Vergleich von Methoden zum Nachweis von Mycoplasma hyopneumoniae-Infektionen beim Schwein sowie epidemiologische Untersuchungen über die Verbreitung der Enzootischen Pneumonie im Weser-Ems Gebiet im Jahre 1996

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der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Vergleich von Methoden zum Nachweis von

Mycoplasma hyopneumoniae-Infektionen beim Schwein sowie epidemiologische Untersuchungen über die Verbreitung der Enzootischen Pneumonie im Weser-Ems Gebiet im Jahre 1996

INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Elke Hiltermann-Linden aus Dissen a. T. W.

Hannover 2004

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Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. M. Ganter

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. M. Ganter 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Th. Blaha

Tag der mündlichen Prüfung: 24.11.2004

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Meiner Familie

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Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 9

2 Schrifttum 10

2.1 Mycoplasma (M.) hyopneumoniae 10

2.1.1 Ätiologie 10

2.1.2 Epidemiologie 11

2.1.3 Pathogenese 13

2.1.4 Klinik 14

2.1.5 Immunität 15

2.1.6 Pathologie 16

2.1.7 Diagnose 18

2.1.7.1 Nachweis spezifischer Antikörper 18

2.1.7.2 Immunfluoreszenztest 20

2.1.7.3 Kultureller Nachweis des Erregers 22

2.1.7.4 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 23

2.1.8 Bekämpfung 25

2.1.8.1 Sanierungsverfahren 26

2.1.8.2 Impfung 28

2.1.8.3 Therapie 31

3 Material und Methode 32

3.1 Chemikalien und Reagenzien 32

3.2 Geräte und Hilfsmittel 32

3.3 Lösungen 33

3.4 Antigen für den TiHo-ELISA 34

3.5 Hyperimmunseren für den Immunfluoreszenztest 34

3.6 Probenmaterial und –auswahl 34

3.7 Vergleich der serologischen Testsysteme 37

3.7.1 Enzyme Linked Immunosorbent Assay des Instituts für

Mikrobiologie und Tierseuchen der Tierärztlichen Hochschule Hannover

(TiHo-ELISA) 37

3.7.2 DAKO Mycoplasma hyopneumoniae ELISA (DAKO-ELISA) 38 3.7.3 Chekit-Hyoptest I nach Dr. Bommeli (Bommeli I-ELISA) 39 3.7.4 Chekit-Hyoptest II nach Dr. Bommeli (Bommeli II-ELISA) 41 3.8 Vergleich der unterschiedlichen Methoden zum Nachweis von

M. hyopneumoniae-Infektionen 41

3.8.1 Vergleich der Serologie mit dem Immunfluoreszenztest und der Kultur 41 3.8.1.1 Nachweis von M. hyopneumoniae in Lungen mit dem indirekten

Immunfluoreszenztest 42

3.8.2 Vergleich der Serologie und des Immunfluoreszenztests mit der Sektion 42

3.9 Epidemiologische Untersuchung 43

3.9.1 Kartographierung der Betriebe 43

3.10 Vergleich der Epidemiologie von M. hyopneumoniae mit denen von

Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pp.) und Influenza 43

(6)

3.11 Statistische Auswertung 43

4 Ergebnisse 45

4.1.1 Analyse von Häufigkeiten qualitativer Daten mit Berechnung von Sensitivität

und Spezifität 45

4.1.2 Konkordanzindex Kappa und Mc-Nemar-Test 46

4.1.3 Regressionsanalyse 47

4.2 Drei verschiedene Nachweismethoden für

M. hyopneumoniae-Infektionen im Vergleich 47

4.2.1 Der indirekte Immunfluoreszenztest 47

4.3 Vergleich des indirekten Immunfluoreszenztests an Lungenproben

mit dem Bommeli II-ELISA korrespondierender Serumproben 48 4.3.1 Überprüfung der Sensitivität und Spezifität des Bommeli II-ELISAs 49

4.3.1.1 Konkordanzindex Kappa und Mc-Nemartest 49

4.4 Vergleich der Serologie mit dem Immunfluoreszenztest und der Kultur 50 4.5 Vergleich der Serologie und des Immunfluoreszenztests mit der Sektion 51

4.5.1 Auswertung der Sektionsprotokolle 51

4.5.2 Vergleich der Ergebnisse der Serologie und des Immunfluoreszenztests mit den makroskopischen Untersuchungen der Lungen

auf M. hyopneumoniae 52

4.6 Epidemiologische Untersuchung 53

4.6.1 Auswertung der untersuchten Serumproben von Schlachtschweinen 53 4.6.1.1 Scheinbare Intra-Herden-Prävalenz (PN) von M. hyopneumoniae 53 4.6.1.2 Scheinbare Intra-Herden-Prävalenz (PN) von Antikörpern gegen

Influenzavirus A/swine/Bakum/5/95 (H1N1) 53 4.6.1.3 Scheinbare Intra-Herden-Prävalenz (PN) von Antikörpern gegen

Influenzavirus A/swine/Bakum/909/93 (H3N2) 54 4.6.1.4 Scheinbare Herden-Prävalenz von M. hyopneumoniae 54 4.6.1.5 Scheinbare Herden-Prävalenz von Antikörpern gegen Influenzavirus

A/swine/Bakum/5/95 (H1N1) 55

4.6.1.6 Scheinbare Herden-Prävalenz von Antikörpern gegen Influenzavirus

4.6.2 Einflussfaktoren auf die Intra-Herden-Prävalenzen 55 4.6.2.1 Anzahl und Einfluss der Mastplätze auf die M. hyopneumoniae-

Prävalenz 56

4.6.2.2 Anzahl und Einfluss der Mastplätze auf Infektionen mit Influenzavirus

4.6.2.3 Anzahl und Einfluss der Mastplätze auf Infektionen mit Influenzavirus

4.6.2.4 Einfluss der Betriebsform auf die M. hyopneumoniae-Prävalenz 59 4.6.2.5 Einfluss der Betriebsform auf Infektionen mit Influenzavirus

4.6.2.6 Einfluss der Betriebsform auf Infektionen mit Influenzavirus

4.6.2.7 Einfluss der Einstallungsform auf die M. hyopneumoniae-Prävalenz 61 4.6.2.8 Einfluss der Einstallungsform auf Infektionen mit Influenzavirus

4.6.2.9 Einfluss der Einstallungsform auf Infektionen mit Influenzavirus

(7)

4.6.2.10 Einfluss der Ferkelherkunft auf die M. hyopneumoniae-Prävalenz 65 4.6.2.11 Einfluss der Ferkelherkunft auf Infektionen mit Influenzavirus

4.6.2.12 Einfluss der Ferkelherkunft auf Infektionen mit Influenzavirus

4.6.2.13 Einfluss der Produktionsverfahren auf die

M. hyopneumoniae-Prävalenz 68

4.6.2.14 Einfluss der Produktionsverfahren auf Infektionen mit Influenzavirus

4.6.2.15 Einfluss der Produktionsverfahren auf Infektionen mit Influenzavirus

4.7 Beziehung zwischen Lungenbefundung und dem jeweiligen Testsystem für M. hyopneumoniae und den beiden Influenzavirus Subtypen

(H1N1) und (H3N2) 74

4.7.1 Beziehung zwischen Lungenbefundung und M. hyopneumoniae-

Antikörpernachweisen 74

4.7.2 Beziehung zwischen Lungenbefundung und Influenzavirus H1N1-

4.7.3 Beziehung zwischen Lungenbefundung und Influenzavirus H3N2-

4.8 Geographische Verteilung einzelner Erreger respiratorischer Erkrankungen bei

Mastschweinen 77

4.8.1 Geographische Verteilung von M. hyopneumoniae 77 4.8.2 Geographische Verteilung von Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pp.) 79 4.8.3 Geographische Verteilung des

Influenzastammes A/swine/Bakum/5/95 (H1N1) 80 4.8.4 Geographische Verteilung des

Influenzastammes A/swine/Bakum/909/93 (H3N2) 81 4.9 Vergleich der Epidemiologie von M. hyopneumoniae mit denen von

Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pp.) nach POPPE (1997) und den beiden Influenzastämmen A/swine/Bakum/5/95 (H1N1) und A/swine/Bakum/909/93

(H3N2) nach SCHENK 2000 82

5 Diskussion 84

5.2 Vergleich der Serologie mit dem Immunfluoreszenztest und der Kultur 86 5.3 Vergleich der Serologie und des Immunfluoreszenztests mit der Sektion 87

5.4 Epidemiologische Studie 88

5.5 Lungenbefundung 90

5.6 Geographische Verteilung von M. hyopneumoniae 90 5.7 Vergleich der Epidemiologie von M. hyopneumoniae mit denen von

Actinobacillus pleuropneumoniae nach POPPE (1997) und den beiden Influenzavirusstämmen A/swine/Bakum/5/95 (H1N1) und

A/swine/Bakum/909/93 (H3N2) nach SCHENK (2000) 91

6 Zusammenfassung 94

7 Summary 96

8 Literaturverzeichnis 98

(8)

Abkürzungsverzeichnis

Abb. Abbildung

A. pp. Actinobacillus pleuropneumoniae Aqua dest. Aqua destillata (destilliertes Wasser)

Aqua tridest. Aqua tridestillata (3-fach destilliertes Wasser) BALF bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit

bp Basenpaare

-NAD -Nicotinamid-adenin-dinucleotid bzgl. bezüglich

bzw. beziehungsweise BO II-ELISA Bommeli II-ELISA cfu colony forming units d. h. das heißt

DNA Desoxyribonucleid Acid

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

EP Enzootische Pneumonie

fg femtogramm 10^-15

FITC Fluoresceinisothiocyanat

IFT Immunfluoreszenztest

Ig Immunglobulin

IBA Immuno-Binding-Assay

IVD Innovative Diagnostik Ig PO Immunglobulin Peroxidase

kDa kiloDalton

LT Lebenstag

LW Lebenswoche

MIRD Mycoplasma Induced Respiratory Disease M. hyo. Mycoplasma hyopneumoniae

n Anzahl der untersuchten Proben

ng nanogramm 10^-9

P. multocida Pasteurella multocida PBS phosphate buffered saline PCR polymerase chain reaction

PRDC Porcine Respiratory Disease Complex

PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome

RT Raumtemperatur

® registered

sm registered service mark SPF spezifisch pathogenfrei

Tab. Tabelle

™ trademark

v. a. vor allem

v/v volume per volumen

z. B. zum Beispiel

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1 Einleitung

Untersuchungen zur Enzootischen Pneumonie besagen eine weltweite Verbreitung des Erregers Mycoplasma (M.) hyopneumoniae.

Dieser verursacht erhebliche wirtschaftliche Verluste, v. a. durch eine Verschlech- terung der Futteraufnahme sowie Futterverwertung, damit Wachstumsminderung und somit Verlängerung der Mastdauer. Der ökonomische Verlust resultiert aus einer komplexen Interaktion zwischen M. hyopneumoniae und anderen Infektionen, schlechtem Management und schlechten Umweltbedingungen (ROSS 1999).

Da die Ausbreitung der Infektion weder durch eine antibiotische Behandlung noch durch Impfungen verhindert werden kann, besteht die einzige Möglichkeit, diese Erkrankung in den Griff zu bekommen, in der Eliminierung infizierter Schweine (HOWARD und TAYLOR 1985, SCHATZMANN et al. 1996, CALSAMIGLIA und PIJOAN 1998).

Die exakte Diagnostik ist jedoch ein Problem, da insbesondere Trägertiere oder chronisch infizierte Tiere mit den gängigen Methoden oft nicht erkannt werden.

Ein Ziel dieser Arbeit ist daher der Vergleich der bisher am häufigsten gebrauchten Nachweismethoden für M. hypneumoniae in Blut- und Lungenproben.

Ein weiteres Ziel ist die epidemiologische Untersuchung über die Verbreitung von M.

hyopneumoniae an Mastschweinen im Weser-Ems Gebiet aus dem Jahre 1996.

Abschließend sollen die gefundenen Ergebnisse mit den Ausbreitungsmustern von Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pp.) aus der Arbeit von POPPE (1996) und den Influenzastämmen A/swine/Bakum/5/95 (H1N1) und A/swine/Bakum/909/93 (H3N2) mit den Daten von SCHENK (2000) aus dem gleichen Probenpool von 1996 verglichen werden.

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2 Schrifttum

2.1 Mycoplasma (M.) hyopneumoniae

2.1.1 Ätiologie

Die zellwandlosen und daher pleomorphen Mykoplasmen passieren die üblichen bakteriendichte Filter, da sie mit 0,1-0,3 µm Durchmesser die kleinsten Mikroorganismen sind, die sich außerhalb von Zellen selbständig vermehren können (BISPING und AMTSBERG 1988, ROLLE und MAYR 1993, 2002).

Für Mensch und Tier von besonderer Bedeutung ist die Familie der Mykoplasmataceae, die zur Klasse der Mollicutes und der Ordnung Mykoplasmatales gehören. Von diesen stellt die Gattung Mycoplasma mit ihren ca. 100 Arten die wohl wichtigste Gruppe dar.

Mykoplasmen sind überwiegend harmlose Parasiten der Schleimhäute, vor allem im Respirations- und Urogenitaltrakt, kommen aber auch im Euter und in den Gelenken vor. Neben den vielen apathogenen Mykoplasmaarten gibt es jedoch viele Spezies, die als Sekundärerreger bekannt sind, und einige, die als primäre

Krankheitserreger isoliert wurden (ROLLE und MAYR 1993, RAZIN et al. 1998). Für das Schwein gelten die folgenden vier Arten als bedeutend:

1. M. flocculare

2. M. hyopneumoniae 3. M. hyorhinis

4. M. hyosynoviae

Von besonders großer Bedeutung für das Schwein ist dabei M. hyopneumoniae.

Zwei unabhängig voneinander arbeitende Forschergruppen in England und den U.S.A. (GOODWIN et al. sowie MARÉ und SWITZER) gelang 1965 der Beweis, dass dieses Bakterium als der primäre Erreger der Enzootischen Pneumonie der Schweine anzusehen ist.

Die kulturelle Anzüchtung der Mykoplasmen ist sehr aufwändig, da sie extreme Nährbodenansprüche stellen, u.a. benötigen sie Bausteine der DNA, Cholesterin, enthalten in den zugesetzten Tierseren (v.a. Pferdeserum), und Hefeextrakt. Hinzu kommt die relativ lange Bebrütungszeit von mindestens zehn Tagen (BISPING und AMTSBERG 1988, ROLLE und MAYR 1993, 2002). Beim Gelingen der Anzucht von M. hyopneumoniae zeigen sich dann sehr kleine Kolonien mit 0,25–1 mm Durchmesser (ROLLE und MAYR 1993, 2002), die jedoch nicht wie die meisten Mykolasmen ein spiegeleiförmiges, d.h. biphasisches Wachstum (WHITTLESTONE 1979), sondern eine homogene Kolonieoberfläche aufweisen.

Die Isolierung von M. hyopneumoniae wird nach WHITTLESTONE (1979) und ROLLE und MAYR (1993) zudem oft noch durch die Anwesenheit und das schnellere Wachstum von M. hyorhinis, der nach ROLLE und MAYR (1993) als ein häufiger Begleiter auf der Bronchialschleimhaut anzusehen ist, erschwert. Seine Beteiligung am Krankheitskomplex wurde schon 1991 von FALK und Mitarbeitern vermutet, und ist nach ROLLE und MAYR (2002) mittlerweile nicht mehr auszuschließen.

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Anhand der typischen biochemischen Merkmale für M. hyopneumoniae, wie der Sterolabhängigkeit, der Glukosefermentation, einer fehlenden Arginin- und Harnstoffhydrolyse etc. kann eine Artbestimmung versucht werden, größere Sicherheit bringt aber (ROLLE und MAYR 2002) die serologische Differenzierung von Mykoplasmen, wobei das Arbeiten mit DNA-Sonden und der PCR zunehmend an Bedeutung gewinnt.

2.1.2 Epidemiologie

Die Enzootische Pneumonie ist eine der häufigsten und ökonomisch wichtigsten Erkrankung der Schweine. Sie ist in der ganzen Welt verbreitet (SIMECKA et al.

1992, MAES et al. 1996, ROSS 1999). Fast 50 % aller Mastschweine weisen Lungenveränderungen auf, die auf eine Enzootische Pneumonie zurückgehen (WHITTLESTONE 1972, EICH und SCHMIDT 2000). Dieser Prozentanteil liegt aber wahrscheinlich höher, denn nach WALLGREN et al. (1993, 1994) werden abgeheilte Lungenläsionen früher Infektionen bei der Schlachtung oft nicht erkannt und damit registriert. BERNER (1995) sowie PFÜTZNER und BLAHA (1995) gehen davon aus, dass ein hoher Prozentanteil deutscher Betriebe mit M. hyopneumoniae infiziert ist.

Dies konnte 1997 durch HORST et al. bestätigt werden. Sie zeigten, dass der Anteil seropositiver Bestände in den einzelnen Bundesländern bei 75-100 % liegt. In Belgien beträgt die mittlere Seroprävalenz auf Herdenbasis 88 % (MAES et al. 1999).

In Skandinavien sind die Herden-Prävalenzen mit 39 % im Westen Finnlands (RAUTIAINEN 1998) und in Dänemark mit 30 % (SØRENSEN et al. 1992b) deutlich geringer.

Die Infektion mit M. hyopneumoniae erfolgt als Tröpfcheninfektion entweder direkt durch das Nasensekret kranker Tiere oder über ein Aerosol in der Atemluft (WHITTLESTONE 1979, LEON et al. 2001). Der Nachweis einer in-utero Infektion fehlt (DONE 1996). Das Bakterium überlebt besonders gut im Regenwasser bei niedrigen Temperaturen, also in feucht-kalter Luft, so dass eine Tendenz für beginnende Ausbrüche im Herbst und Winter zu beobachten sind (GOODWIN 1985).

Neben den klimatischen Bedingungen spielen für die Einschleppung von M.

hyopneumoniae in einen Betrieb, bzw. für die generelle Verbreitung dieser multifaktoriellen Erkrankung, eine ganze Reihe von weiteren Faktoren eine große Rolle, wie die Luftübertragung über mehrere Kilometer, der Zukauf subklinisch infizierter Tiere und der Tiertransport, v. a. von Schlachtschweinen (GOODWIN 1985, STÄRK et al. 1992, 1998, MAES et al. 2000, HEGE et al. 2002).

Unterschiedliche Managementsysteme, das Stallklima sowie eine hohe Schweinedichte im Bestand bzw. in der Region sind prädisponierend (STÄRK et al.

1992, BERNER 1995, DONE 1996, ROSS 1999). Ein besonderes Infektionsrisiko stellt dabei (STÄRK et al. 1992, DONE 1996) die Größe und die Entfernung des nächsten infizierten Nachbarbetriebes dar. Ein weiterer beeinflussender Faktor ist nach STÄRK et al. (1992) und DONE (1996) die Topographie. Hier bilden so genannte „Hanglagen“ der Betriebe und isolierte Standorte außerhalb einer Gemeinde einen gewissen Schutz vor einer Infektion mit M. hyopneumoniae. Nach BATISTA et al. (2002) kann die Übertragung von M. hyopneumoniae über exponierte Personen durch das Tragen von betriebseigener Schutzkleidung und Stiefeln sowie Duschen und Kleiderwechsel zwischen den Bestandsbesuchen verhindert werden.

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BESKOW und Mitarbeiter (1998) untersuchten die Schnelligkeit der Ausbreitung einer Mykoplasmeninfektion. Sie kamen dabei zu dem Schluss, dass diese eher von dem Antikörperstatus der Ferkel bei der Einstallung abhängig zu sein scheint als z.

B. vom Stallklima. Die Schwierigkeit der Bekämpfung der Enzootischen Pneumonie spiegelt v. a. die jährliche Reinfektionsrate wieder. Sie beträgt nach WHITTLESTONE (1990) 5–10 %. Im Jahre 2000 lag sie in der Schweiz bei immerhin 2,6 % (HEGE et al. 2002). Als Hauptursache dafür nennen die Schweizer Autoren den Zukauf von Tieren, aerogene Infektionen und chronisch unentdeckte Infektionen in der Herde.

Nach SØRENSEN et al. (1994b) können die ersten Symptome einer Infektion in einer Herde klinische Symptome, positive serologische Befunde oder pneumonische Läsionen bei der Schlachtung sein. Sehr oft verkompliziert sich eine Mykoplasmenpneumonie durch bakterielle Sekundärinfektionen (MAES et al. 1996, SØRENSEN et al. 1997), so dass man in diesem Zusammenhang besser von der Mycoplasma Induced Respiratory Disease (MIRD) spricht (BÆKBO et al. 1994, PFÜTZNER und BLAHA 1995, ROLLE und MAYR 2002). Nach CLARK (1999) beschreibt der Name Porcine Respiratory Disease Complex (PRDC) die Erkrankung noch treffender, denn Viren, hauptsächlich das Influenza-Virus, das PRRS (Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome)-Virus und das PRC (Porcine Respiratory Corona)-Virus, initiieren den Lungenschaden. M. hyopneumoniae verstärkt die bakteriellen Sekundärinfektionen, und es entsteht eine sehr ernste respiratorische Erkrankung. So soll M. hyopneumoniae selbst nach Untersuchungen von THACKER et al. (1999) sowie OPRIESSNIG und HALBUR (2004) die Schwere und Dauer einer PRRS-induzierten bzw. einer PCV2 (Porcine Circo-Virus Type 2)-induzierten Viruspneumonie potenzieren. Neuere Untersuchungen von THANAWONGNUWECH und THACKER (2003) ergaben unter anderem einen signifikanten Anstieg des Cytokins Interleukin-12 (Il-12) in Schweinen mit beiden Infektionen. Dadurch könnte ihrer Meinung nach die Fähigkeit des Immunsystems beeinträchtigt werden, PRRS aus der Lunge zu eliminieren. Dies würde die verlängerte Präsens von PRRS und die Verstärkung der Pneumonie in dualinfizierten Schweinen erklären. Nach Untersuchungen von THACKER et al. (2001) wird dagegen eine Influenza- Virusinfektion im Gegensatz zur PRRS-Virusinfektion nicht von M. hyopneumoniae potenziert. ROSS und Young (1993) konnten wiederum in ihren Untersuchungen zeigen, dass eine Anfälligkeit der Schweine für Actinobacillus pleuropneumoniae (A.

pp.) durch eine M. hyopneumoniae-Infektion verstärkt wird.

Dabei führen nicht nur offensichtliche Pneumonien, sondern auch subklinische Infektionen durch Reduktion der Wachstumsrate und der Futterverwertung, zu erheblichen wirtschaftlichen Einbußen (POINTON et al. 1985, STRAW et al. 1989, REGULA et al. 2000). In diesem Zusammenhang scheinen besonders Sekundärinfektionen und Umweltfehler eine besondere Rolle zu spielen (RAUTIAINEN et al. 2000b, ESCOBAR et al. 2002). CLARK et al. 1991 schätzen, dass die Enzootische Pneumonie der nordamerikanischen Schweineindustrie Kosten in Höhe von $ 200 Millionen bis zu $1 Milliarde jährlich verursachen. Nach ROSS (1999) ist der ökonomische Verlust assoziiert mit dieser Erkrankung das Resultat einer komplexen Interaktion zwischen den Mykoplasmen und anderen Infektionen, schlechtem Management und schlechten Umweltbedingungen.

Nach CLARK et al. (1991) übertragen erkrankte oder infizierte Sauen M.

hyopneumoniae auf wenigstens einige ihrer Ferkel. Die Sau ist allerdings nicht als Hauptübertragungsquelle anzusehen (SHELDRAKE et al. 1990, ROSS 1992, 1999).

Als eine weitere Möglichkeit ist die Übertragung zwischen Wurfgeschwistern und zwischen den Würfen in der Aufzuchtphase anzusehen. Eine besonders wichtige

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Stellung nimmt die Infektion der Mastläufer, vorwiegend durch ältere Mastschweine, ein (CLARK et al. 1991). Wie schon GROßE BEILAGE (1999) zeigen konnte, verdeutlichen auch die Untersuchungen von RAUTIAINEN et al. (2000b) die Bedeutung der erst im Verlauf der Mast erfolgenden Ausbreitung der M.

hyopneumoniae-Infektion. In zwei Mastbeständen stieg die Seroprävalenz von anfänglich 6 auf 54 % bzw. von 31 auf 81 % respektive zum Ende der Mastperiode.

Nach ROSS (1992, 1999) trägt die lange Inkubationsperiode, die langsame Ausbreitung der Organismen in den Würfen, die Zunahme der Tierdichte, die Ausbreitung anderer infektiöser Keime und Umweltfaktoren dazu bei, dass nach dem Absetzen die Prävalenz der M. hyopneumoniae-Erkrankung bei Läufer und Mastschweinen am höchsten ist. RAUTIAINEN et al. (2001) stellten fest, dass v.a.

geschlossene Betriebe und Mastbetriebe mit kontinuierlicher Belegung ein konstantes Risiko für eine M. hyopneumoniae-Infektion auf andere Herden, durch Tiertransport, Verkauf von Mastläufern und enger Nachbarschaft der Betriebe, darstellen.

2.1.3 Pathogenese

M. hyopneumoniae produziert eine chronische, lymphohistiozytäre Broncho- pneumonie bei Schweinen (THACKER et al. 1999). Nach natürlicher Infektion reicht die Inkubationszeit von 10-16 Tagen bis zu 3-5 Monaten (BETTS 1952, GOODWIN 1984) und scheint damit abhängig von der Antigendosis zu sein (BARFOD 1994).

Nach experimentell induzierter Infektion liegt die Inkubationszeit gewöhnlich bei 7-10 Tagen (WHITTLESTONE 1985).

Die Tröpfcheninfektion führt zu einer bronchogenen Ausbreitung und zur Anheftung des Erregers an die Oberflächen des Flimmerepithels von Trachea, Bronchien und Bronchiolen (ROLLE und MAYR 1993, 2002). KWON und Mitarbeiter (2002) konnten im Rahmen eines Infektionsversuches durch in situ Hybridisation die DNA von M.

hyopneumoniae eine Woche post inoculationem in bronchialen und bronchiolären Epithelzellen und eine weitere Woche später in alveolären und interstitiellen Makrophagen und Typ I Pneumozyten nachweisen. Starke Hybridisationssignale konnten hauptsächlich an der luminalen Oberfläche der Bronchialepithelzellen entdeckt werden. Wie jedoch schon GOODWIN (1972) vermutete, konnten UTRERA und Mitarbeiter (2002a) in einem in vitro Versuch in zwei verschiedenen genetischen Schweinezuchtlinien, die sich im übrigen als sehr resistent gegenüber der Kolonisierung von M. hyopneumoniae zeigten, Unterschiede in den Ausmaßen der von Mykoplasmen besetzten Tracheen zwischen Ferkelwürfen feststellen. Des Weiteren schien auch das Geschlecht der Tiere bei der Ausprägung eine Rolle zu spielen. Hier bedarf es weiterer Klärung.

Elekronenmikroskopische Untersuchungen ergaben, dass die Mykoplasmen bis ca.

einen Monat nach experimenteller Infektion am zahlreichsten vorliegen, und zwar hauptsächlich zwischen den Zilien des Bronchiolarepithels und nur selten in den Alveolen (BERTSCHINGER et al.1972, WHITTLESTONE 1972).

Für die Adhärenz von M. hyopneumoniae an den Zilien scheinen nicht nur strahlenförmige Fibrillen auf der äußeren Membranoberfläche der Bakterien (TAJIMA und YAGIHASHI 1982, BLANCHARD et al. 1992) sowie spezielle Strukuren - ZHANG und Mitarbeiter konnten dort 1995 ein Adhesin identifizieren - eine Rolle zu spielen, sondern auch spezifische Strukturen auf der Zilienoberfläche, die als Glyko- lipidrezeptoren für die Bakterien funktionieren (ZHANG et al. 1994). Nach ZIELINSKI und ROSS (1993) sind auch unspezifische hydrophobische Interaktionen am

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Anheftungsprozess beteiligt. Diese zumindest enge Assoziation von M.

hyopneumoniae an das zilientragende Epithel, unterstützt durch die den Mykoplasmen eigene Pleomorphie durch das Fehlen einer Zellwand (HOWARD und TAYLOR 1985), scheint die folgende Ziliostase mit Verlust der Zilien zu induzieren (MEBUS und UNDERDAHL 1977, BLANCHARD et al. 1992, DE BEY und ROSS 1994). Der exakte Zerstörungsvorgang ist noch nicht genau geklärt, u.a. soll auch ein zytopathischer Faktor, lokalisiert auf der Membran von M. hyopneumoniae (GEARY und WALCZAK 1985), beteiligt sein. HOWARD und TAYLOR (1985) vermuten hingegen, dass die Freisetzung von toxischen Produkten zur Zellzerstörung führt.

Durch Desquamation der Epithelzellen, besonders der Alveolarepithelzellen mit folgendem Mangel des Surfactants (produziert von den Typ II Pneumozyten), kommt es zur Störung der mukoziliären Clearance. Ein weiterer wichtiger Faktor der pathogenen Kapazität von M. hyopneumoniae liegt nach ADEGBOYE (1978) in der Unterdrückung der zellulären Immunabwehr. CARUSO und ROSS konnten 1990 zeigen, dass eine Suppression des Phagozytosepotentials der Alveolarmakrophagen bei einer Sekundärinfektion auftritt. Hieraus resultiert eine Begünstigung der Anheftung von Sekundärerregern. In der Regel führt dies zu ausgeprägteren Erkrankungsformen (CIPRIÁN et al. 1988, AMASS et al. 1994, BERNER 1995, THACKER et al. 1999).

M. hyopneumoniae hat nicht nur eine immunsuppressive Wirkung sondern auch eine immunstimulierende (MESSIER et al. 1990) und zwar kommt es durch die Infektion zu einer zunehmenden Anhäufung von Lymphozyten im perivaskulären und peribronchialen Raum. Weiterhin induziert M. hyopneumoniae nach neueren Untersuchungen von ESCOBAR und Mitarbeitern (2002) einen signifikanten Anstieg des inflammatorischen Zytokins Interleukin-1beta (Il-1 ß) und einen statistisch nicht ät des Wirtes trägt zu einem großen Teil an der Entstehung der pathologischen Läsionen bei.

Über eine mögliche Variabilität der Virulenz von M. hyopneumoniae ist bislang noch recht wenig bekannt. So stellten ARTIUSHIN und MINION (1996) eine genetische Heterogenität in den von ihnen untersuchten Feldisolaten von M. hyopneumoniae fest, konnten aber eine gesicherte Korrelation dieser Heterogenität mit der Virulenz nicht überprüfen. VICCA und Mitarbeiter (2002a, b) untersuchten das Infektions- muster von M. hyopneumoniae anhand von fünf klinisch infizierten Herden mit guten und fünf subklinisch infizierten Herden mit schlechten Haltungs- und Managementbedingungen. Da die Seroprävalenzen in den klinisch infizierten Herden höher waren, und sich die meisten Schweine dort in einem jüngeren Alter mit M.

hyopneumoniae angesteckt hatten, folgerten sie, dass eine ziemlich hohe Variation der Virulenz zwischen den Feldisolaten vorliegt, wie schon ROSS (1996) vermutete.

Virulenzmarker könnte ein 5000 bp Fragment, gewonnen mit der arbitrarily primed- PCR (AP-PCR), sein. Weitere Untersuchungen müssen folgen (VICCA et al. 2002a).

2.1.4 Klinik

Die Enzootische Pneumonie ist eine ansteckende respiratorische Erkrankung, charakterisiert durch einen chronischen Husten, Wachstumsverzögerung, einer hohen Morbidität von 30 bis 80 % aller Schweine und einer Mortalität, die gegen Null geht (SIMECKA et al. 1992, MAES et al. 1996, SIEVERDING 2000). Generell sind Schweine aller Altersklassen anfällig für eine Infektion mit M. hyopneumoniae, wobei sich die Schweine innerhalb einer Herde gewöhnlich in den aller ersten Lebens-

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wochen infizieren (GOODWIN und WHITTLESTONE 1967, SIMECKA et al. 1992).

PIFFER und ROSS (1984) untersuchten Ferkel im Alter von 3, 6 und 12 Wochen und konnten keinen Unterschied in der Anfälligkeit finden, während nach STRASSER et al. (1992) zwei Wochen alte Schweine nach experimenteller Infektion schwerer erkrankten als acht Wochen alte Tiere. Gewöhnlich breitet sich die Erkrankung unter den Tieren langsam aus. Ferkel unter sechs Wochen sind meistens noch nicht betroffen. Hauptsächlich erkranken Schweine im Alter von drei bis sechs Monaten, d.

h. bei Läufern und Mastschweinen ist die Hustenintensität oft am größten (ROSS 1992, DONE 1996, ROSS 1999), wobei nach BAHNSON et al. (1996) ein spät einsetzender und lang andauernder Husten mit einer hohen Prävalenz der Lungenveränderungen zum Mastende korreliert.

Die Dauer der aktiven Infektion wird von WALLGREN et al. 1994 auf ca. 12 Wochen geschätzt. Der Husten tritt erstmalig 6-21 Tage post infektionem (BERTSCHINGER et al.1972, WHITTLESTONE 1985, ABIVEN et al. 1990, BEREITER et al. 1990, KOBISCH et al. 1993, FEENSTRA et al. 1994, SØRENSEN et al. 1997) auf, erreicht ein Maximum zwischen 3. und 4. Woche (FEENSTRA et al. 1994, SØRENSEN et al.

1994b, 1997) und hört ca. zwei Monate post infektionem auf, bzw. ist danach nur noch sporadisch zu beobachten (BERTSCHINGER et al. 1972, SØRENSEN et al.

1997) in Abhängigkeit vom Immunstatus des Tieres und dem Herdenmanagement (MAES et al. 1996). Nach SØRENSEN et al. (1994b) besteht nicht nur eine Korrelation zwischen dem Auftreten von Husten und der Entwicklung einer Pneumonie, sondern die Pneumonie verhält sich auch, parallel zur Abnahme des Hustens, rückläufig.

Eine M. hyopneumoniae-Infektion ist zwar selten unkompliziert, ist dann aber gewöhnlich subklinisch oder charakterisiert durch einen trockenen, unproduktiven Husten, der meistens bemerkt wird, wenn die Schweine plötzlich nach einer Ruheperiode aktiv werden, geringgradigem Fieber und Anorexie (MAES et al. 1996, RUNNELS 1988). Bei einer Mykoplasmenpneumonie begleitet von einer Sekundärinfektion, z. B. durch Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Arcanobacterium pyogenes, Streptococcus- und Staphylococcus-Spezies, aber auch Wanderlarven von Ascaris suum in der Lunge, ist gewöhnlich ein größerer Anteil der Lunge betroffen. Dies spiegelt sich meistens in einem mehr feuchten Husten, hohem Fieber, Anorexie, hochgradiger Atemnot bis hin zu Todesfällen, aber auch ungleiches Wachstum bzw. Wachstumsstillstand und ein rauhes Haarkleid wieder (RUNNELS 1988, MAES et al. 1996, SIEVERDING 2000). Nach PLONAIT (1988) werden Schwere und Verlauf dieser Erkrankung dann zu einem großen Teil vom Stallklima und Infektionsdruck bestimmt.

2.1.5 Immunität

Auf eine M. hyopneumoniae-Infektion folgt eine adequate Immunantwort auf ein breites Spektrum virulenter Faktoren und zwar nicht nur systemisch, sondern auch lokal (ROSS und YOUNG 1993). Es kommt zum Aufbau einer Resistenz (KOBISCH und FRIIS 1996) in den Schweinen. Die Serokonversion tritt dabei ungefähr zur gleichen Zeit wie der Husten (LEON et al. 2001), bzw. nach SØRENSEN et al.

(1994b) durchschnittlich neun Tage nach Hustenbeginn auf. In dem von BAHNSON al. (1994) entwickeltem Modell verläuft die Höhe des Antikörpertiters parallel zu den Lungenläsionen und zum Husten.

Die ersten Serumantikörper können sich schon nach 8-46 Tagen post infektionem entwickeln, wobei 50 % der untersuchten spezifisch pathogenfreien (SPF)-Schweine

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innerhalb der ersten drei Wochen serokonvertierten (KOBISCH et al. 1993, BARFOD et al. 1994, DONE 1996). Der Höhepunkt der Antikörperproduktion ist nach 10-12 Wochen (KOBISCH et al. 1993, DONE 1996) erreicht. Danach erfolgt eine graduelle Abnahme, und einzelne Immunglobuline können ein bis drei Jahre persistieren (BEREITER et al. 1990, KOBISCH et al. 1993, DONE 1996, RAUTIAINEN et al.

2000a). Bei einer natürlichen Infektion kann die Serokonversion (SØRENSEN et al.

1993), in Abhängigkeit vom Managementsystem, nach drei bis fünf Wochen auftreten. Nach Untersuchungen von WALLGREN und SCHWAN (1994) serokonvertierten vier Monate alte Schweine in einem geschlossenen Zuchtbetrieb innerhalb 50–70 Tagen nach Einstallung mit älteren infizierten Tieren.

Im Serum können erstmalig zwei Wochen nach experimenteller Infektion Antikörper der Klasse IgG entdeckt werden (SUTER et al. 1985, STRASSER et al. 1992). Nach HOLMGREN (1974a) bestanden die Serumantikörper zwei bis vier Wochen post infektionem aus den Ig-Klassen G und hochmolekularem IgA. In den tracheo- bronchialen Sekreten zeigten die Immunglobuline der Klassen IgA, IgG, IgM zwei Wochen post infektionem nach SUTER et al. (1985) erhöhte Werte. Hier erreichten die Antikörper der IgM- und IgG-Klasse fünf Wochen nach Infektion ihre Maximalwerte und herrschten somit in der frühen Phase der Infektion vor, während die Antikörper der IgA-Klasse im Verlauf des achtwöchigen Experiments stetig zunahmen. Nach MESSIER et al. (1990) bestanden die Antikörper in Lungen- spülungen von Schweinen zwei bis sechs Wochen post infektionem hauptsächlich aus IgG und IgA Isotypen.

Das Kolostrum der Muttersauen besteht in den ersten 6 Stunden nach dem Abferkeln, neben IgM und IgA, hauptsächlich aus dem Immunglobulin G (KLOBASA 1987). Dieses Kolostrum verleiht den neugeborenen Ferkeln, zumindest bis zu einem Alter von zwei Wochen, einen kompletten passiven Schutz unabhängig vom Alter und dem Immunstatus der Sauen (RAUTIAINEN et al. 1998, WALLGREN et al.

1998). Die Persistenz der maternalen Antikörper bezieht sich letztlich auf die Höhe der Antikörper im Serum der Sauen, deren Höhe auch wiederum vom Alter der Sau abhängig zu sein scheint (MORRIS et al. 1994, ZIMMERMANN und WEISKOPF 1996) und variiert so zwischen Würfen (WALLGREN et al. 1998). Nach MORRIS et al. (1994) beträgt die mittlere Halbwertzeit der M. hyopneumoniae-Antikörper 15,8 (8,3-28,4) Tage in Abhängigkeit von der initialen Konzentration der passiv erworbenen Antikörper im Ferkel. In Bezug auf den Zeitpunkt einer prophylaktischen Impfung sind dabei an die suppressiven Effekte maternaler Antikörper zu denken (MORRIS et al. 1994, HODGINS et al. 2002).

Im weiteren Verlauf verfügen Schweine besonders zu Beginn der Mastperiode nur über eine niedrige Antikörperkonzentration (LEON et al. 2001). Das ist, nach Untersuchungen dieser Autoren in drei geschlossenen Betrieben, die kritische Periode für eine Übertragung von M. hyopneumoniae.

2.1.6 Pathologie

Ein bis zwei Wochen nach experimenteller Infektion von Schweinen mit M.

hyopneumoniae können die ersten für eine Mykoplasmenpneumonie typischen makroskopischen Lungenveränderungen zu sehen sein (WHITTLESTONE 1972, 1985, BLANCHARD et al. 1992, KOBISCH et al. 1993). Im ersten Monat post infektionem zeigten bei SPF-Schweinen vorwiegend die ventralen Abschnitte der Spitzen- und Mittellappen verfestigte Bezirke, die farblich von rot bis dunkelrot, über blaßrot bis blaßgelb zu blaßgrau reichen (BERTSCHINGER et al.1972,

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WHITTLESTONE 1972, 1985, FEENSTRA et al. 1994). Die meist scharf lobulär begrenzten Herde waren im Anschnitt saftreich und nicht erhaben. In einigen zeigte sich lufthaltiges eingesprengtes Gewebe. Nur aus den Bronchien makroskopisch veränderter Lungenlappen ließ sich trüber, weißlicher Schleim auspressen, der meist auch in der Trachea zu sehen war. Die Pleura zeigte nie eine Veränderung, und die Bronchiallymphknoten waren leichtgradig geschwollen (BERTSCHINGER et al.

1972). Die makroskopischen Lungenveränderungen können bei SPF-Schweinen nach BERTSCHINGER et al. (1972) schon innerhalb von zwei Monaten ver- schwinden. Länger vorhandene Veränderungen zeigten sich dann als wenig ausgedehnte band- oder sternförmige Einziehungen der Lungenoberfläche. Nach KOBISCH und NICOLET (1987) sowie KOBISCH et al. (1993) sind Reparations- vorgänge 7-10 Wochen post infektionem erkennbar. Eine vollständige Abheilung kann nach WHITTLESTONE (1972, 1985) neun Monate und länger dauern. Nach Abheilung sind bei makroskopisch negativem Lungenbefund aber histologisch meist immer noch deutliche Läsionen sichtbar (BERTSCHINGER et al. 1972).

Sehr oft verkompliziert sich diese Lungenerkrankung durch bakterielle Sekundärinfektionen. Dies kann zu ausgedehnteren Läsionen bis hin zur Perikarditis, Pleuritis und Abszedierungen (CIPRIÁN et al. 1988, AMASS et al. 1994, SØRENSEN et al. 1997, SIEVERDING 2000) führen.

Die histologische Untersuchung in der frühen Phase der Infektion zeigt das Bild einer Pneumonie, charakterisiert durch eine bronchioläre und lymphorretikuläre Hyper- plasie mit einer zunehmenden perivaskulären Akkumulation mononuklearer Zellen (BLANCHARD et al. 1992). Die Bronchiolen und Alveolen enthalten anfangs polymorphkernige neutrophile Granulozyten. Es kommt zur Proliferation und Vergrößerung von Alveolarzellen mit Vakuolen im Zytoplasma. Nach WHITTLESTONE (1972, 1985) ist dies eine der auffälligsten Merkmale der Enzootischen Pneumonie. Im weiteren Verlauf akkumulieren Lymphozyten, Histiozyten und Plasmazellen erst im perivaskulären und dann im peribronchiolären Gewebe. In der etablierten Pneumonie entwickelt sich ein alveoläres Exsudat, und es kommt zur Proliferation von lymphoretikulärem Gewebe im perivaskulären und besonders im peribronchiolären Gewebe. Nach HODGES et al. (1969) ist das alveoläre Exsudat ein signifikantes Merkmal für die Dissemination von M.

hyopneumoniae. DONE (1996) beschreibt dagegen das Vorliegen von Exsudat als variabel und seinen Untersuchungen zufolge ist es gewöhnlich in unkomplizierten, einfachen Mykoplasmeninfektionen nicht vorhanden. Die so um Bronchien und Bronchiolen zirkulär ausgebildeten Infiltratmäntel können die einzelnen Bronchiolen deutlich einengen und sich häufig auch auf die benachbarten Alveolarsepten fortsetzen. Diese Infiltratmäntel enthalten in der Regel die eigentlichen Lymphfollikel.

Das zelluläre Exsudat enthält nun weniger polymorphkernige neutrophile Granulo- zyten, dafür aber mehr Plasmazellen. In den Reparationsvorgängen kommt es gewöhnlich an den Spitzen der apikalen und kardialen Lungenlappen zu flachen Fissuren, entstanden aus kollabierten Alveolen neben alveolären Emphysemen. Das alveoläre Exsudat verschwindet, und die Hyperplasie des Bronchialepithels bildet sich mit der Zeit zurück (BERTSCHINGER et al.1972, WHITTLESTONE 1972, 1985).

Auch die Sekundärinfektionen führen zu veränderten histologischen Befunden, wie z.

B. einer Betonung der exsudativen Komponente (CIPRIÁN et al. 1988).

Nach HURNIK et al. (1993) hat die makroskopische Beurteilung der Lunge nach M.

hyopneumoniae-verdächtigen Veränderungen, verglichen mit der histologischen Untersuchung als „Golden Standard“, nur eine Sensitivität von 76 % und eine Spezifität von 71 %.

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2.1.7 Diagnose

Klinische Symptome einer M. hoypneumoniae-Infektion erlauben nur eine Verdachts- diagnose. Die Lungenläsionen sind zwar charakteristisch, aber nicht patho- gnomonisch (ROSS 1992, ARMSTRONG 1994, ROSS 1999). ZIMMERMANN et al.

(1989) sowie ZIMMERMANN (1990) sind der Überzeugung, dass Mischmas- tversuche, Kontrollschlachtungen und die ELISA-Serologie für eine sichere Diagnose ausreichen und sogar latente Infektionen aufdecken können. Nach ARMSTRONG (1994) wird für die definitive Diagnose der Enzootischen Pneumonie ein positives Ergebnis in der Immunfluoreszenz oder ein kultureller Erregernachweis gefordert.

ROSS (1996) empfiehlt für die Diagnose bei dem Ausbruch einer akuten Infektion im Rahmen der PRDC die ELISA-Serologie, und zwar die Anfertigung eines Serum- profils zur Dokumentation der Antikörper und des Antikörper-Titeranstiegs bei gleichzeitigem Anstieg der klinischen Symptome. Für die Bestätigung der Diagnose sollte die Histopathologie verbunden mit dem Immunfluoreszenztest angewendet werden.

Folgende Laboruntersuchungen stehen für einen Antikörper- bzw. Erregernachweis zur Verfügung.

2.1.7.1 Nachweis spezifischer Antikörper

Für den Nachweis von spezifischen Antikörpern sind verschiedene Testsysteme entwickelt worden, u. a. sind das der indirekte Hämagglutinationstest, die Komplementbindungsreaktion und der Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Vergleichsuntersuchungen der verschiedenen Techniken sind mehrfach unternommen worden.

So zeigte sich der indirekte Hämagglutinationstest relativ unsensitiv bei der Untersuchung von kontaktinfizierten Schweinen und technisch umständlich und war damit ungeeignet als praktischer Feldtest (ARMSTRONG et al. 1983, FREEMAN et al. 1984b, FELD et al. 1992).

Mit der Komplementbindungsreaktion können v. a. frühe Antikörper gegen M.

hyopneumoniae nachgewiesen werden (ARMSTRONG et al. 1983, BEREITER et al.

1990), aber für den Nachweis der späten Antikörperantwort war sie am unzuverlässigsten (ARMSTRONG et al. 1983, MORI et al. 1987). Für beide Testsysteme konnten FREEMAN et al. (1984a) Kreuzreaktionen zwischen M.

hyopneumoniae, M. flocculare und M. hyorhinis feststellen.

Letztlich stellte sich der ELISA als der sensitivste und als der am einfachsten handzuhabende diagnostische Test heraus (ARMSTRONG et al. 1983, PIFFER et al.

1984, KOBISCH und NICOLET 1987, FELD et al. 1992, KENNY 1992, SØRENSEN et al. 1992a, 1992b). Auch eine Untersuchung von Kolostrumproben ist mit dem ELISA möglich (NICOLET et al. 1990, SØRENSEN e t al. 1992a, 1992b, LEVONEN 1994). Von Vorteil ist dabei, dass im Kolostrum eine z. T. bis zu fünf mal höhere Antikörper-Konzentration vorliegt als im Serum. Daher ist die Kolostrum-Serologie für die Herdenkontrolle von Bedeutung (CHASTTONAY 1988, SØRENSEN et al. 1992a, YAGIHASHI et al. 1993, MORRIS et al. 1994, RAUTIAINEN et al. 2000a). Der ELISA hat viele Vorteile, aber er ist abhängig von der Fähigkeit des Schweins, die für ihn spezifischen Antikörper zu produzieren (SIMECKA et al. 1992). Weiterhin zeigten sich auch beim ELISA Kreuzreaktionen zwischen M. hyopneumoniae und den obengenannten Mykoplasmen sowie M. hyosynoviae (FREEMAN et al. 1984a). Je nach Testsystem und abhängig vom Versuchsaufbau sind Antikörper gegen M.

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hyopneumoniae erstmals ab dem 8. Tag bis zu sieben Wochen und längstens bis zu ein bis drei Jahren nachweisbar (ARMSTRONG et al. 1983, BEREITER et al. 1990, BARFOD et al. 1994, LE POTIER et al. 1994, FUTO et al. 1995, WALLGREN et al.

1996, RAUTIAINEN et al. 2000a). Da jedoch nicht jedes mit M. hyopneumoniae subklinisch infizierte Schwein bzw. Trägertier einen mit diesem Testsystem detektierbaren Antikörper-Titer aufweist, ist der ELISA ungeeignet für die Einzeltier- diagnostik und damit für Eradikationsprogramme. Für die Herdendiagnostik und Herdenüberwachung hat er sich jedoch bewährt (RUNNELS 1988, WHITTLESTONE 1990, VAN AKEN und GEERTS 1992, ARMSTRONG 1994).

Eine Verbesserung der Spezifität des von BRUGGMANN et al. (1977) entwickelten ELISAs, bei dem ein mit Natriumdodecylsulfat gelöster Extrakt von M.

hyopneumoniae als Antigen verwendet wird, konnte erst durch Reinigung dieses Antigens mit Tween 20 erreicht werden (NICOLET et al. 1980, BOMMELI und NICOLET 1983). Nach NICOLET et al. (1990) ist dieser Tween 20-ELISA eine sehr sensitive Methode und erlaubt auch eine Diagnose der Infektion ohne Schwierig- keiten in chronisch infizierten Herden, allerdings nur auf Herdenbasis. SHELDRAKE und ROMALIS (1992) ermittelten für diesen ELISA auf Einzeltierbasis eine Sensi- tivität von 95,6 % und eine Spezifität von 98,8 % in Bezug auf die pathologisch- anatomische Beurteilung der Lunge als „Golden Standard“. Nach Angaben von ABIVEN et al. (1990) konnten sie zwar schwache Kreuzreaktionen zwischen M.

hyopneumoniae und M. flocculare im Immunoblot belegen, diese hatten allerdings keine Auswirkungen in Bezug auf falsch-positive Ergebnisse des Tween 20-ELISAs.

BEREITER et al. (1990) konnten dagegen in Seren mit einem hohen Antikörpertiter gegen M. flocculare schwache Kreuzreaktionen mit dem M. hyopneumoniae-Antigen im ELISA nachweisen. Beim indirekten ELISA, wie z. B. dem TiHo-ELISA (AMMAR et al. 1980, SCHERM et al. 2002) und dem kommerziell erhältlichem Chekit®- Hyoptest I bzw. II nach Dr. Bommeli, werden Mikrotiterplatten verwendet, die mit dem Tween 20 gereinigtem Antigen von M. hyopneumoniae beschichtet sind. Beim Chekit®-Hyoptest ist das Antigen ein Membran-Lysat und für den TiHo-ELISA wird ein Ganzzell-Antigen verwendet. Nacheinander werden die zu untersuchenden Serumproben, der zweite mit Peroxidase markierte Antikörper, bei Chekit®-Hyoptest I und dem TiHo-ELISA ist das Konjugat polyklonal; bei Chekit®-Hyoptest II, einer Weiterentwicklung Ende der 90iger Jahre im letzten Jahrhundert, monoklonal und das Enzymsubstrat, mit den jeweiligen Waschschritten dazwischen, aufgetragen. Der Test ist mit Entstehung des gefärbten Produkts, der Enzymreaktion, beendet, und das Resultat kann mit Hilfe eines Photometers abgelesen werden. Die Intensität der Verfärbung ist dabei proportional zur Konzentration der Serum-antikörper. LEVONEN (1994) ermittelte für den Chekit®-Hyoptest I eine Spezifität von 91,5 % und eine Sensitivität von 66,7 % auf Herdenbasis in Bezug auf die klinische Untersuchung.

Nach SCHELP¹ zeigten interne Untersuchungen der Firma Intervet eine Spezifität des Chekit®-Hyoptest II mit Proben aus negativen Beständen von 97,2 %. In akut infizierten Beständen wurden etwa 93 % der Tiere positiv getestet. Bei chronisch infizierten Herden lag der Anteil positiver Tiere bei etwa 13 %.

Daneben wurde in Dänemark ein Blocking-ELISA entwickelt, der mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern spezifische Proteine der cytoplasmatischen Membran von M. hyopneumoniae entdecken kann (FELD et al. 1992, DJORDJEVIC et al. 1994, LE POTIER et al. 1994, FUTO et al. 1995). LE POTIER et al. (1994) konnte mit dieser Methode und einem 40 kDa Membran-Protein, und FUTO et al. (1995) mit einem rekombinanten 46 kDa Oberflächenantigen, keine Kreuzreaktionen zwischen M.

1 Persönliche Mitteilung von Dr. Chr. Schelp vom 27.06.03

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hyopneumoniae, M. flocculare und M. hyorhinis beobachten. Nach WALLGREN et al.

(1996) ist durch den Gebrauch monoklonaler Antikörper das Risiko für Kreuz- reaktionen mit anderen Mykoplasmenspezien reduziert worden. Dieser Test ist unter dem Namen DAKO Mycoplasma hyopneumoniae ELISA auf dem Markt. Hier sind die Mikrotiterplatten mit dem M. hyopneumoniae-Antigen, einem 74 kDa Protein, be- schichtet. Der methodische Ablauf ist der gleiche wie oben beschrieben, außer, dass zwischen dem Auftragen der Serumproben und dem monoklonalen Konjugat der Waschschritt entfällt. Dieser 2. markierte Antikörper tritt nun in Konkurrenz zu den Antikörpern im Serum. Die gemessene Farbintensität ist hier nun umgekehrt proportional zur Konzentration der Antikörper im Serum. BARFOD und Mitarbeiter (1994) sowie SØRENSEN und Mitarbeiter (1997) berechneten mit Proben von SPF- Kontrolltieren für den DAKO-ELISA eine Spezifität von 93-100 %, und eine Sensi- tivität von 98-100 % mit den Proben von experimentell infizierten Schweinen. Auf Herdenbasis, anhand klinischer, pathologischer und kultureller Untersuchungen, konnten SØRENSEN und Mitarbeiter (1992a, b) eine Spezifität von 96 % und eine Sensitivität von 93 % ermitteln. RAUTIAINEN und Mitarbeiter (1996) errechneten auf der Grundlage von klinischen und pathologischen Untersuchungen für den DAKO- ELISA auf Herdenbasis eine Spezifität von 98,7 % und eine Sensitivität von annähernd 100 %.

Bei dem direkten Vergleich des DAKO-ELISAs mit einem Tween 20-ELISA war der DAKO-ELISA nach THACKER et al. (2004) und FANO et al. (2004b) die sensitivere Methode. LEVONEN und Mitarbeiter (1999) verglichen die beiden kommerziellen Testsysteme Chekit®-Hyoptest und den DAKO-ELISA. Leider ist in ihren Ausführungen nicht ersichtlich, ob sie den Chekit®-Hyoptest I oder II untersucht haben. Nach Meinung dieser Autoren sind bei Anwendung beider Tests die Einteilung der Proben in richtig-positiv und falsch-positiv möglich, da sie sich ergänzen. In ihren Untersuchungen zeigte sich der DAKO-ELISA auf individuellem Niveau sensitiver, doch auf Herdenniveau war ihre geschätzte Sensitivität gleich und hoch genug für eine Eradikation der Erkrankung auf Herdenbasis. Dies entsprach somit den Angaben der beiden Hersteller, dass es sich um Herdentests handelt.

Basierend auf klinischen, pathologischen und epidemiologischen Folge- untersuchungen konnten sie anhand individueller Proben für den DAKO-ELISA eine Spezifität von 99,3 % und für den Chekit®-Hyoptest eine Spezifität von 98 % bestimmen. Die höhere Spezifität des DAKO-ELISAs erklären sie sich hauptsächlich durch den unterschiedlichen Aufbau des Testsystems und den Gebrauch von monoklonalen Antikörpern. Die falsch-positive Kategorie besteht ihrer Meinung nach aus kontaminierten Proben und so genannten „singleton reactors“, bei denen Antikörper der IgM Klasse untypisch reagieren.

2.1.7.2 Immunfluoreszenztest

Mit der in den 60iger Jahren des letzten Jahrhunderts von DEL GIUDICE et al.

(1967) entwickelten Fluoreszenz-Antikörper-Methode, war die schnelle Identifizierung von auf Agar wachsenden Kolonien von Mykoplasmen möglich. Die mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-konjugierten Antiköper wurden auf die Kolonien aufgebracht, um diese dann nach Inkubation und folgenden Waschschritten unter dem Fluoreszenzmikroskop zu untersuchen. Die Methode zeigte sich effektiv, da auch Mischkulturen auf den Primärplatten durch Verwendung homologer Antiseren erkannt werden konnten. SCHULLER und Mitarbeiter (1976) beschrieben eine weiter entwickelte Immunfluoreszenz-Technik zur Identifizierung von M. hyopneumoniae-

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Kolonien. Hierbei wird das Kulturmedium in einer dünnen Schicht auf Objektträger aufgebracht, die dann mit der Flüssigkultur von M. hyopneumoniae beschickt und inkubiert werden. Der entscheidende Schritt besteht nun in der Lufttrocknung der Objektträger mit Hilfe eines Ventilators für 12-14 Stunden. Diese Prozedur fixiert die Kolonien so dauerhaft, dass sie bei der weiteren Behandlung mit dem Fluorescein- konjugiertem Antiserum und den Waschschritten mit PBS nicht mehr abgespült werden können. Kreuzreaktionen mit M. hyorhinis und M. hyosynoviae traten in ihren Untersuchungen nicht auf. M. flocculare wurde nicht getestet. L’ECUYER und BOULANGER (1970) sowie MEYLING (1971) wendeten die direkte Nachweis- methode für die Diagnose der Enzootischen Pneumonie unter anderem in Gewebeproben der Lunge an. In den Fällen mit deutlich positiven Befunden ist die Oberfläche des Epithels der Bronchien und Bronchiolen von einer intensiven, gelb- grünen fluoreszierenden Mykoplasmenschicht bedeckt. In den Untersuchungen von MEYLING (1971) zeigte sich M. hyorhinis in pneumonisch veränderten Lungen von Ferkeln in der gleichen Lokalisation, die auch für M. hyopneumoniae typisch ist. Die ansonsten vergleichbare Fluoreszenz war aber oft reichlicher, und manchmal wurden Herde von Organismen auch im Alveolargewebe gefunden. Kreuzreaktionen mit M.

hyorhinis oder M. hyosynoviae konnten nicht beobachtet werden. Selbst selten auftretende Kreuzreaktionen mit M. flocculare sind im Gegensatz zu WHITTLESTONE (1990) nach FRIIS (1990) von geringer Bedeutung für die Spezifität des indirekten Immunfluoreszenztests (einer Modifikation) für M.

hyopneumoniae. Nach RUNNELS (1988) ist der Immunfluoreszenztest an verändertem Gewebe die verlässlichste Untersuchungsmethode, und positive Ergebnisse sind daher spezifisch und diagnostisch signifikant. Dies konnte ARMSTRONG (1994) bestätigen. Aber ein negatives Ergebnis besagt nicht, dass eine M. hyopneumoniae-Infektion nicht vorliegt (ARMSTRONG et al. 1984, RUNNELS 1988, ARMSTRONG 1994). So konnten L’ECUYER und BOULANGER (1970) erst ab dem 25. Tag post infektionem M. hyopneumoniae mit dem Immun- fluoreszenztest nachweisen. FEENSTRA et al. (1994) sowie SØRENSEN et al.

(1997) konnten zeigen, dass in chronischen Krankheitsstadien diese Methode eine deutlich geringere Sensitivität besitzt als der kulturelle Nachweis von M.

hyopneumoniae. So lag er nach SØRENSEN et al. (1997) am 57. Tag post infektionem bei 59-85 % und sank bis auf 11-38 % am 85. Tag nach experimenteller Infektion. Zwei Gründe für die Schwierigkeit der Diagnostik in den Frühstadien wären nach L’ECUYER und BOULANGER (1970): die Schwierigkeit repräsentative Lungenproben zu bekommen, wenn die Gebiete der Lungenveränderungen noch sehr klein sind, und ein Auswaschen des Antigens aus dem Epithel der Luftwege während des Immunfluoreszenztests. Dieser Wascheffekt dürfte noch bedeutender sein in den Frühstadien der Infektion, da der so genannte „Verschluss“ durch das bronchioläre Exsudat, welches oft die Luftwege in späteren Stadien ausfüllt, fehlt.

Generell kann man aber sagen, dass die Sensitivität des Immunfluoreszenztests von der Anzahl der Organismen in dem untersuchten Probestück abhängt (L’ECUYER und BOULANGER 1970, MEYLING 1971, HOLMGREN 1974b, VAN WEES 1987, FEENSTRA et al. 1994). Nach WHITTLESTONE (1990) sind für ein definitives positives Ergebnis wahrscheinlich mehr als 10⁴-10⁵ Mykoplasmen/g Gewebe notwendig. Weiterhin ist auch die Zugänglichkeit dieser Organismen zu den markierten Antikörpern von Wichtigkeit. Lokale Antikörper, die die Mykoplasmen von den markierten Antikörpern abschirmen, könnten auch für die schwachen oder negativen Färbeergebnisse in chronischen Fällen einer M. hyopneumoniae-Infektion verantwortlich sein (L’ECUYER und BOULANGER 1970, MEYLING 1971, HOLMGREN 1974b, SCHULLER et al. 1977, FEENSTRA et al. 1994). Daher ist

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diese Methode wenig geeignet, um Trägertiere oder subklinische Erkrankungen zu erkennen. Ist die Anzahl von Mykoplasmen aber hoch, wie es in akuten Krankheitsstadien der Fall ist, liegt seine Sensitivität bei 86-100 % und seine Spezifität bei 93-100 % verglichen mit dem kulturellen Nachweis (SØRENSEN et al.

1997). In solchen Fällen erweist sich diese schnelle und einfach zu handhabende Technik als brauchbare Diagnostikmethode (WHITTLESTONE 1990, SIMECKA et al.

1992, ROSS 1992, 1999).

GIGER und Mitarbeiter (1977) sowie DOSTER und LIN (1988) verglichen den Immunfluoreszenztest mit dem Immunoperoxidase-Test. Anstelle von Fluoresceinisothiocyanat (FITC) werden hier Peroxidase-Enzym-Einheiten an die Antikörper gekoppelt. Die Untersuchung von GIGER et al. (1977) zeigte eine gute Korrelation zwischen Immunofluoreszenz und Peroxidasetest. Beide immunologischen Methoden hatten eine hohe Spezifität, d. h. bei positiven immunologischen Befunden war der Nachweis von M. hyopneumoniae gesichert.

Nach DOSTER und LIN (1988) zeigte sich der Peroxidasetest sensitiver als der Immunfluoreszenztest, da die Meerrettich-Peroxidase eine Verstärkung der Chromogenwirkung bewirkte. Geringe Mengen der Erreger, wie bei chronisch infizierten Trägern oder bei abflauenden Infektionen, führten aber auch zu Problemen bei der Interpretation ähnlich wie bei der Immunfluoreszenz-Technik. Der Vorteil des Peroxidasetests liegt jedoch in dem Gebrauch eines gewöhnlichen Labormikroskops im Vergleich zum relativ teuren Fluoreszenzmikroskop.

2.1.7.3 Kultureller Nachweis des Erregers

Die Isolierung von M. hyopneumoniae ist sehr schwierig und zeitaufwendig (MCKEAN et al. 1976, WHITTLESTONE 1990, ROSS 1992, 1999), da er sehr hohe Nährstoffansprüche stellt (ROLLE und MAYR 1993, 2002), und die Kulturansätze häufig mit bakterieller Kontamination überwachsen waren. Deshalb sollte nach SCHULLER (1986) eine Isolierung nur bei frischen, d.h. akut veränderten Gewebeteilen versucht werden. Die Isolierung und Differenzierung kann schon innerhalb von 7-10 Tagen erfolgen, es kann aber auch 20-30 Tage dauern. Der Schnitt liegt zwischen 10-21 Tage (WHITTLESTONE 1985, 1990). Eine negative Beurteilung sollte erst nach mehrwöchiger Inkubation getroffen werden (WHITTLESTONE 1985). Eine weitere Schwierigkeit in der Kultivierung besteht darin, dass M. hyopneumoniae häufig von M. hyorhinis, der sich schneller an das künstliche Medium adaptieren kann, überwuchert wird, wodurch dessen Isolierung noch schwieriger und zeitaufwendiger wird, und es so zu falsch-negativen Ergebnissen kommt (FRIIS 1975, SCHULLER et al. 1977, WHITTLESTONE 1985, ARMSTRONG 1994). Andere Mykoplasmen stören dagegen selten bei der Isolierung (WHITTLESTONE 1985). Um das schnellere Wachstum von M. hyorhinis zu unterdrücken, hat sich der Zusatz des Antibiotikums Cycloserin, sowie Antiserum gegen M. hyorhinis und fünf bis sieben wöchentliche Passagen, nach denen sich M.

hyopneumoniae aber nicht M. hyorhinis weiterhin vermehrt, bewährt (ARMSTRONG

1994, GOI M. hyorhinis wächst M. hyopneumoniae

etwas besser in nichtselektivem Medium (WHITTLESTONE 1979). Nach FRIIS (1975), WHITTLESTONE (1979) und ARMSTRONG (1994) sollte die Primär- isolierung aus dem Gewebe in flüssigem Kulturmedium erfolgen, da wenig bis kein Wachstum aus der Inokulation direkt auf festem Medium erfolgt. Da M.

hyopneumoniae ein Säurenbildner ist, wird sein Wachstum durch eine pH- Wertänderung angezeigt. Die Subkultivierung kann nach Farbumschlag des pH-

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Indikators in beiden Medien erfolgen. Auf festem Medium erscheinen die ersten Kolonien nach zwei- bis dreitägiger Inkubation. Im Gegensatz zu den meisten anderen Mykoplasmen haben die Kolonien von M. hyopneumoniae keinen dunklen Zentralbereich (FRIIS 1975, WHITTLESTONE 1979). Misslungene Isolierungen können auch auf kleine Unterschiede zwischen den einzelnen Chargen des Kulturmediums zurückzuführen sein (WHITTLESTONE 1985). Für die Isolierung von M. hyopneumoniae haben sich besonders die Selektivmedien, die von FRIIS (1971, 1975) und von GOODWIN (1976) beschrieben wurden, bewährt. Eine weitere

Verbesserung des Friis-Med -NAD

erreicht werden (ETHERIDGE et al. 1979). Die Identifizierung der Art erfolgt serologisch anhand des Wachstumshemmtests, des Immunfluoreszenztests an auf Agar wachsenden Kolonien oder dem indirekten Immunfluoreszenztest an gewachsenen Kolonien auf einer Filtermembran (ARMSTRONG 1994). Nach ARMSTRONG et al. (1984) sowie HURNIK et al. (1993) ist die Isolierung von M.

hyopneumoniae nicht nur teuer, sondern die Kulturtechniken sind zudem auch unzuverläßlich, da viele falsch-negative Ergebnisse auftreten. In den chronischen Stadien der Infektion sollte die kulturelle Untersuchung jedoch nach SØRENSEN et al. (1997) als Bestätigung negativer Ergebnisse des indirekten Immunfluoreszenz- tests, der PCR und des Antigen-ELISAs nach PEDERSEN et al. (1990) dienen.

2.1.7.4 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Die von MULLIS und Mitarbeitern (1986) erarbeitete Methode ist in der Lage, die DNA lebender Organismen zu vervielfältigen. Ausgangsmaterial ist ein Gemisch an doppelsträngiger DNA, die die zu vermehrende und als Matrize dienende DNA- Sequenz enthält. Der PCR-Prozess, das so genannte „Amplifizieren“, besteht aus mehreren Wiederholungen der drei folgenden Schritte. Zunächst wird die doppelsträngige DNA bei hoher Temperatur in ihre beiden Einzelstränge aufgetrennt.

Danach lagern sich zwei Primer (Oligonukleotide), die komplementär zu den Randsequenzen des zu vermehrenden DNA-Abschnitts sind, an ihre Zielsequenzen und dienen der DNA-Polymerase als Startstellen für den letzten Schritt, d. h. für die Synthese der komplementären DNA-Stränge. Als Endergebnis ist die zunächst sehr kleine Menge an DNA exponentiell vermehrt und kann, nach Gelelektrophorese mittels Ethidiumbromidfärbung oder Hybridisierung mit DNA-Sonden, nachgewiesen werden (MULLIS et al. 1986, MATTSSON et al. 1995). Durch die Detektion von speziesspezifischen DNA-Sequenzen kann auf die Anwesenheit des gesuchten Organismus in der Probe geschlossen werden. Seit der Einführung dieser Technik sind eine ganze Reihe von PCRs entwickelt worden. Die Nachweisgrenze konnte immer mehr verbessert werden (siehe Tabelle 1). Die bronchoalveoläre Lavage- flüssigkeit und Nasentupfer haben als Untersuchungsmaterial an Bedeutung gewonnen (SØRENSEN et al. 1997, CALSAMIGLIA et al. 1999, KURTH et al. 2002, SIBILA et al. 2002), wobei der Nachweis in Nasentupfern selbst mit der nested-PCR (zwei speciesspezifische Primerpaare werden verwendet) bzw. der neuesten Entwicklung, der Real-Time-PCR, nicht immer gelingt (RUIZ und PIJOAN 2002, FANO et al. 2004c, ZEEH et al. 2004). Mit der Weiterentwicklung der nested-PCR ist man jetzt in der Lage, die kleinste Menge an Organismen aufzuspüren, die anwesend sein könnte (VERDIN et al. 2000, KURTH et al. 2002). Heute ist es daher möglich, nicht nur Infektionen im Frühstadium, sondern auch subklinische Erkrankungen und damit Trägertiere eindeutig zu erkennen (VERDIN et al. 2000, KURTH et al. 2002). Die Vorteile der PCR liegen nicht nur in der Schnelligkeit,

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sondern vor allem in der hohen Sensitivität und der hohen Spezifität, da die beiden Werte bis 100 % erreichen (BAUMEISTER 1996, THOMSON et al. 1996, SØRENSEN et al. 1997, BAUMEISTER et al. 1998, KURTH et al. 2002). So ist die nested-PCR in Kombination mit einer Luft-Filtration (STÄRK et al. 1998) für den Nachweis von Aerosol-Übertragungen geeignet. Ein weiterer Vorteil der PCR liegt darin, dass auch unkultivierbare Stämme von M. hyopneumoniae bzw. tote oder beschädigte Organismen, die dann in der Kultur natürlich nicht wachsen, erkannt werden (BAUMEISTER et al. 1998, CALSAMIGLIA 1999). Nachteilig kann dies allerdings für die nested-PCR sein, denn aufgrund ihrer hohen Sensitivität ist es möglich, dass sie in einer kontaminierten Umgebung falsch-positive Ergebnisse liefert (KURTH et al. 2002). Vorsichtsmaßnahmen sind daher ein wichtiger Bestandteil für die Durchführung dieser Methode.

Nach CALSAMIGLIA et al. (2001) ist die nested-PCR eine gut geeignete Untersuchungsmethode, wenn histopathologisch nicht ganz eindeutige Befunde erhoben werden können. Den Untersuchungen von VERDIN et al. (2000) zufolge ist die nested-PCR verglichen mit dem Blocking-ELISA und dem Immunfluoreszenztest signifikant sensitiver.

An die für die Routinediagnostik besser geeignete Real-Time-PCR und an der multiplex Real-Time-PCR, die eine schnelle und gleichzeitige Entdeckung von mehreren PRDC-assoziierten Keimen ermöglicht, wird gearbeitet (HARDER und HUEBERT 2004, KUHNERT et al. 2004, SIBILA et al. 2004).

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Tab. 1: In der Literatur beschriebene PCRs zum Nachweis von M. hyopneumoniae Autor Art der

PCR

Größe des amplifizierten Produktes

Herkunft des amplifizierten Fragments

Nachweisgrenze Anwendung

STEMKE et al.

(1994)

single- stage

238 bp Sequenz aus dem 16S-r- RNA-Gen

3 ng DNA

= ca. 1000 Organismen

DNA von einem

Laborstamm und 4

Feldisolaten von M. hyo.

THOMSON et al. (1996)

single- stage

230 bp Sequenz aus dem 16S-r- RNA-Gen

500 cfu Lungenproben von natürlich infizierten Schweinen

BAUMEISTER (1998)

single- stage

853 bp Unbekannte Sequenz

10² cfu/ml BALF Bronchoal- veoläre Lavageflüs- sigkeit von experimentell infizierten SPF-

Schweinen CALSAMIGLIA

et al. (1999)

nested- PCR

649 bp + 352 bp

Sequenzen aus dem 16S-r-RNA- Gen

80 Organismen Nasentupfer von natürlich und

experimentell infizierten Schweinen VERDIN et al.

(2000)

nested- PCR

nicht genanntes bp-Produkt + 706 bp

Unbekannte Sequenz

Ca. 1fg

= ca. 1 Organismus

Tracheo- bronchial- lavage und Nasentupfer von natürlich infizierten Schweinen

2.1.8 Bekämpfung

Nach den Untersuchungen von CLARK et al. (1991) ist ein Rein-Raus- Managementsystem, verbunden mit einer routinemäßigen Reinigung und Desinfektion und stabilen Umweltbedingungen, bei Schweinen einer enzootisch mit M. hyopneumoniae infizierten Herde geeignet, die Entwicklung von Pneumonien zu

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verhindern und die Gewichtszunahme der Schweine zu erhöhen. Dies belegt die große Bedeutung optimaler Umwelt- und Managementbedingungen. Daneben erfolgt die Bekämpfung der Enzootischen Pneumonie über Sanierungsverfahren zur Eliminierung des Erregers, prophylaktische Impfungen und Gabe von Chemotherapeutika.

2.1.8.1 Sanierungsverfahren

Schon WALDMANN und RADTKE erkannten 1937 die Vorteile der räumlichen Isolierung von Sauen und deren Nachkommen und konnten erste Erfolge in der Bekämpfung der Enzootischen Pneumonie mit Hilfe der so genannten „Riemser Einzelhüttenanlage“ vorweisen. Das Grundprinzip aller Sanierungsverfahren ist seitdem die frühe Isolierung der Ferkel von der Sau und anderen Schweinen, um Übertragungswege für Krankheitserreger zu unterbrechen.

Die extremste Form stellt dabei das spezifisch pathogenfrei (SPF)-Verfahren dar, bei dem Ferkel per Sectio Cesarea gewonnen, kolostrumfrei und isoliert aufgezogen werden. Das Ziel ist eine Schweineproduktion im Zucht- und Mastbereich ohne die Gegenwart von vorher festgelegten schweinespezifischen Krankheitserregern, wozu auch M. hyopneumoniae gehört. Das SPF-Verfahren wird heute noch in Dänemark und der Schweiz durchgeführt (BLAHA 1992, ROSS 1992, EICH und SCHMIDT 2000).

Das Medicated early weaning (MEW)-Verfahren wurde von ALEXANDER et al.

(1980) in den U.S.A. entwickelt und dort angewandt, und ist nach PLOMGAARD et al. (1992) als effektive und günstige alternative Methode zum SPF-Verfahren zu sehen. Das Ziel ist der Aufbau von Minimal-Disease-Herden, die das SPF-Verfahren zum Zwecke der Sanierung von Nukleus- oder Vermehrungsherden ersetzt (BLAHA 1992, EICH und SCHMIDT 2000). Die Unterbrechung der vertikalen Erreger- übertragung von der Sau auf die Ferkel basiert auf der Verabreichung eines Medizinalfutters an die Sauen ab dem Eintritt in einen isolierten Abferkelstall bis zum frühen Absetzen der Ferkel mit 5 Tagen, die dann jeweils in einer isolierten Abteilung aufgezogen bzw. gemästet werden. Auch die Ferkel werden antibiotisch vom Tag der Geburt bis zum 10. Lebenstag behandelt. Mit dieser Behandlung blieben die Schweine bis zur Schlachtung mykoplasmenfrei.

Ein ähnliches Sanierungsprogramm beschreibt MÉSZÁROS et al. (1985). Aber hier werden die mit 6 Tagen früh abgesetzten, stärkeren Ferkel dann auf eine isolierte und desinfizierte Farm verbracht und dort aufgezogen und die 2. und 3. Generation gezüchtet. Auch hier war keines der 2000 untersuchten Schweine in der drei Jahre dauernden Versuchsperiode mit M. hyopneumoniae infiziert. In den Seren der drei Tage alten Saugferkel der 2. und 3. Generation ließen sich keine maternalen Antikörper gegen diesen Erreger nachweisen. HOFMO und LIUM (1998) erreichten mit dieser Methode in Norwegen die Schaffung einer M. hyopneumoniae- und Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pp)-freien Herde mit Elterntieren, die mit beiden Erregern infiziert waren. Zusätzlich impften sie vorher alle Tiere gegen A. pp. mit Pleurinord® und verbrachten die Schweine in einen isolierten Stall vier Wochen vor dem erwarteten Wurftermin. Die Verabreichung eines Medizinalfutters erfolgte fünf Tage vor bis fünf Tage nach dem Transport und fünf Tage vor dem erwarteten Wurftermin bis zum Absetzen der Ferkel mit fünf Tagen. Die Ferkel wurden dann in einen mehrere km entfernten Stall verbracht und vom Tag der Geburt an bis zum 5.

Tag nach dem Absetzen antibiotisch behandelt. Diese Ferkel bildeten nun die Grundlage der neuen Herde. Die zwei Jahre dauernde Versuchsperiode wurde mit