Feldstudie zum Einfluss einzeltierspezifischer Risikofaktoren für die Infektion mit Mycoplasma hyopneumoniae bei Saugferkeln
in Norddeutschland
INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae - ( Dr. med. vet. )
vorgelegt von Stefanie Döhring
Kassel
Hannover 2012
Wissenschaftliche Betreuung: Apl. Prof. Dr. E. große Beilage Außenstelle für Epidemiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
1. Gutachterin: Apl. Prof. Dr. E. große Beilage
2. Gutachterin: Univ. Prof. Dr. M. Hewicker-Trautwein
Tag der mündlichen Prüfung: 11. Mai 2012
Die Arbeit wurde dankenswerterweise unterstützt von Pfizer Tiergesundheit
Meinen Eltern
1. Einleitung ... 9
2. Literatur ... 10
2.1 Erregereigenschaften ... 10
2.2 Epidemiologie ... 11
2.2.1 M. hyopneumoniae-Prävalenz bei Saug- und Absetzferkeln ... 11
2.2.2 Erregerübertragung und Tenazität ... 13
2.2.3 Erregerpersistenz und Verlauf der Infektion in Herden ... 15
2.2.4 Erregerausscheidung ... 17
2.2.5 Interaktion mit dem Immunsystem des Wirts und Einfluss auf den Verlauf der Infektion ... 17
2.3 Krankheitsbild ... 19
2.4 Diagnostik ... 21
2.4.1 Indirekter Erregernachweis ... 23
2.4.2 Direkter Erregernachweis ... 25
2.4.2.1 Polymerasekettenreaktion ... 27
2.4.2.2 Realtime PCR ... 28
2.4.2.3 Geeignetes Probenmaterial und DNA-Isolierung ... 30
2.5 Prävention ... 32
2.5.1 Maßnahmen zur Reduzierung der Erregerübertragung ... 32
2.5.2 Impfung ... 35
2.6 Planung, Validierung, Durchführung epidemiologischer Studien ... 36
3. Material und Methoden ... 38
3.1 Vorversuche ... 38
3.1.1 Direkter Erregernachweis / PCR ... 38
3.1.2 Auswahl der Bestände ... 38
3.2 Untersuchung der Bestände ... 43
3.2.1 Einteilung der Gruppen ... 43
3.2.2 Untersuchung der Sauen ... 44
3.2.3 Untersuchung der Ferkel ... 45
3.2.4 Labordiagnostische Untersuchungen ... 50
3.2.4.1 Ermittlung des serologischen M. hyopneumoniae-Status der Sauen und Ferkel ... 50
3.2.4.2 Untersuchung der Nasentupfer auf Genomfragmente von M. hyopneumoniae ... 51
3.3 Elektronische Datenverarbeitung ... 58
3.3.1 Elektronische Erfassung der Daten ... 58
3.3.2 Statistische Auswertung ... 59
PCR bei Saugferkeln und den zugehörigen Sauen ... 62
4.3 Deskriptive Auswertung der Daten ... 65
4.4 Statistische Auswertung der Daten von Saugferkeln und Sauen ... 77
4.4.1 Univariable Poisson-Regression ... 77
4.4.2 Multivariable Poisson-Regression ... 87
5. Diskussion ... 101
5.1 Wahl der Extraktionsmethode... 101
5.2 Nachweisraten und Risikofaktoren für das Vorkommen von M. hyopneumoniae bei Saugferkeln ... 102
5.2.1 Anteil der M. hyopneumoniae-Nachweise in Ferkeln und Sauen ... 102
5.2.2 Vergleich der Antikörper-Konzentrationen von Sauen und deren Ferkel ... 106
5.2.3 Risikofaktoren für den Nachweis von M. hyopneumoniae beim Saugferkel ... 107
5.3 Schlussfolgerungen ... 121
6. Zusammenfassung ... 123
7. Summary ... 126
8. Literaturverzeichnis ... 128
9. Anhang ... 148
Abbildungsverzeichnis ... 201
Tabellenverzeichnis ... 202
A. Actinobacillus a. p. ante partum
ABC ATP-binding-cassette
B. Bordetella
BALF bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit
BALT bronchus associated lymphoid tissue (Bronchus -assoziiertes lymphatisches Gewebe)
bp Basenpaar
Cp crossing point
Ct threshold cycle (Schwellenwert-Zyklus)
DNA deoxyribonucleic acid (Desoxy-Ribonuklein-Säure) ELISA enzym linked immunosorbent assay
fg femto (x10-15) -gramm
g Beschleunigung GCP good clinical practice
°C Grad Celsius
H. Haemophilus
HPLC high pressure liquid chromatography IFT Immunfluoreszenztest IHA Indirekter Hämagglutinationstest
IHC Immunhistochemie IL Interleukin
IRR Incidence rate ratio ISH in-situ-Hybridisierung
KBR Komplement-Bindungsreaktion km Kilometer
LB Luria-Bertani (-Medium)
M molar (mol/L)
M. Mycoplasma MGB minor groove binder
µg mikro (x 10-6) -gramm µm mikro (x 10-6) -meter µM mikro (x 10-6) -molar mM milli (x 10-3) -molar
nM nano (x10-9) -molar
OD Optische Dichte
P. Pasteurella p. p. post partum
p. i. post infectionem
PCR polymerase chain reaction (Polymerase-Kettenreaktion) PCV2 Porcine circovirus Type II (Porzines Circovirus Typ II) per inj. per injectionem
pg piko (x10-12) -gramm
PGE2 Prostaglandin E2
PMWS Porcine multisystemic wasting syndrome ppm parts per million
PRDC Porcine respiratory disease complex
PRRS Porcine reproductive and respiratory syndrome REP repeated element protein
Rn Infektionsrate
S. Streptococcus
S/P-Wert sample/positive ratio (Proben-/Positivkontroll-Wert)
ss-DNA single stranded desoxyribonucleic acid (einsträngige Desoxy- Ribonuklein-Säure)
TNFα Tumor-Nekrose-Faktor α
vers. versus
xGal 5-Brom-4chlor-3-indoxyl-ß-D-galactopyranosid
1. Einleitung
Mycoplasma (M.) hyopneumoniae, der Erreger der Enzootischen Pneumonie der Schweine, ist weltweit verbreitet (THACKER 2006). Zusammen mit dem porcine circovirus 2 (PCV2), dem porcine reproductive und respiratory syndrome virus (PRRSV) sowie dem swine influenza virus (SIV) ist der Erreger an der Ausprägung des sogenannten porcine respiratory disease complex (PRDC) beteiligt (THACKER 2004).
Vorkommen und Bedeutung von Infektionen mit M. hyopneumoniae bei Saug- und Absetzferkeln werden von den Autoren bisher vorliegender Publikationen unterschiedlich eingeschätzt. Die in vorangegangenen Studien ermittelten Prävalenzen innerhalb dieser Altersgruppe weichen z.T. stark voneinander ab, da mit einer Ausnahme (WOESTE 2011) selektiv Bestände untersucht wurden, in denen Atemwegserkrankungen bei den Saugferkeln aufgetreten waren (CALSAMIGLIA u.
PIJOAN 2000; RUIZ u. PIJOAN 2002; MOORKAMP 2007; SIBILA et al.
2007a; NATHUES et al. 2010; VILLARREAL 2010).
Die Übertragung von M. hyopneumoniae erfolgt sowohl horizontal als auch vertikal.
Die vertikale Übertragung von der Sau auf ihre Ferkel findet nicht intrauterin, sondern über den direkten Kontakt nach der Geburt statt. Die Bedeutung der vertikalen Übertragung wird kontrovers diskutiert, wobei aber grundsätzlich unbestritten ist, dass Ferkel, die sich während der Säugezeit infizieren, Initiatoren für die Ausbreitung der Infektion in späteren Produktionsstadien sind (MEYNS et al. 2004; FANO et al.
2007; SIBILA et al. 2007a). Ungeachtet der Möglichkeit der vertikalen Erregerübertragung von der Sau auf ihre Ferkel, scheint die horizontale Ausbreitung bei den Absetzferkeln oftmals nur sehr langsam zu erfolgen (VILLARREAL et al.
2010).
Die Enzootische Pneumonie ist eine multifaktorielle Erkrankung, die in Deutschland mit endemischem Charakter auftritt (NATHUES u. GROSSE BEILAGE 2009).
Vorkommen und Schwere der Erkrankung sind abhängig von der Virulenz des Erregerstammes sowie dem Vorhandensein von Koinfektionen und verschiedenen
Risiko- und Belastungsfaktoren, die sich insbesondere aus den Haltungs- und Managementbedingungen betroffener Bestände ergeben.
Die Erkrankung nimmt üblicherweise einen chronischen Verlauf und weist eine hohe Morbidität, jedoch geringe Mortalität auf (MAES et al. 1996). Wirtschaftliche Verluste entstehen durch Wachstumseinbußen sowie durch den erhöhten Bedarf an Antibiotika.
Durch die Identifikation von Risiko- und Belastungsfaktoren kann gezielt Einfluss auf Haltungs- und Managementbedingungen genommen werden und somit ein Beitrag zur Eindämmung der Enzootischen Pneumonie geleistet werden. Einige Publikationen, die Risiko- und Belastungsfaktoren für die M. hyopneumoniae- Infektion bei Absetzferkeln und Mastschweinen spezifizieren, liegen bereits vor (MAES et al. 1996; KOBISCH 2000; OSTANELLO et al. 2007; MAES et al.
2008; GROSSE BEILAGE et al. 2009; STEENHARD et al. 2009; NATHUES 2011).
Anhand der vorliegenden Untersuchung wurde der Einfluss von Faktoren geprüft, für die eine Wirkung auf den Infektionsstatus von Saugferkeln anzunehmen ist. Die Studie soll Aufschluss darüber geben, welche Faktoren mit einer erhöhten Wahrscheinlichkeit einhergehen, bei Ferkeln zum Zeitpunkt des Absetzens M. hyopneumoniae nachzuweisen. Die Identifikation von Risikofaktoren bei Schweinen dieser Altersgruppe kann einen Beitrag zur Eindämmung vertikaler Infektionen leisten.
2. Literatur
2.1 Erregereigenschaften
M. hyopneumoniae, der Erreger der Enzootischen Pneumonie der Schweine, gehört zur Klasse der Mollicutes (Lat.: mollis: weich, cutis: Haut) und damit zu den kleinsten sich selbst teilenden Prokaryonten (TULLY et al. 1993). Der Durchmesser beträgt 0,2 bis 0,5 µm. Eine Besonderheit dieser Klasse stellt die Begrenzung der Zelle mittels einfacher Plasmamembran anstelle einer Prokaryonten-typischen Zellwand dar (RAZIN 1978). Dieses Merkmal resultiert in der pleomorphen Gestalt des Erregers.
Aufgrund der fehlenden Zellwand sind ß-Lactam Antibiotika, deren Wirkungsweise in
der Hemmung der bakteriellen Zellwand-Synthese liegt, nicht wirksam gegenüber M. hyopneumoniae.
Der Erreger verfügt über eine limitierte Anzahl an Genen, weshalb das Bakterium auf eine parasitäre Lebensform angewiesen ist. Der Stoffwechsel des Wirtes komplettiert das Spektrum an Aminosäuren, Fettsäuren, Cholesterin und Vitaminen, das für die Deckung des komplexen Nährstoffbedarfs notwendig ist. Dementsprechend sind die Ansprüche an das Nährmedium zur Kultivierung besonders hoch. Epithelzellen des Respirations- und Urogenitaltraktes gelten als primäres Habitat der Mykoplasmen (RAZIN 1992). M. hyopneumoniae kolonisiert die Oberfläche des zilien-tragenden, respiratorischen Epithels. Eine Penetration der Wirtszelle erfolgt dabei nicht (BLANCHARD et al. 1992).
2.2 Epidemiologie
Infektionen mit M. hyopneumoniae sind weltweit verbreitet (THACKER 2006) und treten in Deutschland mit endemischem Charakter auf (NATHUES u. GROSSE BEILAGE 2009). Sie sind regelmäßig assoziiert mit weiteren respiratorischen Erregern bakterieller und viraler Herkunft. Eine enge Korrelation von M. hyopneumoniae konnte insbesondere für Pasteurella (P.) multocida ermittelt werden (CIPRIAN et al. 1988; AMASS et al. 1994; ROSS 2006). Durch Infektionsversuche mit M. hyopneumoniae und P. multocida konnten mittels experimenteller Infektion mit beiden Erregern deutlich stärker ausgeprägte respiratorische Symptome und deutlich ausgeprägtere Lungenläsionen nachgewiesen werden, als bei experimenteller Inokulation jeweils nur einer der beiden Erreger (CIPRIAN et al. 1988; AMASS et al. 1994).
2.2.1 M. hyopneumoniae-Prävalenz bei Saug- und Absetzferkeln
Eine Untersuchung in verschiedenen Ländern innerhalb Europas (Belgien, Dänemark, Frankreich, Deutschland, Ungarn, Italien, Polen, Spanien und den Niederlanden) an Saugferkeln aus 52 Herden mit respiratorischen Erkrankungen bei Saug- und/oder Absetzferkeln zeigte, dass 68 % dieser selektierten Herden positiv für M. hyopneumoniae waren. Der Anteil positiver Herden war in Frankreich, den
Niederlanden, Italien und Deutschland am höchsten. Es wurden pro Land 6 (Deutschland 4) Herden und innerhalb der Herden jeweils 30 Nasentupfer von Ferkeln um den 21. Lebenstag mittels nested polymerase chain reaction (nested PCR)-Verfahren untersucht. Durchschnittlich wurde ein Anteil positiver Ferkel von 10,7 % ermittelt (VILLARREAL 2010). Weitere Untersuchungen zur Prävalenz von M. hyopneumoniae bei Ferkeln zum Zeitpunkt des Absetzens wurden von CALSAMIGLIA und PIJOAN (2000) sowie SIBILA et al. (2007a) durchgeführt. Als Probenmatrix dienten ebenfalls Nasentupfer, die mittels nested PCR untersucht wurden. Bei zwei aufeinanderfolgenden Untersuchungen von 130 bzw. 125 Ferkeln einer Herde mit respiratorischen Erkrankungen wurde M. hyopneumoniae in 7,7 % resp. 9,6 % der Nasentupfer nachgewiesen (CALSAMIGLIA u. PIJOAN 2000).
SIBILA et al. (2007a) untersuchten 507 Ferkel in der ersten Lebenswoche aus einer ebenfalls von respiratorischen Erkrankungen betroffenen Herde und ermittelten eine Prävalenz von 1,5 %. Zum Zeitpunkt des Absetzens stieg der Anteil positiver Ferkel auf 3,8 %. WOESTE (2011) konnte im Rahmen einer Untersuchung von je 20 Ferkeln aus 125 Beständen zum Zeitpunkt des Absetzens einen Anteil von 3,9 % M. hyopneumoniae-positiver Ferkel ermitteln. Der Nachweis erfolgte mittels multiplex realtime PCR an Nasentupfern. RUIZ und PIJOAN (2002) untersuchten innerhalb ihrer Studie zur Ausscheidung von M. hyopneumoniae in einer natürlich infizierten Herde 72 Ferkel mittels nested PCR an Nasentupfern. Dabei lagen die Nachweishäufigkeiten zum Zeitpunkt des Absetzens unter 15 %. VILLARREAL (2010) konnte mittels nested PCR-Verfahren an Lungenlavageproben am Ende der Aufzuchtphase im Flatdeck in 31 % einer vakzinierten Ferkelgruppe und 64 % einer Gruppe ungeimpfter Ferkel positive Nachweise erzielen. Die Vakzination der Ferkel wurde zum Zeitpunkt des Absetzens durchgeführt. Zu diesem Zeitpunkt wurden 14 % positive Nachweise in den gerade vakzinierten Ferkeln und 36 % in den ungeimpften Ferkeln erzielt. MOORKAMP (2007) untersuchte jeweils zehn klinisch auffällige Ferkel aus 50 Herden mit Atemwegserkrankungen mittels nested PCR an Bronchoalveoläre Lavage-Flüssigkeit (BALF). Trotz intensiver Vorselektion der Herden konnte lediglich ein prozentualer Anteil positiver Nachweise von 11,2 % ermittelt werden.
NATHUES et al. (2010) stellten im Rahmen einer retrospektiven Studie über die Untersuchung von 1122 Lungenproben von Saugferkeln und Absetzferkeln Prävalenzen von 2 % resp. 9,3 % fest.
2.2.2 Erregerübertragung und Tenazität
Verschiedene Studien (PIFFER u. ROSS 1984; KOBISCH et al. 1993) haben gezeigt, dass Schweine jeden Alters für M. hyopneumoniae empfänglich sind. Die Übertragung findet vorrangig durch den direkten Kontakt mit Sekreten des Respirationstraktes infizierter Schweine statt (THACKER 2006). Es sind sowohl vertikale als auch horizontale Übertragungswege bekannt. Drei Wege der direkten Erregerübertragung sind zu nennen:
1. Die Übertragung von der Sau auf ihre Ferkel,
2. die Übertragung zwischen Ferkeln derselben Bucht, insbesondere nach dem Zusammenführen von Ferkeln aus unterschiedlichen Würfen oder Buchten und
3. die Übertragung von älteren Tieren auf jüngere Tiere in kontinuierlichen Produktionssystemen (ROSS 1999; SIBILA et al. 2007a).
Bezüglich des vertikalen Übertragungsweges während der Säugezeit geht man von einigen wenigen infizierten Ferkeln pro Wurf aus, die als Initiatoren für die Ausbreitung der Infektion in späteren Produktionsstadien gelten (SIBILA et al. 2007a).
In diesem Zusammenhang spielt vermutlich das Ausmaß der Erregerausscheidung der Sauen eine besondere Rolle (GROSSE BEILAGE et al. 2009). Unter experimentellen Bedingungen konnte festgestellt werden, dass ein infiziertes Absetzferkel während der sechswöchigen Aufzucht im Flatdeck die Infektion auf durchschnittlich ein Ferkel aus einer Gruppe von sechs Kontakttieren überträgt (MEYNS et al. 2004). Im Gegensatz zu diesem Ergebnis konnten VILLARREAL et al.
(2010) in einem Feldversuch während einer sechswöchigen Aufzuchtphase eine durchschnittliche Infektionsrate (Rn) von 0,56 für Ferkel ermitteln. Die unterschiedlichen Ergebnisse können ihre Ursache in der Art der Infektion (experimentelle Infektion versus Feldinfektion), der Stammunterschiede, der Infektionsdosis, aber auch in den verschiedenen Haltungsbedingungen sowie im
Immunstatus der Tiere haben. Eine weitere Studie liefert ebenfalls Hinweise für eine Infektion von Ferkeln während der Säugezeit. M. hyopneumoniae-Infektionen bei Ferkeln zum Zeitpunkt des Absetzens korrelieren hier mit M. hyopneumoniae- typischen Veränderungen beim Lungencheck auf dem Schlachthof (FANO et al.
2007). Als Einflussfaktor auf das Risiko der vertikalen Übertragung von M. hyopneumoniae wird das Alter der Sau angesehen. Demnach übertragen Sauen, die sich im ersten oder zweiten Wurf befinden, den Erreger mit höherer Wahrscheinlichkeit auf ihre Ferkel als ältere Sauen (FANO et al. 2006).
CALSAMIGLIA und PIJOAN (2000) ermittelten in ihrer Studie zusätzlich ein höheres Übertragungsrisiko für Sauen, die den siebten oder spätere Würfe haben. Die Übertragung innerhalb einer Herde findet außer über direkten Kontakt mit infizierten Tieren indirekt durch belebte und unbelebte Vektoren und über die Luft statt. Das Vorkommen der Erregerübertragung mit der Luft wurde mehrfach berichtet (GOODWIN 1985; STÄRK et al. 1992; THOMSEN et al. 1992). Anhand einer Filtration der Stallluft (STÄRK et al. 1998) in Herden, die akute Krankheitssymptome zeigten, konnte mittels nested PCR-Verfahren M. hyopneumoniae in 80 % der Proben nachgewiesen werden. Bei infizierten Herden ohne akute klinische Symptome konnte der Erreger mit dieser Methode dagegen in keinem Fall nachgewiesen werden. Diese Beobachtung ist wahrscheinlich auf die Tatsache zurück zu führen, dass M. hyopneumoniae von erkrankten Tieren vermehrt ausgeschieden und durch den Husten verstärkt in die Umgebung abgegeben wird.
Anhand einer case/control Studie über mögliche Risikofaktoren für Reinfektionen von zuvor M. hyopneumoniae-freien Herden (STÄRK et al. 1992) wurde die Nähe zu M. hyopneumonie-infizierten Schweineherden sowie die Nähe zu Straßen, die von Schweinetransportern befahren werden, als einflussnehmende Faktoren identifiziert.
Das Risiko einer Übertragung ist dabei mit der Distanz zu M. hyopneumonie- infizierten Schweineherden negativ korreliert. GOODWIN (1985) schätzte die kritische Entfernung für die Luftübertragung von M. hyopneumoniae auf 3,2 km. In einer neueren Studie wurde eine Luftübertragung aus einer künstlich infizierten Herde über eine maximale Entfernung von 4,7 km nachgewiesen (DEE et al. 2009).
HEGE et al. (2002) konnten in 22,3 % mit M. hyopneumoniae reinfizierter Herden
eine aerogene Übertragung als wahrscheinlichste Ursache feststellen. Des Weiteren unterstützt diese Studie die Annahme, dass die Haupteintragsquelle im Zukauf infizierter aber klinisch unauffälliger Tiere liegt. In 43,4 % der Fälle wurde der Zulauf infizierter Tiere als Eintragsursache angesehen. MORRIS et al. (1994) ermittelten anhand serologischer Untersuchungen ein siebenmal größeres Risiko für die Übertragung der Infektion durch direkten als durch indirekten Kontakt.
Die Übertragung des Erregers zwischen Herden wird durch verschiedene topographische und klimatische Faktoren beeinflusst. Eine flache Landschaft, hohe relative Luftfeuchtigkeit, Wind, Temperaturschwankungen und ein bedeckter Himmel, der die zytotoxische UV-Strahlung limitiert, steigern das Risiko einer Übertragung ebenso wie die enge Nachbarschaft zu einer infizierten Herde (DONE 1996). Unter Feldbedingungen bleibt M. hyopneumoniae bis zu 48 Stunden infektiös. Der Erreger überlebt längere Zeit in Regenwasser bei kühleren Temperaturen. Ausbrüche der Enzootischen Pneumonie werden vermehrt im Herbst und Winter beobachtet (GOODWIN 1985). Eine Häufung von Reinfektionen von SPF-Herden wurde entsprechend in den Monaten November bis März beobachtet (STÄRK et al. 1992).
Durch die fehlende Zellwand ergibt sich eine hohe Empfindlichkeit gegenüber Umweltfaktoren wie osmotischem Druck oder dem Vorhandensein von Detergenzien (MAES et al. 1996).
Aufgrund der mehrtägigen Überlebensfähigkeit von M. hyopneumoniae außerhalb des Tieres (GOODWIN 1985) besteht die Gefahr der Verschleppung durch Personen beziehungsweise Gegenstände. BATISTA et al. (2004) konnten allerdings zeigen, dass die üblichen Hygienemaßnahmen (Duschen und Wechseln der Kleidung) ausreichen, um eine Verschleppung des Erregers zu verhindern.
2.2.3 Erregerpersistenz und Verlauf der Infektion in Herden
Die Erregerpersistenz im Tier wurde in verschiedenen Studien untersucht. Aus Lungengewebe konnte M. hyopneumoniae bis 85 Tage post infectionem (p.i.) kulturell nachgewiesen werden (SØRENSEN et al. 1997). FANO et al. (2005) gelang ein Nachweis mittels nested PCR-Verfahren aus Bronchustupfern sogar bis 185 Tage p.i..
In der Regel erfolgt die Ausbreitung des Erregers innerhalb einer Tiergruppe recht langsam (KOBISCH 2000). Nach direktem Kontakt einer Gruppe mit infizierten Tieren konnte eine Übertragung des Erregers nach 28 Tagen mittels nested PCR in Nasentupfern festgestellt werden, nach frühestens 35 Tagen waren Antikörper im Serum nachweisbar. Ausgehend von der ersten positiven Serumreaktion dauerte die Serokonversion der gesamten Gruppe 28 Tage (FANO et al. 2005). PIETERS et al.
(2009) konnten nachweisen, dass die Infektion - nach experimenteller Inokulation des Erregers – über einen Zeitraum von mindestens 200 Tagen auf andere Tiere übertragen werden kann.
Nach ARTIUSHIN und MINION (1996) unterscheiden sich die verschiedenen M. hyopneumoniae-Stämme in ihrer Virulenz. An experimentell infizierten Tieren konnten virulente und weniger virulente M. hyopneumoniae-Stämme differenziert werden (VICCA et al. 2003; MEYNS et al. 2007). VICCA et al. (2003) konnten mittels Immunfluoreszenz eine deutlich höhere Errregerdichte in Lungen von Schweinen ermitteln, die mit einem hochvirulenten Stamm inokuliert wurden. Nach den Autoren liegt die Ursache dieses Ergebnisses in einer höheren Adhäsionskapazität oder in einem stärkeren Vermehrungspotential virulenterer Stämme. Letzteres konnten MEYNS et al. (2007) bestätigen. Des Weiteren zeigten sich schwerwiegendere Entzündungsprozesse nach Inokulation von hochvirulenten Stämmen.
In chronisch infizierten Herden kann häufig ein Anstieg der Antikörperkonzentration während der Mastphase beobachtet werden (SHELDRAKE et al. 1990; GROßE BEILAGE 2000; LEON et al. 2001). Diese Beobachtungen lassen darauf schließen, dass die Infektion zu Beginn der Mastperiode stattfindet, in einem Zeitraum, in dem die Antikörperkonzentrationen gegen M. hyopneumoniae besonders niedrig sind (LEON et al. 2001). In Herden mit kontinuierlicher Stallbelegung gelten die älteren Tiere als Infektionsquellen für die zugestallten, jüngeren Tiere während in Betrieben mit all in all out-Management die vertikale Übertragung vermutlich die größte Bedeutung hat (CALSAMIGLIA u. PIJOAN 1998).
2.2.4 Erregerausscheidung
Die Ausscheidung von M. hyopneumoniae erfolgt über die Atemluft und wird durch den für die Enzootische Pneumonie typischen Husten forciert. Bei intratrachealer Inokulation und anschließender Probenentnahme (Nasentupfer) in regelmäßigen Abständen konnte festgestellt werden, dass eine Ausscheidung des Erregers ab elf Tagen p.i. erfolgt, während sich klinische Symptome frühestens zwei Tage später zeigen (PIETERS et al. 2009). Im Gegensatz dazu konnten FANO et al. (2005) an erregerfreien Schweinen nach Exposition/Kontakt zu infizierten Tieren erst 28 Tage p.i. eine Erregerausscheidung nachweisen (siehe Kapitel 2.2.3). Die Ausscheidung des Erregers über die Nase erfolgt in Intervallen, demzufolge ist der Nachweis des Erregers in Nasentupfern infizierter Tiere mittels PCR im Verlauf einer Infektion lediglich diskontinuierlich möglich (CALSAMIGLIA et al. 1999). Bezüglich der Dauer der Erregerausscheidung wurden bisher nur wenige Studien durchgeführt. PIETERS et al. (2009) demonstrierten eine lang andauernde Ausscheidung infektionsfähiger Erreger an Jungsauen, die den Erreger noch 200 Tage nach experimenteller Infektion übertragen haben. RUIZ und PIJOAN (2002) untersuchten Ausscheidungsmuster von Absetzferkeln während der Aufzuchtphase. Nach dem Absetzen wurden von jedem Tier über einen Zeitraum von sieben Wochen mehrmals Nasentupfer entnommen und mittels nested PCR auf M. hyopneumoniae untersucht.
Für die meisten der 72 untersuchten Ferkel konnte eine Ausscheidung an einem der sieben Untersuchungszeitpunkte ermittelt werden. Die Anzahl der Ferkel, bei denen an mehr als einem Untersuchungszeitpunkt M. hyopneumoniae im Nasentupfer identifiziert werden konnten, wurde von den Autoren ohne nähere Angaben als gering bezeichnet.
2.2.5 Interaktion mit dem Immunsystem des Wirts und Einfluss auf den Verlauf der Infektion
Die Infektion mit M. hyopneumoniae induziert sowohl eine humorale als auch eine zelluläre Reaktion des Immunsystems (THACKER et al. 2000). Anhand von Infektionsstudien konnte demonstriert werden, dass als Reaktion auf eine Infektion mit M. hyopneumoniae verschiedenste, von Alveolarmakrophagen freigesetzte,
proinflammatorische Zytokine, wie Interleukin (IL) IL1, IL6, IL8, IL10, IL12 PGE2 sowie TNFα gebildet werden (ASAI et al. 1993; ASAI et al.
1994; THANAWONGNUWECH et al. 2004). Allgemein führt eine Infektion mit M. hyopneumonie zu einer mäßigen Stimulation porziner Lymphozyten (MESSIER u.
ROSS 1991).
Hinweise für die Entwicklung einer belastbaren Immunität nach erfolgter Infektion gibt ein Infektionsversuch (KOBISCH et al. 1993). Eine Boosterinfektion, 14 Wochen nach erstmaliger intratrachealer Inokulation von Erregermaterial, konnte keine klinischen Symptome induzieren, führte aber zum erneuten Anstieg der Konzentration von Antikörpern gegen M. hyopneumoniae. Die nachweislich hohe antigenische Variabilität (ARTIUSHIN u. MINION 1996) ermöglicht dem Erreger, sich dem Immunsystem des Wirtes zumindest teilweise zu entziehen. Welche Konsequenzen das für die Bekämpfung von M. hyopneumoniae im Feld hat, ist bisher nicht geklärt. VILLARREAL et al. (2009) konnten in ihrem Infektionsversuch eine deutliche Verstärkung der klinischen Symptome nach intratrachealer Inokulation eines hochvirulenten Stammes in Ferkel nachweisen, die allerdings bereits vier Wochen zuvor mit einem wenig virulenten Stamm infiziert wurden. Aufgrund dieser Ergebnisse schlussfolgern die Autoren, dass die Infektion mit einem wenig virulenten Stamm keinen Schutz vor der Infektion mit einem hochvirulenten Stamm induziert und die Doppelinfektion die Krankheitssymptome sogar verstärkt.
Eine Beeinflussung der Immunreaktion von Schweinen durch eine Infektion mit M. hyopneumoniae wurde mehrfach beschrieben (CARUSO u. ROSS 1990; ASAI et al. 1996; MAES et al. 1996). Eine Beeinträchtigung der Funktion von Alveolarmakrophagen M. hyopneumoniae-infizierter Tiere kann nach Infektion mit weiteren respiratorischen Erregern auftreten (CARUSO u. ROSS 1990). Eine Reduktion der Antikörperbildungs-Kapazität durch M. hyopneumoniae-Infektionen ist ebenfalls als mögliche Beeinträchtigung der humoralen Immunreaktion beschrieben.
Die zelluläre Immunantwort kann durch Inhibition von Makrophagen zusätzlich beeinträchtigt sein. Dieser Effekt ist insbesondere während der frühen Phase der Infektion zu beobachten, kann jedoch auch einige Wochen bestehen bleiben (MAES et al. 1996).
Ferkel können spezifische Immunglobuline gegen M. hyopneumoniae über das Kolostrum aufnehmen. Die mittlere Halbwertszeit maternaler Antikörper beträgt 15,8 Tage (MORRIS et al. 1994), wobei die Persistenz maternaler Antikörper positiv mit der initialen Konzentration korreliert ist. Nach MAES et al. (1996) beträgt sie 30 bis 63 Tage. GROSSE BEILAGE et al. (2005) konnten bei Ferkeln von Jungsauen in der ersten und vierten Lebenswoche deutlich niedrigere AK-Konzentrationen feststellen, als bei Ferkeln von Altsauen. BANDRICK et al. (2008) konnten eine Übertragung spezifischer T-Zellen via Kolostrum mittels der Testung auf eine Hypersensitivität vom Spättyp (verzögerte Hypersensitivität) sowie in vitro Lymphozyten-Proliferation in Ferkelblut und Kolostrum nachweisen.
LEON et al. (2001) weisen auf die kritische Phase für die Verbreitung des Erregers um den 70. Lebenstag hin, die mit einer, bis dahin, sehr geringen Konzentration maternaler Antikörper zusammenhängen könnte.
2.3 Krankheitsbild
Die Enzootische Pneumonie ist eine chronische Erkrankung des Respirationstraktes, die sich durch eine geringe Mortalität und eine hohe Morbidität auszeichnet.
Trockener, unproduktiver Husten, der in seiner Ausprägung individuell variiert, gilt als primäres Symptom. Andere Symptome wie Fieber, Inappetenz, Dyspnoe und/oder Schwäche sind mit dem Vorkommen von Sekundärerregern assoziiert (KOBISCH 2000; SIBILA et al. 2009). M. hyopneumoniae-bedingte Erkrankungen treten bei Absetzferkeln ab der 6. Lebenswoche, vorrangig aber bei älteren Ferkeln und Masttieren auf (JERICHO 1986; MAES et al. 1996). Gelegentlich kann eine typische Symptomatik schon in der dritten bis vierten Lebenswoche beobachtet werden (MAES et al. 1996). In endemisch infizierten Herden ist das, aufgrund der Übertragung hoher Konzentrationen maternaler Antikörper auf die Ferkel, allerdings selten. Für die Mehrzahl der Schweine, die an Enzootischer Pneumonie erkranken, kann eine reduzierte Mastleistung nachgewiesen werden. Die Ausbreitung der Erkrankung in Herden dauert oft Wochen bis Monate (THACKER 2006). Der chronische Husten besteht in der Regel über einen Zeitraum von vier bis sechs Wochen und klingt dann langsam ab (CONNOR 2007).
KOBISCH et al. (1993) konnten ab 14 Tage nach experimenteller Infektion bei 48 Ferkeln Husten sowie eine Erhöhung der Körpertemperatur feststellen. Die stärkste Intensität des Hustens wurde fünf Wochen p.i. erreicht. Zwölf Wochen p.i. waren klinische Symptome nicht mehr festzustellen. Ähnliche Ergebnisse beschreiben SØRENSEN et al. (1997) anhand eines Infektionsversuches. Husten trat durchschnittlich ab 13 Tage p.i. auf und war vier Wochen p.i. am stärksten ausgeprägt. PIETERS et al. (2009) konnten ebenfalls 13 Tage nach intratrachealer Inokulation erste Symptome einer Enzootischen Pneumonie feststellen.
Das Ausmaß der klinischen Symptome wird von den Umgebungsbedingungen, dem Vorkommen von Koinfektionen sowie der Infektionsdosis beeinflusst (MAES et al.
1996; SIBILA et al. 2009). Anhand zweier Infektionsversuche konnte die Hypothese bestätigt werden, dass verschieden virulente M. hyopneumoniae-Stämme unterschiedlich stark ausgeprägte Symptome hervorrufen (VICCA et al.
2003; VILLARREAL et al. 2009). Nach intratrachealer Inokulation von zwei wenig virulenten und einem hochvirulenten Stamm konnten stärkere klinische Symptome nach Inokulation des hochvirulenten Stammes nachgewiesen werden (VILLARREAL et al. 2009).
GEARY und WALCZAK (1983) konnten ein Oberflächenprotein von M. hyopneumoniae als Virulenzfaktor mit zytotoxischer Wirkung identifizieren. Ob es sich bei dem Vermögen der Adhäsion an die Wirtszelle um eine Virulenzeigenschaft handelt, wird kontrovers diskutiert. Während einige Autoren diese Theorie unterstützen (ZHANG et al. 1995; CHEN et al. 1998; BURNETT et al. 2006), konnten CALUS et al. (2009) in einer in vitro-Studie zeigen, dass die Höhe des Adhäsionsvermögens keinen Einfluss auf die Virulenz des M. hyopneumoniae- Stammes hat. DEBEY und ROSS (1994) konnten in ihrer in vitro-Studie nach Inokulation trachealer Organkulturen Ziliostase sowie Zilienverlust nachweisen. Die Störung der ziliären Clearance prädisponiert die Schweine für Infektionen mit Sekundärerregern (DONE 1996). Koinfektionen beeinflussen die Ausprägung von Klinik und Lungenläsionen. Letztere sind signifikant deutlicher ausgeprägt, wenn P. multocida ebenfalls nachgewiesen wurde (AMASS et al. 1994; SØRENSEN et al.
1997). Assoziationen mit anderen respiratorischen Erregern wurden innerhalb einer
Studie (PALZER et al. 2008) nachgewiesen. BALF-Proben von Schweinen aus Herden mit Pneumonie-Problematik wurden auf verschiedene Erreger von Atemwegserkrankungen untersucht. Eine signifikante Assoziation mit M. hyopneumoniae wurde für P. multocida, Bordetella (B.) bronchiseptica, Mycoplasma (M.) hyorhinis sowie PRRSV (EU-Typ) ermittelt. NATHUES et al. (2010) ermittelten eine höhere Wahrscheinlichkeit für ein M. hyopneumoniae-Nachweis in Lungengewebe, wenn Streptococcus (S.) suis, P. multocida, Haemophilus (H.) parasuis, M. hyorhinis sowie PRRSV (EU-Typ) nachgewiesen wurde. Ascaris suis steht ebenfalls im Verdacht, das Risiko für Pneumonien zu erhöhen. Als ursächlich dafür wird die Migration der Larven in die Lunge angesehen (WALLGREN et al. 1994). Zusammenfassend ist auf die vielen Faktoren hinzuweisen, die Einfluss auf die Ausprägung der Krankheitssymptome nehmen. Koinfektionen werden regelmäßig beobachtet und verändern das Krankheitsbild in hohem Maße.
2.4 Diagnostik
Zum Nachweis von M. hyopneumoniae stehen zahlreiche Methoden zur Verfügung.
Da jede Methode Nachteile aufweist, wird die Anwendung einer Kombination von Nachweismethoden empfohlen (DONE 1996; THACKER 2006). Die zuvor beschriebene Klinik (siehe 2.3) sowie typische Lungenläsionen können lediglich als Hinweis auf eine Infektion mit M. hyopneumoniae bewertet werden (DONE 1996; MAES et al. 1996; THACKER 2006). Der Husten kann mit Hilfe eines Hustenindexes quantifiziert werden (MAES et al. 1999; MATEUSEN et al. 2002).
Die makroskopische Beurteilung der Lunge und ggf. die weiterführende pathologisch- histologische Untersuchung können den klinischen Verdacht auf Enzootische Pneumonie erhärten, den spezifischen Erregernachweis aber nicht ersetzen. Die typischen, aber nicht pathognomonischen Lungenläsionen werden als violette bis graue, verdichtete Bezirke beschrieben. Die Veränderungen sind überwiegend an den Spitzenlappen beider Lungen zu beobachten (MAES et al. 2008). Bei Beteiligung anderer Erreger zeigen sich die Bezirke weniger gut abgegrenzt und sind nicht nur auf die Spitzenlappen beschränkt. Das Verteilungsmuster der betroffenen Bezirke variiert je nach Begleiterreger (THACKER 2006). Vergrößerungen der bronchialen
und mediastinalen Lymphknoten sind häufig. Eine Infektion mit M. hyopneumoniae kann auch bei Saug- und Absetzferkeln zu Lungenläsionen führen. Dies belegen die Ergebnisse einer Studie (MOORKAMP 2007) über den Zusammenhang zwischen dem Nachweis von M. hyopneumoniae und dem Vorkommen typischer Lungenläsionen innerhalb dieser Altersgruppe. M. hyopneumoniae-Nachweise, die mittels nested PCR erhoben wurden, korrelierten hier mit den typischen pathomorphologischen Veränderungen dieser Lungen.
Die maximale Ausprägung der Lungenläsionen ist bei Monoinfektionen zwei bis vier Wochen p.i. zu beobachten, während acht Wochen p.i. die Ausheilung beginnt (MAES et al. 1996). Die Rückbildung der Lungenläsionen beginnt acht bis zehn Wochen p.i. (KOBISCH et al. 1993; MAES et al. 1996).
Histologisch sind im Zusammenhang mit der M. hyopneumoniae-Infektion Zilienverluste, Abstoßungen von Epithelzellen und Ansammlungen neutrophiler Granulozyten nachweisbar. Letztere sind im Lumen sowie peribronchiolar bzw.
peribronchial anzutreffen (MAES et al. 1996). KOBISCH et al. (1993) konnten eine perivaskuläre Akkumulationen von Lymphozyten und Plasmazellen feststellen.
Zusätzlich zeigt sich eine mehr oder weniger ausgeprägte BALT-Hyperplasie (MAES et al. 1996). MOORKAMP (2007) konnte anhand eines Immunhistochemie (IHC)- Verfahrens verlässlich Antigen von M. hyopneumoniae an Lungenproben detektieren, die eine BALT-Hyperplasie an der entsprechenden Lokalisation aufwiesen.
Nach STRAIT und THACKER (2005) kann ein Hervorrufen M. hyopneumoniae- ähnlicher makroskopischer und histologischer Veränderungen durch M. flocculare nicht ausgeschlossen werden. Eine Identifikation typischer Lungenläsionen kann außer über die pathologische Untersuchung auch über einen sogenannten Lungencheck auf dem Schlachthof erfolgen. Verlässliche Aussagen sind allerdings stark abhängig von der Erfahrung der untersuchenden Person. Eine Einteilung in Grade verschiedener Ausprägungen erfolgt nach verschiedenen, standardisierten Schemata (HANNAN et al. 1982; MORRISON et al. 1985; STRAW et al.
1986; CHRISTENSEN et al. 1999).
2.4.1 Indirekter Erregernachweis
Der indirekte Nachweis von M. hyopneumoniae kann mittels Komplementbindungsreaktion (KBR), indirektem Hämagglutinationstest (IHA) oder durch verschiedene enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) erfolgen. Der ELISA wurde bereits in den achtziger Jahren als das sensitivste Verfahren identifiziert (ARMSTRONG et al. 1983). Er ist heute der am häufigsten verwendete Test zum indirekten Nachweis einer M. hyopneumoniae-Infektion in Schweineherden.
Die Vorteile dieses Tests sind die einfache und schnelle Durchführung sowie die relativ geringen Kosten. Zur Ergebnisinterpretation wird der photometrisch gemessene OD (Optische Dichte) -Wert oder der daraus errechnete S/P-Wert herangezogen. Der S/P-Wert beschreibt das Verhältnis des OD-Werts der Probe (S = sample) zum OD-Wert der Positivkontrolle (P), jeweils abzüglich des OD-Werts der negativen Kontrolle. Die Interpretation serologischer Untersuchungsergebnisse muss mit einer gewissen Vorsicht erfolgen. Grund dafür ist die langsame Verbreitung des Erregers innerhalb der Herde und die verzögerte Serokonversion im Einzeltier. In einem Infektionsversuch von SØRENSEN et al. (1997) wurden acht Tage p.i.
erstmals eine Serokonversion nachweisende S/P-Werte gemessen, während in einem Feldstudie erst drei Wochen nach Exposition entsprechend hohe S/P-Werte gemessen werden konnten (MORRIS et al. 1995b). Unter Feldbedingungen ist die Serokonversion häufig erst sechs bis acht Wochen nach dem erstmaligen Kontakt zu infizierten Tieren zu beobachten (CALSAMIGLIA u. PIJOAN 1998). Frühe Infektionsstadien gehen demnach häufig noch nicht mit Seropositivität einher, so dass eine Interpretation von Ergebnissen erschwert ist, wenn der Zeitpunkt der Infektion mit dem Erreger unbekannt ist (STRAIT u. THACKER 2006). Die langsame Serokonversion ist vermutlich auf die Besonderheit des Erregers zurückzuführen, die Zilien der Epithelzellen des Respirationstraktes zu besiedeln, wo sie vom Immunsystem möglicherweise nicht sofort erkannt werden.
Antikörpertiter gegen M. hyopneumoniae erreichen 70 bis 80 Tage p.i. ihr Maximum (DONE 1996). MORRIS et al. (1995b) konnten 77 Tage nach Exposition von SPF- Tieren mit M. hyopneumoniae-infizierten Tieren die höchsten S/P-Werte ermitteln.
Diese Ergebnisse entsprechen denen von KOBISCH et al. (1993), die 77 bis 84 Tage
nach experimenteller Infektion die maximale Antikörperkonzentration nachweisen konnten. Die Persistenz infektionsbedingter Antikörper wird mit mindestens einem Jahr angegeben (DONE 1996). FANO et al. (2005) konnten zeigen, dass es bei indirekter Übertragung von M. hyopneumoniae zu einer stark verzögerten Serokonversion kommt. Zwischen der Erkennung des ersten Tieres und dem letzten Tier dieser Gruppe, die eine Serokonversion zeigten, lagen 42 Tage. Als Ursache für diese Verzögerung wird die, durch diese Übertragungsvariante bedingte, geringe Infektionsdosis angenommen (FANO et al. 2005).
Die Beeinflussung des Zeitpunktes der Serokonversion von der Infektionsdosis wird auch von CALSAMIGLIA und PIJOAN (1998) beschrieben; außerdem wird ein Zusammenhang mit dem Vorhandensein und der Stärke von Gewebeläsionen vermutet (SITJAR et al. 1996). Im Durchschnitt wurde vom Zeitpunkt des ersten Auftretens klinischer Symptome bis zur Serokonversion eine Zeitspanne von neun Tagen ermittelt (SØRENSEN et al. 1997).
In Deutschland werden überwiegend zwei Testsysteme zur Detektion spezifischer Antikörper gegen M. hyopneumoniae verwendet. Der HerdCheck® M. hyopneumoniae Antibody Test Kit (IDEXX GmbH, D-55826 Wörrstadt) ist ein indirekter ELISA. Die Vertiefungen der Mikrotiterplatten sind mit inaktivierten M. hyopneumoniae-Zellen beschichtet. Alternativ wird auch ein blocking-ELISA (M. hyopneumoniae ELISA, Fa. Oxoid, Cambridgeshire, CB7 4ET, UK) verwendet.
Die Böden der Kavitäten sind bei diesem Testsystem mit einem M. hyopneumoniae- spezifischen Oberflächenprotein beschichtet (STRAIT 2009). Beide Testsysteme gelten als hoch spezifisch für M. hyopneumoniae (AMERI-MAHABADI et al.
2005; ERLANDSON et al. 2005; STRAIT u. THACKER 2005). ERLANDSON et al.
(2005) konnten eine Spezifität beim Einzeltier von 100 % ermitteln während AMERI- MAHABADI et al. (2005) eine Testspezifität von 99,2 % auf Einzeltierebene nachweisen konnten. Die Sensitivität variiert in Zusammenhang mit der Phase der Infektion. Ein Anstieg der Antikörperkonzentration ist regelmäßig während der Mastphase zu beobachten (SIBILA et al. 2004a; NATHUES et al. 2006). In einer Untersuchung an 357 Tieren mittels indirektem ELISA zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach Vakzination gegen M. hyopneumoniae konnte 28, 43 und 62 Tage
nach der Impfung, unter der Annahme, dass alle Tiere eine Serokonversion zeigen müssen, eine Sensitivität von 95,7 %, 88,4 % und 92,6 % festgestellt werden. Eine Untersuchung mit dem blocking-ELISA führte zu ähnlichen Werten für die Sensitivität (AMERI-MAHABADI et al. 2005).
Eine Differenzierung zwischen Reaktionen auf Infektionen resp. Impfungen und maternalen Antikörpern ist mittels serologischer Untersuchung nicht möglich (GROSSE BEILAGE et al. 2005).
Zusammenfassend sind ELISA-Testsysteme zum indirekten Nachweis von M. hyopneumoniae geeignet, um den Herdenstatus zu bestimmen (THACKER 2004).
Anhand einer Untersuchung von gepaarten Serumproben bei beobachteter Klinik ist eine Aussage darüber möglich, ob der Erreger ursächlich für die respiratorische Erkrankung verantwortlich ist. Empfohlen wird eine erste Probenentnahme zum Zeitpunkt des Auftretens typischer Symptome sowie eine weitere Probenentnahme vier bis sechs Wochen nach der Ersten (NATHUES et al. 2006).
2.4.2 Direkter Erregernachweis
Die kulturelle Anzüchtung in Friismedium wird durch THACKER (2004) nach wie vor als Goldstandard beschrieben. Die Bebrütung der Platten nimmt vier bis acht Wochen in Anspruch (FRIIS 1975). Aufgrund des sehr langsamen Wachstums und einer häufigen Überwucherung durch andere Mykoplasmen, insbesondere M. hyorhinis und M. flocculare (MAES et al. 1996) bzw. andere Erreger, ist diese Methode nicht für die Routinediagnostik geeignet. Post mortem ist ein direkter Erregernachweis an Formalin-fixiertem Lungengewebe mit der sogenannten in-situ Hybridisierung (ISH) und der IHC möglich. Um die Wahrscheinlichkeit falsch negativer Ergebnisse zu reduzieren, sollten die histologischen Präparate Bronchen bzw. Bronchiolen enthalten (THACKER 2006). Die Identifizierung bei der in-situ Hybridisierung erfolgt durch eine Sonde, die spezifisch an DNA resp. 16S ribosomale RNA bindet (KWON u. CHAE 1999; BOYE et al. 2001). Die Methode gilt als hoch spezifisch, ist jedoch mit einer aufwendigen Vorbereitung des Präparates verbunden.
Verschiedene Nachweismethoden basierend auf IHC-Verfahren wurden publiziert (DOSTER u. LIN 1988; CHEIKH SAAD BOUH et al. 2003; SARRADELL et al.
2003; OPRIESSNIG et al. 2004; RIBEIRO et al. 2004; MOORKAMP 2007). Im Vergleich mit einem nested PCR-Verfahren, bei welchem BALF-Proben des selben Tieres als Matrix verwendet wurden, konnte nur bei 16 von 33 PCR-positiven Tieren der Erreger mittels IHC nachgewiesen werden. Des Weiteren besteht der Verdacht, dass mit dieser Methode nicht alle Stämme identifiziert werden können, da in einer Herde keines der mittels nested PCR als positiv bewerteten Tiere in der IHC als positiv erkannt wurde (MOORKAMP 2007). Ein weiteres immunologisches Nachweisverfahren ist der Immunfluoreszenztest (IFT). Die Durchführung des Tests ist anhand einer Vielzahl von Probenmaterialien möglich. Für den Nachweis von M. hyopneumoniae wurden IFT-Verfahren entwickelt, deren Probenmatrix Bronchustupfer (GIGER et al. 1977) oder Lungengewebe (AMANFU et al. 1984) sein können. Das Verfahren ist besonders geeignet für den Nachweis von M. hyopneumoniae in akuten Phasen der Infektion, wenn der Erregergehalt im Probenmaterial besonders hoch ist (ROSS 1999).
AHRENS u. FRIIS (1991) entwickelten ein M. hyopneumoniae-Nachweisverfahren mittels Southern blot Technologie und konnten eine Detektionsgrenze von 100 pg DNA ermitteln. Mittels realtime PCR-Verfahren konnte dagegen eine Nachweisgrenze von weniger als 1 fg DNA erzielt werden (DUBOSSON et al. 2004).
Bei dem Southern blot Verfahren wird DNA aus dem Probenmaterial mittels verschiedener Restriktionsenzyme gespalten und anschließend gelelektrophoretisch aufgetrennt. Nach Denaturierung der DNA-Fragmente werden diese auf eine blotting- Membran übertragen. Eine spezifische Sonde, die aus einem komplementären DNA- Abschnitt aufgebaut ist, der an einem Ende chemisch oder radioaktiv markiert ist, bindet komplementär an dem zu detektierenden DNA-Abschnitt. Die Durchführung dieser Methode dauert ca. 24 Stunden (HOFF et al. 2007).
In der Routinediagnostik kommen üblicherweise PCR-Methoden zur Anwendung.
Ursächlich dafür sind die Vielfalt der zur Verwendung möglichen Ausgangsmaterialien, die auch einen Erregernachweis intra vitam ermöglichen, die meist höhere Sensitivität sowie die schnelle und einfache Durchführung.
2.4.2.1 Polymerasekettenreaktion
Die Methode der PCR wurde erstmalig 1986 vom US-amerikanischen Biochemiker Kary Banks Mullis beschrieben (MULLIS et al. 1986). Bei der PCR handelt es sich um eine sensitive und spezifische in vitro Technik, die es ermöglicht, spezifische DNA-Sequenzen zu vervielfältigen (Amplifikation) und sie anschließend zu detektieren. Das Prinzip der PCR beruht auf einer exponentiellen Vermehrung eines - durch reverse und forward Primer- genau definierten DNA-Abschnittes mithilfe eines Enzyms, der DNA-Polymerase. Als Vorlage (template oder Matrize) wird einzelsträngige DNA benötigt.
Für die Mykoplasmen-Diagnostik wird die PCR aufgrund der einfachen und schnellen Durchführung der langwierigen und schwierigen kulturellen Anzüchtung vorgezogen.
Studien, in denen die kulturelle Anzüchtung mit einem single PCR-Verfahren verglichen wurde, ermittelten eine signifikant höhere Sensitivität bei Anwendung des PCR-Verfahrens (MAROIS et al. 2006).
Seit der Entwicklung der ersten PCR zum Nachweis von M. hyopneumoniae (HARASAWA et al. 1991) wurden diverse weitere auf der PCR-Technik basierende Nachweismethoden publiziert (ARTIUSHIN et al. 1993; STEMKE et al.
1994; MATTSSON et al. 1995; BLANCHARD et al. 1996; BAUMEISTER et al.
1998; MINION et al. 2002).
In den letzten 20 Jahren wurde die Weiterentwicklung der Methode aufgrund ihrer vielen Vorteile forciert. Es entstanden Varianten der PCR, wie die sogenannte multiplex PCR, die nested PCR und die realtime PCR. Das oben beschriebene Verfahren der ursprünglichen Methode wird seither als single PCR bezeichnet.
Mit dem Verfahren der multiplex PCR werden in einer Reaktion mehrere Genomfragmente amplifiziert. Die Einsparung von Zeit und Material geht allerdings mit einer geringeren Sensitivität einher. Für die Differenzierung von porzinen Mykoplasmen stehen multiplex PCR-Verfahren zur Verfügung (CARON et al.
2000; STAKENBORG et al. 2006).
Die nested PCR ist ein Verfahren, bei der zwei PCR-Reaktionen aufeinander folgen.
Das Amplifikat der ersten Reaktion dient dabei als Matrize für die zweite Reaktion.
Dadurch wird die Sensitivität deutlich erhöht. Verschiedene M. hyopneumoniae-
Nachweismethoden basierend auf dieser PCR-Variante sind beschrieben (STEMKE 1997; STÄRK et al. 1998; CALSAMIGLIA et al. 1999; CALSAMIGLIA et al.
2000; VERDIN et al. 2000; KURTH et al. 2002). Die Gefahr der Kontamination ist durch die Verwendung eines PCR-Produktes als Matrize in der zweiten Amplifikation allerdings stark erhöht.
Die realtime PCR ist die neuste Variante der PCR. Sie unterscheidet sich im Wesentlichen in ihrer Detektionsmethode von den bisher genannten Methoden. Das Amplifikat wird hierbei elektronisch durch fluoreszierende Reportermoleküle (siehe 2.4.2.2) visualisiert.
2.4.2.2 Realtime PCR
Die realtime PCR unterscheidet sich von den konventionellen PCR-Methoden durch die Detektion des PCR-Produkts während der Reaktion. Verschiedene Variationen dieser Methode stehen zu Verfügung. Neben der Sybr-Green-Methode, in der das PCR-Produkt durch einen unspezifischen, interkalierenden Fluoreszenzfarbstoff detektiert wird und ggf. eine anschließende Schmelzkurvenanalyse erforderlich macht, existieren Methoden, die eine Detektion des Amplifikats durch spezifische, hybridisierende Sonden ermöglichen. Die verschiedenen, auf der Sondentechnologie basierenden Methoden unterscheiden sich in der Art der Sonde (FRET-Sonden, TaqMan-Sonden, Molecular Beacons, Scorbions). Die Fluoreszenz ist jeweils annähernd proportional zur Menge des entstandenen PCR-Produkts. Während der Amplifikation werden drei Phasen unterschieden. In der ersten Phase ist die unspezifische Hintergrundfluoreszenz dominierend. Zu dem Zeitpunkt, an dem die Fluoreszenz erstmals die unspezifische Hintergrundfluoreszenz übersteigt, beginnt die zweite Phase der Amplifikation. Ein exponentieller Anstieg der Fluoreszenz kommt lediglich in dieser Phase vor. Er ist gleichbedeutend mit der Verdopplung des PCR- Produktes pro Zyklus. Eine Quantifizierung ist nur in dieser Phase möglich. Man bezeichnet den Amplifikationszyklus, in dem erstmals PCR-Produkt detektiert wird bzw. die Hintergrundfluoreszenz überschritten wird, als Ct-Wert (threshold cycle =
"Schwellenwert-Zyklus") oder Cp-Wert (crossing point). In der letzten Phase der
Amplifikation ist eine Verdopplung des Amplifikats pro Zyklus nicht mehr möglich.
Ursächlich dafür ist der Verbrauch der Substrate, die Hemmung der Reaktion durch die große Menge entstandener (Neben-) Produkte sowie die Inaktivierung der Polymerase durch die andauernde Hitze.
Nachweisverfahren für M. hyopneumoniae, die auf dieser Methode basieren, wurden mehrfach publiziert (DUBOSSON et al. 2004; STRAIT et al. 2008; MAROIS et al.
2010). DUBOSSON et al. (2004) beschreiben in ihrer Veröffentlichung zwei realtime PCR-Verfahren, die bei kombinierter Anwendung die Sensitivität der Einzelnachweise deutlich steigern. Im ersten Test dient das repeated element-Protein -REP- (MHYP1- 03-950) als Zielgen. Die Entwicklung fand in Anlehnung an eine nested PCR (STÄRK et al. 1998) statt. Zielgen des zweiten Tests stellt eine Sequenz dar, die mutmaßlich für ein ABC (ATP-binding cassette)-Transporter-Protein kodiert (I-141 DNA-Sequenz).
Die Entwicklung einer spezifischen Hybridisierungs-Sonde, Analysen dieser Sequenz (ABIVEN et al. 1992; BLANCHARD et al. 1996) sowie die Entwicklung eines nested PCR-Verfahrens (VERDIN et al. 2000), welchem diese Sequenz als Zielgen dient, gingen der Etablierung dieses realtime PCR-Verfahren voraus. Eine Besonderheit des ABC-Nachweisverfahrens ist die Verwendung zweier unterschiedlicher reverse Primer. Grund dafür ist die Entdeckung von Sequenzvariationen unterschiedlicher Stämme. Die Entwicklung der PCR erfolgte an Lungenproben. Während für die einzelnen REP- und ABC-Nachweisverfahren auf Einzeltierebene Sensitivitäten von 51,2 % resp. 68,3 % ermittelt wurden, stieg die Sensitivität bei der Kombination beider Tests auf 84,5 %. Die Spezifität dieser Kombination wird mit 99,6 % angegeben.
ZEEH (2004) ermittelte im Rahmen einer Untersuchung von Nasentupfern mittels realtime PCR nach DUBOSSON et al. (2004) eine Spezifität von 100 %. Die Sensitivität beider Nachweisverfahren (ABC und REP) an einzelnen Tieren lag lediglich bei 47,1 %. Auf Herdenebene erhöhte sich der Wert auf 95,5 %. Für Herden, in denen Husten beobachtet wurde, konnten signifikant höhere Werte für die Sensitivität ermittelt werden. Dies kann mit der Tatsache in Verbindung gebracht werden, dass die Erreger auf ihrem Weg von den tiefen Atemwegen in die Umwelt die Nasenhöhle passieren. Folglich ist die Wahrscheinlichkeit, mittels Nasentupfer M. hyopneumoniae zu detektieren bei Schweinen die husten erhöht (ZEEH 2004).
Basierend auf den beiden realtime PCR-Verfahren nach DUBOSSON et al. (2004) wurde eine multiplex realtime PCR entwickelt; die Kombination der beiden Tests reduziert die Anzahl der Untersuchungen und damit deren Kosten (GIANI 2005).
2.4.2.3 Geeignetes Probenmaterial und DNA-Isolierung
Der direkte Nachweis von M. hyopneumoniae mittels PCR kann aus unterschiedlichsten Probenmaterialien erfolgen. Neben Lungenproben bzw.
Bronchustupfern sind hier Untersuchungsmaterialien zu nennen, die eine Diagnostik intra vitam ermöglichen, wie Nasentupfer oder BALF. Des Weiteren ist eine oropharyngeale oder tracheobronchiale Probenentnahme mittels Tupfer oder Bürstchen möglich. Bei einem Vergleich von vier verschiedenen Probenmaterialien (Nasentupfer, oropharyngeale Bürstchen, Bronchoalveolär-Lavage-Proben und Tracheobronchial-Bürstchen) wurden für Nasentupfer die niedrigste Sensitivität (13,3 %) und für Tracheobronchial-Bürstchen die höchste Sensitivität (60,0 %) ermittelt (FABLET et al. 2010). Der Erregernachweis erfolgte jeweils mittels nested PCR Verfahren (CALSAMIGLIA et al. 1999). Im Rahmen einer Untersuchung an experimentell infizierten Ferkeln, bei denen Nasen- und Tonsillentupfer innerhalb der Aufzucht- und Mastphase entnommen wurden, konnte eine 4,5 mal höhere Sensitivtät bei Verwendung von Tonsillentupfern anstatt Nasentupfern ermittelt werden (MAROIS et al. 2008). Im Gegensatz dazu halten PIETERS und PIJOAN (2006) Nasentupfer in Kombination mit dem Nachweis über ein nested PCR- Verfahren als geeignet, frühe Phasen der Infektion zu identifizieren. In einer weiteren Studie, in der drei Wochen alte Ferkel intratracheal infiziert wurden, konnte der Erreger mittels nested PCR aus Nasentupfern bei annähernd 100 % der Ferkel eine Woche, zwei Wochen und vier Wochen p.i. identifiziert werden, während drei und fünf Wochen p.i. kaum positive Ergebnisse erzielt wurden (RUIZ et al. 2002). Diese Beobachtung unterstützt die Hypothese der diskontinuierlichen nasalen Ausscheidung des Erregers (siehe 2.2.3).
Um bei der Verwendung von Tupfern die Ausbeute des Erregers zu erhöhen, sollten synthetische Materialien wie z.B. Dacron®-Tupfer an Stelle von Baumwolltupfern verwendet werden, da Baumwolle dazu neigt, Flüssigkeiten nur schwer wieder
abzugeben. Des Weiteren sollte auf die Verwendung von Kunststoff- oder Aluminiumstäben, anstelle von Holzstäben geachtet werden, da Holz bei der Probenentnahme am lebenden Tier leichter bricht (ANONYM 2005a). Eine Studie (MOORKAMP et al. 2009) gibt Hinweise, dass BALF-Proben das geeignetere Probenmaterial zum Nachweis von M. hyopneumoniae in frühen Infektionsphasen sind, während bei typischen Lungenveränderungen der direkte Nachweis in Gewebe erfolgreicher ist. Die genannte Untersuchung erfolgte an typisch erkrankten Absetzferkeln, indem zuerst Lungenlavageproben und nach Euthanasie Lungengewebe entnommen wurden. Die Proben wurden mittels nested PCR (KURTH et al. 2002) auf M. hyopneumoniae untersucht. Antibiotische Vorbehandlungen scheinen keinen Einfluss auf die Detektion des Erregers in Lungengewebe zu haben (NATHUES et al. 2010).
Vor der Durchführung der PCR muss eine Aufbereitung der Proben stattfinden, um die Zellen zu lysieren und mutmaßlich vorhandene Inhibitoren der PCR zu entfernen.
Letzteres ist erforderlich, da die Sensitivität der PCR durch die inhibierenden Bestandteile nicht aufbereiteter, direkt verwendeter Proben sehr stark reduziert sein kann (RADSTRÖM et al. 2004). Die ideale Methode zur DNA-Isolierung sollte hohe Ausbeuten hochreiner sowie hochmolekularer DNA liefern, aber auch einfach, schnell und ökonomisch sein. Bei Untersuchungen größerer Probenzahlen ist es sinnvoll, die Extraktionsmethode im Vorfeld in Kombination mit der entsprechenden Amplifikationsmethode zu validieren (VISVIKIS et al. 1998).
Klassische Verfahren wie das Aufkochen und Filtrieren des Ausgangsmaterials, das häufig in Kombination mit Salzfällung der DNA durchgeführt wurde, sowie die sogenannte Zwei-Phasen-Extraktion wurden aufgrund niedriger Qualität der isolierten DNA sowie Gefahren für die Untersucher und die Umwelt (Äther) durch weiterentwickelte Verfahren abgelöst. Zu nennen sind dabei unter anderem die Anionenaustauscher-Chromatographie, die Extraktion mittels magnetic beads- Technologie sowie Silikagel-basierte Verfahren, wie beispielsweise die Silikasäulen- Technologie. Das letztgenannte Verfahren basiert auf der Bindung der Nukleinsäure an Silikaoberflächen in Gegenwart hoher Konzentrationen chaotroper Salze (GRIESS et al. 2007). Bereits 1990 publizierten BOOM et al. die Durchführung einer schnellen
und einfachen Nukleinsäureextraktion aus Serum und Urin humanen Ursprungs unter Verwendung von Silikapartikeln als Nukleinsäureträger. Die erzielten Ausbeuten lagen regelmäßig bei über 50 %. Außerdem zeigte sich die Nukleinsäure als geeignet für die Verwendung als Substrat für Polymerasen, Restriktionsenzyme und Ligasen (BOOM et al. 1990). Demgegenüber stehen die Ergebnisse weiterer Untersuchungen zur Nukleinsäureausbeute bei Extraktionen mittels Silikamembran-basierter Technologie, in denen anhand von Stuhl- oder Blutproben deutlich geringere Ausbeuten (≤ 5 %) erzielt werden konnten (LI et al. 2003; QUEIPO-ORTUNO et al.
2008; NATHUES et al. 2009). Einige Firmen bieten heute Kits an, die auf Silikamembran-Technologie basieren. Der Prozess wird dabei unterteilt in die Lyse der Proben, das Binden der Nukleinsäure an die Silikamembran, das Waschen zur Beseitigung von Inhibitoren mittels alkoholhaltiger Puffer und schließlich das Eluieren der reinen, hochmolekularen Nukleinsäure unter Niedrigsalzbedingungen (SETZKE 2007).
2.5 Prävention
2.5.1 Maßnahmen zur Reduzierung der Erregerübertragung
Die Enzootische Pneumonie ist eine multifaktorielle Erkrankung, somit haben verschiedene Risiko- und Belastungsfaktoren Einfluss auf Vorkommen und Schwere der Erkrankung. In dem Zusammenhang sind insbesondere die Haltung und das Management, der Produktionstyp, die Herdengröße sowie die Distanz zur nächsten M. hyopneumoniae-positiven Herde zu nennen (KOBISCH 2000). Die Umgebung eines Bestandes hat Einfluss auf das Risiko der Reinfektion M. hyopneumoniae- freier Herden, wie auch auf den Eintrag neuer Isolate in bereits infizierte Bestände.
Ein hohes Aufkommen von Schweinetransporten auf benachbarten Straßen bzw. das Vorkommen eines Schlachthofes in der näheren Umgebung erhöhen das Risiko für einen Erregereintrag (MAES et al. 1996). Als Risikofaktoren für eine Reinfektion von SPF-Herden in der Schweiz wurde die Nähe zu infizierten, größeren Herden in konventioneller Haltung identifiziert (STÄRK et al. 1992).
Verschiedene Maßnahmen im Rahmen von Haltung und Management können die Erregerübertragung beeinflussen. Nach MAES et al. (1996) werden folgende
Maßnahmen in diesem Zusammenhang als sinnvoll diskutiert: Ein striktes Rein- Raus-Verfahren, die Reinigung und Desinfektion der Abteile vor Neubelegung, die Vermeidung einer Überbelegung der Abteile sowie optimale klimatische Bedingungen, wie die Vermeidung von Zugluft, Minimierung des Ammoniakgehalts und Optimierung der Raumtemperatur. Eine relative Luftfeuchtigkeit von 60-80 % sollte angestrebt werden. Die Minimierung der Herkünfte zugekaufter Tiere, eine Minimierung der Frequenz von Zukäufen und die Durchführung von Quarantänemaßnahmen bei zugekauften Tieren werden ebenfalls empfohlen.
In Herden, die als geschlossenes System operieren, wird das Risiko des Erregereintrags geringer eingeschätzt als in anderen Haltungssystemen (MAES et al.
1996). Eine Studie zur Seroprävalenz von Sauen ermittelte höhere Anteile seropositiver Sauen in Herden von Ferkelerzeugern mit oder ohne angeschlossene Aufzucht als in geschlossenen Systemen (GROSSE BEILAGE et al. 2009). Eine Haltung innerhalb geschlossener Herden wirkt sich demnach reduzierend auf die Ausbreitung von M. hyopneumoniae in Herden aus. Im Gegensatz dazu identifizierten OSTANELLO et al. (2007) das Vorhandensein von Zuchttieren innerhalb der Herde bzw. geschlossene Systeme, fehlende Vakzination gegen M. hyopneumoniae sowie Aufzucht- und Mastphasen während der Wintermonate als Risikofaktoren für eine verstärkte Ausprägung von Lungenläsionen bei Masttieren.
LEON et al. (2001) halten den Zeitpunkt der Einstallung in die Mastabteile in Bezug auf die Verbreitung von M. hyopneumoniae für besonders kritisch und raten in diesem Zusammenhang zu Stressvermeidung, z.B. durch Einschränkung der Gruppendurchmischung sowie zur Einhaltung eines angemessenen Stallklimas in dieser Mastphase. Die Tierdichte in den Mastbuchten und die Tierdichte pro Raumvolumen innerhalb des Mastabteils gelten als Einflussfaktoren, mit denen das Risiko der Erregerübertragung zu reduzieren ist (MAES et al. 2000; LEON et al.
2001). Eine zu hohe Tierdichte bedingt hohe Erreger- und Ammoniakkonzentrationen in der Stallluft. Hohe Ammoniakkonzentrationen können das Risiko einer Infektion mit respiratorischen Erregern steigern, da sie die Zilien-Aktivität herabsetzen (PLONAIT 2004).
Besondere Berücksichtigung bei den Maßnahmen zur Reduzierung der Erregerübertragung verdienen die Sauen, die als potentielle Reservoire des Erregers durch die Übertagung auf ihre Nachkommenschaft eine große Rolle spielen.
Managementpraktiken können nachweislich einen Einfluss auf den Infektionsstatus im Sinne einer geringeren Anzahl seropositiver Sauen haben. Dazu zählt die Quarantäne von Jungsauen und Jungebern, der eine adäquate Eingliederung in die Sauenherde folgen muss. Die Vakzination der Ferkel gegen M. hyopneumoniae, ein striktes Rein-Raus-Verfahren innerhalb der Abferkelabteile sowie die Umsetzung eines 1- oder 3-Wochen-Abferkelrhythmus gelten ebenfalls als wichtige Maßnahmen.
Die Produktion im 2- oder 4-Wochen-Rhythmus wirkt sich dagegen ungünstig aus.
Ursächlich dafür sind vermutlich die damit verbundenen Abferkelungen außerhalb des eigentlichen Rhythmus, die häufig nicht in gesonderten Abteilen stattfinden können und somit die Altersspanne der Ferkel innerhalb eines Abteils erhöhen und ein konsequentes Rein-Raus-Verfahren erschweren (GROSSE BEILAGE et al. 2009).
Die Altersstruktur der Sauenherde wird ebenfalls als Einflussfaktor diskutiert (KOBISCH 2000; GROSSE BEILAGE et al. 2009). MAES et al. (1996) empfehlen eine ausgeglichene Altersstruktur der Sauenherden mit nicht mehr als 30 % Jungsauen. Der Carrier-Status (M. hyopneumoniae-Ausscheidung) von Jungsauen während der Quarantäne bzw. der Sauenherde kann anhand des direkten Erregernachweises aus Nasentupfern mittels PCR bewertet werden. Das Monitoring des Carrier-Status kann helfen, Krankheitsausbrüchen in der Sauenherde frühzeitig zu erkennen (CALSAMIGLIA u. PIJOAN 1998).
Infektionen mit Ascaris suum hemmen nachweislich die Effizienz der Vakzination gegen M. hyopneumoniae. Regelmäßige Parasitenkontrollen bzw. Entwurmungen sind demnach von großer Bedeutung (STEENHARD et al. 2009). Aufgrund der Assoziation von M. hyopneumoniae mit anderen respiratorischen Erregern (PALZER et al. 2008; NATHUES et al. 2010) sollten auch diese bei der Durchführung präventiver Maßnahmen berücksichtigt werden (MAES et al. 2008). Um eine indirekte Erregerübertragung zu vermeiden, sollte vor Betreten der Stallungen auf stalleigene bzw. gereinigte und desinfizierte Kleidung und Stiefel geachtet werden.
Haustiere und Besucher sollten keinen Zugang zu den Abteilen haben (MAES et al.
1996).
2.5.2 Impfung
Die Vakzination der Ferkel ist in Ländern mit hoher Schweinedichte die wichtigste Maßnahme zur Kontrolle der Enzootischen Pneumonie (GROSSE BEILAGE et al.
2006). SIBILA et al. (2007b) konnten bei geimpften Tieren geringer ausgeprägte Lungenläsionen sowie deutlich geringere Nachweisraten des Erregers in den oberen Atemwegen (Nasenhöhle, Tonsillen) beobachten, was auf einen niedrigeren Infektionsdruck in geimpften Herden hindeutet. Im Gegensatz dazu konnten MEYNS et al. (2006) und VILLARREAL et al. (2010) keine signifikanten Unterschiede zwischen den Übertragungsraten bei geimpften bzw. ungeimpften Absetzferkeln nachweisen. Eine Verminderung der vertikalen Übertragung durch Maßnahmen zur Senkung der Prävalenz in Sauenherden ist sinnvoll und reduziert die Kosten präventiver und therapeutischer Maßnahmen in späteren Produktionsphasen (FANO et al. 2007). RUIZ et al. (2003) untersuchten Ferkel zum Zeitpunkt des Absetzens mittels nested PCR an Nasentupfern und ermittelten signifikant weniger positive Nachweise bei Ferkeln von geimpften Sauen, als von ungeimpften Sauen. SIBILA et al. (2008) konnten dagegen keine signifikanten Unterschiede zwischen der M. hyopneumoniae-Kolonisation in der Nasenhöhle von Ferkeln geimpfter und ungeimpfter Muttersauen ermitteln. Innerhalb dieser Untersuchung wurden jedoch mittels Schlachtlungen-Checks signifikant weniger stark ausgeprägte M. hyopneumoniae-typische Veränderungen bei Nachkommen von geimpften Sauen nachgewiesen.
Verschiedene Untersuchungen konnten höhere tägliche Zuwachsraten bei geimpften Tieren im Gegensatz zu ungeimpften nachweisen (DOHOO u. MONTGOMERY 1996; KYRIAKIS et al. 2001; JENSEN et al. 2002).
Junge Zuchttiere sollten während ihrer Eingliederungsphase gegen M. hyopneumoniae geimpft werden, da eine Infektion während der Eingliederung oder bei Integration in die Stammherde die Ausscheidung hoher Erregermengen zur
Folge hat, die auf andere Sauen und die eigenen Ferkel übertragen werden können (NATHUES u. GROSSE BEILAGE 2009).
Die Vakzination von Ferkeln in der ersten Lebenswoche kann ebenfalls zu einer signifikanten Reduzierung M. hyopneumoniae-typischer Lungenläsionen führen (ANDREASEN et al. 2006; STRAUSS 2007). Inwiefern die Konzentration maternaler Antikörper einen Einfluss auf den Impfeffekt hat, wird kontrovers diskutiert. Während nach STRAUSS (2007) das Vorhandensein maternaler Antikörper gegen M. hyopneumoniae die Impfreaktion nicht beeinflusst, konnte LEHNER (2008) einen Effekt im Sinne einer erhöhten Anzahl serokonvertierter Schweine und ausgeprägterer Lungenläsionen am Ende der Mast bei Tieren von geimpften Sauen, die in der ersten Lebenswoche gegen M. hyopneumoniae geimpft wurden, feststellen.
GROSSE BEILAGE et al. (2006) beobachteten einen Zusammenhang zwischen der Durchführung einer Ferkelimpfung und niedrigeren Seroprävalenzen bei den Sauen entsprechender Herden. Eine Reduzierung der Verbreitung des Erregers durch die Durchführung der Ferkelvakzination kann demnach postuliert werden.
Ein langfristiges Impfmanagement ist hauptsächlich sinnvoll, um die Ausprägung der Klinik und der Läsionen zu minimieren. Eine Kombination mit geeigneten Management- und Hygienemaßnahmen hilft die Erregerübertragung zu reduzieren.
2.6 Planung, Validierung, Durchführung epidemiologischer Studien
Um valide Ergebnisse zu erhalten, sollte vor Beginn einer epidemiologischen Studie der benötigte Stichprobenumfang errechnet werden. Grundsätzlich bedarf die Durchführung einer Risikoanalyse für das Vorkommen eines Erregers innerhalb von Herden, der Untersuchung von Beständen mit einer nennenswerten Intra- Herdenprävalenz. Andernfalls wäre der notwendige Stichprobenumfang zur Identifizierung von Risikofaktoren so groß, dass die Machbarkeit und Finanzierung solcher Studien in Frage stünde. Eine Voruntersuchung kann hilfreich sein, solche Herden aus einem größeren Kollektiv zu selektieren. Die Auswahl des Probenmaterials sowie die Probenaufarbeitung und das Nachweisverfahren in einer Voruntersuchung müssen den Bedingungen in der eigentlichen Studie entsprechen.
Die Probenentnahme sollte in Anlehnung an die Richtlinien der internationalen Einrichtung Office International des Épizooties (OIE, Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals, chapter 1.1.1) erfolgen. Die Gefahr der Kontamination von Proben während der Entnahme muss vermieden werden.
Außerdem sollte das Verletzungsrisiko für die Versuchstiere und für den Probennehmer gering gehalten werden. Mögliche Vorsichtsmaßnahmen sollten im Vorfeld eruiert und bei der Durchführung eingehalten werden. Bei allen Maßnahmen sollte Stress für die Tiere vermieden werden (ANONYM 2005a).
Angelehnt an die good clinical practice (GCP) guidelines des International Cooperation on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Veterinary Medicinal Products (VICH) sollten bei der Durchführung von Studien alle Beobachtungen, Untersuchungen, Aufzeichnungen sowie die Datenanalysen nach standardisierten Schemata durchgeführt werden (ANONYM 2001). Die Verwendung einheitlicher Formblätter im Rahmen der Datenerhebung hilft die Richtigkeit und Vollständigkeit der Ergebnisse zu gewährleisten. Eine standardisierte Probenentnahme ist sinnvoll, um die Variabilität gering zu halten und somit die Vergleichbarkeit der Untersuchungsergebnisse zu garantieren. Mittels Durchführung der Messungen, Untersuchungen und Beobachtungen durch nur eine Person kann die sogenannte Inter-Untersucher-Variabilität ausgeschlossen werden (HEINEMANN u. BÖTHIG 1994).
Für die Durchführung einer Risikoanalyse zum Vorkommen eines Erregers innerhalb einer Tiergruppe ist es sinnvoll, einige wenige Herden intensiv zu untersuchen. Bei der Datenerhebung sollten Aspekte fokussiert werden, bei denen ein Einfluss auf das Vorkommen des Erregers innerhalb der Tiergruppe wahrscheinlich ist. Bereits publizierte Untersuchungen können bei der Identifikation solcher Aspekte hilfreich sein.
