9.1 Material
9.1.6 Kommerziell erhältliche Systeme
AmpliScribe™ T7 High Yield Transcription Kit Epicentre®Biotechnologies
pGEM®-TEasy Vector System II Promega
Riboprobe® System - SP6/T7 Promega
QIAamp® Viral RNA Mini Kit Qiagen
QIAGEN OneStep RT-PCR Kit Qiagen
QIAquick® Gel Extraction Kit Qiagen
QuantiTect™ Probe RT-PCR Kit Qiagen
RNase-free DNase Set Qiagen
RNeasy® Mini Kit Qiagen
SuperScript™ III One-Step RT-PCR System Invitrogen Thermo Sequenase Fluorescent Labelled Primer Cycle Sequencing Kit
Amersham Biosciences 9.1.7 Antigene, Antikörper und Konjugate
AP-konjugiertes anti-DIG-Fab-Fragment Roche
Avidin-Biotin-Komplex Vector
Beschichtungsantigen FLI
RHDV-Antigen, gereinigt und konzentriert (Pool aus S3/98 und S 39/00)
Beschichtungsantikörper FLI
ANHANG
biotinyliertes Ziege-anti-Maus-Ig Vector
FITC-konjugiertes Ziege-anti-Maus-Ig, polyklonal DakoCytomation Gemisch aus 3 gegen RHDV gerichteten mAKs (1G8, 6A12, 10A6)
ehem. BFAV Tübingen Gemisch aus 4 gegen RHDV gerichteten mAKs (1G8, 3C12, 4D7, 7G3)
ehem. BFAV Tübingen
Kontrollantigene FLI
positiv: RHDV Eisenhüttenstadt 73/98 Ethylenimin-inaktiviert, lyophilisiert 9/02 negativ: negative Kaninchenleber, lyophilisiert 9/02
Kontrollseren FLI
positiv: RHDV-Hyperimmunserum (A862) vom Kaninchen negativ: Normalserum (F136) vom Kaninchen
POD-konjugiertes anti-Kaninchen-Ig Sigma
POD-konjugiertes anti-Maus-IgG Sigma
9.1.8 Puffer, Lösungen, Nährmedien und Wasser
Alle Puffer und Lösungen für die Verwendung mit RNA wurden mit RNase-freiem Wasser hergestellt und sofern möglich autoklaviert. Soweit nicht anders erwähnt wurden die verwendeten Chemikalien von den Firmen Roth, Merck, Serva und Sigma bezogen.
9.1.8.1 RNA-Isolierung, PCR Erythrozytenlysispuffer
8,29 g/l NH4Cl 1 g/l KHCO3
1mM EDTA Ethanol 70 %, 75 %
70 bzw. 75 ml Ethanol (100%) ad 100 ml A. bidest
RNase-freies Wasser A. bidest
0,1 % DEPC Sigma
schütteln, über Nacht stehen lassen, autoklavieren
Material
RNA safe buffer
50 ng/µl Carrier polyA-RNA Amersham Bisosciences 0,05 % Tween 20
0,05 % Natriumazid, Lagerung - 20 °C Salzlösung, hochkonzentriert
0,8 M Natriumcitrat 1,2 M Natriumchlorid 10mM Tris-HCl pH 8
9.1.8.2 Klonierung und in vitro-Transkription EDTA 0,5 M
Essigsäure 100 % Ethanol 75 % LB-Medium
20 g LB BROTH BASE Invitrogen
ad 1 l A. bidest, autoklavieren Lithiumchlorid 4 M
Lösung I
50 mM Glukose
25 mM Tris-HCl pH 8 10 mM EDTA pH 8 Lösung II
0,2 N NaOH 1 % SDS (20 %) Lösung III
3 M Kaliumacetat pH 4,8 Natriumacetat 3 M (pH 7,2) Natriumcarbonatpuffer (pH 10,2)
ANHANG
Ribomax Puffer (5x)
für SP6-Sonde: für T7-Sonde:
100 µl 100 µl Hepes-KOH 1 M (pH 7,5) Sigma
20 µl 15 µl MgCl2 1 M Merck
2,5 µl 2,5 µl Spermidin Sigma
50 µl 50 µl DTT 1 M Merck
ad 250 µl ad 250 µl RNase-freies Wasser RNase A-haltiges Wasser (mit 20 mg/ml RNase A)
1, 3 ml A. bidest 1 µl RNase A
9.1.8.3 Agarosegelelektrophorese, Membrantransfer von RNA blocking reagent 10 %
10 g blocking reagent Roche
ad 100 ml Maleinpuffer, autoklavieren, Lagerung - 20 °C blocking solution
5 ml blocking reagent 10 % (= 1 %) Roche 1 ml Tween 20, 10 % (= 0,2 %) Serva ad 50 ml Maleinpuffer, frisch herstellen
Blot-Puffer (0,05 N NaOH)
aus 1 N NaOH 1:20 verdünnen Denhard´s (50x)
5 g Ficoll Sigma
5 g Polyvinylpyrrolidon Sigma
5 g BSA Sigma
ad 500 ml RNase-freies Wasser, sterilfiltrieren, Lagerung - 20 °C DNA-Probenpuffer
40 % (w/v) Saccharose
1 mM EDTA
0,4 % (w/v) Bromphenolblau Sigma
0,4 % (w/v) Xylencyanol Merck
Material
Ethidiumbromid-Lösung
5 ml Ammoniumacetat 4 M (= 0,1 M)
20µl Ethidiumbromidlösung 1 % (= 1 µg/µl) Roth ad 200 ml RNase-freies Wasser
Formamid, deionisiert
280 ml Formamid Merck
AG-501-X8-Resin Bio-Rad
zugeben, bis keine Orangefärbung mehr; 5 h rühren, filtrieren, Lagerung - 20 °C Maleinpuffer
11,608 g Maleinsäure Sigma
8,766 g NaCl
ad 1 l RNase-freies Wasser, pH 7,5 einstellen, autoklavieren
MESA-Puffer (1x) Sigma
40 mM MOPS
10 mM Natriumacetat
1 mM EDTA
pH 8,3
NBT (75 mg/ml) Sigma
250 mg in 3,325 ml Dimethylformamid 70 % in A. bidest lösen, Lagerung 4 °C Prähybridisationsmix
250 ml Formamid, deionisiert (= 50 % Formamid) Merck 100 ml SSC (2x) (= 4 x SSC)
20 ml Denhard´s (50x ) (= 2 x Denhard´s) 117 ml RNase-freies Wasser, Lagerung - 20 °C Puffer 3 (pH 9,5)
12,1 g Tris (= 100 mM)
5,84 g NaCl (= 100 mM)
pH 9,5 einstellen
10, 16 g MgCl2 x 6 H2O (= 50 mM)
ad 1 l RNase-freies Wasser, sterilfiltrieren, Lagerung 4 °C
ANHANG
Puffer 4
5 ml Tris-HCl 1 M (= 10 mM)
1 ml EDTA 0,5 M (= 1 mM)
ad 500 ml RNase-freies Wasser, Lagerung 4 °C
RNA aus Kälberleber 10 mg/ml Sigma
50 mg in 5 ml RNase-freiem Wasser lösen, Lagerung - 70 °C RNA-Denaturierungspuffer
500 µl Formamid, deionisiert
162 µl Formaldehyd 37 % Merck
100 µl MESA-Puffer (10x) Sigma
283 µl RNase-freies Wasser, frisch herstellen RNA-Probenpuffer
50 % (w/v) Glycerin
0,4 % (w/v) Bromphenolblau Sigma
0,4 % (w/v) Xylencyanol Merck
2 mM Na2HPO4
8 mM KH2PO4
SDS 10 % SSC (20x)
175,3 g NaCl (= 3 M)
88,2 g Natriumcitrat x 2 H20 (= 0,3 M) 800 ml RNase-freies Wasser
pH 7 einstellen, ad 1 l RNase-freies Wasser, autoklavieren TAE
0,04 M Tris-acetat 0,001 M EDTA Tween 20, 10 % in Maleinpuffer
10 g Tween 20 Serva
ad 100 ml Maleinpuffer
x-Phosphat (50 mg/ml) Sigma
100 mg in 2 ml Dimethylformamid konz. lösen, Lagerung - 20 °C
Material
9.1.8.4 ELISA
Antikörperverdünnungspuffer PBST
5 % Pferdeserum Beschichtungspuffer (pH 7,6)
0,02 M Tris 0,15 M NaCl Carbonatpuffer (pH 9,6)
1,59 g Natriumcarbonat 2,93 g Natriumhydrogencarbonat ad 1 l A. bidest
PBS
8 g NaCl 0,2 g KCl
1,15 g Na2HPO4 x 2 H2O 0,2 g KH2PO4
ad 1 l A. bidest PBST
PBS 0,05 % Tween 20 Schwefelsäure, 4 M Substratlösung für ELISA
4 mg OPD Sigma
ad 10 ml Substratpuffer [vor Gebrauch gemischt aus 2,43 ml Lösung A (0,1 M Citronensäure), 2,57 ml Lösung B (0,2 M Na2HPO4 x 2 H2O) und 5 ml A.dest], 15 µl H2O2 (30 %) frisch dazugeben
ANHANG
9.1.8.5 Zellkultur, Hämagglutinationstest, Viruskonzentrierung DABCO-Puffer mit Propidiumiodid (pH 8,6)
10 ml PBS
2,5 g Diazobicyclooctan
100 µl Propidiumiodid Sigma
90 ml Glycerin IP (pH 6, pH 7,2)
8,28 g NaCl
1,186 g Na2HPO4 x 2 H2O 0,2 g KH2PO4
ad 1 l A. bidest TEN (pH 7,6)
2,42 g Tris 0,037 g EDTA 8,76 g NaCl ad 1 l A. bidest
Zellkulturmedium ZB5 (pH 7,2) FLI
5,32 g MEM Hanks Sigma
4,76 g MEM Earle GIBCO
1,52 g NaHCO3 Roth
0,12 g Natriumpyruvat Fluka
10 ml NEAS Biochrom
100 ml FKS (=10 %)
ad 1 l A. bidest
9.1.8.6 Histologie, Immunhistologie, In situ-Hybridisierung CaCl2 0,1 M
1,47 g ad 100 ml RNase-freies Wasser, autoklavieren
Dextransulfat 100 % Sigma
250 mg in 250 µl RNase-freiem Wasser lösen bei 50 °C Ethanol 100 %, 95 %, 75 %, 70 %
Material
Formalin 4 % HCl 5 M
50 ml RNase-freies Wasser 50 ml HCl 37 %
HCl 0,2 M
48 ml RNase-freies Wasser 2 ml HCl 5 M
Lösung von Acetanhydrid in Triethanolamin
745 mg Triethanolamin Merck
ad 50 ml RNase-freies Wasser, pH 7,5 einstellen
125 µl Acetanhydrid Sigma
frisch herstellen Lösung zur RNase-Behandlung
8,3 ml NaCl 3 M (=0,5 M) 500 µl Tris 1 M pH 8 (= 10 mM) 100 µl EDTA 0,5 M pH 8 (= 1 mM)
10 µl DNase-freie RNase (500 µg/ml) Roche 10 µl RNase T1 aus Aspergillus oryzae (500000 U/ml) Roche ad 50 ml RNase-freies Wasser, frisch herstellen
Maleinpuffer/0,2 % Tween 20
2 ml Tween 20, 10 % Serva
ad 100 ml Maleinpuffer, frisch herstellen NaCl 3 M
17,53 g NaCl
ad 100 ml RNase-freies Wasser, autoklavieren NaOH 10 M
10 g NaOH-Plätzchen ad 25 ml RNase-freies Wasser
Paraformaldehyd 4 % Merck
10 g Paraformaldehyd zu 200 ml PBS (60°C), pH 7,35 - 7,4 einstellen mit NaOH 2 M, ad 250 ml PBS
ANHANG
PBS (10x) 40 g NaCl 1 g KCl
7,2 g Na2HPO4 x 2 H2O 1,2 g KH2PO4
ad 500 ml RNase-freies Wasser; für PBS (1x): 1:10 verdünnen aus 10 x PBS, pH 7,4 einstellen, autoklavieren
Proteinase K-Puffer
2,5 ml Tris 1 M pH 8 (=50 mM) 0,75 ml CaCl2 0,1 M (=1,5 mM) ad 50 ml RNase-freies Wasser, frisch herstellen TBS (pH 7,4)
50 mM Tris
200 mM NaCl
Tris 1 M pH 8 60,57 g Tris 400 ml A. bidest
pH 8 einstellen, ad 500 ml A. bidest, autoklavieren
Weitere Puffer und Lösungen, die für die In situ-Hybridisierung gebraucht werden, sind in 9.1.8.3 aufgeführt.
9.1.9 Sonstige Reagentien
AEC-Substrat Dako
Agarose Eurogentec
Ampicillin Sigma
Aquatex® Merck
ATV FLI
ß-Mercaptoethanol Merck
BSA (100x) NEW ENGLAND BioLabs®
Chloroform Roth
DIG-RNA Labeling Mix Roche
Geräte und Gebrauchsgegenstände
dNTP mix Promega
Ethanol (100%) Roth
Ethidiumbromidlösung 1 % Roth
Formaldehyd 37 % Merck
Glycergel® Dako
IPTG Sigma
Isopropanol Roth
Levamisol Sigma
MgCl2 Promega
Mineralöl Sigma
Phenol/Chloroform/Isomamylalkohol (25:24:1) Roth
Polyethylenglykol 6000 Sigma
rekombinante Bakulovirusvakzine FLI
RIKA-VACC Riemser Arzneimittel AG
ROX Reference Dye Invitrogen
Saccharose Sigma
TRIzol®Reagent Invitrogen
x-Gal Sigma
Xylol Roth
9.2 Geräte und Gebrauchsgegenstände
Analysenwaage SBA41 SCALTEC Gesellschaft für Laborbedarf mbH Bakterienschüttler New Brunswick Scientific Brutschränke
für Bakterien VEB MLW Medizinische Geräte für Zellen, CO2-begast Heraeus Instruments
Elektrophoresesystem Bio-Rad
Elektroporator GenePulser Xcell™ Bio-Rad
Exsikkator Kartell®
Hybridisierungsofen, Rollerröhren MWG Biotech AG, Hybaid Magnetrührer IKAMAG®RH Janke&Kunkel, IKA®-Labortechnik
ANHANG
Mikroskope
Lichtmikrokop TMS-F Nikon
UV-Mikroskop IX51 Olympus
Neubauer-Zählkammer OptikLabor Photometer
DU®640 Spectrophotometer Beckman
Spectra Mini Photometer Tecan
Pipetten eppendorf
Pipettierhilfe pipetus®-akku Hirschmann Laborgeräte Sequenzierautomat LI-Cor DNA-Analyzer GENE READER 4200 MWG Biotech AG Sterilbank Uniflow UVUB 1200 Biohazard Uniequip GmbH
Thermocenter salvisLAB by Renggli
Thermocycler
MiniCycler™ Biozym
Mx3000P™ Real-Time PCR System Stratagene
Primus 96plus MWG Biotech AG
Thermomixer 5436 eppendorf
Tissue Lyser Qiagen
Transilluminator UVT-28 M Herolab UV-Bestrahlungsbox DNA/RNA UV-CLEANER UVC/T
Vortexer Janke&Kunkel, IKA®-Labortechnik
Wasserbad IKA® TER 2 Janke&Kunkel, IKA®-Labortechnik Zentrifugen
J2-HS Centrifuge Beckman
Kühlzentrifuge UNIVERSAL 30 RF Hettich
Megafuge 1.0R Heraeus
Tischzentrifuge Centrifuge 5415C eppendorf
Ultrazentrifuge Coulter Optima™ LE-80K Ultracentrifuge Beckman
Verbrauchsmaterialien
9.3 Verbrauchsmaterialien Ampicillin-Selektionsagarplatten
32 g LB Agar Invitrogen
ad 1 l A. bidest, 121 °C 15 min, nach dem Abkühlen auf 56 °C 1,5 µl/ml Ampicillin (50 mg/ml) zugeben
EDTA-Röhrchen Sarstedt
Einfrierröhrchen greiner
Einmalbesteck Braun, Aesculap AG & CO. KG
Elektroporationsküvetten (4 mm) peqlab Biotechnologie GmbH Gel-Blotting-Papier Schleicher&Schuell
Gewebekulturflaschen, -platten costar®
Kanülen Braun
Microtainer-Röhrchen Becton Dickinson
Mikrotiterplatten
Maxi Sorp™ microtitre plates nunc™
PS microplate 96 well greiner
U-Form greiner
Nylon membranes, positively charged Roche Objektträger SuperFrost® Plus microscope slides Menzel Reaktionsgefäße (0,2 ml, 0,5 ml, 1,5 ml, 2 ml) eppendorf
Spritzen Dispomed Witt oHG
Stainless Steel Beads (5 mm) Qiagen
Sterilfilter Millipore
Zentrifugenröhrchen Sarstedt, greiner 96well-Platten für PCR: Thermo-Fast® 96, Non Skirted; mit Ultra Clear Cap Strips
ABgene®
ANHANG
9.4 Software
analySIS® labFlow 5.0 Soft Imaging System GmbH Beacon Designer 2.06 PremierBiosoft International
BLASTn National Center for Biotechnology Information easyWIN screening V6.0a TECAN
Mx3000P v2.00 Stratagene
Wisconsin Package Version 10.2 GCG 9.5 Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Beispiel der Berechnung über die Standardkurven-Methode zur relativen
Quantifizierung. ... 38
Tabelle 2: Beispiel der Berechnung über die 2-∆∆Ct-Methode zur relativen Quantifizierung... 38
Tabelle 3: Übersicht über häufig verwendete Reporterfarbstoffe und Quencher. Bei Quenchern ohne Angabe der Emissionswellenlänge handelt es sich um nicht-fluoreszierende Quencher, d.h. sie emittieren die aufgenommene Energie in Form von Wärme... 39
Tabelle 4: Spezifität der real-time RT-PCR... 81
Tabelle 5: Virusstämme, die für diese Arbeit verwendet wurden. n.d. not determined... 135
Tabelle 6: Primer und Sonden, die für diese Arbeit verwendet wurden. ... 136
9.6 Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Genom des RHDV. An die 5´NTR schließen sich die codierenden Bereiche für die Nichtstrukturproteine (hellgrau) und die beiden Strukturproteine, das VP60 und das VP10 (dunkelgrau), an (modif. nach MEYERS et al. (2000)). ... 14
Abbildung 2: Das FRET-Prinzip. F1 und F2 sind die beiden beteiligten Fluorochrome, die auch als Reporter/Donor und Quencher/Akzeptor bezeichnet werden. Sie haben die Anregungswellenlängen A1 und A2 sowie die Emissionswellenlängen E1 und E2. In den Diagrammen ist die Emission (als Fluoreszenzstärke R) gegen die Wellenlänge aufgetragen... 24
Software, Tabellenverzeichnis, Abbildungsverzeichnis
Abbildung 3: Funktionsprinzip der interkalierenden Farbstoffe. (a) Denaturierung. (b) Annealing (dt. Anlagerung). (c) Elongation. Es ist jeweils nur der rev-Strang sowie der for-Primer (Pfeil) gezeigt. Der in die doppelsträngige DNA interkalierende Farbstoff ist grün dargestellt. ... 26 Abbildung 4: Schmelzkurvenanalyse mit SYBR®Green I. Die normalisierte Fluoreszenzstärke ist in (a) als Rn und in (b) als -Rn (T), jeweils gegen die Temperatur in °C, aufgetragen. Die schwarzen Kurven gehen auf spezifische PCR-Produkte zurück.
Die graue Kurve repräsentiert die negative Kontrolle (engl. no template control, NTC), bei der Primerdimere detektiert werden. Diese lassen sich durch die geringere Schmelztemperatur von spezifischen Produkten differenzieren. Es wurde eine log10 -Verdünnungsreihe von RHDV-RNA als template eingesetzt... 28 Abbildung 5: Funktionsprinzip der FRET-Sonden (a), TaqMan®-Sonden (b), minor groove binder (MGB)-Sonden (c) und molecular beacons (d). Es ist jeweils nur der rev-Strang sowie der for-Primer (Pfeil) gezeigt. Das obere Bild zeigt jeweils die Denaturierungsphase, das mittlere die Annealing- und das untere die Elongationsphase. Die Sonden tragen ein Donormolekül „D“ und ein Akzeptormolekül „A“ bzw. den Reporterfarbstoff „R“ sowie einen Quencher „Q“.
„MGB“ steht für den minor groove binder. ... 31 Abbildung 6: Funktionsprinzip eines Scorpions™. (a) Annealing/Elongation. (b)
Denaturierung. (c) Annealing. Es ist in (a) und (b) jeweils nur ein Strang sowie der Scorpion™ mit der sequenzspezifischen Primerstruktur (Pfeil) gezeigt. Beim zweiten Annealing-Schritt (c) ist nur noch der von der Taq-Polymerase synthetisierte Strang dargestellt. Die Sonde trägt einen Reporterfarbstoff „R“ sowie einen Quencher „Q“.
„Stop“ steht für das Hexethylen-Glykol, das die Synthese eines zur Haarnadelstruktur komplementären Strangs verhindert. ... 33
ANHANG
Abbildung 7: Amplifikationsgrafik. In diesem Fall ist die normalisierte und Basislinien-korrigierte Fluoreszenzstärke (dRn) gegen die Zyklenzahl aufgetragen. Die schwarze Linie stellt den Fluoreszenzschwellenwert (engl. threshold) dar. Der Schnittpunkt zwischen Amplifikationsgraph und Fluoreszenzschwellenwert, projiziert auf die x-Achse, markiert den Ct-Wert (engl. threshold cycle). Es wurden 4 Standards (gefüllte Kästchen), eine unbekannte Probe (nicht gefüllte Kästchen) und eine negative Kontrolle, bei der kein Anstieg der Fluoreszenz zu verzeichnen war, eingesetzt. .... 34 Abbildung 8: Standardkurve und tabellarische Darstellung der Ergebnisse bei der absoluten
Quantifizierung. Für die Standardkurve wird die Zyklenzahl gegen die initiale Menge der Zielsequenz (als Kopienzahl auf der logarithmischen x-Achse) aufgetragen. Es wurden 4 Standards (gefüllte Kästchen) und eine unbekannte Probe (nicht gefüllte Kästchen) verwendet, die Amplifikationsgrafik ist in der Abbildung 7 dargestellt... 36 Abbildung 9: Alignment und Consensus-Sequenz von 27 RHDV VP60-Gensequenzen in der Primer/Sonden-Region. Der „single letter code of nucleotides“ wurde verwendet.
Die grauen Kästen repräsentieren die von den Primern bzw. der Sonde umfassten Regionen. Striche stehen für identische Nukleotide, während „wobble“-Nukleotide in Fettschrift hervorgehoben sind. ... 72 Abbildung 10: Analytische Sensitivität und dynamischer Bereich der real-time RT-PCR für
RHDV. Die Amplifikationsgraphen (a) und die Standardkurve (b), die nach Amplifizierung einer log10-Verdünnungsreihe von 1010 bis 101 Molekülen PC RNA erhalten wurden, sind dargestellt. ... 75 Abbildung 11: Sensitivität des single und multiplex real-time RT-PCR assays. (a) zeigt die Amplifikationsgraphen für FAM, die durch die Amplifizierung der RHDV-RNA zustande kommen. (b) stellt die Amplifikationsgraphen für HEX dar, die die Amplifizierung der IC repräsentieren. Schwarze Linien stehen jeweils für den multiplex assay und graue Linien für den single assay. Es wurde eine log10 -Verdünnungsreihe von RHDV-RNA mit den Verdünnungsstufen von 10-5 bis 10-10 als template eingesetzt. ... 76
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 12: Sensitivität der real-time RT-PCR im Vergleich zur konventionellen RT-PCR.
(a) zeigt die Ergebnisse für den Subtyp „RHDV Eisenhüttenstadt“ und (b) für
„RHDV Triptis“. Für die konventionelle RT-PCR wurde eine log10 -Verdünnungsreihe ausgehend von unverdünnter RNA als template eingesetzt, während für die real-time RT-PCR nur die Verdünnungsstufen ab 10-5 verwendet wurden. Zunächst wurde die konventionelle RT-PCR mit 30 Zyklen durchgeführt (nur für „RHDV Eisenhüttenstadt“, linkes Agarosegel in (a)). In einem zweiten Ansatz wurde die Anzahl der Zyklen auf 40 erhöht und RNA beider Subtypen verwendet... 78 Abbildung 13: Sensitivität der real-time RT-PCR im Vergleich zum Antigen-ELISA. (a) zeigt die Ergebnisse für den Subtyp „RHDV Eisenhüttenstadt“ und (b) für „RHDV Triptis“. Die Balken stellen die in der real-time RT-PCR erhaltenen Ergebnisse in Kopien/Reaktion dar. Die schwarze Linie repräsentiert die Titration im Antigen-ELISA, wobei die für die einzelnen Verdünnungsstufen erhaltenen ELISA-indices als Punkte dargestellt sind. Die Achsen für die ELISA-indices unterscheiden sich, da
„RHDV Triptis“ nur mit einem der 4 zur Detektion verwendeten mAKs reagiert, so daß die ELISA-indices insgesamt geringer ausfallen. Es wurde eine log4 -Verdünnungsreihe ausgehend von 10 % Leberhomogenaten resp. die daraus extrahierte RNA verwendet. ... 80 Abbildung 14: Körpertemperatur der überlebenden Kaninchen nach experimenteller Infektion mit RHDV. Die Daten wurden von der Riemser Arzneimittel AG zu Verfügung gestellt... 82
ANHANG
Abbildung 15: Detektion von RHDV-Antigen bzw. RHDV-RNA in der Leber eines an akuter RHD verstorbenen Kaninchens und eines rekonvaleszenten Tieres. Der Antigennachweis erfolgte mittels Immunhistologie (oben). Die In situ-Hybridisierung zum Nachweis viraler RNA wurde mit einer sequenzspezifischen T7-Sonde durchgeführt (unten). Zur Kontrolle wurde die entsprechende SP6-T7-Sonde verwendet, die kein Signal erzeugte (kleine Abbildung in (c)). Es handelt sich in (a) und (c) um eine als positive Kontrolle mitgeführte Leber eines an akuter RHD verstorbenen Tieres, bei der jeweils eine spezifische Anfärbung der Hepatozyten (Pfeile) festgestellt wurde. In (b) und (d) ist exemplarisch das Ergebnis für das Tier Nr. 670 gezeigt, hier konnte 5 Wochen p.i. weder RHDV-Antigen noch RHDV-RNA in der Leber detektiert werden. Maßstabsbalken = 100 µm. ... 83 Abbildung 16: Antikörper-Status der infizierten Tiere (Nr. 685, 670, 679, 697, 718) und der nicht infizierten Kontrolltiere (Nr. 1 - 3) 5 Wochen p.i... 84 Abbildung 17: Virusgenomlast in den Leukozyten rekonvaleszenter Tiere. Die Bestimmung
der Virusgenomlast erfolgte wöchentlich, beginnend mit der Woche 4 p.i., bis das jeweilige Tier getötet und der Sektion zugeführt wurde. In den Wochen 11-14 p.i.
wurden keine Daten erhoben. ... 85 Abbildung 18: Virusgenomlast in den Organen, Exkreten und Leukozyten rekonvaleszenter
Tiere. Es sind die Virusgenomlasten der einzelnen Proben zum Zeitpunkt von 5 Wochen p.i. (a), 7 Wochen p.i. (b) und 15 Wochen p.i. (c) dargestellt. ... 86 Abbildung 19: Northern Blot (rechts) zum Nachweis von RHDV-RNA in der Leber des
Tieres Nr. 685 und vorangegangene Formaldehyd-Agarosegelelektrophorese (links).
Die Proben wurden wie folgt aufgetragen: Marker M: 0,24 - 9,5 kb RNA Leiter. Spur 1: positive Kontrolle, 4,94 x 1011 Kopien RHDV-RNA, 224 nt. Spur 2: positive Kontrolle, 1,78 x 1013 Kopien RHDV-RNA, 224 nt. Spur 3: weitere, in diesem Falle irrelevante, Probe. Spur 4: konzentrierte RNA aus der Leber des Tieres Nr. 685, 1,5 x 1010 Kopien RHDV-RNA. ... 87
Abkürzungsverzeichnis
Abbildung 20: Antikörperbildung nach der Immunisierung mit RIKA-VACC und einer rekombinanten Bakulovirusvakzine. In grau dargestellt sind die Ergebnisse für die Tiere, die mit RIKA-VACC immunisiert wurden. Die schwarzen Linien stehen für die Tiere, die eine rekombinante Bakulovirusvakzine in einer 1:64-Verdünnung erhielten... 89 Abbildung 21: Virusgenomlast in Organen und Gallenflüssigkeit immunisierter Tiere nach
der challenge-Infektion. (a) zeigt die Virusgenomlast bei Tieren, die RIKA-VACC erhielten, und (b) die Virusgenomlast bei Tieren, die mit der rekombinanten Bakulovirusvakzine immunisiert wurden. Es sind die Virusgenomlasten der einzelnen Proben zum Zeitpunkt von 9, 11, 13 und 15 Wochen p.i. dargestellt. ... 90 Abbildung 22: Virusgenomlast in RLI-R-Zellen und Zellkulturüberständen nach der Infektion mit RHDV... 91 Abbildung 23: Virusgenomlast in RLI-R-Zellen und Zellkulturüberständen nach der
Transfektion mit RHDV-RNA... 92 Abbildung 24: Nachweis von RHDV-Antigen in RLI-R-Zellen nach der Transfektion mit
RHDV-RNA. Mittels des indirekten Immunfluoreszenztestes wurden die Virusreplikation nach 2 h (a), 24 h (b), 48 h (c) und 72 h (d) überprüft. Für RHDV-Antigen positive RLI-R-Zellen erscheinen grün, während die Zellkerne rot angefärbt sind. Maßstabsbalken = 500 µm. ... 93 9.7 Abkürzungsverzeichnis
Å Angstrom
A. bidest aqua bidestillata, destilliertes Wasser AEC 3-Amino-9-Ethylcarbazol AMV Aviäre Myeloblastose-Virus AP alkalische Phosphatase ATCC American Type Culture Collection ATV Alfevers Trypsine Versene, Trypsin
BFAV Bundesforschungsanstalt für Viruskrankheiten BHQ black hole quencher
bp base pairs, Basenpaare
ANHANG
(c)DNA (copy) desoxyribonucleic acid, (komplementäre) Desoxyribonukleinsäure CLP core like particle
Ct threshold cycle d Tag(e)
DABCO Diazobicyclooctan
Dabcyl 4-(4´-Dimethylaminophenylazo)-Benzoesäure DEPC Diethylpyrocarbonat
DIG Digoxigenin DMSO Dimethylsulfoxid
dNTP desoxy-Nukleosidtriphosphate DTT Dithiothreitol
EBHSV European Brown Hare Syndrome Virus EDTA Ethylendiamintetraacetat
EGFP enhanced green fluorescent protein
ELISA enzyme linked immunosorbent assay, Enzym-gekoppelter Immuntest E. coli Escherichia coli
Fab Antigen-bindendes Fragment eines Antikörpers FAM 6-Carboxyfluorescein
FCV Felines Calicivirus FITC Fluoreszeinisothiocyanat FLI Friedrich-Loeffler-Institut for forward
FRET Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer g Gramm, Erdbeschleunigung
GADPH Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase GCG Genetics Computer Group
h Stunde(n)
HA/HAE Hämagglutination/hämagglutinierende Einheit HE Haematoxylin und Eosin
HEX Hexachloro-6-carboxyfluorescein
Hz Hertz
Abkürzungsverzeichnis
IC internal control, interne Kontrolle Ig(G, M) Immunglobulin (G, M)
i.m. intramuskulär
IPTG Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranosid kDa Kilodalton
l Liter LB Luria-Bertani LED Licht emittierende Diode log Logarithmus LUX Light Upon eXtension (m)M (milli)molar, (milli)mol/l mak monoklonaler Antikörper
MESA 3-(N-morpholino)propansulfonsäure (MOPS)-EDTA-Sodium-Acetat
mg Milligramm
MGB minor groove binder min Minute(n) ml Milliliter
mm Millimeter
MOPS 3-(N-morpholino)propansulfonsäure
(m)RNA (messenger) ribonucleic acid, (Boten-) Ribonukleinsäure µl Mikroliter
µm Mikrometer
NBT Nitro Blue Tetrazolium
nm Nanometer
nt Nukleotid(e)
NTC no template control, negative Kontrolle NTPase Nukleosidtriphosphatase
NTR non translated region, nicht-translatierte Region
OIE Office International des Épizooties, internationales Tierseuchenamt OPD o-Phenylenediamin
ORF open reading frame, offener Leserahmen
ANHANG
Ω Ohm
PBS phosphate buffered saline, Phosphat gepufferte Salzlösung PC positive control, positive Kontrolle
p.i. post infectionem, nach Infektion pmol Picomol
POD Peroxidase Pol Polymerase Pro Protease
p.v. post vaccinationem, nach Vakzinierung RCV Rabbit Calicivirus
rev reverse
RHD(V) Rabbit Haemorrhagic Disease (Virus) RLI-R rabbit liver immortalized
RNase Ribonuklease
ROX 5-Carboxy-X-Rhodamin
rpm rounds per minute, Umdrehungen/Minute RSq Korrelationskoeffizient
RT reverse transcriptase, Reverse Transkriptase, reverse transcription, Reverse Transkription, Raumtemperatur
(RT-) PCR (reverse transcriptase-) polymerase chain reaction, (Reverse Transkriptase-) Polymerasekettenreaktion
s Sekunde(n)
SDS sodiumdodecylsulfate, Sodiumdodecylsulfat SNP single nucleotide polymorphism, Punktmutation s-RHDV smooth RHDV
SSC sodiumchlorid sodiumcitrate, Natriumchlorid und Natriumcitrat TAE Tris-Acetat-EDTA
TAMRA Tetramethyl-6-Carboxyrhodamin Taq Thermus aquaticus
TBS tris buffered saline, Tris-gepufferte Salzlösung TEN Tris-EDTA-Natriumchlorid
Abkürzungsverzeichnis
u units, Enzymeinheit unverd. unverdünnt UV ultraviolett V Volt
VESV Vesicular exanthema of swine virus VLP virus like particle
Vpg virales Protein, genomassoziiert
VP60/VP10 Strukturproteine des RHDV (60 kDa/10kDa) w/v weight/volume, Gewicht/Volumen
x-Gal 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-galactopyranosid x-Phosphat 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphat
Tagungsbeiträge auf wissenschaftlichen Kongressen:
GALL, A., HOFFMANN, B., TEIFKE, J. P., LANGE, B. u. SCHIRRMEIER, H. (2005):
Viral load in rabbits that overcome Rabbit Haemorrhagic Disease Virus infection.
Jahrestagung der Gesellschaft für Virologie, Hannover, 16. - 19. März 2005
HEßMANN, M., GALL, A., WEGE, H., SCHIRRMEIER, H. u. KÖLLNER, B. (2005):
Rabbit hemorrhagic disease (RHD) a model for fulminate liver failure (FLF) syndrom? – A study on possible immunopathogenesis of RHD.
Jahrestagung der Gesellschaft für Virologie, Hannover, 16. - 19. März 2005
Folgende Teile dieser Arbeit wurden zur Publikation eingereicht:
GALL, A., HOFFMANN, B., TEIFKE, J. P., LANGE, B. u. SCHIRRMEIER, H. (2005):
Persistence of viral RNA in rabbits which overcome an experimental RHDV infection detected by a highly sensitive multiplex real-time RT-PCR.
Vet. Microbiol. (submitted)
GALL, A. u. SCHIRRMEIER, H. (2006):
Persistence of rabbit haemorrhagic disease virus genome in vaccinated rabbits after experimental infection.
J. Vet. Med. B (submitted)
Danksagung
Die vorliegende Arbeit wurde unter der Anleitung von Herrn Dr. med. vet. H. Schirrmeier angefertigt. Ihm danke ich für die Überlassung des interessanten Themas, die kompetente Betreuung und ganz besonders für das gute Arbeitsklima sowie seine Menschlichkeit.
Herrn PD Dr. med. vet. M. Beer und Frau Prof. Dr. med. vet. B. Grummer danke ich für die Unterstützung und die wissenschaftliche Betreuung dieser Arbeit.
Herrn Prof. Dr. rer. nat. T. C. Mettenleiter danke ich für die Möglichkeit der Anfertigung dieser Dissertation am Friedrich-Loeffler-Institut, Insel Riems.
Herrn Dr. med. vet. B. Hoffmann danke ich für sein Engagement und die konstruktiven Diskussionen.
Herrn Dr. med. vet. B. Lange, Riemser Arzneimittel AG, danke ich für die gute
Herrn Dr. med. vet. B. Lange, Riemser Arzneimittel AG, danke ich für die gute