3 Material und Methoden
3.7 Vergleich der serologischen Testsysteme
Für den Nachweis von Antikörpern im Blutserum standen vier ELISA Testsysteme zur Verfügung.
3.7.1 Enzyme Linked Immunosorbent Assay der Mikrobiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover (TiHo-ELISA)
Die zu untersuchenden Seren sowie die Kontrollen, das Konjugat, das Substrat und das Antigen wurden vor der Durchführung aufgetaut. Bei dieser Methode wurde das Antigen des Mycoplasmenstammes M. hoypneumoniae J an die Trägeroberfläche einer Polysorb®–Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (Wells) gebunden. Bei diesem als „coating” bezeichneten Vorgang wurde das Antigen zunächst 1:1500 mit Coatingpuffer verdünnt und jeweils 100 µl dieser Verdünnung in jedes Well pipettiert.
Die Platten wurden anschließend mit Folie abgedeckt und bei RT über Nacht auf einem Rotationsschüttler inkubiert.
Am folgenden Tag wurden die Platten dreimal in einem Plattenwaschgerät mit PBS-Tween 20 als Waschpuffer gewaschen. Die Seren sowie die Positiv- und Negativ-Kontrollen wurden 1:10 mit dem Waschpuffer vorverdünnt. Jeweils 200 µl dieser Seren wurden in die Wells 1-10 der Reihe A, 200 µl der Positiv-Kontrolle wurden in das Well A11 und 200 µl der Negativ-Kontrolle in das Well A12 pipettiert. In die Wells der Reihen B bis H wurden jeweils 100 µl Waschpuffer vorgelegt. Anschließend wurden die Seren und die Kontrollen durch Überführen von jeweils 100 µl aus Reihe A in Reihe B und gründliches Mischen verdünnt. Die Verdünnungen wurden in gleicher Weise bis Reihe H fortgeführt. Aus den Wells der Reihe H wurden zum Schluss jeweils 100 µl verworfen. So entstand eine 1:2-er Verdünnungsreihe für die Seren und Kontrollen von 1:10 in Reihe A bis zu 1:1280 in Reihe H.
Die abgedeckten Platten wurden 30 Minuten inkubiert und anschließend dreimal mit dem PBS-Tween 20 gewaschen. Im nächsten Arbeitsschritt wurden 100 µl des Peroxidase-anti-Schwein-Konjugates in einer Gebrauchsverdünnung von 1:3000 mit PBS in jedes Well eingefüllt. Nach 30 minütiger Inkubation wurden die Platten, wie oben beschrieben, gewaschen. Als Chromogen wurde ABTS (2,2`-Azino-di-[3-äthyl-benzthiazolinsulfonat (6)], gelöst in Zitronenpuffer, eingesetzt. Unmittelbar vor der Verwendung wurden zu je 10 ml der 0,04 %igen Chromogen-Lösung 20 µl H2O2 1
%ig (v/v) zugegeben. 100 µl dieser Substratlösung wurden im letzten Schritt in jedes Well pipettiert. Bei der letzten Inkubation wurden die Platten nicht abgedeckt. Nach 30 Minuten wurde die Enzym-Substrat-Reaktion schließlich mit 50 %-igem Methanol (jeweils 100 µl pro Well) gestoppt und die Absorptionen bei 405 nm gegen 492 nm in einem Fotometer gemessen.
Für die Auswertung wurde die Extinktion der Negativkontrolle in dem Well A12 mit dem Faktor 2 multipliziert. Die Verdünnungsstufe, bei welcher der Extinktionswert der Probe oberhalb dieses errechneten Grenzpunktes liegt, beschrieb somit die Höhe des Titers.
Die Inkubationen erfolgten bei RT auf einem Rotationsschüttler, die Waschschritte wurden mittels eines Plattenwaschgerätes durchgeführt.
Tab. 4: Bewertung des Titers des TiHo-ELISAs Kriterium Aussage
Titer < 1:10
negative Probe, d. h. es sind keine Antikörper gegen M. hyopneumoniae nachweisbar
Titer 1:10 zweifelhafter Bereich
Titer > 1:20 positive Probe, d. h. es sind Antikörper gegen M. hyopneumoniae nachweisbar
3.7.2 DAKO Mycoplasma hyopneumoniae ELISA (DAKO-ELISA)
Mit dem (käuflichen) kommerziell erhältlichen Enzymimmuntest-Kit von DAKO A/S, Glostrup, Dänemark, wird das Verdünnungsmedium, der Substratpuffer (enthält Wasserstoffperoxid), die Stopp-Lösung (Schwefelsäure-Lösung) und das Konjugat gebrauchsfertig geliefert. Bei dem Konjugat handelt es sich um Peroxidase-konjugierte monoklonale Mäuse-Antikörper, die gegen ein spezifisches Epitop eines 74 kDa Proteins gerichtet sind. Das Chromogen, ein 1,2-Phenylenediamin, in Tablettenform muss kurz vorher mit Substratpuffer im Dunkeln aufgelöst werden. Die mitgelieferten Platten, bestehend aus 16 Vertiefungen, angeordnet in zwei Reihen (siehe Abbildung 2), sind gebrauchsfertig mit M. hyopneumoniae-Antigen beschichtet. Auch bei diesem System müssen die beiden mitgelieferten Kontrollen (positiv und negativ) und die Serumproben zuvor 1:10 mit dem Verdünnungsmedium verdünnt werden.
Es wurden von allen Proben und Kontrollen Doppelansätze sowie vom Verdünnungsmedium ein Vierfachansatz (jeweils 100 µl) gemacht und in die Wells nach folgendem Muster eingebracht.
P P 5 5
N N 6 6
V V 7 7
V V
1 1
2 2
3 3
4 4
Abb. 2: 2 Mikrotiterplatten mit jeweils 16 Wells und ein Beispiel der Probenverteilung P = Positivkontrolle
N = Negativkontrolle V = Verdünnungsmedium 1, 2, 3, 4, 5, 6, usw. = Probennummer
Die mit Folie abgedeckten Platten wurden für 1,5 Stunden ohne Schütteln bei RT (20-25 °C) inkubiert. Im nächsten Arbeitsschritt wurden jeweils 100 µl Konjugat zusätzlich in alle Wells gegeben und 15 Minuten ohne Schütteln inkubiert.
Anschließend wurden die Platten viermal mit Aqua dest. gewaschen und schließlich 100 µl Chromogen in jedes Well pipettiert. Die Inkubation erfolgte im Dunkeln für 10 Minuten bei RT (20-25 °C). Im letzten Arbeitsschritte wurden jeweils 100 µl der Stopp-Lösung in jedes Well überführt und die Absorption bei 490 nm (Referenzfilter zwischen 600 und 650 nm) innerhalb einer Stunde nach Zufügen der Stopp-Lösung gemessen.
Die optischen Dichten (OD) wurde folgendermaßen ermittelt:
Berechnung der Absorptions-Mittelwerte für die zwei Positivkontrollen (= OD-Positivkontrolle), die zwei Negativkontrollen (= OD-Negativkontrolle), die vier Pufferkontrollen (= OD-Pufferkontrolle) und den einzelnen Proben (= OD-Probe).
Qualitätskontrolle:
- OD-Pufferkontrolle muss > 0.75 und < 2.500 sein (der erwartete Wert liegt bei ca. 1.000 - 1.400)
- OD-Positivkontrolle muss < 50 % der OD-Pufferkontrolle sein (der erwartete Wert liegt bei ca. 20 – 40 %)
- OD-Negativkontrolle muss > 75% der OD-Pufferkontrolle sein (der erwartete Wert liegt bei ca. 90 - 110%)
Tab. 5: Interpretation der Ergebnisse des DAKO-ELISAs
Kriterium Aussage
OD-Probe > 50 % der OD-Pufferkontrolle
negative Probe, d.h. es sind keine Antikörper gegen M. hyopneumoniae nachweisbar
OD-Probe < 50 % der OD-Pufferkontrolle
positive Probe, d.h. es sind Antikörper gegen M. hyopneumoniae nachweisbar
Liegt die OD-Probe zwischen 50 und 65 %, sollte, entsprechend der Empfehlung des Herstellers, das Tier nach zwei Wochen noch einmal getestet werden.
3.7.3 Chekit®-Hyoptest I nach Dr. Bommeli (Bommeli I-ELISA)
Dieser Enzymimmuntest (Dr. Bommeli AG, Liebefeld-Bern, Schweiz, jetzt: Intervet International bv, Niederlande) liefert Testplatten, deren 96 Wells gebrauchsfertig mit dem inaktivierten Erregerantigen M. hyopneumoniae beschichtet sind. Außer dem Chromogen wird die Stopplösung gebrauchsfertig mitgeliefert.
Nach Herstellung der Wasch- und Verdünnerlösung aus dem 10-fach-Konzentrat wurden das Positiv- und Negativ-Kontrollserum sowie die einzelnen Proben 1:100 sowie das Protein A-Konjugat (polyklonal), markiert mit Meerrettichperoxydase, 1:200 verdünnt. Von den Proben wurden Doppelansätze, von den Kontrollen Vierfach-ansätze gemacht (siehe Abbildung 3), wobei jeweils 200 µl der verdünnten Proben und Kontrollen in die Wells der Testplatte übertragen wurden. Die Testplatten wurden mit Folie abgedeckt und 90 Minuten bei RT in einer feuchten Kammer ohne Schütteln inkubiert. Der nächste Arbeitsschritt beinhaltete das dreimalige Waschen der Platten mit der Wasch- und Verdünnerlösung (mindestens 300 µl pro Well).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A N N N N
B P P P P
C 1 1 7 7
D 2 2 8 8
E 3 3
F 4 4
G 5 5
H 6 6
Abb. 3: Format der Testplatte und ein Beispiel der Probenverteilung N = Negativkontrolle
P = Positivkontrolle 1,2,3, usw. = Probennummer
Nach dem Waschen werden die Platten sorgfältig ausgeklopft, bevor in jedes Well 200 µl des verdünnten Konjugats pipettiert wird. Die Testplatten wurden wiederum abgedeckt und 90 Minuten bei RT in einer feuchten Kammer inkubiert. Der folgende Waschschritt wurde, wie bereits oben beschrieben, durchgeführt. Anschließend erfolgte die Verteilung des auf 25 °C vorgewärmten Chromogens (jeweils 200 µl) mit Inkubation bei RT oder optimal bei 25 °C. Die Differenz der Extinktionen zwischen negativer und positiver Kontrolle, gemessen im Fotometer bei einer Wellenlänge von 405 nm (Referenzwellenlänge = 492 nm), sollte nach 15 bis 30 Minuten größer oder gleich 0,7 sein. Dann wurde die Farbreaktion mit 50 µl/Well der auf RT erwärmten Stopplösung gestoppt.
Bewertung der Ergebnisse:
Nach Berechnung der Mittelwerte der optischen Dichte (OD) der beiden Kontrollen sowie der Proben, wurden die ODs der positiven Kontrolle und der Proben durch Subtraktion der OD der negativen Kontrolle korrigiert. Die Proben wurden dann auf die positive Kontrolle (=100%) bezogen.
OD-Probe – OD-neg.
Probenwert (%)= --- x 100 % OD-pos. – OD-neg.
Tab. 6: Interpretation der Ergebnisse des Bommeli I-ELISAs
Kriterium Aussage
Probenwert < 50 %
negative Probe, d. h. es sind keine Antikörper gegen M. hyopneumoniae nachweisbar
Probenwert 50 – 70 % grenzwertiger Bereich Probenwert > 70 %
positive Probe, d. h. es sind
Antikörper gegen M. hyopneumoniae nachweisbar
Nach Angaben des Herstellers sollte eine grenzwertige Probe ein zweites Mal getestet werden. Bleibt sie auch dann grenzwertig, so sollte von dem gleichen Tier eine zweite Probe untersucht werden. Ergibt diese Probe abermals ein grenzwertiges
Resultat, sollte das Ergebnis mit einer anderen Labormethode überprüft und das epidemiologische Umfeld mit in die Diagnose einbezogen werden. Dies konnte hier im Zweifelsfalle nicht vorgenommen werden, da es sich um Blutproben schon geschlachteter Mastschweine handelte.
3.7.4 Chekit®-Hyoptest II nach Dr. Bommeli (Bommeli II-ELISA)
Die wichtigste Weiterentwicklung dieses Enzymimmuntests (Dr. Bommeli AG, Liebefeld-Bern, Schweiz, jetzt: Intervet International bv, Niederlande) war hier die Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen ein Immunglobulin vom Schwein, das mit Meerrettichperoxidase konjugiert ist. Auch dieses Konjugat wurde in einer Verdünnung von 1:200 verwendet. Weitere Änderungen waren das direkte Verdünnen der Kontrollen und der Proben in die Wells in einer Endverdünnung von 1:10 sowie der Gebrauch des halben Volumens der verdünnten Kontrollseren, der Proben und des Konjugats für die weiteren Testschritte. Abgesehen von diesen Änderungen verlief die Durchführung dieses Tests genauso wie die des Bommeli I-ELISAs.
Bei der Ablesung der Ergebnisse soll dann die Differenz der Extinktionen zwischen negativer und positiver Kontrolle größer gleich 0,3 sein (siehe oben). Die Bewertung der Ergebnisse erfolgte analog zum Bommeli I-ELISA.
Tab. 7: Interpretation der Ergebnisse des Bommeli II-ELISAs
Kriterium Aussage
Probenwert < 20 %
negative Probe, d. h. es sind keine Antikörper gegen M.
hyopneumoniae nachweisbar Probenwert 20 – 30 % grenzwertiger Bereich
Probenwert > 30 %
positive Probe, d. h. es sind Antikörper gegen M.
hyopneumoniae nachweisbar
3.8 Vergleich der unterschiedlichen Methoden zum Nachweis von