32 g LB Agar Invitrogen
ad 1 l A. bidest, 121 °C 15 min, nach dem Abkühlen auf 56 °C 1,5 µl/ml Ampicillin (50 mg/ml) zugeben
EDTA-Röhrchen Sarstedt
Einfrierröhrchen greiner
Einmalbesteck Braun, Aesculap AG & CO. KG
Elektroporationsküvetten (4 mm) peqlab Biotechnologie GmbH Gel-Blotting-Papier Schleicher&Schuell
Gewebekulturflaschen, -platten costar®
Kanülen Braun
Microtainer-Röhrchen Becton Dickinson
Mikrotiterplatten
Maxi Sorp™ microtitre plates nunc™
PS microplate 96 well greiner
U-Form greiner
Nylon membranes, positively charged Roche Objektträger SuperFrost® Plus microscope slides Menzel Reaktionsgefäße (0,2 ml, 0,5 ml, 1,5 ml, 2 ml) eppendorf
Spritzen Dispomed Witt oHG
Stainless Steel Beads (5 mm) Qiagen
Sterilfilter Millipore
Zentrifugenröhrchen Sarstedt, greiner 96well-Platten für PCR: Thermo-Fast® 96, Non Skirted; mit Ultra Clear Cap Strips
ABgene®
ANHANG
9.4 Software
analySIS® labFlow 5.0 Soft Imaging System GmbH Beacon Designer 2.06 PremierBiosoft International
BLASTn National Center for Biotechnology Information easyWIN screening V6.0a TECAN
Mx3000P v2.00 Stratagene
Wisconsin Package Version 10.2 GCG 9.5 Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Beispiel der Berechnung über die Standardkurven-Methode zur relativen
Quantifizierung. ... 38
Tabelle 2: Beispiel der Berechnung über die 2-∆∆Ct-Methode zur relativen Quantifizierung... 38
Tabelle 3: Übersicht über häufig verwendete Reporterfarbstoffe und Quencher. Bei Quenchern ohne Angabe der Emissionswellenlänge handelt es sich um nicht-fluoreszierende Quencher, d.h. sie emittieren die aufgenommene Energie in Form von Wärme... 39
Tabelle 4: Spezifität der real-time RT-PCR... 81
Tabelle 5: Virusstämme, die für diese Arbeit verwendet wurden. n.d. not determined... 135
Tabelle 6: Primer und Sonden, die für diese Arbeit verwendet wurden. ... 136
9.6 Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Genom des RHDV. An die 5´NTR schließen sich die codierenden Bereiche für die Nichtstrukturproteine (hellgrau) und die beiden Strukturproteine, das VP60 und das VP10 (dunkelgrau), an (modif. nach MEYERS et al. (2000)). ... 14
Abbildung 2: Das FRET-Prinzip. F1 und F2 sind die beiden beteiligten Fluorochrome, die auch als Reporter/Donor und Quencher/Akzeptor bezeichnet werden. Sie haben die Anregungswellenlängen A1 und A2 sowie die Emissionswellenlängen E1 und E2. In den Diagrammen ist die Emission (als Fluoreszenzstärke R) gegen die Wellenlänge aufgetragen... 24
Software, Tabellenverzeichnis, Abbildungsverzeichnis
Abbildung 3: Funktionsprinzip der interkalierenden Farbstoffe. (a) Denaturierung. (b) Annealing (dt. Anlagerung). (c) Elongation. Es ist jeweils nur der rev-Strang sowie der for-Primer (Pfeil) gezeigt. Der in die doppelsträngige DNA interkalierende Farbstoff ist grün dargestellt. ... 26 Abbildung 4: Schmelzkurvenanalyse mit SYBR®Green I. Die normalisierte Fluoreszenzstärke ist in (a) als Rn und in (b) als -Rn (T), jeweils gegen die Temperatur in °C, aufgetragen. Die schwarzen Kurven gehen auf spezifische PCR-Produkte zurück.
Die graue Kurve repräsentiert die negative Kontrolle (engl. no template control, NTC), bei der Primerdimere detektiert werden. Diese lassen sich durch die geringere Schmelztemperatur von spezifischen Produkten differenzieren. Es wurde eine log10 -Verdünnungsreihe von RHDV-RNA als template eingesetzt... 28 Abbildung 5: Funktionsprinzip der FRET-Sonden (a), TaqMan®-Sonden (b), minor groove binder (MGB)-Sonden (c) und molecular beacons (d). Es ist jeweils nur der rev-Strang sowie der for-Primer (Pfeil) gezeigt. Das obere Bild zeigt jeweils die Denaturierungsphase, das mittlere die Annealing- und das untere die Elongationsphase. Die Sonden tragen ein Donormolekül „D“ und ein Akzeptormolekül „A“ bzw. den Reporterfarbstoff „R“ sowie einen Quencher „Q“.
„MGB“ steht für den minor groove binder. ... 31 Abbildung 6: Funktionsprinzip eines Scorpions™. (a) Annealing/Elongation. (b)
Denaturierung. (c) Annealing. Es ist in (a) und (b) jeweils nur ein Strang sowie der Scorpion™ mit der sequenzspezifischen Primerstruktur (Pfeil) gezeigt. Beim zweiten Annealing-Schritt (c) ist nur noch der von der Taq-Polymerase synthetisierte Strang dargestellt. Die Sonde trägt einen Reporterfarbstoff „R“ sowie einen Quencher „Q“.
„Stop“ steht für das Hexethylen-Glykol, das die Synthese eines zur Haarnadelstruktur komplementären Strangs verhindert. ... 33
ANHANG
Abbildung 7: Amplifikationsgrafik. In diesem Fall ist die normalisierte und Basislinien-korrigierte Fluoreszenzstärke (dRn) gegen die Zyklenzahl aufgetragen. Die schwarze Linie stellt den Fluoreszenzschwellenwert (engl. threshold) dar. Der Schnittpunkt zwischen Amplifikationsgraph und Fluoreszenzschwellenwert, projiziert auf die x-Achse, markiert den Ct-Wert (engl. threshold cycle). Es wurden 4 Standards (gefüllte Kästchen), eine unbekannte Probe (nicht gefüllte Kästchen) und eine negative Kontrolle, bei der kein Anstieg der Fluoreszenz zu verzeichnen war, eingesetzt. .... 34 Abbildung 8: Standardkurve und tabellarische Darstellung der Ergebnisse bei der absoluten
Quantifizierung. Für die Standardkurve wird die Zyklenzahl gegen die initiale Menge der Zielsequenz (als Kopienzahl auf der logarithmischen x-Achse) aufgetragen. Es wurden 4 Standards (gefüllte Kästchen) und eine unbekannte Probe (nicht gefüllte Kästchen) verwendet, die Amplifikationsgrafik ist in der Abbildung 7 dargestellt... 36 Abbildung 9: Alignment und Consensus-Sequenz von 27 RHDV VP60-Gensequenzen in der Primer/Sonden-Region. Der „single letter code of nucleotides“ wurde verwendet.
Die grauen Kästen repräsentieren die von den Primern bzw. der Sonde umfassten Regionen. Striche stehen für identische Nukleotide, während „wobble“-Nukleotide in Fettschrift hervorgehoben sind. ... 72 Abbildung 10: Analytische Sensitivität und dynamischer Bereich der real-time RT-PCR für
RHDV. Die Amplifikationsgraphen (a) und die Standardkurve (b), die nach Amplifizierung einer log10-Verdünnungsreihe von 1010 bis 101 Molekülen PC RNA erhalten wurden, sind dargestellt. ... 75 Abbildung 11: Sensitivität des single und multiplex real-time RT-PCR assays. (a) zeigt die Amplifikationsgraphen für FAM, die durch die Amplifizierung der RHDV-RNA zustande kommen. (b) stellt die Amplifikationsgraphen für HEX dar, die die Amplifizierung der IC repräsentieren. Schwarze Linien stehen jeweils für den multiplex assay und graue Linien für den single assay. Es wurde eine log10 -Verdünnungsreihe von RHDV-RNA mit den Verdünnungsstufen von 10-5 bis 10-10 als template eingesetzt. ... 76
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 12: Sensitivität der real-time RT-PCR im Vergleich zur konventionellen RT-PCR.
(a) zeigt die Ergebnisse für den Subtyp „RHDV Eisenhüttenstadt“ und (b) für
„RHDV Triptis“. Für die konventionelle RT-PCR wurde eine log10 -Verdünnungsreihe ausgehend von unverdünnter RNA als template eingesetzt, während für die real-time RT-PCR nur die Verdünnungsstufen ab 10-5 verwendet wurden. Zunächst wurde die konventionelle RT-PCR mit 30 Zyklen durchgeführt (nur für „RHDV Eisenhüttenstadt“, linkes Agarosegel in (a)). In einem zweiten Ansatz wurde die Anzahl der Zyklen auf 40 erhöht und RNA beider Subtypen verwendet... 78 Abbildung 13: Sensitivität der real-time RT-PCR im Vergleich zum Antigen-ELISA. (a) zeigt die Ergebnisse für den Subtyp „RHDV Eisenhüttenstadt“ und (b) für „RHDV Triptis“. Die Balken stellen die in der real-time RT-PCR erhaltenen Ergebnisse in Kopien/Reaktion dar. Die schwarze Linie repräsentiert die Titration im Antigen-ELISA, wobei die für die einzelnen Verdünnungsstufen erhaltenen ELISA-indices als Punkte dargestellt sind. Die Achsen für die ELISA-indices unterscheiden sich, da
„RHDV Triptis“ nur mit einem der 4 zur Detektion verwendeten mAKs reagiert, so daß die ELISA-indices insgesamt geringer ausfallen. Es wurde eine log4 -Verdünnungsreihe ausgehend von 10 % Leberhomogenaten resp. die daraus extrahierte RNA verwendet. ... 80 Abbildung 14: Körpertemperatur der überlebenden Kaninchen nach experimenteller Infektion mit RHDV. Die Daten wurden von der Riemser Arzneimittel AG zu Verfügung gestellt... 82
ANHANG
Abbildung 15: Detektion von RHDV-Antigen bzw. RHDV-RNA in der Leber eines an akuter RHD verstorbenen Kaninchens und eines rekonvaleszenten Tieres. Der Antigennachweis erfolgte mittels Immunhistologie (oben). Die In situ-Hybridisierung zum Nachweis viraler RNA wurde mit einer sequenzspezifischen T7-Sonde durchgeführt (unten). Zur Kontrolle wurde die entsprechende SP6-T7-Sonde verwendet, die kein Signal erzeugte (kleine Abbildung in (c)). Es handelt sich in (a) und (c) um eine als positive Kontrolle mitgeführte Leber eines an akuter RHD verstorbenen Tieres, bei der jeweils eine spezifische Anfärbung der Hepatozyten (Pfeile) festgestellt wurde. In (b) und (d) ist exemplarisch das Ergebnis für das Tier Nr. 670 gezeigt, hier konnte 5 Wochen p.i. weder RHDV-Antigen noch RHDV-RNA in der Leber detektiert werden. Maßstabsbalken = 100 µm. ... 83 Abbildung 16: Antikörper-Status der infizierten Tiere (Nr. 685, 670, 679, 697, 718) und der nicht infizierten Kontrolltiere (Nr. 1 - 3) 5 Wochen p.i... 84 Abbildung 17: Virusgenomlast in den Leukozyten rekonvaleszenter Tiere. Die Bestimmung
der Virusgenomlast erfolgte wöchentlich, beginnend mit der Woche 4 p.i., bis das jeweilige Tier getötet und der Sektion zugeführt wurde. In den Wochen 11-14 p.i.
wurden keine Daten erhoben. ... 85 Abbildung 18: Virusgenomlast in den Organen, Exkreten und Leukozyten rekonvaleszenter
Tiere. Es sind die Virusgenomlasten der einzelnen Proben zum Zeitpunkt von 5 Wochen p.i. (a), 7 Wochen p.i. (b) und 15 Wochen p.i. (c) dargestellt. ... 86 Abbildung 19: Northern Blot (rechts) zum Nachweis von RHDV-RNA in der Leber des
Tieres Nr. 685 und vorangegangene Formaldehyd-Agarosegelelektrophorese (links).
Die Proben wurden wie folgt aufgetragen: Marker M: 0,24 - 9,5 kb RNA Leiter. Spur 1: positive Kontrolle, 4,94 x 1011 Kopien RHDV-RNA, 224 nt. Spur 2: positive Kontrolle, 1,78 x 1013 Kopien RHDV-RNA, 224 nt. Spur 3: weitere, in diesem Falle irrelevante, Probe. Spur 4: konzentrierte RNA aus der Leber des Tieres Nr. 685, 1,5 x 1010 Kopien RHDV-RNA. ... 87
Abkürzungsverzeichnis
Abbildung 20: Antikörperbildung nach der Immunisierung mit RIKA-VACC und einer rekombinanten Bakulovirusvakzine. In grau dargestellt sind die Ergebnisse für die Tiere, die mit RIKA-VACC immunisiert wurden. Die schwarzen Linien stehen für die Tiere, die eine rekombinante Bakulovirusvakzine in einer 1:64-Verdünnung erhielten... 89 Abbildung 21: Virusgenomlast in Organen und Gallenflüssigkeit immunisierter Tiere nach
der challenge-Infektion. (a) zeigt die Virusgenomlast bei Tieren, die RIKA-VACC erhielten, und (b) die Virusgenomlast bei Tieren, die mit der rekombinanten Bakulovirusvakzine immunisiert wurden. Es sind die Virusgenomlasten der einzelnen Proben zum Zeitpunkt von 9, 11, 13 und 15 Wochen p.i. dargestellt. ... 90 Abbildung 22: Virusgenomlast in RLI-R-Zellen und Zellkulturüberständen nach der Infektion mit RHDV... 91 Abbildung 23: Virusgenomlast in RLI-R-Zellen und Zellkulturüberständen nach der
Transfektion mit RHDV-RNA... 92 Abbildung 24: Nachweis von RHDV-Antigen in RLI-R-Zellen nach der Transfektion mit
RHDV-RNA. Mittels des indirekten Immunfluoreszenztestes wurden die Virusreplikation nach 2 h (a), 24 h (b), 48 h (c) und 72 h (d) überprüft. Für RHDV-Antigen positive RLI-R-Zellen erscheinen grün, während die Zellkerne rot angefärbt sind. Maßstabsbalken = 500 µm. ... 93 9.7 Abkürzungsverzeichnis
Å Angstrom
A. bidest aqua bidestillata, destilliertes Wasser AEC 3-Amino-9-Ethylcarbazol AMV Aviäre Myeloblastose-Virus AP alkalische Phosphatase ATCC American Type Culture Collection ATV Alfevers Trypsine Versene, Trypsin
BFAV Bundesforschungsanstalt für Viruskrankheiten BHQ black hole quencher
bp base pairs, Basenpaare
ANHANG
(c)DNA (copy) desoxyribonucleic acid, (komplementäre) Desoxyribonukleinsäure CLP core like particle
Ct threshold cycle d Tag(e)
DABCO Diazobicyclooctan
Dabcyl 4-(4´-Dimethylaminophenylazo)-Benzoesäure DEPC Diethylpyrocarbonat
DIG Digoxigenin DMSO Dimethylsulfoxid
dNTP desoxy-Nukleosidtriphosphate DTT Dithiothreitol
EBHSV European Brown Hare Syndrome Virus EDTA Ethylendiamintetraacetat
EGFP enhanced green fluorescent protein
ELISA enzyme linked immunosorbent assay, Enzym-gekoppelter Immuntest E. coli Escherichia coli
Fab Antigen-bindendes Fragment eines Antikörpers FAM 6-Carboxyfluorescein
FCV Felines Calicivirus FITC Fluoreszeinisothiocyanat FLI Friedrich-Loeffler-Institut for forward
FRET Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer g Gramm, Erdbeschleunigung
GADPH Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase GCG Genetics Computer Group
h Stunde(n)
HA/HAE Hämagglutination/hämagglutinierende Einheit HE Haematoxylin und Eosin
HEX Hexachloro-6-carboxyfluorescein
Hz Hertz
Abkürzungsverzeichnis
IC internal control, interne Kontrolle Ig(G, M) Immunglobulin (G, M)
i.m. intramuskulär
IPTG Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranosid kDa Kilodalton
l Liter LB Luria-Bertani LED Licht emittierende Diode log Logarithmus LUX Light Upon eXtension (m)M (milli)molar, (milli)mol/l mak monoklonaler Antikörper
MESA 3-(N-morpholino)propansulfonsäure (MOPS)-EDTA-Sodium-Acetat
mg Milligramm
MGB minor groove binder min Minute(n) ml Milliliter
mm Millimeter
MOPS 3-(N-morpholino)propansulfonsäure
(m)RNA (messenger) ribonucleic acid, (Boten-) Ribonukleinsäure µl Mikroliter
µm Mikrometer
NBT Nitro Blue Tetrazolium
nm Nanometer
nt Nukleotid(e)
NTC no template control, negative Kontrolle NTPase Nukleosidtriphosphatase
NTR non translated region, nicht-translatierte Region
OIE Office International des Épizooties, internationales Tierseuchenamt OPD o-Phenylenediamin
ORF open reading frame, offener Leserahmen
ANHANG
Ω Ohm
PBS phosphate buffered saline, Phosphat gepufferte Salzlösung PC positive control, positive Kontrolle
p.i. post infectionem, nach Infektion pmol Picomol
POD Peroxidase Pol Polymerase Pro Protease
p.v. post vaccinationem, nach Vakzinierung RCV Rabbit Calicivirus
rev reverse
RHD(V) Rabbit Haemorrhagic Disease (Virus) RLI-R rabbit liver immortalized
RNase Ribonuklease
ROX 5-Carboxy-X-Rhodamin
rpm rounds per minute, Umdrehungen/Minute RSq Korrelationskoeffizient
RT reverse transcriptase, Reverse Transkriptase, reverse transcription, Reverse Transkription, Raumtemperatur
(RT-) PCR (reverse transcriptase-) polymerase chain reaction, (Reverse Transkriptase-) Polymerasekettenreaktion
s Sekunde(n)
SDS sodiumdodecylsulfate, Sodiumdodecylsulfat SNP single nucleotide polymorphism, Punktmutation s-RHDV smooth RHDV
SSC sodiumchlorid sodiumcitrate, Natriumchlorid und Natriumcitrat TAE Tris-Acetat-EDTA
TAMRA Tetramethyl-6-Carboxyrhodamin Taq Thermus aquaticus
TBS tris buffered saline, Tris-gepufferte Salzlösung TEN Tris-EDTA-Natriumchlorid
Abkürzungsverzeichnis
u units, Enzymeinheit unverd. unverdünnt UV ultraviolett V Volt
VESV Vesicular exanthema of swine virus VLP virus like particle
Vpg virales Protein, genomassoziiert
VP60/VP10 Strukturproteine des RHDV (60 kDa/10kDa) w/v weight/volume, Gewicht/Volumen
x-Gal 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-galactopyranosid x-Phosphat 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphat
Tagungsbeiträge auf wissenschaftlichen Kongressen:
GALL, A., HOFFMANN, B., TEIFKE, J. P., LANGE, B. u. SCHIRRMEIER, H. (2005):
Viral load in rabbits that overcome Rabbit Haemorrhagic Disease Virus infection.
Jahrestagung der Gesellschaft für Virologie, Hannover, 16. - 19. März 2005
HEßMANN, M., GALL, A., WEGE, H., SCHIRRMEIER, H. u. KÖLLNER, B. (2005):
Rabbit hemorrhagic disease (RHD) a model for fulminate liver failure (FLF) syndrom? – A study on possible immunopathogenesis of RHD.
Jahrestagung der Gesellschaft für Virologie, Hannover, 16. - 19. März 2005
Folgende Teile dieser Arbeit wurden zur Publikation eingereicht:
GALL, A., HOFFMANN, B., TEIFKE, J. P., LANGE, B. u. SCHIRRMEIER, H. (2005):
Persistence of viral RNA in rabbits which overcome an experimental RHDV infection detected by a highly sensitive multiplex real-time RT-PCR.
Vet. Microbiol. (submitted)
GALL, A. u. SCHIRRMEIER, H. (2006):
Persistence of rabbit haemorrhagic disease virus genome in vaccinated rabbits after experimental infection.
J. Vet. Med. B (submitted)
Danksagung
Die vorliegende Arbeit wurde unter der Anleitung von Herrn Dr. med. vet. H. Schirrmeier angefertigt. Ihm danke ich für die Überlassung des interessanten Themas, die kompetente Betreuung und ganz besonders für das gute Arbeitsklima sowie seine Menschlichkeit.
Herrn PD Dr. med. vet. M. Beer und Frau Prof. Dr. med. vet. B. Grummer danke ich für die Unterstützung und die wissenschaftliche Betreuung dieser Arbeit.
Herrn Prof. Dr. rer. nat. T. C. Mettenleiter danke ich für die Möglichkeit der Anfertigung dieser Dissertation am Friedrich-Loeffler-Institut, Insel Riems.
Herrn Dr. med. vet. B. Hoffmann danke ich für sein Engagement und die konstruktiven Diskussionen.
Herrn Dr. med. vet. B. Lange, Riemser Arzneimittel AG, danke ich für die gute Zusammenarbeit.
Den Mitarbeitern des Friedrich-Loeffler-Instituts danke ich für die freundliche Aufnahme.
Insbesondere danke ich Frau H. Wege und Frau B. Meinke für die jederzeit gewährte Hilfestellung bei der praktischen Arbeit und den Doktoranden für die vielen heiteren Momente.
Meiner Familie und meinen Freunden danke ich für die moralische Unterstützung und das entgegengebrachte Verständnis.
Dem Impfstoffwerk Dessau-Tornau GmbH danke ich für die finanzielle Förderung der Arbeit.