Bibliografische Informationen der Deutschen Bibliothek
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1. Auflage 2006
© 2006 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, Gießen Printed in Germany
ISBN 3-938026-81-2
Verlag: DVG Service GmbH Frankfurter Straße 89
35392 Gießen 0641/24466 geschaeftsstelle@dvg.net
www.dvg.net
Aus dem Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
und dem Institut für Virusdiagnostik des Friedrich-Loeffler-Instituts, Insel Riems
Etablierung, Validierung und praktische Anwendung einer multiplex real-time RT-PCR zum Nachweis
des Rabbit Haemorrhagic Disease Virus
INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Astrid Gall aus Ibbenbüren
Hannover 2006
Wissenschaftliche Betreuung:
Prof. Dr. med. vet. B. Grummer, Tierärztliche Hochschule Hannover PD Dr. med. vet. M. Beer, Friedrich-Loeffler-Institut, Insel Riems
1. Gutachterin: Prof. Dr. med. vet. B. Grummer
2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. G. von Samson-Himmelstjerna
Tag der mündlichen Prüfung: 29. Mai 2006
Meinen Liebsten
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG... 11
2 LITERATURÜBERSICHT ... 13
2.1 Die Rabbit Haemorrhagic Disease ... 13
2.1.1Ätiologie / Das Rabbit Haemorrhagic Disease Virus... 13
2.1.1.1 Taxonomie... 13
2.1.1.2 Morphologie und physikalische Eigenschaften... 13
2.1.1.3 Genomorganisation und Proteine ... 14
2.1.2Klinik, Pathologie und Pathogenese... 16
2.1.3Epidemiologie und Bekämpfung ... 18
2.1.4Laboratoriumsdiagnose... 21
2.1.4.1 Indirekter Erregernachweis ... 21
2.1.4.2 Direkter Erregernachweis... 21
2.2 Die quantitative real-time Polymerasekettenreaktion... 22
2.2.1Einleitung... 22
2.2.2Detektionssysteme ... 26
2.2.2.1 Detektionssysteme ohne Zuwachs an Spezifität ... 26
2.2.2.2 Detektionssysteme mit Zuwachs an Spezifität... 29
2.2.3Datenanalyse... 33
2.2.4Quantifizierung ... 35
2.2.4.1 Absolute Quantifizierung ... 35
2.2.4.2 Relative Quantifizierung ... 37
2.2.5Multiplex real-time PCR... 39
2.2.6Interne Kontrollen... 40
INHALTSVERZEICHNIS
3 MATERIAL UND METHODEN... 43
3.1 Virusstämme ... 43
3.2 RNA-Isolierung... 43
3.2.1Allgemeines ... 43
3.2.2RNA-Isolierung mit dem RNeasy® Mini Kit ... 44
3.2.3RNA-Isolierung mit dem QIAamp® Viral RNA Mini Kit ... 45
3.2.4RNA-Isolierung mit TRIzol®Reagent ... 45
3.3 Klonierung und in vitro-Transkription ... 46
3.3.1Allgemeines ... 46
3.3.2Herstellung einer positiven Kontrolle für die real-time RT-PCR ... 47
3.3.2.1 Amplifizierung mittels RT-PCR ... 47
3.3.2.2 Klonierung... 48
3.3.2.3 In vitro-Transkription... 50
3.3.3Herstellung einer positiven Kontrolle für die Formaldehyd- Agarosegelelektrophorese und den Northern Blot ... 52
3.3.4Herstellung der RNA-Sonden für den Northern Blot und die In situ- Hybridisierung ... 53
3.4 Real-time RT-PCR ... 54
3.4.1Auswahl von Primern und Sonden ... 54
3.4.2Reaktionsbedingungen... 55
3.5 Konventionelle RT-PCR ... 56
3.6 Agarosegelelektrophorese, Membrantransfer von RNA ... 58
3.6.1Agarosegelelektrophorese (für DNA) ... 58
3.6.2Formaldehyd-Agarosegelektrophorese (für RNA)... 59
3.6.3Dot Blot und Northern Blot ... 59
3.7 Antigen-ELISA ... 61
3.8 Antikörper-ELISA... 62
3.9 Zellen und Zellkulturtechnik... 62
3.10 Infektion und Transfektion... 63
3.11 Indirekter Immunfluoreszenztest ... 64
3.12 Hämagglutinationstest... 64
3.13 Viruskonzentrierung ... 65
3.14 Histologie und Immunhistologie ... 65
3.15 In situ-Hybridisierung... 66
3.16 Untersuchungen zur Viruspersistenz in rekonvaleszenten Tieren ... 67
3.17 Untersuchungen zum carrier-Status von immunisierten Tieren nach challenge-Infektion ... 69
3.18 Untersuchungen zur in vitro-Replikation nach Infektion und Transfektion ... 70
4 ERGEBNISSE ... 71
4.1 Etablierung einer multiplex real-time RT-PCR für RHDV ... 71
4.1.1Primer- und Sondendesign... 71
4.1.2Optimierung der Reaktionsbedingungen ... 73
4.1.3Herstellung einer positiven Kontrolle und externer RNA-Standards... 73
4.1.4Sensitivität ... 74
4.1.4.1 Analytische Sensitivität... 74
INHALTSVERZEICHNIS
4.1.4.3 Sensitivität im Vergleich zur konventionellen RT-PCR ... 77
4.1.4.4 Sensitivität im Vergleich zum Antigen-ELISA ... 79
4.1.5Spezifität ... 79
4.2 Untersuchungen zur Viruspersistenz in rekonvaleszenten Tieren ... 81
4.2.1Klinik und Pathologie ... 81
4.2.2Detektion von Antikörpern... 83
4.2.3Verteilung der Virusgenomlast und Charakterisierung der isolierten RNA ... 84
4.2.4Detektion von Antigen oder infektiösem Virus... 88
4.3 Untersuchungen zum carrier-Status von immunisierten Tieren nach challenge-Infektion ... 88
4.3.1Detektion von Antikörpern... 88
4.3.2Verteilung der Virusgenomlast... 89
4.4 Kinetik von Replikationsvorgängen in vitro... 91
4.4.1Kinetik nach Infektion ... 91
4.4.2Kinetik nach Transfektion ... 92
5 DISKUSSION... 95
5.1 Etablierung einer multiplex real-time RT-PCR für RHDV ... 95
5.2 Nachweis der Persistenz von Virusgenom in rekonvaleszenten sowie immunisierten und danach feldvirusexponierten Kaninchen ... 99
5.3 Kinetik von Replikationsvorgängen des RHDV in vitro... 103
6 ZUSAMMENFASSUNG ... 105
7 SUMMARY ... 107
8 LITERATURVERZEICHNIS ... 109
9 ANHANG ... 135
9.1 Material ... 135
9.1.1Virusstämme ... 135
9.1.2Zellen und Bakterienstämme ... 135
9.1.3Versuchstiere ... 135
9.1.4Primer, Sonden, Nukleinsäuren und Längenstandards... 136
9.1.5Enzyme ... 136
9.1.6Kommerziell erhältliche Systeme... 137
9.1.7Antigene, Antikörper und Konjugate ... 137
9.1.8Puffer, Lösungen, Nährmedien und Wasser... 138
9.1.8.1 RNA-Isolierung, PCR ... 138
9.1.8.2 Klonierung und in vitro-Transkription... 139
9.1.8.3 Agarosegelelektrophorese, Membrantransfer von RNA... 140
9.1.8.4 ELISA... 143
9.1.8.5 Zellkultur, Hämagglutinationstest, Viruskonzentrierung... 144
9.1.8.6 Pathohistologie, Immunhistologie, In situ-Hybridisierung ... 144
9.1.9Sonstige Reagentien... 146
9.2 Geräte und Gebrauchsgegenstände ... 147
9.3 Verbrauchsmaterialien ... 149
9.4 Software... 150
9.5 Tabellenverzeichnis ... 150
9.6 Abbildungsverzeichnis ... 150
9.7 Abkürzungsverzeichnis ... 155
1 EINLEITUNG
Die Rabbit Haemorrhagic Disease (RHD, syn. Hämorrhagische Krankheit der Kaninchen) ist eine 1984 erstmals beschriebene und mittlerweile weltweit auftretende Erkrankung adulter Kaninchen der Species Oryctolagus cuniculus. Sie wird durch das Rabbit Haemorrhagic Disease Virus (RHDV), ein RNA-Virus aus der Familie Caliciviridae, verursacht.
Die RHD verläuft in den meisten Fällen perakut bis akut, daneben wurden aber auch eine subakute sowie eine chronische Verlaufsform beschrieben. Starkes Fieber, eine hochgradige Leberschädigung und Veränderungen im Sinne einer Disseminierten Intravasalen Gerinnung dominieren das Krankheitsbild. Die Morbidität und die Mortalität können bis zu 100 % betragen. Die Epidemiologie der Erkrankung ist bisher wenig untersucht. Insbesondere die Bedeutung von rekonvaleszenten Tieren, immunisierten Tieren nach Kontakt mit Feldvirus und Jungtieren - die zwar infizierbar sind, aber nicht erkranken - ist noch weitgehend ungeklärt. In der letzten Zeit wurde eine Viruspersistenz als wichtiger Faktor diskutiert, bislang gab es aber keine experimentellen Studien zur Klärung dieser Frage.
Die virologische Diagnostik der RHD basierte zunächst auf dem Hämagglutinationstest sowie dem Antigennachweis mittels Elektronenmikroskopie, ELISA (engl. enzyme linked immunosorbent assay, Enzym-gekoppelter Immuntest), Immunhistologie und Western Blot.
Seit 1995 wird eine konventionelle RT-PCR (engl. reverse transcriptase-polymerase chain reaction, Reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion) eingesetzt, die vor allem der Untersuchung pathogenetischer und epidemiologischer Fragestellungen dient. Da kein Zellkultursystem zur produktiven Vermehrung des RHDV existiert, war eine hochsensitive Quantifizierung des RHDV bis dato nicht möglich.
In den letzten Jahren wird vermehrt die real-time PCR als hochsensitive und spezifische Methode zur Diagnostik und Quantifizierung verschiedener Pathogene eingesetzt. Durch die simultane Amplifizierung und Detektion der Produkte über Fluoreszenzsignale entfällt hierbei eine Agarosegelelektrophorese, so daß diese Methode ferner eine geringere Kontaminationsgefahr aufweist und schnellere Resultate ermöglicht als eine konventionelle PCR.
Ziel dieser Arbeit war daher, eine real-time RT-PCR als neue Methode zum Nachweis des RHDV zu etablieren und zu validieren. Durch ihre Anwendung bei tierexperimentellen
EINLEITUNG
feldvirusexponierten Kaninchen sollten neue Erkenntnisse zu Vorkommen und Bedeutung von Virus- bzw. RNA-Persistenz in der Epidemiologie der RHD erhalten werden. Der Einsatz der entwickelten real-time RT-PCR für in vitro Studien zielte darauf, die Replikation des RHDV auf genomischer Ebene zu analysieren, um mögliche Ursachen für dessen fehlende produktive Vermehrung in Zellkulturen zu ermitteln.
Die Rabbit Haemorrhagic Disease
2 LITERATURÜBERSICHT
2.1 Die Rabbit Haemorrhagic Disease
2.1.1 Ätiologie / Das Rabbit Haemorrhagic Disease Virus 2.1.1.1 Taxonomie
Das RHDV gehört zum Genus Lagovirus innerhalb der Familie Caliciviridae (OHLINGER et al. 1990; OHLINGER u. THIEL 1991; MEYERS et al. 1991b; MOUSSA et al. 1992). Es ist eng verwandt mit dem European Brown Hare Syndrome Virus (EBHSV), dem zweiten bisher beschriebenen Lagovirus. Außerdem existiert ein apathogenes Rabbit Calicivirus (RCV, CAPUCCI et al. 1996b), welches der Species RHDV zugeordnet ist. Weitere Genera innerhalb der Familie Caliciviridae sind die humanmedizinisch relevanten Genera Norovirus und Sapovirus, sowie das veterinärmedizinisch bedeutsame Genus Vesivirus mit den Species Felines Calicivirus (FCV) und Vesicular exanthema of swine virus (VESV).
2.1.1.2 Morphologie und physikalische Eigenschaften
Beim RHDV handelt es sich um ein unbehülltes Virus mit einem sphärischen Kapsid von ikosaedrischer Symmetrie. Die Virionen sind mit 32 - 42 nm relativ klein und einfach aufgebaut. Mittels elektronenmikroskopischer Untersuchung lassen sich die Vertiefungen der Ikosaederseitenflächen darstellen (GRANZOW et al. 1989, 1996; VALICEK et al. 1990).
Diese „calices“ (lat. Kelch) sind bei allen Caliciviren zu finden, und der Name der Familie leitet sich von diesen Strukturen ab. Das Kapsid wird von dem Hauptstrukturprotein mit einem Molekulargewicht von 60 kDa gebildet (VP60). Beim RHDV handelt es sich um ein hämagglutinierendes Virus, es sind jedoch auch nicht-hämagglutinierende Stämme beschrieben worden (CAPUCCI et al. 1996a; SCHIRRMEIER et al. 1999).
Eine zweite Art von Viruspartikeln wurde mehrfach beschrieben (CAPUCCI et al. 1991; DU 1991; MOUSSA et al. 1992; ALEXANDROV et al. 1993; BARBIERI et al. 1997). Diese als
„core-like particles (CLPs)" (GRANZOW et al. 1996) bzw. „smooth RHDV (s-RHDV) particles“ (BARBIERI et al. 1997) bezeichneten Viruspartikel sind mit 25 - 33 nm kleiner als die üblicherweise gefundenen Virionen und haben eine unstrukturierte Oberfläche. Sie bestehen aus einem 30 kDa Strukturprotein, sind nicht-hämagglutinierend und werden bei
LITERATURÜBERSICHT
einem protrahierten Verlauf der RHD nachgewiesen. Für ihr Auftreten wird eine unvollständige Expression des Gens für das VP60 bzw. die Expression eines trunkierten Genoms verantwortlich gemacht (GRANZOW et al. 1996). Als weitere Ursache wird eine Degradation der Virionen genannt (CAPUCCI et al. 1991; MOUSSA et al. 1992), die als Folge der Clearance von RHDV-Ig (Immunglobulin)M-Immunkomplexen auftreten soll (BARBIERI et al. 1997). Ferner werden die beschriebenen Partikel als Core-Partikel ohne Kapsomere (DU 1991) oder frühes Stadium in der Reifung der RHDV-Partikel (ALEXANDROV et al. 1993) angesehen.
Das RHDV ist als unbehülltes Virus verhältnismäßig stabil in der Umwelt. Die Infektiosität des RHDV bleibt in einer Organsuspension bei 4 °C über 225 Tage erhalten, im getrockneten Zustand bei Raumtemperatur (RT) über 105 Tage und bei 60 °C für 2 Tage sowohl als Organsuspension als auch im getrockneten Zustand (SMID et al. 1991).
2.1.1.3 Genomorganisation und Proteine
Das Genom der Caliciviren besteht aus einem Molekül linearer einzelsträngiger RNA mit Plusstrangorientierung und ist nicht segmentiert. Im Falle vom RHDV umfasst es 7437 Nukleotide (ohne Poly A-Schwanz) und ist von nicht-translatierten Regionen (NTR) flankiert. MEYERS et al. (1991b) bestimmten die vollständige Nukleinsäuresequenz des RHDV als erste komplette Sequenz eines Calicivirus. Am 5´-Ende ist die RNA kovalent an das Vpg (virales Protein, genomassoziiert) gebunden, und am 3´-Ende ist sie polyadenyliert (Abbildung 1).
Abbildung 1: Genom des RHDV. An die 5´NTR schließen sich die codierenden Bereiche für die Nichtstrukturproteine (hellgrau) und die beiden Strukturproteine, das VP60 und das VP10 (dunkelgrau), an (modif. nach MEYERS et al. (2000)).
Das Genom besteht aus zwei offenen Leserahmen (engl. open reading frame, ORF), die um 17 Nukleotide überlappen (MEYERS et al. 1991b). Der ORF1 (Nukleotide 10 - 7044) codiert für ein 257 kDa Polyprotein, aus welchem durch proteolytische Prozessierung sieben
NTPase Vpg Pro Pol
Vpg
VP10 (A) VP60
10 7044
7025 7378 ORF2 ORF1
Die Rabbit Haemorrhagic Disease
Nichtstrukturproteine (p16, p23, p37, p29, p13, p15, p58) und das Hauptstrukturprotein hervorgehen. Der ORF2 (Nukleotide 7025 - 7378) weist eine Leserasterverschiebung von (-1) auf und codiert für ein weiteres Strukturprotein mit einem Molekulargewicht von 10 kDa, das VP10 (MEYERS et al. 1991b, 2003). Neben der genomischen RNA kann eine 2,2 kb große subgenomische RNA aus Geweben infizierter Kaninchen isoliert werden. Sie ist kolinear mit dem 3´-Ende der genomischen RNA, ebenfalls proteingebunden und wird in Viruspartikel verpackt (MEYERS et al. 1991a, 1991b). Beide Strukturproteine können somit auch durch Translation der subgenomischen RNA entstehen (MEYERS et al. 1991b; PARRA et al.
1993).
Die Gene im ORF1 sind in der Reihenfolge NH2 - p16 - p23 - p37 - p29 - p13 - p15 - p58 - VP60 - COOH angeordnet. Als größere Vorläuferproteine wurden das p60 (p23 + p37), das p41 (p29 + p13) und das p72 (p15 + p58) nachgewiesen (WIRBLICH et al. 1996; KÖNIG et al. 1998; MEYERS et al. 2000). Unter den Nichtstrukturproteinen sind bisher die Nukleosidtriphosphatase (NTPase, p37), das Vpg (p13), die Protease (Pro, p15) und die Polymerase (Pol, p58) identifiziert worden; die Funktion der anderen Proteine ist nicht bekannt.
Das VP60 ist das Hauptstrukturprotein des RHDV und bildet das Kapsid, gegen das sich die neutralisierenden Antikörper richten (VIAPLANA et al. 1997). Es besteht aus zwei Domänen, von denen die innere durch die N-terminalen Aminosäuren und die äußere mit den antigenen Determinanten durch die C-terminalen Aminosäuren gebildet wird (CAPUCCI et al. 1995, 1998; SCHIRRMEIER et al. 1999). Es sind in Analogie zu anderen Caliciviren (NEILL 1992) die Regionen A - F beschrieben worden, von denen die Aminosäuresequenzen der Regionen C und E variabel sind und die der restlichen Regionen konserviert (SCHIRRMEIER et al.
1999). Die oberflächenexponierte Region E mit den wichtigsten antigenen Epitopen wird für phylogenetische Analysen der Nukleotidsequenzen sowohl beim RHDV (MOSS et al. 2002;
FORRESTER et al. 2003; GALL-RECULE et al. 2003) als auch beim FCV (RADFORD et al. 1997, 1999) genutzt. Basierend auf antigenetischen (Reaktivität mit monoklonalen Antikörpern im Antigen-ELISA und Western Blot) und genetischen Eigenschaften (Sequenzanalysen) wurde ein zweiter Subtyp des RHDV nahezu zeitgleich in Italien (CAPUCCI et al. 1998) und Deutschland (SCHIRRMEIER et al. 1999) beschrieben, der sich vor allem in der Region E (Aminosäuren 344 - 434) unterscheidet. Serotypen sind beim
LITERATURÜBERSICHT
RHDV bislang nicht bekannt, und die beschriebenen Isolate weisen eine geringe genetische Variabilität mit einem Homologiegrad von 95 - 98 % in der Aminosäuresequenz des VP60 auf (SCHIRRMEIER et al. 1999).
Das vom ORF2 kodierte VP10 ist ein kleines basisches Strukturprotein, dessen Funktion nicht vollständig geklärt ist. Es wird vermutet, daß es mit der RNA interagiert und bei der Verpackung des Genoms in die Virionen beteiligt ist (WIRBLICH et al. 1996).
Über die Nichtstrukturproteine ist bekannt, daß die NTPase die Helikaseaktivität beinhaltet.
Das Vpg ist kovalent an die RNA gebunden, seine Funktion ist noch nicht klar. Für das FCV wurde gezeigt, daß eine proteolytische Entfernung dieses Proteins zu einer herabgesetzten Translationseffizienz in vitro führte (HERBERT et al. 1997) und RNA-Transkripte eines cDNA-Klons des kompletten Genoms (engl. full-length cDNA clone) auch ohne Vpg infektiös sind (SOSNOVTSEV u. GREEN 1995). Die Protease ist verantwortlich für die proteolytische Prozessierung des Polyproteins. Mittlerweile wurde jedoch eine Spaltstelle im p41 identifiziert, die nur mit sehr geringer Effizienz von dieser Protease gespalten wird. Die proteolytische Spaltung an dieser Stelle führt zu zwei weiteren Proteinen, dem p23 und p18 (THUMFART u. MEYERS 2002). Bei der Polymerase handelt es sich um die RNA-abhängige RNA-Polymerase, die während der Virusreplikation den Minusstrang synthetisiert.
2.1.2 Klinik, Pathologie und Pathogenese
Die RHD ist eine i.d.R. tödliche Erkrankung bei Kaninchen der Species Oryctolagus cuniculus. Nach oronasaler oder konjunktivaler Aufnahme des Virus verläuft die RHD meistens perakut bis akut, daneben wurde aber auch eine subakute Verlaufsform beschrieben (FUCHS u. WEISSENBÖCK 1992; TEIFKE et al. 2002). Die Erkrankung hat eine hohe Morbidität und Mortalität (bis 100 %) sowie eine Inkubationszeit von 1 - 3 Tagen.
In perakuten Fällen verenden die Kaninchen plötzlich ohne vorherige klinische Symptome.
Die akute Verlaufsform ist gekennzeichnet durch eine Lymphopenie, Fieber, Anorexie und Apathie. Es können zentralnervöse Störungen (Krämpfe, Opisthotonus) und ein blutiger Nasenausfluß auftreten, bevor die Tiere innerhalb 24 - 72 h sterben (SCHIRRMEIER et al.
1990; HAAS u. THIEL 1993; NOWOTNY et al. 1993; SHIEN et al. 2000; KIMURA et al.
2001). Eine subakute bzw. chronische Verlaufsform ist selten und kann nach Wochen mit dem Tod der Tiere enden. Es zeigen sich milde Symptome wie Apathie und Anorexie sowie
Die Rabbit Haemorrhagic Disease
evtl. ein Ikterus. Dieser protrahierte Verlauf ist mit dem Nachweis von so genannten „CLPs“
(GRANZOW et al. 1996) bzw. „s-RHDV particles“ (BARBIERI et al. 1997) verbunden. Er wird insbesondere bei jungen Kaninchen, die mit geringen Mengen RHDV infiziert wurden (TEIFKE et al. 2002), und in endemischen Gebieten beobachtet (FUCHS u. WEISSENBÖCK 1992).
Pathologisch-anatomisch und histologisch dominiert bei der RHD eine Leberschädigung in Kombination mit Veränderungen im Sinne einer Disseminierten Intravasalen Gerinnung. Der Ausprägungsgrad variiert zwischen deutlich erkennbaren und fast fehlenden Läsionen. Die Leber ist lehmfarben verfärbt, brüchig und weist eine verstärkte Läppchenzeichnung auf; sie kann aber auch dunkelrot verfärbt und geschwollen sein. Es lassen sich eine Leberzelldegeneration und -nekrose sowie eine Infiltration mit Neutrophilen und Histiozyten nachweisen. Petechien sowie Hämorrhagien sind in verschiedenen Organen, insbesondere Milz, Niere, Lunge, Trachea und Thymus, zu finden (SCHIRRMEIER et al. 1990; HAAS u.
THIEL 1993; NOWOTNY et al. 1993). Die Blutgerinnung ist gestört, und es sind Mikrothromben in den kleineren Gefäßen von Leber, Milz, Lunge, Gehirn und Niere nachweisbar (PARK et al. 1995, 1997; GUITTRE et al. 1996; PRIETO et al. 2000). Beim subakuten Verlauf lassen sich neben einer zentrolobulären Lebernekrose mit Kalzifikation auch Reparation (Fibrose), Regeneration und eine geringgradige entzündliche Reaktion beobachten, die das Gesamtbild einer Leberzirrhose ergeben (TEIFKE et al. 2002).
Die frühe Phase der Virusreplikation, insbesondere die Ausbreitung des Virus nach der Aufnahme bis zur Leber, ist wenig untersucht. GUITTRE et al. (1996) wiesen bei einem Tier virale RNA mittels RT-PCR zum Zeitpunkt der nasalen Infektion in der Tonsille und der Lunge nach, was auf das Inokulum zurückgeführt wurde. Schon ab 18 h p.i. wurde virales Genom in der Leber sowie der Milz und der Gallenflüssigkeit nachgewiesen. Bereits nach 36 h p.i. waren alle untersuchten Proben (diverse Organe, Leukozyten, Faeces, Urin) positiv in der RT-PCR. Ab diesem Zeitpunkt gelang auch der Nachweis von RHDV-Antigen mittels Hämagglutinationstest in der Leber, der Milz und der Gallenflüssigkeit sowie mittels Antigen-ELISA in der Leber (GUITTRE et al. 1996; SHIEN et al. 2000).
Durch Anwendung der Immunhistologie und In situ-Hybridisierung wurden die Zielzellen des RHDV charakterisiert. Virales Antigen wurde schon 12 h p.i. und später in den Hepatozyten nachgewiesen (PARK et al. 1995; GELMETTI et al. 1998; MIKAMI et al. 1999; JUNG et al.
LITERATURÜBERSICHT
2000; PRIETO et al. 2000; TEIFKE et al. 2002). PRIETO et al. (2000) fanden RHDV-Antigen 36 h p.i. auch in den Makrophagen und Lymphozyten der Milz und erst 72 h p.i. in den Makrophagen der Leber. Sie folgerten, daß der Hepatozyt die einzige Zelle in der Leber ist, die eine Virusreplikation direkt nach der Infektion ermöglicht. Mittels Immunhistologie wurde virales Antigen in Makrophagen der Milz und Leber auch von PARK et al. (1995) und MIKAMI et al. (1999) nachgewiesen. Schon nach 8 h p.i. detektierten GELMETTI et al. (1998) mittels In situ-Hybridisierung für RHDV-RNA positive Hepatozyten und folgerten daraus, daß in der Leber als Hauptreplikationsort des RHDV fast direkt nach der Infektion die Virusreplikation stattfindet. Neben den Hepatozyten waren mit dieser Methode insbesondere die Makrophagen der Leber, der Milz sowie Alveolarmakrophagen positiv (KIMURA et al. 2001; TEIFKE et al. 2002). KIMURA et al.
(2001) wiesen dabei mittels In situ-Hybridisierung und RT-PCR sowohl RNA in Plus- als auch in Minusstrangorientierung nach. Sie postulierten, daß auch in Makrophagen eine aktive Virusreplikation stattfindet, so daß diesen eine wichtige Rolle bei der Verbreitung des RHDV zukommt.
Die Entstehung des Hämorrhagischen Syndroms bei der RHD wird sowohl mit der massiven Lebernekrose als auch mit einer Schädigung des Gefäßendothels erklärt, die zusammen den primären und sekundären Mangel an Gerinnungsfaktoren bedingen. JUNG et al. (2000) haben ferner eine Apoptose von Hepatozyten bei der Infektion mit RHDV beschrieben, und auch bei Monozyten und Endothelzellen wurde eine Apoptose festgestellt (ALONSO et al. 1998). Die Leberschädigung bewirkt eine verstärkte Fibrinogensynthese und die Freisetzung von großen Mengen des Gewebsthromboplastins (PARK et al. 1997). Die Clearance der Gerinnungsfaktoren in der Leber ist gestört. Durch die Endothelschädigung wird ebenfalls Gewebsthromboplastin freigesetzt, und die Konzentration von gerinnungshemmenden Substanzen nimmt ab. Das Resultat ist eine Disseminierte Intravasale Gerinnung mit Verbrauch von Gerinnungsfaktoren und Blutplättchen, die mit Blutungen in diversen Organen einhergeht.
2.1.3 Epidemiologie und Bekämpfung
Erstmals wurde die RHD 1984 in China beschrieben (LIU et al. 1984), wo sie bei Kaninchen auftrat, die aus Deutschland importiert wurden. Es sind ausschließlich adulte Kaninchen der Species Oryctolagus cuniculus empfänglich. Heute ist die Erkrankung nahezu weltweit
Die Rabbit Haemorrhagic Disease
verbreitet und tritt in Asien, Europa, Afrika, Mittel- und Nordamerika auf (MITRO u.
KRAUSS 1993). Die RHD ist in der Liste B der OIE (frz. Office International des Èpizooties, internationales Tierseuchenamt) aufgeführt. Aufgrund der hohen Mortalität und der schnellen Ausbreitung der Erkrankung wurde die Eignung des RHDV zur Bekämpfung der Wildkaninchenplage in Australien untersucht. Während der Versuche auf einer Insel erreichte das Virus 1995 das Festland von Australien und wurde zwei Jahre später nach illegaler Freisetzung auch in Neuseeland nachgewiesen (THOMPSON u. CLARK 1997; KOVALISKI 1998).
Das RHDV hat eine hohe Kontagiosität und Tenazität (SMID et al. 1991), weshalb neben dem direkten Kontakt der Tiere auch die indirekte Übertragung durch belebte und unbelebte Vektoren von Bedeutung ist. Die Ausscheidungswege sind nicht vollständig aufgeklärt.
Mittels des Hämagglutinationstestes konnte das RHDV in Gallenflüssigkeit detektiert werden, Konjunktivaltupferproben und konzentrierte Urinproben waren nur sehr schwach positiv.
Durch RT-PCR wurde virale RNA in Kotproben, Urin und Gallenflüssigkeit nachgewiesen (NOWOTNY et al. 1993; SHIEN et al. 2000).
Das Auftreten klinischer Erscheinungen ist abhängig vom Alter der Tiere und der Immunitätslage. Es erkranken ausschließlich adulte Kaninchen. Bis heute ist nicht geklärt, warum Tiere bis zu einem Alter von 10 - 12 Wochen experimentell infizierbar sind, aber keine klinischen Symptome zeigen. Bei 4 Wochen alten Tieren wurden eine akute transiente Neutropenie, ein Anstieg der Aktivität der hepatischen Transaminasen sowie Infiltrate von Lymphozyten und eine geringgradige Zellschädigung in der Leber nachgewiesen (FERREIRA et al. 2004, 2005). Mittels Immunhistologie konnten PRIETO et al. (2000) bei 6 Wochen alten Tieren und MIKAMI et al. (1999) bei 2 bzw. 4 Wochen alten Tieren in der Leber RHDV-Antigen nachweisen. SHIEN et al. (2000) beobachteten bei 4 - 5 Wochen alten Tieren Fieber und eine Serokonversion. Mittels RT-PCR konnten sie virale RNA in den ersten Tagen nach der Infektion in diversen Organen und bis zu 47 d.p.i. in der Gallenflüssigkeit und der Milz nachweisen.
Da in Australien sowohl in Seren gesunder Kaninchen aus dem Jahre 1996 als auch in Seren, die vor dem Auftreten der RHD auf dem Festland gewonnen wurden, RHDV-spezifische Antikörper nachgewiesen wurden, wurde die Existenz eines nicht-pathogenen Calicivirus vor dem Jahre 1995 postuliert (NAGESHA et al. 2000). Das apathogene RCV, das insbesondere
LITERATURÜBERSICHT
im Darm vorkommt, wurde als potentieller Vorläufer des RHDV beschrieben (CAPUCCI et al. 1996b). Die Infektion von Kaninchenpopulationen mit diesem Virus führt zu einer Seroprävalenz von 100 % in adulten Tieren, die einen Kreuzschutz gegenüber dem RHDV bewirkt (CAPUCCI et al. 1997).
In letzter Zeit wurde aufgrund serologischer Untersuchungen und der Detektion viraler RNA in Organen von gesunden Kaninchen eine Viruspersistenz als bedeutender Faktor in der Epidemiologie diskutiert. FORRESTER et al. (2003) wiesen virales Genom in kompletter Länge in Lebern mittels nested RT-PCR und Sequenzierung nach und schlossen daraus auf persistierende RHDV-Infektionen in Neuseeland. Virale RNA wurde weiterhin mittels nested RT-PCR in Seren aus den Jahren 1955 bis 1980 aus Großbritannien detektiert (MOSS et al. 2002). Diese Arbeitsgruppe schlußfolgerte, daß ein avirulentes RHDV in der Population zirkulierte und diskutierte ebenfalls die Persistenz eines virulenten oder genetisch ähnlichen avirulentem RHDV trotz der Anwesenheit von Antikörpern. Experimentelle Beweise für diese These fehlen bisher.
Kaninchen, die RHDV-spezifische Antikörper aufweisen, sind vor der Erkrankung geschützt.
Es gibt aber auch serologische Hinweise auf ein RHDV-ähnliches Virus, das keine Kreuzimmunität bewirkt (MARCHANDEAU et al. 2005). Nach einer Vakzinierung bildet sich eine schützende Immunität innerhalb eines Zeitraums von ca. einer Woche aus; der Schutz bleibt für mindestens ein Jahr erhalten (ANONYMUS 2004).
Da die RHD eine i.d.R. akut verlaufende und nicht therapierbare Erkrankung ist, steht bei der Bekämpfung neben hygienischen Maßnahmen die prophylaktische - und evtl. auch metaphylaktische - Impfung im Vordergrund. Die kommerziell erhältlichen Vakzinen basieren auf inaktivierten und mit Adjuvans versetzten Leberhomogenaten von experimentell infizierten Kaninchen. Zur Zeit sind in Deutschland die Impfstoffe Cunivak RHD (Impfstoffwerk Dessau-Tornau), Lapimed® RHD (Merial) und RIKA-VACC (Riemser Arzneimittel) zur RHD-Prophylaxe sowie der Kombinationsimpfstoff Dercunimix®
(Merial) mit zusätzlichem Schutz gegen die Myxomatose erhältlich. Es handelt sich ausschließlich um monovalente Vakzinen, die aber ebenfalls - wenn auch mit geringerer Effizienz - einen Schutz gegen den seit 1998/1999 vermehrt nachgewiesenen zweiten Subtyp des RHDV verleihen. Verschiedene Subunitvakzinen sind in den letzten 15 Jahren entwickelt und unter experimentellen Bedingungen eingesetzt worden. Sie gewährleisten einen Schutz
Die Rabbit Haemorrhagic Disease
vor der Infektion mit RHDV, bislang ist aber keine dieser Vakzinen auf dem Markt erhältlich.
Als Expressionssysteme für das VP60 als Hauptimmunogen des RHDV sind Escherichia coli (BOGA et al. 1994), Saccharomyces cerevisiae (BOGA et al. 1997), Pichia pastoris (FARNOS et al. 2005) und transgene Pflanzen (CASTANON et al. 1999;
FERNANDEZ-FERNANDEZ et al. 2001) verwendet worden. Weiterhin wurden virale Expressionssysteme wie Vaccinia- (BERTAGNOLI et al. 1996b), Kanarienpocken- (FISCHER et al. 1997), Myxoma- (BERTAGNOLI et al. 1996a; BARCENA et al. 2000;
TORRES et al. 2001) und Bakuloviren (LAURENT et al. 1994; MARIN et al. 1995;
NAGESHA et al. 1995; PLANA-DURAN et al. 1996) genutzt. Bei der Expression des VP60 über rekombinante Bakuloviren setzt sich das Protein zu so genannten
„virus-like particles (VLPs)“ zusammen, die ebenfalls immunogen wirken (LAURENT et al.
1994; NAGESHA et al. 1995; SIBILIA et al. 1995; PLANA-DURAN et al. 1996).
2.1.4 Laboratoriumsdiagnose 2.1.4.1 Indirekter Erregernachweis
Serologische Nachweisverfahren zum indirekten Erregernachweis, d.h. zum Nachweis RHDV-spezifischer Antikörper, spielen bei der zumeist perakut bis akut verlaufenden RHD eine untergeordnete Rolle. Für die Bestimmung des Antikörperstatus nach der Vakzinierung oder einer überstandenen Infektion sind sie von Bedeutung, da die humorale Immunantwort entscheidend ist für den Schutz vor der Erkrankung. Im „Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals“ der OIE (ANONYMUS 2004) ist die Durchführung eines Hämagglutinationshemmtestes (LIU et al. 1984), eines kompetitiven Antikörper-ELISAs und eines Isotypen-spezifischen Antikörper-ELISAs beschrieben. Antikörper-ELISAs wurden z.B. von NAGESHA et al. (2000) und COLLINS et al. (1995) entwickelt und angewendet.
2.1.4.2 Direkter Erregernachweis
Mittels des direkten Erregernachweises wird das Virus oder dessen Nukleinsäure nachgewiesen. Die Leber enthält die größten Mengen an Virus und wird daher meistens als Probenmaterial verwendet, alternativ können auch andere Organe, wie z.B. die Milz, genutzt werden (SCHIRRMEIER et al. 1990).
LITERATURÜBERSICHT
Der Hämagglutinationstest mit Humanerythrozyten der Blutgruppe 0 war der erste in der Routinediagnostik angewandte Test zum Nachweis des RHDV (LIU et al. 1984) und wird auch heute noch häufig eingesetzt. Das Virus kann auch mittels Elektronenmikroskopie bzw.
Immun-Elektronenmikroskopie (GRANZOW et al. 1989, 1996; VALICEK et al. 1990, 1992;
OHLINGER et al. 1990; OHLINGER u. THIEL 1991), Antigen-ELISA (CAPUCCI et al.
1991, 1995; COLLINS et al. 1996; SCHIRRMEIER et al. 1999), Immunhistologie (CARRASCO et al. 1991; STOERCKLE-BERGER et al. 1992; PARK u. ITAKURA 1992;
PARK et al. 1992; PRIETO et al. 2000) und Western Blot (PARK u. ITAKURA 1992; PARK et al. 1992; SHIEN et al. 1998) nachgewiesen werden, wobei mit diesen Techniken ein Zuwachs an Sensitivität und Spezifität erreicht wurde. Ab dem Jahre 1995 wurden diverse RT-PCR-Verfahren (GUITTRE et al. 1995; GOULD et al. 1997; ROS et al. 1997; MOSS et al. 2002; FORRESTER et al. 2003) und auch eine Immunocapture-RT-PCR (GALL-RECULE et al. 2001) für den Nachweis von RHDV beschrieben. Ferner kann mittels In situ-Hybridisierung das virale Genom im Gewebe detektiert werden (GELMETTI et al.
1998; KIMURA et al. 2001; TEIFKE et al. 2002). Im „Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals“ der OIE (ANONYMUS 2004) ist die Durchführung der genannten Testverfahren mit Ausnahme der RT-PCR und der In situ-Hybridisierung beschrieben. Für diese Methoden zum Nachweis der RNA wird auf entsprechende Publikationen verwiesen (GUITTRE et al. 1995; GOULD et al. 1997; GELMETTI et al.
1998). Ferner wird die experimentelle Infektion empfänglicher Kaninchen erwähnt, da kein Zellkultursystem zur produktiven Vermehrung des RHDV existiert.
Differentialdiagnostisch müssen Intoxikationen sowie Infektionen mit Pasteurellen oder Staphylokokken berücksichtigt werden (MITRO u. KRAUSS 1993).
2.2 Die quantitative real-time Polymerasekettenreaktion
2.2.1 Einleitung
Die PCR wurde 1986/1987 als Technik zur in vitro-Amplifizierung eines spezifischen DNA-Fragmentes (MULLIS et al. 1986; MULLIS u. FALOONA 1987) durch ein hitzestabiles Enzym, wie z.B. die Taq-Polymerase des Bakteriums Thermus aquaticus (CHIEN et al. 1976; SAIKI et al. 1988), eingeführt. Sie ist seitdem zu einer der wichtigsten Methoden in der Diagnostik und Forschung geworden. Die konventionelle PCR mit der sich
Die quantitative real-time Polymerasekettenreaktion
anschließenden Darstellung der Amplifikate über eine Agarosegelelektrophorese ist mit einem verhältnismäßig großen Arbeits-, Material- und Zeitaufwand verbunden. Außerdem ist das Risiko von Kreuzkontaminationen und falsch-positiven Ergebnissen erheblich (MCKILLIP u. DRAKE 2004). Das gilt insbesondere für eine nested PCR (dt. verschachtelte PCR), bei der das Produkt als template (dt. Matrize) für eine weitere PCR mit innerhalb des ersten Amplifikates liegenden Primern genutzt wird, und eine two-step RT-PCR (dt. zweischrittige RT-PCR), da hier die Reaktionsgefäße nach der Reversen Transkription (RT, cDNA-Synthese) zusätzlich geöffnet werden, um cDNA in den PCR-Ansatz zu überführen. Ferner handelt es sich bei der Detektion über Agarosegele um eine Endpunktanalyse, weil hier nur die Bandenstärke, die abhängig sein kann von der Effizienz der Amplifizierung, berücksichtigt wird (MCKILLIP u. DRAKE 2004).
Daher wurde in der Folgezeit an der Entwicklung von Detektionssystemen gearbeitet, die eine Analyse der Amplifikatbildung in „real-time“ (dt. Echtzeit) über Fluoreszenzsignale, die direkt mit der Amplifizierung des Zielgens in Zusammenhang stehen, erlauben. Wenn die Amplifizierung und die Detektion gleichzeitig ablaufen, ist diese Methode schneller - erlaubt also einen höheren Probendurchsatz - und birgt ein geringeres Kontaminationsrisiko als die konventionelle PCR (NAZARENKO et al. 1997; SCHWEIGER et al. 2000; BLACK et al.
2002). Bei der real-time PCR wird bereits am Beginn der exponentiellen Phase der PCR der so genannte Ct-Wert (engl. threshold cycle) ermittelt und zur Bestimmung der Ausgangsmenge der Zielsequenz genutzt. Der Ct-Wert zeigt eine bessere Korrelation mit der tatsächlichen Ausgangsmenge der Zielsequenz als die mittels einer Agarosegelelektrophorese dargestellte Menge des PCR-Produktes nach der Reaktion, da hierbei zum Zeitpunkt der Detektion die Plateauphase schon erreicht ist. Die Detektion bei der real-time PCR erfolgte zunächst mit interkalierenden fluoreszierenden Farbstoffen, später wurden sequenzspezifische Sonden (engl. probe) entwickelt, die einen Zuwachs an Spezifität gegenüber der konventionellen PCR ermöglichten (BUSTIN 2000). Die Grundlage dafür bildete das von CARDULLO et al. (1988) beschriebene Prinzip des Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfers (FRET, Abbildung 2).
LITERATURÜBERSICHT
Abbildung 2: Das FRET-Prinzip. F1 und F2 sind die beiden beteiligten Fluorochrome, die auch als Reporter/Donor und Quencher/Akzeptor bezeichnet werden. Sie haben die Anregungswellenlängen A1 und A2 sowie die Emissionswellenlängen E1 und E2. In den Diagrammen ist die Emission (als Fluoreszenzstärke R) gegen die Wellenlänge aufgetragen.
Der FRET-Effekt tritt auf, wenn zwei Fluorochrome, deren Anregungs- und Emissionsspektren überlappen, in eine räumliche Nähe von unter etwa 70 Å gebracht werden (SELVIN u. HEARST 1994). Ein Fluorochrom F1 wird durch eine bestimmte Anregungswellenlänge A1 zur Emission der Energie mit der Emissionswellenlänge E1 angeregt. Wenn E1 der Anregungswellenlänge A2 des Fluorochroms F2 entspricht, wird die Energie auf dieses übertragen und in Form der Emissionswellenlänge E2 abgegeben. Wenn F1 und F2 räumlich getrennt werden, findet diese Energieübertragung nicht mehr statt. Die Bezeichnung der verwendeten Fluorochrome richtet sich nach der gemessenen Wellenlänge:
Wird E1 gemessen, so ist F1 der Reporterfarbstoff und F2 der Quencher (engl. to quench, unterdrücken). Die Emissionswellenlänge des Quenchers wird entweder nicht detektiert, oder es handelt sich um nicht-fluoreszierende Quencher (so genannte „dark quencher“), die die Energie in Form von Wärme abgeben. Bei Messung von E2 wird F1 als Donor und F2 als Akzeptor bezeichnet.
Parallel entwickelte sich die Technologie zur Detektion der Fluoreszenzsignale weiter. Um die Amplifizierung des Produktes in „real-time“ beobachten zu können, wurde in ersten Versuchen die Reaktion mehrmals gestoppt, ein Aliquot genommen und die Stärke des Fluoreszenzsignales analysiert. Ferner wurde mit Videokameras bzw. der Kombination eines klassischen Thermocyclers mit einer Fiberglasoptik und einem Spektrofluorometer
E1 = A2
E2 A2
A1 E1
A1 E2
F1
F1
F2
F2 Wellenlänge
Wellenlänge R
R
Die quantitative real-time Polymerasekettenreaktion
gearbeitet (HIGUCHI et al. 1992, 1993). Heute sind real-time PCR-Systeme verschiedener Anbieter (Applied Biosystems, Roche, Stratagene, Bio-Rad, Corbett Research) kommerziell verfügbar, die einen Thermocycler, eine Lichtquelle (Licht emittierende Dioden, sog. LEDs, Laser oder Halogenlampe, je nach Modell) und das Detektionsmodul in einem Gerät kombinieren (ISHIGURO et al. 1995; WITTWER et al. 1997b). Es wurden Geräte für die simultane Detektion mehrerer Wellenlängen mit entsprechender Filteranzahl (maximal 6) entwickelt, die eine Koamplifizierung und -detektion mehrerer Zielsequenzen (engl. multiplexing) ermöglichen. Die neuesten Systeme erlauben eine Messung von Wellenlängen zwischen 350 und 750 nm. Außerdem können bis zu 384 Proben bei vollständiger Automatisierung parallel analysiert werden.
Weitere Vorteile der real-time PCR gegenüber der konventionellen PCR sind die i.d.R.
größere Sensitivität, die auf der Amplifizierung sehr kurzer Fragmente basiert (TOOULI et al.
2000), und die Möglichkeit der Quantifizierung der eingesetzten Nukleinsäuremengen (HEID et al. 1996; BUSTIN 2000; LIVAK u. SCHMITTGEN 2001; FRONHOFFS et al. 2002).
Die genannten Gründe erklären den immer breiteren Einsatz der real-time PCR sowohl für diagnostische als auch für wissenschaftliche Zwecke. Ein wichtiges Anwendungsgebiet ist die schnelle Diagnostik von Pathogenen mit einem hohen Probendurchsatz, wie sie z.B. beim Screening von Blutproben oder Zellkulturen auf Retroviren nötig ist (DE WIT et al. 2000;
DROSTEN et al. 2001). Auch in der veterinärmedizinischen Diagnostik sind diverse real-time PCR-Protokolle beschrieben worden (MCGOLDRICK et al. 1998; COOK et al.
2002; HUGHES et al. 2004). Weiterhin wird die real-time PCR verwendet zur Quantifizierung von Nukleinsäuremengen, z.B. zur Bestimmung der Virusgenomlast im Rahmen von Pathogenesestudien bzw. für prognostische Aussagen (PAS et al. 2000; RYAN et al. 2003; BRUNBORG et al. 2004; OLVERA et al. 2004; TOWNER et al. 2004) oder zur Messung der Genexpression für verschiedene Zytokine (STORDEUR et al. 2002). Außerdem können mit dem Ziel der allelen Diskriminierung Punktmutationen (engl. single nucleotide polymorphisms, SNPs) mittels real-time PCR detektiert werden (GIESENDORF et al. 1998;
TYAGI et al. 1998; THELWELL et al. 2000; PICKERING et al. 2002).
LITERATURÜBERSICHT
2.2.2 Detektionssysteme
2.2.2.1 Detektionssysteme ohne Zuwachs an Spezifität
In doppelsträngige DNA interkalierende Farbstoffe waren die ersten eingesetzten Systeme zur Detektion der Amplifikatbildung bei einer PCR in „real-time“. Zunächst wurde Ethidiumbromid verwendet (HIGUCHI et al. 1992, 1993), das nach Anregung durch ultraviolettes (UV) Licht fluoresziert. Bei der Interkalierung in die PCR-Produkte nimmt die Fluoreszenz stark zu (Abbildung 3).
Abbildung 3: Funktionsprinzip der interkalierenden Farbstoffe. (a) Denaturierung. (b) Annealing (dt. Anlagerung). (c) Elongation. Es ist jeweils nur der rev-Strang sowie der for-Primer (Pfeil) gezeigt. Der in die doppelsträngige DNA interkalierende Farbstoff ist grün dargestellt.
Es wurde festgestellt, daß die Kinetik der Zunahme der Fluoreszenz mit der Ausgangsmenge der DNA-Moleküle korreliert. Je weniger Zyklen nötig waren für eine detektierbare Fluoreszenz, desto größer war die Ausgangsmenge der Zielsequenz (HIGUCHI et al. 1993).
Heute werden außerdem YO-PRO-1 (ISHIGURO et al. 1995) und in den meisten Fällen 3´ 5´
3´
3´
5´
5´
(a)
(b)
(c)
Die quantitative real-time Polymerasekettenreaktion
SYBR®Green I (Molecular Probes Inc.) eingesetzt (WITTWER et al. 1997a, 1997b). Da diese Farbstoffe alle unspezifisch in die doppelsträngige DNA, also auch Primerdimere und unspezifische PCR-Produkte, interkalieren, kann es auch in negativen Proben zu einem Anstieg der Fluoreszenz kommen (BROWNIE et al. 1997). Eine Quantifizierung auf der Basis interkalierender Farbstoffe kann nur erfolgreich sein, wenn es keine Primerdimere und unspezifische PCR-Produkte gibt bzw. wenn nachgewiesen wird, daß diese keinen Einfluß auf die Quantifizierung haben. Aus diesen beiden Gründen müssen unspezifische PCR-Produkte und Primerdimere von den spezifischen PCR-Produkten differenziert werden.
Das ist über eine Schmelzkurvenanalyse, die sich der eigentlichen PCR anschließt, möglich (RIRIE et al. 1997). Dabei wird der Reaktionsansatz von beispielsweise 55 °C auf 95 °C erhitzt, kontinuierlich die Fluoreszenz R gemessen und gegen die jeweilige Temperatur aufgetragen. Man erhält Schmelzkurven, deren Verlauf abhängig ist vom GC-Gehalt, der Länge und der Sequenz des Produktes. Beim Erreichen der Schmelztemperatur kommt es zur Denaturierung des Produktes, d.h. die doppelsträngige DNA schmilzt, und es ergibt sich ein Abfall der Fluoreszenzstärke. Wenn auf der x-Achse die Temperatur und auf der y-Achse die Fluoreszenzstärke als -R (T) aufgetragen wird, resultieren Schmelzpunkt-Peaks, die jeweils für ein Produkt stehen (Abbildung 4). Ist die Schmelztemperatur des spezifischen Produktes bekannt, so kann dieses von Artefakten unterschieden werden, und auch verschiedene spezifische Produkte, die auf unterschiedliche Isolate eines Virus zurückgehen, können differenziert werden (HELPS et al. 2002). Der Einsatz interkalierender Farbstoffe in der real-time PCR ist nützlich für einmalige Anwendungen, da die Farbstoffe günstig und universell verwendbar sind, und außerdem sinnvoll für das Testen verschiedener Primer für die Optimierung einer PCR-Reaktion.
LITERATURÜBERSICHT
Abbildung 4: Schmelzkurvenanalyse mit SYBR®Green I. Die normalisierte Fluoreszenzstärke ist in (a) als Rn und in (b) als -Rn (T), jeweils gegen die Temperatur in °C, aufgetragen. Die schwarzen Kurven gehen auf spezifische PCR-Produkte zurück. Die graue Kurve repräsentiert die negative Kontrolle (engl. no template control, NTC), bei der Primerdimere detektiert werden. Diese lassen sich durch die geringere Schmelztemperatur von spezifischen Produkten differenzieren. Es wurde eine log10-Verdünnungsreihe von RHDV-RNA als template eingesetzt.
(a)
(b)
Die quantitative real-time Polymerasekettenreaktion
Als weitere Detektionssysteme, die zwar spezifischer sind als interkalierende Farbstoffe, aber keinen Zuwachs an Spezifität gegenüber der konventionellen PCR ermöglichen, werden modifizierte Primer angeboten. Das Amplifluor™ Universal Detection System (Chemicon®
international) verwendet den so genannten UniPrimer™ mit Haarnadelstruktur (UEHARA et al. 1999). Er trägt am 5´-Ende den Reporterfarbstoff, am 3´-Ende einen nicht-fluoreszierenden Quencher und noch weiter in 3´-Richtung eine sequenzspezifische Primerstruktur. Während der Elongation wird die Haarnadelstruktur geöffnet und ein komplementärer Strang erzeugt, so daß der Primer in das PCR-Produkt inkorporiert wird. Dabei wird der FRET-Effekt aufgehoben und die Reporterfluoreszenz emittiert. Dieses System erwies sich als gut geeignet für die Automatisierung (PICKERING et al. 2002).
Die LUX™ Fluorogenic Primer (Light Upon eXtension, Invitrogen) stellen ein weiteres kommerziell erhältliches System von modifizierten Primern dar. Jedes LUX™ Primer Set besteht aus einem nicht modifizierten Primer sowie einem Fluorochrom-markierten Primer, die beide spezifisch für die Zielsequenz sind. Der markierte Primer weist durch 4 - 6 selbst-komplementäre Nukleotide eine Haarnadelstruktur auf und trägt nahe dem 3´-Ende den Farbstoff (FAM, JOE, TET, HEX oder Alexa Fluor® 546). Durch diese Konfiguration kommt ein quenching zustande. Es wird unterbrochen, wenn der Primer in linearer Form in das PCR-Produkt eingebaut wird, und resultiert in einem Anstieg der Stärke des Fluoreszenzsignales.
2.2.2.2 Detektionssysteme mit Zuwachs an Spezifität
Die auf dem FRET-Prinzip basierenden sequenzspezifischen Sonden werden als zusätzliche hybridisierende Oligonukleotide neben den beiden Primern in der real-time PCR eingesetzt, wodurch ein Zuwachs an Spezifität gegenüber der konventionellen PCR und den bisher beschriebenen Detektionssystemen gegeben ist (BUSTIN 2000).
Die FRET-Sonden oder Hybridisierungssonden („HybProbe“, Roche Diagnostics GmbH) wurden für die Verwendung mit dem LightCycler® (Roche) konzipiert (WITTWER et al.
1997a, 1997b). Es handelt sich im Prinzip um zwei Sonden, von denen die eine (Donor) am 3´-Ende mit Fluoreszein und die andere (Akzeptor) am 5´-Ende mit LightCycler Red markiert ist (Abbildung 5a). In der Annealing-Phase (dt. Anlagerung) hybridisieren beide im Abstand von 1 - 5 Nukleotiden mit der Zielsequenz. Es kommt zum FRET-Effekt und die Fluoreszenz
LITERATURÜBERSICHT
Dadurch, daß zwei Sonden neben den beiden Primern eingesetzt werden, ist die Spezifität besonders hoch, aber auch das Design der Sonden erschwert.
Bereits 1991 wurde von HOLLAND et al. (1991) beschrieben, daß Sonden, die am 5´-Ende radioaktiv markiert waren, durch die 5´-3´-Exonuklease-Aktivität der Taq-Polymerase hydrolysiert werden. LEE et al. (1993) entwickelten daraufhin Sonden, die am 5´-Ende mit einem Reporterfarbstoff und am 3´-Ende mit einem Quencher modifiziert waren (Applied Biosystems). In beiden Fällen war die simultane Amplifizierung des Zielgens und Generierung eines Zielgen-spezifischen Signals möglich. Die Auswertung erfolgte jedoch noch nach der PCR. Die TaqMan®-Sonden (Applied Biosystems/Genentech) basieren auf dieser Technologie und kommen seit 1995 zum Einsatz (LIVAK et al. 1995; GIBSON et al.
1996; HEID et al. 1996). Sie sind am 5´-Ende mit einem Reporterfarbstoff und am 3´-Ende mit einem Quencher markiert (Abbildung 5b). Während der Denaturierungs- und Annealing- Phase kommt es zum FRET-Effekt. In der Elongationsphase wird die Sonde durch die 5´-3´- Exonuklease-Aktivität der Taq-Polymerase hydrolysiert, der FRET-Effekt aufgehoben und die Reporterfluoreszenz emittiert.
Bei den minor groove binder (MGB)-Sonden (MGB Eclipse™ Probes, Epoch Bioscience;
QuantiProbe™, Qiagen) befindet sich am 5´-Ende der MGB (KUMAR et al. 1998) sowie ein nicht-fluoreszierender Quencher und am 3´-Ende der Reporterfarbstoff. Der MGB legt sich in die kleine Furche der DNA und stabilisiert die Bindung, so daß die Sonde verkürzt werden kann, was mit einer erhöhten Spezifität einhergeht (KUTYAVIN et al. 2000). Der FRET-Effekt wird nicht durch die Taq-Polymerase aufgehoben, vielmehr verhindert der MGB die Hydrolyse der Sonde (AFONINA et al. 2002, MGB Eclipse™ Probes). Die Reporterfluoreszenz wird hier emittiert, da die Sonde sich während der Annealing-Phase in eine lineare Form streckt, so daß Reporterfarbstoff und Quencher getrennt werden (Abbildung 5c). Es sind außerdem TaqMan®-Sonden erhältlich, die mit einem MGB modifiziert sind (TaqMan® MGB Probes, Applied Biosystems).
Die quantitative real-time Polymerasekettenreaktion
Abbildung 5: Funktionsprinzip der FRET-Sonden (a), TaqMan®-Sonden (b), minor groove binder (MGB)-Sonden (c) und molecular beacons (d). Es ist jeweils nur der rev-Strang sowie der for-Primer (Pfeil) gezeigt. Das obere Bild zeigt jeweils die Denaturierungsphase, das mittlere die Annealing- und das untere die Elongationsphase. Die Sonden tragen ein Donormolekül „D“ und ein Akzeptormolekül „A“ bzw. den Reporterfarbstoff „R“ sowie einen Quencher „Q“. „MGB“ steht für den minor groove binder.
3´
3´
3´ 5´
5´
5´ 3´ 5´
3´ 5´
3´ 5´
(c) (d)
R R
R Q
MGB MGB
MGB
Q Q
R R
Q Q
R Q
D A
D A
Q R
R
R
Q Q
D A 3´ 5´
3´
3´
5´
5´
3´
3´
5´
5´
3´ 5´
(a) (b)
LITERATURÜBERSICHT
Molecular beacons sind am 5´-Ende mit einem Reporterfarbstoff und am 3´-Ende mit einem Quencher markiert, wobei i.d.R. nicht-fluoreszierende Quencher wie Dabcyl (4-(4´-Dimethylaminophenylazo)-Benzoesäure) verwendet werden (TYAGI u.
KRAMER 1996; GIESENDORF et al. 1998; VET et al. 1999). Sie liegen während der Denaturierung und der Elongation in einer Haarnadelstruktur vor, die aus einer selbst-komplementären Stammregion und einer loop-Region mit den sequenzspezifischen Nukleotiden besteht. Durch die räumliche Nähe von Reporterfarbstoff und Quencher findet in dieser Konfiguration der FRET-Effekt statt (Abbildung 5d). Während der Annealing-Phase geht die Sonde in eine lineare Struktur über und hybridisiert mit der Zielsequenz. Der FRET- Effekt wird unterbrochen und die Reporterfluoreszenz emittiert. Bei diesen Sonden haben mögliche fehlerhafte Basenpaarungen (engl. mismatches) mit der Zielsequenz einen größeren destabilisierenden Effekt, weil die Haarnadelstruktur im Vergleich zu linearen Sonden stabiler ist. Daher sind molecular beacons sehr spezifisch und werden z.B. für die Detektion von SNPs eingesetzt (TYAGI et al. 1998). Der Nachteil ist das schwierige Design der Sonden.
Bei den Scorpions™ (DxS Ltd.) handelt es sich um von WHITCOMBE et al. (1999) enwickelte Sonden, deren Funktion im Gegensatz zu den bisher genannten auf einem unimolekularen Mechanismus beruht und die irreversibel in das PCR-Produkt inkorporiert werden (THELWELL et al. 2000). Sie bestehen aus einer sequenzspezifischen Haarnadelstruktur, die am 5´-Ende den Reporterfarbstoff und am 3´-Ende einen nicht-fluoreszierenden Quencher trägt. Diese Haarnadelstruktur ist am 3´-Ende über Hexethylen-Glykol mit einer sequenzspezifischen Primerstruktur verbunden (Abbildung 6).
Die Primerstruktur hybridisiert im ersten Annealing-Schritt mit der Zielsequenz und dient bei der Elongation als Startpunkt für die Taq-Polymerase. Bei der folgenden Denaturierung wird auch die Haarnadelstruktur geöffnet. Im zweiten Annealing-Schritt hybridisiert die sequenzspezifische Region der Haarnadelstruktur durch ein „Umklappen“ mit einer komplementären Sequenz des Amplikons, der FRET-Effekt wird aufgehoben und die Reporterfluoreszenz emittiert. Das Hexethylen-Glykol verhindert als „PCR-Stopper“ die Synthese eines komplementären Strangs zur Haarnadelstrukur des Scorpions™, so daß die Haarnadelstruktur nur durch die Hybridisierung mit der Zielsequenz aufgelöst werden kann.
Die quantitative real-time Polymerasekettenreaktion
Abbildung 6: Funktionsprinzip eines Scorpions™. (a) Annealing/Elongation. (b) Denaturierung.
(c) Annealing. Es ist in (a) und (b) jeweils nur ein Strang sowie der Scorpion™ mit der sequenzspezifischen Primerstruktur (Pfeil) gezeigt. Beim zweiten Annealing-Schritt (c) ist nur noch der von der Taq-Polymerase synthetisierte Strang dargestellt. Die Sonde trägt einen Reporterfarbstoff „R“ sowie einen Quencher „Q“. „Stop“
steht für das Hexethylen-Glykol, das die Synthese eines zur Haarnadelstruktur komplementären Strangs verhindert.
2.2.3 Datenanalyse
Die Auswertung der real-time PCR erfolgt Software-gestützt über die Messung und graphische Darstellung der emittierten Fluoreszenz der Fluorochrome, die proportional ist zur entstehenden Amplifikatmenge. In jedem Zyklus wird die Fluoreszenzstärke R gemessen, die für die native Fluoreszenz der Fluorochrome steht. Wird diese korrigiert um den Fluoreszenzwert der Basislinie, so erhält man den Fluoreszenzwert dR. Wenn R mit der Fluoreszenz eines Referenzfarbstoffes (z.B. 5-Carboxy-X-Rhodamin, ROX) abgeglichen (normalisiert) wird, erhält man Rn. Falls sowohl um die Basislinie als auch um die Fluoreszenz des Referenzfarbstoffes korrigiert wird, wird der Fluoreszenzwert dRn dargestellt. Die Ergebnisse werden in Form von Amplifikationsgrafiken
5´ 3´
3´ 5´
3´ 5´
Stop Stop
R
Q
Q R
R Q
Stop
5´ 3´
3´
5´
(a)
(b)
(c)
LITERATURÜBERSICHT
(engl. amplification plots), bei denen auf der x-Achse der Zyklus und auf der y-Achse die Fluoreszenzstärke (als R, Rn, dR, dRn) aufgetragen ist, graphisch dargestellt (Abbildung 7).
Der Referenzfarbstoff wird eingesetzt, um Unterschiede in der Fluoreszenz, die nicht mit der Amplifizierung zusammenhängen (z.B. durch nicht identische Volumina des Mastermixes oder unterschiedliche Lichtbrechung), auszugleichen bzw. zu normalisieren. Die Basislinie wird i.d.R. Software-gestützt für jede Probe berechnet und stellt den Bereich dar, in dem noch kein Anstieg der Fluoreszenzstärke durch entstehende Amplifikate zu verzeichnen ist. Da das quenching der verwendeten Sonden nicht vollständig ist, wird auch hier eine gewisse Hintergrundfluoreszenz gemessen.
Abbildung 7: Amplifikationsgrafik. In diesem Fall ist die normalisierte und Basislinien-korrigierte Fluoreszenzstärke (dRn) gegen die Zyklenzahl aufgetragen. Die schwarze Linie stellt den Fluoreszenzschwellenwert (engl. threshold) dar. Der Schnittpunkt zwischen Amplifikationsgraph und Fluoreszenzschwellenwert, projiziert auf die x-Achse, markiert den Ct-Wert (engl. threshold cycle). Es wurden 4 Standards (gefüllte Kästchen), eine unbekannte Probe (nicht gefüllte Kästchen) und eine negative Kontrolle, bei der kein Anstieg der Fluoreszenz zu verzeichnen war, eingesetzt.
threshold
Ct
Die quantitative real-time Polymerasekettenreaktion
Außerdem wird ein Fluoreszenzschwellenwert (engl. threshold) berechnet, der über der Hintergrundfluoreszenz in der linearen Phase des Amplifikationsgraphen liegen sollte, die der log-linearen Phase der PCR entspricht. In manchen Fällen, z.B. bei großen Mengen template, kann eine manuelle Korrektur der Basislinie sowie des Fluoreszenzschwellenwertes nötig sein. Der Ct-Wert (engl. threshold cycle) markiert den Zyklus, bei dem der Amplifikationsgraph einer positiven Probe den Fluoreszenzschwellenwert kreuzt. Er steht in direktem Zusammenhang mit der Ausgangsmenge der Zielsequenz und bildet so die Grundlage der Quantifizierung. Der Ct-Wert ist umso kleiner, je mehr Zielsequenz in der Probe vorhanden ist (HEID et al. 1996).
2.2.4 Quantifizierung 2.2.4.1 Absolute Quantifizierung
Bei der absoluten Quantifizierung wird die absolute Menge der Zielsequenz in einer unbekannten Probe - meistens ausgedrückt als Kopienzahl pro Reaktion - bestimmt. Dazu werden mehrere Standards mit bekannten Mengen der Zielsequenz in separaten Reaktionen mitgeführt (externe Standards). Als DNA-Standards für eine real-time PCR werden gewöhnlich linearisierte Plasmide mit klonierter Zielsequenz verwendet. Für eine real-time RT-PCR bieten sich als RNA-Standards in vitro-Transkripte auf der Basis von Plasmiden an (BUSTIN 2000; FRONHOFFS et al. 2002). Alternativ können genomische DNA/RNA oder auch PCR-Produkte im Falle der Quantifizierung von DNA genutzt werden.
Für die Standards wird der jeweilig erhaltene Ct-Wert (auf der y-Achse) gegen die initiale Menge der Zielsequenz (als Kopienzahl auf der logarithmischen x-Achse) aufgetragen, wodurch eine Standardkurve entsteht (HEID et al. 1996). Der Ct-Wert einer unbekannten Probe wird mit der Standardkurve verglichen, so daß die absolute initiale Kopienzahl bestimmt werden kann (Abbildung 8). Dabei sollte die unbekannte Probe in den Bereich fallen, der mit der Standardkurve abgedeckt wird (BUSTIN 2000). Die Voraussetzung für eine exakte Quantifizierung ist die korrekte Bestimmung der Kopienzahl der Zielsequenz in den Standards, die über eine Umrechnung mittels des Molekulargewichtes nach der photometrischen Bestimmung der Absorption A260nm erfolgt. Außerdem müssen für die Standards und die Proben die identischen Oligonukleotide zur Amplifizierung und Detektion verwendet werden, die Sequenzen beider müssen möglichst ähnlich sein, und eine äquivalente
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Effizienz der Amplifizierung muß gegeben sein (NIESTERS 2004). Optimal ist eine PCR-Effizienz von 100 %, die sich auch in einer Steigung der Standardkurve von -3,322 widerspiegelt. In diesem Fall wird die Amplifikatmenge pro Zyklus exakt verdoppelt. Der optimale Wert für den Korrelationskoeffizienten RSq, der die Qualität der Standards beschreibt, beträgt 1.
Dye Well Type Ct (dRn) Quantity (copies)
FAM Standard 18,23 1,00E+07
FAM Standard 25,15 1,00E+05
FAM Standard 31,79 1,00E+03
FAM Standard 38,05 1,00E+01
FAM Unknown 35,17 8,04E+01
FAM NTC No Ct No Ct
Abbildung 8: Standardkurve und tabellarische Darstellung der Ergebnisse bei der absoluten Quantifizierung. Für die Standardkurve wird die Zyklenzahl gegen die initiale Menge der Zielsequenz (als Kopienzahl auf der logarithmischen x-Achse) aufgetragen. Es wurden 4 Standards (gefüllte Kästchen) und eine unbekannte Probe (nicht gefüllte Kästchen) verwendet, die Amplifikationsgrafik ist in der Abbildung 7 dargestellt.
Ct Probe x
Kopienzahl Probe x
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2.2.4.2 Relative Quantifizierung
Bei der relativen Quantifizierung wird davon ausgegangen, daß Veränderungen in der Menge der mRNA (engl. messenger RNA, Boten-RNA) den Veränderungen in der Menge des Proteins entsprechen. Die Menge der Zielsequenz in der Probe wird normalisiert auf ein endogenes Referenzgen und dann in Relation zu einer Referenzprobe (Kalibrator) gesetzt. Es werden also zwei Zustände miteinander verglichen, z.B. Zytokinprofile zu unterschiedlichen Versuchszeitpunkten.
Als erstes wird die Menge des Zielgens auf ein endogenes Referenzgen, das in den Proben vorhanden ist, normalisiert (HEID et al. 1996). Als Referenzgen werden gewöhnlich so genannte „housekeeping genes“, z.B. die mRNA für ß-Aktin, GADPH (Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase) sowie ß-2-Mikroglobulin genutzt (HEID et al. 1996). Die Voraussetzung für die Verwendung ist eine konstante Transkription des housekeeping genes unter den experimentellen Bedingungen und in unterschiedlichen Probenmaterialien. Mittels real-time RT-PCR, Northern Blot und Ribonuklease protection-assay (BHATIA et al. 1994; ZHONG u. SIMONS 1999;
TRICARICO et al. 2002) wurde gezeigt, daß diese nicht immer gewährleistet ist. Daher muß das housekeeping gene mit den geringsten Veränderungen ausgewählt oder ein Index aus mehreren housekeeping genes (VANDESOMPELE et al. 2002) verwendet werden. Eine Normalisierung auf ribosomale RNA oder totale RNA ist ebenfalls möglich (ZHONG u.
SIMONS 1999; TRICARICO et al. 2002). Alternativ können artifizielle Nukleinsäuren, wie z.B. Plasmid-DNA, der Probe während der Nukleinsäureisolierung zugesetzt und als Referenzgen genutzt werden (GRUBER et al. 2001). Die Zielsequenz und das Referenzgen werden entweder in separaten Reaktionen (single assay) oder zusammen im multiplex assay amplifiziert. Nachdem ein Kalibrator festgelegt wurde, wird dann für jede Probe die relative Menge der Zielsequenz in Bezug auf den Kalibrator berechnet, so daß die Proben miteinander verglichen werden können. Die Berechnungen erfolgen entweder über Standardkurven oder über die 2-∆∆Ct-Methode (komparative Methode) nach LIVAK u. SCHMITTGEN (2001).
Bei der Standardkurve-Methode wird anhand einer Verdünnungsreihe zunächst eine Standardkurve für das Referenzgen und das Zielgen abgeleitet und die Mengen von Zielgen und Referenzgen in der Probe abgelesen (BUSTIN 2000). Wenn die PCR-Effizienzen für beide gleich sind, erübrigt sich die Standardkurve für das Zielgen. Es ist nicht nötig, die
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absolute Menge der Zielsequenz in den Standards zu kennen, da die Einheiten bei der Berechnung einer relativen Menge der Zielsequenz in der Probe herausfallen. Im ersten Schritt wird nämlich die auf das Referenzgen normalisierte Menge des Zielgens bestimmt, indem die Menge des Zielgens durch die Menge des Referenzgens dividiert wird. Dann wird eine Probe als Kalibrator festgelegt, der den Wert 1 erhält. Die relative Menge der Zielsequenz in einer Probe in Bezug auf den Kalibrator wird berechnet, indem die normalisierte Menge des Zielgens in der Probe durch die normalisierte Menge des Zielgens des Kalibrators geteilt wird (Tabelle 1).
Tabelle 1: Beispiel der Berechnung über die Standardkurven-Methode zur relativen Quantifizierung.
Bei der Berechnung über die 2-∆∆Ct-Methode (LIVAK u. SCHMITTGEN 2001) sind Standardkurven nur initial nötig, um zu gewährleisten, daß die nötigen vergleichbaren PCR-Effizienzen für das Referenzgen und das Zielgen vorhanden sind. Danach können Ct-Werte direkt miteinander verglichen werden, wobei die folgenden Berechnungen nötig sind. Als erstes wird der Wert ∆Ct für jede Probe und für den Kalibrator berechnet:
∆Ct (Probe) = Ct Zielgen - Ct Referenzgen
∆Ct (Kalibrator) = Ct Zielgen - Ct Referenzgen Dann wird ∆∆Ct für jede Probe berechnet:
∆∆Ct = ∆ Ct (Probe) - ∆Ct (Kalibrator) Unter der Voraussetzung vergleichbarer PCR-Effizienzen kann dann
2-∆∆Ct = relative Menge der Zielsequenz in einer Probe
eingesetzt werden (Tabelle 2).
Probe Ct Zielgen Ct Referenzgen ∆Ct ∆∆Ct Menge Zielgen, relativ zum Kalibrator (2 -∆∆Ct)
Kalibrator 36,5 22,8 13,7 0 1
Probe x 31 23,1 7,9 -5,8 55,7
Tabelle 2: Beispiel der Berechnung über die 2-∆∆Ct-Methode zur relativen Quantifizierung.
Probe Ct Zielgen
Ct Referenzgen
Menge Zielgen [ng]
Menge Referenzgen
[ng]
Menge Zielgen, normalisiert auf Referenzgen
Menge Zielgen, relativ zum Kalibrator
Kalibrator 37,01 18,83 1,40E-03 346 4,05E-06 1
Probe x 34,43 18,59 7,20E-03 417 1,73E-05 4,3
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2.2.5 Multiplex real-time PCR
Der Begriff „multiplex PCR“ steht für die simultane Amplifizierung von zwei oder mehreren Zielsequenzen durch unterschiedliche Primerpaare in einer Reaktion.
CHAMBERLAIN et al. (1988) verwendeten sechs Primerpaare für die konventionelle PCR, differenzierten die unterschiedlich großen Fragmente mittels Agarosegelelektrophorese und beschrieben damit erstmalig eine multiplex PCR. Die „multiplex real-time PCR“ wird realisiert durch die Verwendung unterschiedlich markierter Sonden zur Differenzierung der Amplifikate (MACKAY et al. 2002). Anfangs war die Koamplifizierung und -detektion mehrerer Zielsequenzen (engl. multiplexing) in der real-time PCR aufgrund der verfügbaren Reporterfarbstoffe und Quencher sowie der Gerätetechnologie noch stark eingeschränkt.
Mittlerweile kann durch die Entwicklung von zahlreichen Reporterfarbstoffen und nicht-fluoreszierenden Quenchern sowie den Einsatz von Halogenlampen und LEDs ein breites Wellenlängenspektrum genutzt werden (KREUZER et al. 2001). Die Tabelle 3 gibt einen Überblick über eine Auswahl möglicher Reporterfarbstoffe und Quencher sowie deren Anregungs- und Emissionswellenlängen. Da die Emissionsspektren der Reporterfarbstoffe sich möglichst nicht überlagern dürfen, ist die Anzahl der Zielsequenzen, die sich simultan detektieren lassen, jedoch begrenzt.
Reporterfarbstoff / Quencher Anregung / Absorption Emission (nm) Reporterfarbstoffe
FAM 495 520
TET 521 536
JOE 520 548
HEX 535 556
Cy3 552 570
Cy3.5 581 596
ROX 575 602
Texas Red 583 603
Cy5 643 667
Cy5.5 675 694
Quencher
Dabcyl 380-530 -
TAMRA 544 576
BHQ-1 480-580 -
QS-7 500-600 -
BHQ-2 550-650 -
Tabelle 3: Übersicht über häufig verwendete Reporterfarbstoffe und Quencher. Bei Quenchern ohne Angabe der Emissionswellenlänge handelt es sich um nicht-fluoreszierende Quencher, d.h. sie emittieren die aufgenommene Energie in Form von Wärme.
