Untersuchung der Lavageflüssigkeit auf Genomfragmente von M

hyopneumoniae

Der wie in 3.1.2.3 beschrieben dekantierte Überstand wurde wieder auf das Sediment gebracht. Die Lavageflüssigkeit wurde auf dem Vibromischer (Vortex Mixer SA8, Fa. Stuart, Bibby Sterilin LTD. Stone, Staffordshire, ST15 09A, UK) geschüttelt, anschließend in Eppendorf-Cups (Eppendorf-Cup 2 ml, Fa. Eppendorf AG, 22331 Hamburg) aliquotiert und bei -70°C eingefroren.

Zur Untersuchung der Lavageflüssigkeit auf Genomfragmente von M.

hyopneumoniae wurde jeweils ein Aliquot pro Tier aufgetaut und anschließend für 18 min bei 20000 g zentrifugiert (Centrifuge 5424, Fa. Eppendorf AG, 22331 Hamburg).

Der Überstand wurde dekantiert und verworfen.

Die Extraktion der DNA erfolgte unter der Verwendung des DNeasy Tissue Kit^® (Qiagen GmbH, 40724 Hilden). Die nachfolgend beschriebenen Reagenzien sind im Testkit enthalten.

Zu dem im Eppendorf-Cup meistens sichtbaren Pellet wurden 20 μl Proteinase K pipettiert. Nach Zugabe von 180 μl Lysispuffer „Buffer-ATL“ wurde die Probe direkt für 15 sec auf dem Vibromischer geschüttelt. Der Ansatz wurde für 2 bis 3 Stunden bis zur vollständigen Lysis in einem auf 55 °C erwärmten Thermoblock (Thermomixer Comfort 2ml, Fa. Eppendorf AG, 22331 Hamburg) unter Schütteln inkubiert. Nach

* Die Keimdifferenzierung wurde von VMTA S. Schwermann-Jäger und MTA M. Sieve von der Außenstelle für Epidemiologie in Bakum unter der fachlichen Leitung von Dipl.-Biologin R. Tegeler durchgeführt.

vollständiger Lysis wurden alle Proben für 15 sec auf dem Vibromischer geschüttelt und dann bei 20000 g für 15 sec zentrifugiert. Nach Zugabe von 200 μl Extraktionspuffer „Buffer-AL“ erfolgte direkt ein Schütteln mittels Vibromischer für 15 sec und anschließend eine Inkubation des Ansatzes auf dem Thermoblock bei 70 °C unter Schütteln.

Nach Zentrifugation des Ansatzes für 15 sec bei 20000 g wurden jeweils 200 μl Ethanol (Ethanol 96 %, Fa. Merck, 64271 Darmstadt) zur Präzipitation der DNA zugegeben und direkt für 15 sec auf dem Vibromischer geschüttelt. Die Proben wurden wiederum für 15 sec bei 20000 g zentrifugiert.

Der Inhalt der Eppendorf-Cups wurde auf jeweils eine der im Extraktions-Kit enthaltenden Säulen mit Sammelröhrchen gegeben und für 1 min bei 6000 g zentrifugiert. Falls sich nach der Zentrifugation noch Flüssigkeit in der Säule befand, wurde diese für 1 min bei 10000 g wiederholt. Das Filtrat wurde verworfen und die Säulen mit der adsorbierten DNA in ein neues Sammelröhrchen überführt.

Nach Zugabe von 500 μl des Waschpuffers „Buffer AW1“ wurde der Ansatz für 1 min bei 6000 g zentrifugiert. Nach Überführung der Säulen in neue Sammelröhrchen erfolgte der zweite Waschvorgang mit 500 μl des Waschpuffers „Buffer AW2“ bei Zentrifugation mit 20000 g für 3 min. Die Filtrate wurden jeweils verworfen.

Zur Elution der DNA wurden die Säulen in ein 1,5 ml fassendes Eppendorf-Cup (Eppendorf-Cup 1,5 ml; Fa. Eppendorf AG, 22331 Hamburg) eingesetzt und mit erwärmtem 200 μl Elutionspuffer „Buffer AE“ (70 °C) überschichtet. Nach einer Inkubationszeit von 1 min wurden die Eppendorf-Cups mit eingesetzter Säule für 1 min bei 6000 g zentrifugiert.

Der Nachweis von Genomfragmenten von M. hyopneumoniae in der Template-DNA mittels nPCR erfolgte unter Verwendung der von KURTH et al. (2002) publizierten primer-Paare (Tab. 4) TH132 und TH133 (erste PCR) und Mhp3 und Mhp4 (zweite PCR) in einer Endkonzentration von jeweils 5 pmol/µl mittels nPCR.

Tab. 4: primer nach Kurth et al. (2002)

Primer¹ Primer-Sequenz (5’-3’)

TH132 TH133

TAAAACCCAACAAACCTAACT CAGATTCGCCAAATACAAAA Mhp3

Mhp4

AAGTTCATTCGCGCTAGCCC GCTCCTACTCCATATTGCCC

1Primer wurden von der Firma Metabion International AG, 82152 Planegg, synthetisiert

Der Mastermix wurde unter einer Sterilwerkbank (DNA/RNA–Cleaner UVC/T-M-AR, Fa. G. Kisker, 48543 Steinfurt) in einem separaten Raum unter der Verwendung des ReadyMix^TM Taq PCR Reaction Mix with MgCl2 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH P.O.

1120, 89552 Steinheim) zusammengestellt (Tab. 5).

Tab. 5: Reaktionsansätze für die erste und zweite PCR nach KURTH et al. (2002)

erste PCR zweite PCR

PCR-Puffer (ReadyMix^TM) 25 μl 25 μl

Primer-Mix 2 μl 2 μl

Wasser 18 μl 22 μl

Volumen 45 μl 49 μl

Dieser Reaktionsansatz von 45 (erste PCR) bzw. 49 (zweite PCR) μl wurde in 0,2 ml-safe-locked Eppendorf-Cups (Fa. Eppendorf AG, 22331 Hamburg) überführt. Es erfolgte die Zugabe von 5 (erste PCR) bzw. 1 (zweite PCR) μl Template-DNA, so dass jeweils ein End-Volumen von 50 μl erreicht wurde.

Der Reaktionsansatz aus Mastermix und Template-DNA wurde zusammen mit der positiven und negativen Extraktionskontrolle nach Zentrifugation in den räumlich

getrennten Thermocycler (Mastercycler EpgradientS, Fa. Eppendorf AG, 22331 Hamburg) eingesetzt.

Die PCR-Bedingungen für die erste und zweite PCR sind in Tab. 6 zusammengefasst.

Tab. 6: Temperatur-Zeit-Zyklenzahl der ersten und zweiten PCR nach KURTH et al. (2002)

Die Auftrennung der amplifizierten DNA-Fragmente erfolgte in einem 1,5 %igen horizontalen Agarosegel, das vor jeder Gelelektrophorese aus 3 g Agarose (Macro ABgarose, Fa. ABgene, Epsom Surrey, KT 19 9AP, UK) und 200 ml 1:10 mit Wasser (LiChrosolv, Fa. Merck KGaA, 64271 Darmstadt) verdünntem TAE-Puffer (TAE-Puffer, Fa. Merck KGaA, 64271 Darmstadt) hergestellt wurde.

Das erstarrte Gel wurde nach Entfernung der abnehmbaren Seitenbegrenzungen des Gelträgers (C.B.S. Scientific Co., Del Mar, California, 92014, USA) und der Probenkämme in eine mit 1:10 verdünntem TAE-Puffer gefüllte Elektrophorese-Kammer (Module SGU-020T-02, C.B.S. Scientific Co., Del Mar, California, 92014, USA) gegeben, so dass das Gel vollständig bedeckt war. Pro Reihe waren im Gel 20 Taschen vorhanden, wovon die erste Tasche jeweils mit einer DNA-Leiter (Superladder-low 100bp Ladder with ReddyRun^TM, Fa. ABgene, Epsom, Surrey KT19

9AP, UK), die 19. Tasche mit der positiven und die 20. Tasche mit der negativen Extraktionskontrolle beschickt wurden. 10 μl Amplifikationsprodukt wurden jeweils mit 3 μl Gel-Ladepuffer (ReddyRun Gel Loading Buffer^TM, Fa. ABgene, Epsom, Surrey KT19 9AP, UK) versetzt und in die verbleibenden Taschen 2 bis 18 gegeben.

Die DNA-Fragmente wurden für 60 min bei 100V und 85mA getrennt.

Zur Detektion der Amplifikate wurde das Gel nach erfolgter Elektrophorese mit dem Fluoreszenzfarbstoff Ethidiumbromid (Ethidiumbromid (EtBr) 1%, Fa. Merck KGaA, 64271 Darmstadt) angefärbt. Der Farbstoff wurde hierzu 1:10000 mit 1:10 verdünntem TAE-Puffer in einer Kunststoffschale verdünnt und das Gel darin unter Lichtabschluss für 30 min gefärbt.

Die Auswertung und Dokumentation der Gele erfolgte mit Hilfe digitaler Fotografie in einem UV-Kabinett (Multimage^TM Light Cabinet, Alpha Innotech Corporation, Fa.

Bioteck-Fischer GmbH, 35447 Reiskirchen) mit dem System AlphaImager^TM 1220, Alpha Innotech Corporation).

Zur Überprüfung der Methode wurden Lavageproben und Lungengewebeproben von Tieren aus diesem Versuch, Lavageproben aus anderen Versuchen und kulturell M.

hyopneumoniae positives Lungengewebe von drei Schweinen mittels Real Time PCR^* am Institut für Veterinärmedizinische Bakteriologie der Vetsuisse Fakultät in Bern untersucht. Diese Real Time PCR mit einer kalkulierten analytischen Sensitivität zwischen 1 und 10 Zielkopien pro Reaktion wird in der Schweiz im Monitoring M. hyopneumoniae-freier Bestände eingesetzt. Die Ergebnisse zeigten eine 100 %ige Übereinstimmung mit den nPCR-Ergebnissen aus dieser Studie.

3.1.3 Auswahl von Tieren für die histologischen und