. 2007). Der Nachweis mittels PCR aus Bronchialtupfern korreliert dabei mit dem Auftreten für M. hyopneumoniae-typischen, histopathologischen Lungenveränderungen (CALSAMIGLIA et al. 2000).
Die Eignung von Nasentupfern zum Nachweis von M. hyopneumoniae-Infektionen wird kontrovers diskutiert (CALSAMIGLIA et al. 1999; KURTH et al. 2002; SIBILA et al. 2004 b,c; OTAGIRI et al. 2005).
Im Vergleich zur IHC und ISH besteht ein Nachteil der PCR darin, dass histopathologische Veränderungen nicht beurteilt werden können. Da nur ein amplifizierter Genomabschnitt als PCR-Produkt vorliegt, sind viele phäno- und genotypische Methoden zur Stammtypisierung nicht möglich. Zudem kann mit Hilfe qualitativer PCR-Techniken nur eine Aussage über die Anwesenheit und nicht über die Erregermenge von M. hyopneumoniae in der untersuchten Probe gemacht werden.
Der Nachteil der hohen Sensitivität, besonders bei den nPCR-Techniken, besteht darin, dass ein hohes Risiko für Kontaminationen bei der Entnahme, Probenaufbereitung und -bearbeitung existiert (STÄRK et al. 1998; KURTH et al.
2002).
2.7.2 Indirekter Erregernachweis
Die serologische Untersuchung ist die gebräuchlichste Methode in der Praxis, den Infektionsstatus einer Herde zu bestimmen.
Verschiedene Enzyme-linked immunosorbent assay´s (ELISA´s) haben den indirekten Hämagglutinationstest (IHA) (LAM u. SWITZER 1971) und die Komplementbindungsreaktion (KBR) (ROBERTS 1970; SLAVIK u. SWITZER 1972) verdrängt. Sowohl für die KBR als auch für den IHA sind Kreuzreaktionen mit M.
hyorhinis und M. flocculare beschrieben (ROBERTS u. LITTLE 1970; FREEMAN et al. 1984 a, b). Die als ausreichend sensitiv bewerteten ELISA haben den Vorteil, dass größere Probenzahlen gleichzeitig und automatisiert untersucht werden können (CALSAMIGLIA et al. 1999). Der erste, für den Nachweis von M. hyopneumoniae entwickelte ELISA (BRUGGMANN et al. 1977 a) zeigte noch deutliche Kreuzreaktionen mit M. hyorhinis und M. flocculare. NICOLET et al. (1990) konnten die Sensitivität mit der Extraktion des Antigens mit TWEEN 20 deutlich verbessern;
Kreuzreaktionen mit den eng verwandten M. flocculare waren aber nicht gänzlich auszuschließen (NICOLET et al. 1980; BOMMELI u. NICOLET 1983). BEREITER et al. (1990) konnten aber einen cut-off für die OD-Werte festgelegen, mit dem eine Unterscheidung zwischen M. hyopneumoniae und M. flocculare weitgehend gewährleistet ist. Der indirekte TWEEN-20-ELISA zeigt im Vergleich zur Kultur eine Spezifität von 95,6 % und eine Sensitivität von 98,8 % (SHELDRAKE u. ROMMALIS 1992).
Im blocking-ELISA werden monoklonale Antikörper von 40 kDa (LE POTIER et al.
1994), 43 kDa (DJORDJEVIC et al. 1994) oder 74 kDa (FELD et al. 1992) verwendet. Die Sensitivität und Spezifität zweier kommerziell erhältlicher ELISA der Fa. DAKO Denmark A/S (blocking-ELISA) und der Fa. IDEXX Laboratories Inc.
(indirekter ELISA) sind in verschiedenen, zum Teil vergleichenden Studien an Seren von spontan oder experimentell infizierten sowie sicher M. hyopneumoniae-freien Tieren untersucht worden (WALLGREN et al. 1996; THACKER 2001; CHITTICK et al. 2002; ERLANDSON et al. 2002 b; AMERI-MAHABADI et al. 2005). Für ein Herdenscreening, nicht aber für die Einzeltierdiagnostik sind demnach sowohl indirekte als auch blocking ELISA geeignet (PIJOAN 1994; CHITTICK et al. 2002;
AMERI-MAHABADI et al. 2005).
Antikörper gegen M. hyopneumoniae sind im Blutserum bei experimentell infizierten Tieren ab 8 Tagen p.i. (SØRENSEN et al. 1997; SHELDRAKE et al. 1990), häufig
aber erst nach 3 bis 4 Wochen nachweisbar (KOBISCH et al. 1993; LE POTIER et al.
1994). Bei Feldinfektion sind Serokonversionen zwischen 2 und 9 Wochen p. i.
festzustellen (MORRIS et al. 1995; SITJAR et al. 1996; SØRENSEN et al. 1997;
LEON et al. 2001). RAUTIANEN et al. (2000) empfehlen für das Herdenscreening die serologische Untersuchung von Kolostralmilchproben, da hier bis zu 70 % höhere IgG-Werte als im Serum nachzuweisen sind (NICOLET et al. 1990; YAGIHASHI et al. 1993; MORRIS et al. 1994; STÄRK 2000), und ein Antikörpernachweis noch bis zu 3 Jahren p. i. gelingt.
2.8 Bekämpfung
2.8.1 Kontrolle
Die Kontrolle von Infektionen durch M. hyopneumoniae kann grundsätzlich über optimierte Management- und Haltungsbedingungen, durch Impfungen und gezielte Medikation erreicht werden (CLARK et al. 1991; THACKER 2006).
2.8.1.1 Prophylaxe durch Impfung
Die Impfung gegen M. hyopneumoniae wird in den meisten Ländern mit intensiver Schweineproduktion erfolgreich durchgeführt (HAESEBROUCK et al. 2004).
In Europa sind seit 1992 inaktivierte Ganzzellpräparationen mit unterschiedlichen, zum Teil herstellerspezifischen Adjuvantien verfügbar. Nachdem ursprünglich alle verfügbaren inaktivierten Vakzinen zur zweimaligen (two-shot) Applikation vorgesehen waren, sind seit 2002 verschiedene one-shot Vakzinen erhältlich. Die two-shot Vakzinen werden in Europa meist in der 1. und 3./4. Lebenswoche angewendet. Die one-shot Vakzinen werden, abhängig von ihrer Zulassung, gewöhnlich ab der 1. bzw. 3. Lebenswoche verabreicht.
Eine Impfung gegen M. hyopneumoniae kann einen Schutz vor klinischer Erkrankung vermitteln, erzeugt aber keine sterile Immunität, d. h. Kolonisierung, Ausscheidung und Neuinfektionen werden nicht verhindert (MAES et al. 1999; KOBISCH 2000;
MATEUSEN et al. 2002; JOLIE et al. 2004; PIETERS et al. 2006). Die Infektionsraten können durch die Impfung nicht signifikant reduziert werden (MEYNS et al. 2006). Die Effektivität der Impfung beruht auf verbessertem Zuwachs, gesteigerter Futterverwertung, kürzerer Mastdauer, verminderter klinischer Symptomatik sowie der geringeren Prävalenz und Schwere von Lungenläsionen (SCHEIDT et al. 1994; VRAA-ANDERSEN et al. 1994; DOHOO u. MONTGOMERY 1996; RADELOFF 1997; MARTINON et al. 1998; MAES et al. 1999; OKADA et al.
1999; KYRIAKIS et al. 2001; LLOPART et al. 2002; DIAZ et al. 2004; KOLB et al.
