Anteil der positiven
Abb. 11: Hochgradige BALT-Hyperplasie an einem Bronchus
Tier 46, Lokalisation A2, HE-Färbung;
Originalvergrößerung 200 fach
Abb. 12: BALT-Hyperplasie mit Ausbildung eines Keimzentrums (K);
Tier 42, Lokalisation A2, HE-Färbung;
Originalvergrößerung 400 fach
Abb. 13: BALT-Hyperplasie an einem Bronchus, vereinzelt Mitosen (Pfeile);
Tier 43, Lokalisation A2, HE-Färbung;
Originalvergrößerung 400 fach
K
Abb. 16 Abb. 17
Abb. 14: Hochgradig Antigen von M.
hyopneumoniae auf dem Epithel eines Bronchus, dargestellt mit dem mAk D79D1-7;
Tier 42, Lokalisation A2, Originalvergrößerung 400 fach
Abb. 15: Darstellung von M.
hyopneumoniae-Antigen auf dem Epithel desselben Tieres,
immunhistochemische Reaktionsprodukte
ausschließlich auf den Zilien;
Originalvergrößerung 630 fach
Abb. 16: Antigen auf der Epitheloberfläche;
Tier 37; Original-vergrößerung 630 fach
Abb. 17: Makrophagen auf M. hyopneumoniae-positiver Epitheloberfläche desselben Tieres;
Original-Abb. 18a Abb. 18b
Abb. 19a Abb. 19b
Abb. 18a bis 19b: Vergleichend 2 Lokalisationen mit BALT-Hyperplasie in HE-Färbung und immunhistochemischen Nachweis von M.
hyopneumoniae-Antigen; Tier 42, Lokalisation B1, Originalvergrößerung 100 fach
4.3.3.5 Bestand E; Tiere 49 bis 60
Ein Nachweis von M. hyopneumoniae in bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit erfolgte in diesem Bestand bei 4 Tieren der Auswahlstufe 2 und bei 3 Tieren der Auswahlstufe 3.
Kulturell wurden aus den bronchoalveolären Lavageflüssigkeiten der Auswahlstufe 2 bei 9 Tieren mittel- bzw. hochgradig H. parasuis, ebenfalls bei 9 Tieren gering-, mittel- bzw. hochgradig Sc. suis und bei 3 Tieren gering- bzw. mittelgradig B.
bronchiseptica isoliert.
Bei der pathologisch-anatomischen Untersuchung der Lungen wurde bei 6 Tieren eine geringgradige katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie in den Spitzenlappen festgestellt. Mittel- und hochgradige Lungenläsionen in Form einer katarrhalisch-eitrigen Bronchopneumonie der Spitzen-, des Mittel- und der kranioventralen Bereiche der Hauptlappen wurden bei den 3 Tieren mit nPCR-Nachweis von M.
hyopneumoniae beobachtet. Bei den Tieren 54 und 55 wurde makroskopisch der Verdacht auf eine interstitielle Pneumonie erhoben. Tier 58 wies eine generalisierte fibroblastische Pleuritis auf. Die Trachealschleimhaut war bei allen Tieren ohne besonderen pathomorphologischen Befund. Die Tiere mit makroskopischen Lungenveränderungen zeigten eine gering- bis mittelgradige Hyperplasie der bronchialen und mediastinalen Lymphknoten (Tab. 17).
Tab. 17: Zusammenfassung der histopathologischen Befunde an Lungen-gewebeproben der Tiere 49 bis 60; grau unterlegt: M. hyopneumoniae positiv (nPCR)
interstitielle
Lokalisation Lokalisation Lokalisation Nr
Bei den Tieren 50 und 58 wurden eine zum Teil hochgradige Hyperplasie des BALT und ausgeprägte Peribronchitiden und Peribronchiolitiden beobachtet. Diese beiden Tiere wiesen positive immunhistochemische Reaktionsprodukte in Bronchien und/oder Bronchiolen auf. Der Anteil der positiven Epithelzelloberflächen betrug bei Tier 50 bis zu 100 % der betroffenen Bronchien (Tab. 18).
Tab. 18: Zusammenfassung der immunhistochemischen Befunde an Lungen-gewebeproben der Tiere 49 bis 60; grau unterlegt: M. hyopneumoniae positiv (nPCR)
Anteil der positiven
4.3.3.6 Bestand F; Tiere 61 bis 72
In der bronchoalveolären Lavageflüssigleit aus der Auswahlstufe 2 wurden bei 6 Tieren Genomfragmente von M. hyopneumoniae mittels nPCR nachgewiesen.
Kulturell wurden aus den bronchoalveolären Lavageflüssigkeiten von 9 Tieren mittel- bzw. hochgradig Sc. suis, von 5 Tieren mittel- bzw. hochgradig H. parasuis und von 2 Tieren jeweils hochgradig B. bronchiseptica und isoliert.
Die Untersuchung der postmortal entnommenen bronchoalveolären Lavageflüssigkeit von den Tieren der Auswahlstufe 3 mittels nPCR verlief negativ.
Bei 5 Ferkeln wurden geringgradige Verdichtungen des Lungenparenchyms in Form katarrhalisch-eitriger Bronchopneumonien in den Spitzenlappen festgestellt. Bei Tier 64 war der Lobus accessorius in gleicher Weise verändert. Seröse Häute und die Trachealschleimhaut waren bei allen Tieren ohne besonderen pathomorphologischen Befund. Die bronchialen und mediastinalen Lymphknoten zeigten bei den Tieren 63, 64, 65, 67, 71 und 72 eine geringgradige Hyperplasie. Bei den Tieren 61, 62, 63, 64 und 72 waren die Interstitien des Lungenparenchyms gering- bis mittelgradig verbreitert (Tab.19).
Tab. 19: Zusammenfassung der histopathologischen Befunde an Lungengewebeproben der Tiere 61 bis 72
interstitielle
Eine überwiegend geringgradige Hyperplasie des BALT zeigte sich bei 5 Tieren.
Positive immunhistochemische Reaktionsprodukte wurden bei keinem Tier beobachtet.
4.3.3.7 Bestand G; Tiere 73 bis 84
Bei jedem der 10 bzw. 12 untersuchten Tiere der Auswahlstufe 2 bzw. 3 wurden mittels nPCR Genomfragmente von M. hyopneumoniae in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit detektiert.
Kulturell wurden in den zehn bronchoalveolären Lavageproben der Auswahlstufe 2 bei 5 Tieren mittel- bzw. hochgradig H. parasuis, bei 2 Tieren jeweils hochgradig P.
multocida und bei vier Tieren gering- bzw. hochgradig Sc. suis nachgewiesen.
8 Ferkel wiesen eine gering-, mittel- oder hochgradige katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie der Spitzen-, des Mittel und/oder der kranioventralen Bereiche der Hauptlappen auf; ein mukopurulentes Exsudat war zum Teil hochgradig aus den Bronchien nach Anschnitt abpreßbar. Von gleichartigen Veränderungen waren die Lobi accessorii der Tiere 80 bis 83 betroffen. Der Verdacht auf eine interstitielle Pneumonie wurde makroskopisch bei den Tieren 76, 77, 78 und 80 erhoben. Seröse Häute und die Trachealschleimhaut waren bei allen 12 Ferkeln ohne besonderen pathomorphologischen Befund. Eine mindestens geringgradige Hyperplasie der bronchialen und mediastinalen Lymphknoten wurde bei den Tieren 76 und 79 bis 84 beobachtet (Tab. 20).
Tab. 20: Zusammenfassung der histopathologischen Befunde an Lungen-gewebeproben der Tiere 73 bis 84; grau unterlegt: M. hyopneumoniae positiv (nPCR)
interstitielle
Bei 5 Absetzferkeln der 5. und 6. Lebenswoche wurde zum Teil eine hochgradige Hyperplasie des BALT festgestellt (Abb. 20 bis 22). Diese Tiere zeigten außerdem zum Teil ausgeprägte Peribronchitiden und Peribronchiolitiden in den verschiedenen
Lungenlokalisationen. Bei keinem Tier dieses Bestandes wurden weder in den Bronchien noch in den Bronchiolen positive immunhistochemische Reaktionsprodunkte beobachtet. Eine Wiederholung der immunhistochemischen Färbung brachte dasselbe Ergebnis; die Positiv-Kontrolle zeigte typische immunhistochemische Reaktionsprodukte. Die positiven Nachweise von Genomfragmenten von M. hyopneumoniae waren in der Wiederholung der nPCR reproduzierbar.
Abb. 20: Hochgradige BALT-Hyperplasie in Form von mehreren Lymphfollikeln;
Tier 80, Lobus accessorius;
HE-Färbung;
Originalvergrößerung 100 fach
Abb. 21: Hochgradige BALT-Hyperplasie an zwei Bronchiolen, Tier 82, Lobus accessorius, HE-Färbung;
Originalvergrößerung 100 fach
Abb. 22: Hochgradige BALT-Hyperplasie mit Ausbildung eines Keimzentrums, Tier 81, Lobus accessorius, HE-Färbung;
Originalvergrößerung 200 fach
4.3.3.8 Bestand H; Tiere 85 bis 96
Genomfragmente von M. hyopneumoniae wurden mittels nPCR bei den Tieren der Auswahlstufe 3 dieses Bestandes nicht detektiert; in der Auswahlstufe 2 erfolgte bei 6 der 10 untersuchten Tiere ein Erregernachweis.
Kulturell wurden aus den bronchoalveolären Lavageflüssigkeiten der Auswahlstufe 2 von 9 Tieren mittel- bzw. hochgradig Sc. suis, von 6 Tieren gering-, mittel- bzw.
hochgradig H. parasuis und von 3 Tieren mittel- bzw. hochgradig B. bronchiseptica isoliert.
Bei 7 Ferkeln der Auswahlstufe 3 wurden gering- oder mittelgradige katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonien in den Spitzen- und/oder dem Mittellappen festgestellt.
Der Lobus accessorius von Tier 90 war vollständig verdichtet; ein mukopurulentes Exsudat war aus den Bronchien bei Anschnitt abpreßbar. Seröse Häute und die Trachealschleimhaut waren bei allen Tieren ohne besonderen pathomorphologischen Befund. Das Tier 85 wies zudem ein fokales, im Durchmesser ca. 5 cm großes, bullöses Emphysem im rechten Hauptlappen auf. Bei den Tieren 86, 89 und 92 ergab sich makroskopisch der Verdacht auf eine interstitielle Pneumonie. Die Tiere 89 bis 96 zeigten eine mindestens geringgradige Hyperplasie der mediastinalen Lymphknoten (Tab. 21).
Tab. 21: Zusammenfassung histopathologischen Befunde an Lungengewebeproben der Tiere 85 bis 96
interstitielle Lokalisation Lokalisation Lokalisation Nr
Eine geringgradige Hyperplasie des BALT wurde bei 7 Tieren beobachtet. Positive immunhistochemische Reaktionsprodukte auf den Epithelzelloberflächen bzw.
anderen Lokolisationen wurden bei keinem Ferkel festgestellt.
4.3.4 Lokalisation und Ausdehnung der Reaktionsprodukte bei den immunhistochemisch positiven Ferkeln
Positive immunhistochemische Reaktionsprodukte wurden bei M. hyopneumoniae-IHC-positiven Tieren in 6,4 bis 94,4 % der untersuchten Bronchien nachgewiesen. In den Bronchiolen betrug die Nachweisrate 0 bis 17,3 % (Tab. 22).
Tab. 22: Anteil (%) der Bronchien und Bronchiolen mit positiven immunhisto-chemischen Reaktionsprodukten der M. hyopneumoniae-IHC-positiven Tiere
positive Reaktionsprodukte / Zahl betroffener Bronchien/ -iolen (%) Tier
Bronchien Bronchiolen
13 26,1 0,4
14 15,4 0
35 20,0 0
37 76,5 16,8
38 26,9 1,2
39 45,2 2,4
40 6,4 0
41 37,9 0
42 62,5 12,5
43 33,3 0,6
44 94,4 17,3
45 14,3 0
47 13,6 0
48 18,2 0
50 38,1 8,5
58 17,9 0
Der jeweilige Anteil der positiven Epithelzelloberflächen ist in Tab. 23 dargestellt.
Tab. 23: Lokalisation und Ausdehnung der positiven immunhistochemischen Reaktionsprodukte bei den M. hyopneumoniae-IHC-positiven Tieren
Anteil der positiven
Tab. 23 (Fortsetzung)
Tab. 23 (Fortsetzung)
Tab. 23 (Fortsetzung)
Tab. 23 (Fortsetzung)
Tab. 23 (Fortsetzung)
Anteil der positiven Epithelzelloberflächen Tier Brochien/
Bronchiolen
Lokali-sation
Anzahl/
Schnitt
positive Reaktionsprodukte/
Zahl betroffener Bronchien/-iolen
+ ++ +++ ++++
A1 7 - - - - -
A2 8 2 2 - - -
B1 8 1 1 - - -
Bronchien
B2 5 2 2 - - -
A1 32 - - - - -
A2 40 - - - - -
B1 34 - - - - -
58
Bronchiolen
B2 23 - - - - -
Für die Lokalisationen A1, A2 und B1 ergaben sich ähnliche immunhistochemische Nachweishäufigkeiten für M. hyopneumoniae. Auf dem Epithel der Bronchien und vor allem der Bronchiolen der Lokalisation B2 wurde deutlich seltener M.
hyopneumoniae immunhistochemisch nachgewiesen (Abb. 23 und 24).
0 20 40 60 80 100 120
A1 A2 B1 B2
Lokalisation
Bronchien (n)
IHC neg IHC pos
Abb. 23: Anzahl der Bronchien mit bzw. ohne Nachweis positiver immun-
histochemischer Reaktionsprodukte bei M. hyopneumoniae-IHC-positiven Tieren (n = 96 Ferkel)
0 200 400 600 800 1000
A1 A2 B1 B2
Lokalisation
Bronchiolen (n)
IHC neg IHC pos
Abb. 24: Anzahl der Bronchiolen mit bzw. ohne Nachweis positiver immun-histochemischer Reaktionsprodukte bei M. hyopneumoniae-IHC-positiven Tieren (n = 96 Ferkel)
4.3.5 Korrelation zwischen den pathologisch-anatomischen und histomorphologischen Lungenveränderungen und dem Nachweis von M. hyopneumoniae in Lavageflüssigkeit
Mittels Fisher´s Exakt Test zeigte sich zwischen mittel- und hochgradigen, makroskopischen Lungenveränderungen (Lungen Score 2 und 3) und dem Nachweis von M. hyopneumoniae mittels nPCR ein statistisch signifikanter Zusammenhang (p<0,001) (Abb. 25).
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
0 1 2 3
Lungen Score
Anzahl M. hyopneumoniae-infizierter Tiere (%)
Abb. 25: Score makroskopisch sichtbarer Lungenveränderungen in Beziehung zum Nachweis von M. hyopneumoniae mittels nPCR (n = 96 Ferkel).
Unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen signifikante Differenzen (p<0,05)
Ein statistisch signifikanter Zusammenhang (p<0,001) zeigte sich ebenfalls zwischen für M. hyopneumoniae typischen histologischen Veränderungen (Histopathologie Score 3) und dem Nachweis von M. hyopneumoniae mittels nPCR (Abb. 26).
a
a
b
b
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
0 1 2
Histopathologie Score
Anzahl M. hyopneumoniae-infizierter Tiere (%)
Abb. 26: Histopathologie Score in Beziehung zum Nachweis von M.
hyopneumoniae mittels nPCR (n = 96 Ferkel). Unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen signifikante Differenzen (p<0,05)
Tiere mit mittel- oder hochgradigen Lungenveränderungen (Lungen Score 2 und 3) wiesen häufiger für M. hyopneumoniae typische Lungenveränderungen (Histopathologie Score 3) auf (Abb. 27).
a a
b
0%
20%
40%
60%
80%
100%
0 1 2 3
Lungenscore
2 1 0
Histo-patho Score
Abb. 27: Beziehung pathologisch-anatomischer zu histopathologischen Lungenveränderungen
(n = 96 Ferkel)
4.3.6 Vergleich der direkten Erregernachweise mittels nPCR und IHC in Abhängigkeit vom Histopathologie Score
Zur Klärung der Frage, ob sich die Immunhistologie unter der Verwendung des mAk D79D1-7 als Alternative oder Ergänzung zu den bisher angewandten Nachweisverfahren eignet, wurde der Kappa-Index als Maß der Übereinstimmung zwischen dem Nachweis für M. hyopneumoniae typischen, histologischen Lungenveränderungen und dem direkten Erregernachweises mittels nPCR und IHC bestimmt.
Dabei ergab sich für den Nachweis von typischen, pathohistologischen Lungenveränderungen und dem Nachweis mittels nPCR eine starke Übereinstimmung (Kappa-Index 0,78) (Tab. 24).
Tab. 24: Ergebnisse der nPCR in Beziehung zum Histopathologie Score nPCR
Histopathologie Score positiv (n) negativ (n) Kappa Index 1
In die Berechnung des Kappa-Index zwischen dem Nachweis typischer, pathohistologischer Lungenveränderungen und dem direkten Erregernachweis mittels IHC wurden die Tiere aus Bestand G nicht einbezogen, da davon auszugehen ist, dass der mAk D79D1-7 das Antigen des Stammes / der Stämme von M.
hyopneumoniae aus diesem Bestand nicht bindet. Ohne die Tiere des Bestandes G ergab sich nur eine schwache Übereinstimmung zwischen dem Histopathologie Score 3 und dem Nachweis von M. hyopneumoniae mittels IHC (Tab. 25).
Tab. 25: Ergebnisse der IHC in Beziehung zum Histopathologie Score (ohne Bestand G)
IHC (ohne Bestand G)
Histopathologie Score positiv (n) negativ (n) Kappa Index 1
0
0 0
22
5 -
2 0
3 0
33
5 < 0,10
3 0
13 0
8
5 0,38
4.4.4 Spezifitätskontrollen
4.4.4.1 Warthin-Starry-Färbung
Eine Infektion der Ferkel der Auswahlstufe 3 und eine mögliche Kreuzreaktion des monoklonalen Antikörpers gegen M. hyopneumoniae mit Zilien-assoziierten respiratorischen (cilia-associated respiratory: CAR) Bazillen wurde mittels Versilberungs-Technik nach Warthin-Starry an ausgewählten Paraffinschnitten der Lungengewebeproben untersucht (Tab. 26)
Eine charakteristische schwarze Färbung von filamentösen CAR Bazillen auf dem Epithel der Bronchien und Bronchiolen wurde in keinem Schnitt beobachtet.
Ebenfalls negativ verlief diese Untersuchung an den für die Etablierung der Immunhistochemie verwendeten Positiv- und Negativ-Kontrollen.
Tab. 26 Färbung ausgewählter Präparate nach Warthin-Starry
Tier/Lokalisation CAR-Bazillus Tier/Lokalisation CAR-Bazillus
5; A1, A2 - 40; A1, A2 -
6; A1, A2 - 61; A1, A2 -
8; A1, A2 - 62; A1, A2 -
13; A1, A2 - 63; A1, A2 -
14; A1, A2 - 64; A1, A2 -
15; A1, A2 - 65; A1, A2 -
37; A1, A2 - 73; A1, A2 -
37; B1, B2 - 74; A1, A2 -
38; A1, A2 - pos-Kontrolle -
39; A1, A2 - neg-Kontrolle -
5 Diskussion
Die vorliegende Arbeit verfolgt das Ziel, M. hyopneumoniae-Infektionen bei Ferkeln bis zur 6. Lebenswoche durch pathologisch-anatomische, histologische, molekularbiologische und immunhistochemische Untersuchungen zu charakterisieren. Insbesondere wird die Eignung der Immunhistochemie als probate Alternative zu den bisher angewendeten diagnostischen Testverfahren untersucht.
Darüberhinaus sollen vergleichenden Untersuchungen zeigen, ob der direkte Erregernachweis mittels PCR aus Lavageflüssigkeit mit dem Auftreten typischer pathomorphologischer und pathohistologischer Lungenveränderungen assoziiert ist.
Da unter Praxisbedingungen häufiger die Entnahme von bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit als Alternative zu Sektionen durchgeführt wird, ist es von Bedeutung, den Grad der Assoziation zwischen dem Erregernachweis aus Lavageflüssigkeit und dem Vorkommen von Läsionen zu kennen. Um Material für die pathologischen, histologischen und immunhistochemischen Untersuchungen zu gewinnen, wurden Bestände, in denen eine hohe Infektionsrate bei den Ferkeln zu erwarten war, anhand eines dreistufigen Auswahlverfahrens ermittelt. Die Identifizierung von Risikofaktoren für die Infektion von Saug- und Absetzferkeln mit M. hyopneumonie stellt ein weiteres Ziel dieser Untersuchungen dar.
5.1 Auswahlverfahren
Die Untersuchungen wurden in Nordwest-Deutschland, einer Region mit hoher Schweinedichte (Abb. 28; vergleiche Abb. 1), durchgeführt, um M. hyopneumoniae-Infektionen bei Ferkeln bis zur 6. Lebenswoche unter den dortigen Haltungs- und Managementbedingungen zu charakterisieren. Ungefähr 52 % aller Schweine in Deutschland werden in dieser Region gehalten. Die Bestände lagen zu 76 % im nordwestlichen Niedersachsen und zu 24 % in angrenzenden Gebieten Nordrhein-Westfalens.
Abb. 28: Schweinedichte in Deutschland auf Kreisebene (BÄURLE u.
WINDHORST 2005) – Lage der 50 Bestände (Auswahlstufe 2) im Ausschnitt
5.2 Nachweishäufigkeit von M. hyopneumoniae-Infektionen mittels nPCR
Anhand der Voruntersuchung von Lavageproben aus den Beständen der Auswahlstufe 2 sollten Herden vorselektiert werden, die aufgrund einer erhöhten Infektionsrate bei Ferkeln bis zur 6. Lebenswoche für die weiterführenden Untersuchungen geeignet schienen. Die Entscheidung, für diese Voruntersuchungen bronchoalveoläre Lavageproben zu entnehmen, wurde unter Berücksichtigung vergleichender Untersuchungen von Proben aus verschiedenen Entnahmelokalisationen getroffen, in denen sich die bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit für den Nachweis von M. hyopneumoniae-Infektionen geeigneter als die Entnahme von Nasentupfern erwiesen hatte (KURTH et al. 2002; MAROIS et al. 2007). In weiteren Untersuchungen erwiesen sich Lavageproben auch besonders für den Nachweis früher Infektionsstadien geeignet (SIBILA et al. 2004 b, c;
MOORKAMP et al. 2007).
Genomfragmente von M. hyopneumoniae wurden bei den vorselektierten 500 Tieren der Auswahlstufe 2 mit einer Nachweishäufigkeit von 11,2 % und bei den daraufhin ausgewählten 96 Tieren der Auswahlstufe 3 zu 34,4 % nachgewiesen. Diskriminiert nach Saug- und Absetzferkeln ergab sich bei den Schweinen der Auswahlstufe 2 eine Nachweishäufigkeit von 12,3 % bei den Saugferkeln und 10,6 % bei den Absetzferkeln. Dabei ist ausdrücklich zu betonen, dass diese Werte in keiner Weise die Prävalenz von M. hyopneumoniae-Infektionen bei Ferkeln darstellen, da ausschließlich Bestände mit klinischen Atemwegserkrankungen bei Ferkeln der genannten Altersklassen ausgewählt wurden, bei denen andere Krankheitsursachen vorab weitmöglich ausgeschlossen worden waren. Außerdem wurden in diesen Herden ausschließlich erkrankte Tiere in die Untersuchungen einbezogen. Dieses Vorgehen führt zum Nachweis höherer Prävalenzen, als dies bei einer zufälligen Auswahl der Herden und Tiere zu erwarten gewesen wäre. Eine zuverlässige Prävalenzschätzung ist anhand bisher publizierter Untersuchungen nicht möglich, da in der Regel nur sehr wenige Herden in die Studien eingingen und darüber hinaus nicht bekannt ist, ob diese Herden zufällig oder gezielt ausgewählt wurden (CALSAMIGLIA u. PIJOAN 2000; RUIZ et al. 2003; FANO et al. 2006; SIBILA et al.
2007 a). Einer größeren Studie aus Bayern (PALZER et al. 2005), die Schweine aus insgesamt 55 Herden berücksichtigt, ist nicht zu entnehmen aus wie vielen Herden die untersuchten Saugferkel stammten und wie bei der Auswahl der Bestände vorgegangen wurde.
5.3 Bedeutung von M. hyopneumoniae-Infektionen bei Ferkeln bis zur 6.
Lebenwoche (Auswahlstufe 3)
Die Infektion mit M. hyopneumoniae und die daraus resultierenden bzw. assoziierten Erkrankungen sind grundsätzlich in jedem Alter möglich (PIFFER u. ROSS 1984;
KOBISCH et al. 1993; THACKER 2006), die Häufigkeit von Infektionen bei Saug- und Absetzferkeln wird aber kontrovers diskutiert. Die wenigen Studien, die Nachweishäufigkeiten für M. hyopneumoniae bei Saug- und Absetzferkeln angeben, beschränken sich auf den Erregernachweis mittels PCR, während Organveränderungen nicht untersucht wurden!
Ausnahmen stellen die Untersuchungen von PALZER (2006) und von SIBILA et al.
(2007 a) dar. PALZER (2006) wies eine signifikante Korrelation zwischen dem Nachweis von M. hyopneumoniae in Lavageflüssigkeit und klinischen Symptomen bzw. pathomorphologischen Veränderungen der Lunge bei Schweinen von 3 bis 67 kg nach. In der Untersuchung von SIBILA et al. (2007 a) wurden 37 der 507 klinisch und mittels nPCR auf Genomfragmente von M. hyopneumoniae untersuchten Saugferkel zusätzlich pathologisch und histologisch untersucht. Bei 3 der 37 Ferkel wurden Genomfragmente von M. hyopneumoniae in Nasen- und/oder Tonsillentupfern nachgewiesen, während keines der Ferkel typische pathologisch-anatomische und/oder pathohistologische Befunde für M. hyopneumoniae in der Lunge aufwies.
Für die Unterscheidung latenter Infektionen mit M. hyopneumoniae von Infektionen, die mit typischen pathologisch-anatomischen und/oder pathohistologischen Veränderungen einhergehen, wurden die Lungen der Tiere der Auswahlstufe 3
dieser Untersuchung einer makroskopischen und histologischen Untersuchung unterzogen.
Dabei zeigte sich ein signifikanter Zusammenhang (p<0,001) zwischen dem Vorkommen mittel- und hochgradiger, makroskopischer Lungenveränderungen (Lungen Score 2 und 3) und dem Nachweis von M. hyopneumoniae mittels nPCR in Lavageflüssigkeit. Ein ebenfalls statistisch signifikanter Zusammenhang (p<0,001) zeigte sich zwischen dem Auftreten für M. hyopneumoniae typischer, pathohistologischer Lungenveränderungen (Histopathologie Score 2) und dem Nachweis von M. hyopneumoniae mittels nPCR. Der Abb. 26 ist zu entnehmen, dass bei mittel- und hochgradigen pathologisch-anatomischen Lungenveränderungen auch typische pathohistologische Befunde zu erwarten sind. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass die Infektion mit M. hyopneumoniae auch bei Saug- und Absetzferkeln mit pathomorphologischen Veränderungen einhergeht.
Diese Assoziation zwischen dem Erregernachweis und ausgeprägten, für Infektionen mit M. hyopneumoniae typischen pathologisch-anatomischen und pathohistologischen Befunden belegt den pathogenen Charakter von M.
hyopneumoniae bei diesen bis zu sechs Wochen alten Tieren.
Die Häufung der Nachweise von M. hyopneumoniae sowohl mittels nPCR als auch mittels IHC in wenigen Beständen dieser Untersuchung könnte durch Virulenzunterschiede zirkulierender Feldstämme von M. hyopneumoniae verursacht worden sein (VICCA et al. 2003). Der Einfluss schwach- und hochvirulenter Stämme von M. hyopneumoniae auf die Ausbreitung der Infektion ist bislang nicht untersucht worden. Allerdings zeigten hochvirulente Stämme von M. hyopneumoniae in vivo ein höheres Vermehrungspotential, ein schnelleres Wachstum und induzierten einen ausgeprägteren Entzündungsprozess als schwach-virulente Stämme (MEYNS et al.
2007).
Das Auftreten von geringgradigen, für M. hyopneumoniae-Infektionen typischen pathologisch-anatomischen und pathohistologischen Lungenveränderungen bei M.
hyopneumoniae-nPCR bzw. -IHC-negativen Ferkel der Auswahlstufe 3 stützt die Aussagen von JERICHO (1977) und ARMSTRONG et al. (1984), dass diese Veränderungen lediglich typisch, aber nicht pathognomonisch für eine M.
hyopneumoniae-Infektion sind und somit für die Diagnose dieses Erregers nicht genügen. Auch die für M. hyopneumoniae-Infektionen typische BALT-Hyperplasie ist für andere bakterielle Erreger und Noxen nach experimenteller Infektion bzw.
Inokulation unter anderem bei SPF-Schweinen beschrieben (JERICHO et al. 1971 a, b; DELVENTHAL et al. 1992; SOERENSEN et al. 2005). Ätiologisch kommen für die pathomorphologischen Lungenveränderungen der M. hyopneumoniaenPCR bzw. -IHC-negativen Ferkel der Auswahlstufe 3 die kulturell in Auswahlstufe 2 nachgewiesenen Erreger wie B. bronchiseptica (ROOP et al. 1987), P. multocida (PIJOAN 2006) und H. parasuis (RAPP-GABRIELSON et al. 2006) in Betracht. Die kausale pathogene Bedeutung von Streptokokken-Isolaten vor allem aus bronchoalveolären Lavageflüssigkeiten wird bezweifelt (KIPPER 1990; HENSEL et al. 1994; GANTER u. AMTSBERG 1996).
Welche viralen (THACKER et al. 1999; THACKER et al. 2001; OPRIESSNIG et al.
2004; THANAWONGNUWECH et al. 2004) Infektionen bzw. Koinfektionen, die zu einem schwerwiegenderem Krankheitsverlauf der M. hyopneumoniae-Infektion beitragen können, zum Untersuchungszeitpunkt bei den Ferkeln vorlagen, wurde in dieser Studie nicht untersucht.
5.4 Eignung der Immunhistochemie als Alternative oder Ergänzung zu den bisher angewandten diagnostischen Testverfahren
Es wurde ein immunhistochemisches Nachweisverfahren für M. hyopneumoniae etabliert, um die Eignung dieser Methode in der Diagnostik und Bewertung von M.
hyopneumoniae-Infektionen bei Ferkeln zu prüfen. Die Immunhistochemie wurde als Methode gewählt, um über den direkten, semiquantitativen Erregernachweis und durch den Vergleich des Nachweises von M. hyopneumoniae-Antigen mit dem Auftreten typischer BALT-Hyperplasien derselben Lokalisation nach Gegenfärbung den pathogenen Charakter einer Infektion mit M. hyopneumoniae bei Tieren bis zur 6. Lebenswoche bewerten zu können (CHEIKH SAAD BOUH et al. 2003). Die
Notwendigkeit des direkten oder indirekten Erregernachweises ergibt sich aus der Tatsache, dass weder pathologisch-anatomische noch histopathologische Lungenveränderungen genügend spezifisch für die Diagnose einer M.
hyopneumoniae-Infektion sind (JERICHO 1977; MCKEAN et al. 1979; ARMSTRONG et al. 1984; MAES et al. 1996; BUDDLE u. O`HARA 2005).
Positive immunhistochemische Reaktionsprodukte wurden nur bei 16 der 33 M.
hyopneumoniae-nPCR-positiven Tiere nachgewiesen; dabei wiesen alle IHC-positiven Tiere auch Genomfragmente von M. hyopneumoniae mittels nPCR auf. Ein Unterschied in der Sensitivität der beiden Methoden war aufgrund der Antigen-Vervielfältigung in der nPCR zu erwarten. Allerdings lassen zudem die negativen immunhistochemischen Ergebnisse von den Tieren aus Bestand G vermuten, dass der mAk D79D1-7 an das/die Antigen(e) des Stammes / der Stämme aus dem Bestand G nicht binden kann. Untersuchungen von MAYOR et al. (2007) sprechen dafür, dass von einem bestandsspezifischen M. hyopneumoniae-Stamm ausgegangen werden kann. Zur Klärung der Frage, an welche antigene zytosolische oder membranständige Struktur dieser monoklonale Antikörper bindet, bedarf es weiterer Untersuchungen. Die antigenetische Variabilität verschiedener M.
hyopneumoniae-Stämme (FREY et al. 1992; ARTIUSHIN u. MINION 1996;
KOKOTOVIC et al. 1999; VASCONCELOS et al. 2005; STAKENBORG et al. 2005, 2006) hat einen Einfluss auf die synthetisierten Proteine und somit auf die
KOKOTOVIC et al. 1999; VASCONCELOS et al. 2005; STAKENBORG et al. 2005, 2006) hat einen Einfluss auf die synthetisierten Proteine und somit auf die