Es wurden Studien zur in vitro-Replikation des RHDV nach Infektion und Transfektion durchgeführt, die das Ziel hatten, mögliche Ursachen für dessen fehlende produktive Vermehrung in Zellkulturen zu ermitteln. Die RLI-R-Zellen wurden exemplarisch ausgewählt, da sie sich in nicht dargestellten Vorversuchen als geeignet für eine Transfektion und Infektion erwiesen hatten. Die Elektroporation stellte sich in Vorversuchen als effizienteste Transfektionsmethode heraus.
Es wurde festgestellt, daß die RLI-R-Zellen mittels RHDV-RNA effektiv transfiziert werden können und auch eine geringgradige Infektion möglich ist. Trotz der großen Mengen eingesetzter RNA bei der Transfektion wurde nach 24 h ein Anstieg der detektierten Menge viraler RNA um etwa 3 log10-Stufen festgestellt, so daß man von einer aktiven Virusreplikation ausgehen kann. Diese war aber ein zeitlich begrenztes Ereignis, denn nach 48 h hatten die nachgewiesenen Mengen schon wieder abgenommen und fielen danach tendenziell weiter. Das wurde durch die Ergebnisse der Antigen-Nachweisverfahren (ELISA, indirekter Immunfluoreszenztest und Hämagglutinationstest) bestätigt.
Bei der Infektion war der Anstieg der Menge viraler RNA nach 24 h sehr gering und außerdem nur im Zellkulturüberstand zu verzeichnen. In diesem Fall muß insbesondere die große Menge des eingesetzten Virus berücksichtigt werden, so daß hier - wenn überhaupt - nur von einer sehr geringgradigen Virusvermehrung ausgegangen werden darf. Entsprechend
DISKUSSION
indirekten Immunfluoreszenztestes vereinzelt RHDV-Antigen in den Zellen nachgewiesen werden konnte.
Die dargestellten Ergebnisse bestätigen die Schlußfolgerungen aus ebenfalls durchgeführten umfangreichen Studien zur in vitro-Replikation des RHDV mit über 50 etablierten Zellinien, bei denen vor allem Antigen-Nachweisverfahren eingesetzt wurden. Daher wurden keine Wiederholungen der Experimente vorgenommen, und es wurde auf die Untersuchung mehrerer Replikate sowie eine statistische Auswertung verzichtet.
Die festgestellten Unterschiede in den Ergebnissen der Transfektions- und Infektions- (Inokulations-) experimente weisen daraufhin, daß der in vitro Replikationsblock in einer sehr frühen Phase der Virus-Zell-Interaktion (attachment, Penetration, uncoating) liegen muß. In weiteren Untersuchungen, die nicht Gegenstand der vorliegenden Arbeit sind, konnte auch gezeigt werden, daß in Zellkulturen nach Transfektion generiertes RHDV infektiös für Kaninchen ist und damit nach Formulierung als Versuchsvakzine eine protektive Immunität in Kaninchen induziert werden kann.
6 ZUSAMMENFASSUNG
Etablierung, Validierung und praktische Anwendung einer multiplex real-time RT-PCR zum Nachweis des Rabbit Haemorrhagic Disease Virus
Astrid Gall
Die Rabbit Haemorrhagic Disease (RHD, syn. Hämorrhagische Krankheit der Kaninchen) ist eine weltweit auftretende, meistens perakut bis akut und tödlich verlaufende Erkrankung von Kaninchen der Species Oryctolagus cuniculus. Sie wird verursacht durch das Rabbit Haemorrhagic Disease Virus (RHDV), einen Vertreter der Familie Caliciviridae. Die Epidemiologie der Erkrankung, insbesondere die Frage einer möglichen Viruspersistenz bei rekonvaleszenten Tieren sowie immunisierten Tieren nach Kontakt mit Feldvirus, ist bisher nur wenig und nicht in experimentellen Studien untersucht worden. Bis dato gibt es keine hochsensitive und quantitative Diagnostik für RHDV, da kein Zellkultursystem zur produktiven Vermehrung des Virus existiert.
In der vorliegenden Arbeit wurde eine auf der TaqMan®-Technologie basierende multiplex real-time RT-PCR als neue Methode zur Detektion des RHDV etabliert und validiert. Sie beinhaltet in vitro-Transkripte als positive sowie interne Kontrollen und verwendet externe Standards zur absoluten Quantifizierung unbekannter Mengen viraler RNA. Es wurde eine Spezifität von 100 %, eine analytische Sensitivität von 10 Kopien/Reaktion und Linearität über einen dynamischen Bereich von 10 log10-Stufen nachgewiesen. Dabei zeigten der single assay und der multiplex assay mit Koamplifizierung der internen Kontrolle identische Sensitivitäten. Die real-time RT-PCR war eine log10-Stufe sensitiver als eine konventionelle RT-PCR und mehrere Verdünnungsstufen sensitiver als ein Antigen-ELISA.
In dieser Arbeit wurde erstmalig eine mögliche Persistenz des RHDV im Rahmen einer experimentellen Studie untersucht. In zwei Tierversuchen, mit rekonvaleszenten Tieren bzw.
immunisierten und feldvirusexponierten Tieren, konnte mittels real-time RT-PCR die Persistenz viraler RNA bis zu einem Zeitpunkt von 15 Wochen p.i. nachgewiesen und
ZUSAMMENFASSUNG
(bis 4,39 x 106Kopien/µl in der Gallenflüssigkeit eines rekonvaleszenten Tieres 5 Wochen p.i.) gelang es nicht, Antigen bzw. infektiöses Virus nachzuweisen, wofür neben limitierten Sensitivitäten der Detektionssysteme eine Antigenmaskierung durch hohe Antikörpertiter in Frage kommt. Auch wenn somit nicht endgültig gezeigt werden konnte, daß die Persistenz viraler RNA mit einer Viruspersistenz einhergeht, ist der Nachweis von RHDV-RNA bis zu 15 Wochen nach Infektion mit RHDV sowohl bei rekonvaleszenten als auch immunisierten und feldvirusexponierten Tieren ein zwingender Hinweis auf das Vorkommen von carrier-Tieren als einem wesentlichen Faktor in der Epidemiologie der RHD. Die möglichen Mechanismen einer Reaktivierung des persistierenden viralen Genoms bedürfen einer weiteren Klärung. Imbalanzen eines sich ausbildenden Gleichgewichtes Virus versus Antikörper durch zurückliegende Impfungen oder Stressfaktoren wie Gravidität, Ausstellungen etc. erscheinen nicht unwahrscheinlich.
In den durchgeführten Studien zur Replikation des RHDV in Zellkulturen konnte mittels der entwickelten real-time RT-PCR gezeigt werden, daß eine produktive in vitro-Vermehrung nach Transfektion von RNA zeitlich begrenzt auftritt, diese sich jedoch nicht zu einer stabilen Virusreplikation fortführen läßt. Die wesentliche Ursache dafür liegt vermutlich in einem Replikationsblock, der in einer Phase vor der Freisetzung viraler RNA in der Zelle liegen muß.
7 SUMMARY
Development, validation and utilization of a multiplex real-time RT-PCR for the detection of Rabbit Haemorrhagic Disease Virus
Astrid Gall
Rabbit Haemorrhagic Disease (RHD) is a peracute to acute and mostly fatal disease in rabbits of the species Oryctolagus cuniculus with a worldwide occurence. It is caused by the Rabbit Haemorrhagic Disease Virus (RHDV), a member of the family Caliciviridae. The epidemiology of the disease, especially a possible persistence of RHDV in convalescent or immune rabbits after contact to field virus, is little and furthermore not experimentally investigated. Until today, a highly sensitive detection and quantification of RHDV is hampered by the lack of a tissue culture system for the propagation of the virus.
In the presented study, a multiplex real-time RT-PCR using TaqMan®probes was developed and validated as a new tool for the detection of RHDV. It uses in vitro-transcripts as positive and internal controls and external standards for absolute quantification of viral RNA. The assay revealed a specificity of 100 %, an analytical sensitivity of 10 copies/reaction and a linearity over a range from 1010 to 101 copies. An equivalent detection limit was shown for the single assay and the multiplex assay with coamplification of the internal control. The real-time RT-PCR was ten-fold more sensitive than a conventional RT-PCR and several magnitudes more sensitive than an Antigen-ELISA.
In this study, a possible persistence of RHDV was investigated in an experimental study for the first time. Within two animal experiments - with convalescent animals and with immune animals exposed to field virus - persistence of viral RNA for at least 15 weeks was demonstrated and quantified by real-time RT-PCR. Despite the partial high viral loads (up to 4,39 x 106 copies/µl in the bile excretion of a convalescent animal 5 weeks p.i.) the detection of antigen or infectious virus did not succeed. Limited sensitivities of the detection systems and masking of the antigen by high antibody titres are considered to be the reason.
Even though an association of the persistence of viral RNA with a virus persistence could not
SUMMARY
both in convalescent and immune rabbits exposed to field virus is an urgent evidence for the existence of carrier animals as an important factor in the epidemiology of RHD. Possible causes for reactivation of the persistent viral genome have to be investigated in further studies. Disturbances of the balance between virus and antibodies in animals vaccinated in distant past or stress factors as gravidity, exhibitions etc. appear to be likely.
In the conducted experiments on the replication of RHDV in tissue culture it was demonstrated by the developed real-time RT-PCR that a productive in vitro propagation after transfection of RNA was temporary, but could not be continued as stable replication of the virus. The main reason is a block of the replication in an early stage before viral RNA is released in the cell.
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