3.2.1 Allgemeines
Die RNA-Isolierung wurde an einem separaten Arbeitsplatz durchgeführt, der ausschließlich diesem Zwecke diente. Alle Protokolle wurden modifiziert durch die Zugabe von 5 µl in vitro-transkribierter IC2 RNA (2 x 105 Kopien/µl), die als interne Kontrolle verwendet wird (HOFFMANN et al. 2005), nach der Lyse der Probe und Inaktivierung von vorhandenen RNasen. Zur Detektion von möglichen Kreuzkontaminationen wurde während jeder RNA-Isolierung eine weitere Probe, bei der nur Puffer eingesetzt wurde, aufgearbeitet (RNA-Isolierungskontrolle). Außer der konzentrierten RNA für die Transfektion und den Northern Blot wurde die aus einer Probe extrahierte RNA jeweils in 50 µl RNase-freiem Wasser bzw. dem entsprechenden Puffer eluiert. Anschließend wurde die RNA bei - 70 °C gelagert.
MATERIAL UND METHODEN
3.2.2 RNA-Isolierung mit dem RNeasy® Mini Kit
Für die RNA-Isolierung aus Organmaterial, Leberhomogenaten, Lyophilisaten, Leukozyten und RLI-R-Zellen (engl. rabbit liver immortalized, Anhang, 9.1.2) wurde das RNeasy® Mini Kit verwendet. Die Vorbereitung der Puffer wurde entsprechend den Angaben des Herstellers durchgeführt.
Die Homogenisierung und Lyse der Proben in 600 µl Puffer RLT wurde für die einzelnen Proben wie folgt durchgeführt: 20 mg Organmaterial aus dem Tierversuch 3.16 bzw. 10 mg aus dem Tierversuch 3.17 wurden im Puffer RLT in einem 2 ml-Reaktionsgefäß mittels einer Stahlkugel (5 mm) in einem Tissue Lyser (2 min bei 20 Hz) homogenisiert. Lyophilisate wurden in RNase-freiem Wasser gelöst, um ein 10 % Organhomogenat zu erhalten. Von den 10 % Organhomogenaten wurden 100 µl mit dem Puffer RLT versetzt. Die Leukozyten aus 1 ml EDTA-Blut wurden nach ca. 10 min Erythrozytenlyse bei RT mit 4 ml Erythrozytenlysispuffer pelletiert (150 g, 8 min, 4 °C). Der Überstand wurde verworfen, die Leukozytenanzahl wurde mit einer Neubauer-Zählkammer bestimmt, und zu 5 x 106 Leukozyten wurde der Puffer RLT gegeben. RLI-R-Zellen wurden nach der Bestimmung der Zellzahl mit dem Puffer RLT versetzt.
Alle Lysate wurden im Folgenden für 3 min bei 20000 g zentrifugiert. Die Überstände wurden in ein 1,5 ml-Reaktionsgefäß gegeben und mit 600 µl 70 % Ethanol vermischt. Sie wurden dann in zwei Schritten auf eine Säule in einem entsprechenden Auffanggefäß aufgetragen, wobei anschließend jeweils für 15 s bei 8000 g zentrifugiert und der Durchfluß verworfen wurde. Danach wurden 700 µl des Waschpuffers RW1 auf die Säule gegeben, nochmals wie oben zentrifugiert und das Auffanggefäß inklusive Durchfluß verworfen.
Nachdem die Säule in ein neues Auffanggefäß gegeben wurde, folgten zwei weitere Waschschritte mit je 500 µl des Puffers RPE. Zunächst wurde wie oben beschrieben zentrifugiert und der Durchfluß verworfen. Die zweite Zentrifugation erfolgte für 2 min bei 8000 g. Die Säule wurde in ein neues Auffanggefäß übertragen und daraufhin nochmals 1 min bei 20000 g zentrifugiert. Schließlich wurde die Säule in ein 1,5 ml-Reaktionsgefäß gegeben und die RNA mit RNase-freiem Wasser bei 8000 g für 1 min eluiert.
RNA-Isolierung
3.2.3 RNA-Isolierung mit dem QIAamp® Viral RNA Mini Kit
Das QIAamp® Viral RNA Mini Kit wurde für die RNA-Extraktion aus zellfreien Proben wie Serum, Urin, Galle und Zellkulturüberständen benutzt. Die Vorbereitung der Puffer erfolgte nach den Angaben des Herstellers.
Jeweils 140 µl Probenmaterial wurden für 15 s mit 560 µl des Lysispuffers AVL durch vortexen gemischt und dann 10 min bei RT inkubiert. Nach Zugabe von 560 µl 100 % Ethanol und erneutem Mischen wurde die Probe in zwei Schritten auf eine Säule in einem entsprechenden Auffanggefäß aufgetragen. Es wurde jeweils für 1 min bei 6000 g zentrifugiert und der Durchfluß verworfen. Dann wurden 500 µl des Waschpuffers AW1 auf die Säule gegeben und nochmals wie oben zentrifugiert. Nach dem Wechsel des Auffanggefäßes erfolgte ein weiterer Waschschritt mit 500 µl des Puffers AW2 und Zentrifugation für 3 min bei 20000 g. Die Säule wurde in ein neues Auffanggefäß übertragen und daraufhin nochmals 1 min bei 20000 g zentrifugiert. Schließlich wurde die Säule in ein 1,5 ml-Reaktionsgefäß gegeben und die RNA mit dem Puffer AVE bei 6000 g für 1 min eluiert.
3.2.4 RNA-Isolierung mit TRIzol®Reagent
Die RNA-Isolierung mit TRIzol®Reagent wurde entsprechend den Angaben des Herstellers mit einigen im Folgenden beschriebenen Modifikationen durchgeführt.
Diese Methode wurde angewendet für eine Konzentrierung von RNA aus größeren Mengen Gewebe. Dazu wurden je 100 mg Lebergewebe von zwei Kaninchen, die experimentell mit den Stämmen „RHDV Eisenhüttenstadt“ und „RHDV Triptis“ infiziert worden waren, mit einem Homogenisator in 1 ml TRIzol®Reagent homogenisiert und dann weiter nach den Herstellerangaben wie unten beschrieben aufgearbeitet. 1 g Lebergewebe des Tieres Nr. 685 aus dem Tierversuch 3.16 wurde in 20 ml TRIzol®Reagent auf die gleiche Weise homogenisiert und weiter aufgearbeitet, wobei die RNA in 250 µl RNase-freiem Wasser gelöst und für den Northern Blot verwendet wurde. Außerdem wurde 0,9 g Milzgewebe des Tieres Nr. 679 aus dem Tierversuch 3.16 in 20 ml TRIzol®Reagent homogenisiert und weiter aufgearbeitet, wobei die RNA in 250 µl Diethylpyrocarbonat (DEPC)-behandeltem PBS (engl. phosphate buffered saline, Phosphat gepufferte Salzlösung) gelöst und für die Transfektion von RLI-R-Zellen verwendet wurde.
MATERIAL UND METHODEN
Außerdem wurde die RNA-Extraktion mit TRIzol®Reagent verwendet für Probenmaterial, bei denen sich nach der Aufarbeitung mit anderen Methoden eine Inhibition der IC zeigte.
Hierbei handelte es sich um die Isolierung von RNA aus 10 mg Lebergewebe aus dem Tierversuch 3.17 sowie 10 mg Faeces aus dem Tierversuch 3.16. Diese Proben wurden in 1 ml TRIzol®Reagent in einem Tissue Lyser (analog 3.2.2) homogenisiert und anschließend den Herstellerangaben entsprechend aufgearbeitet. Das RNA-Pellet wurde im Falle des Lebergewebes in RNase-freiem Wasser aufgenommen. Das aus Kotproben erhaltene Pellet wurde mit 600 µl Puffer RLT versetzt und danach mit dem RNeasy® Mini Kit wie unter 3.2.2 beschrieben aufgereinigt.
Nach der oben beschriebenen Homogenisierung der einzelnen Proben wurde 10 min bei 12000 g und 4 °C zentrifugiert. Die Überstände wurden in ein 1,5 ml-Reaktionsgefäß übertragen und für 5 min bei RT inkubiert. Nach Zugabe von 200 µl Chloroform/1 ml TRIzol®Reagent wurde für 15 s durch Schütteln gemischt und erneut für 2 - 3 min bei RT inkubiert. Durch eine sich anschließende Zentrifugation (15 min, 12000 g, 4 °C) erfolgte die Trennung der Phenol-Chloroform-Phase von der wäßrigen Phase. Die sich oben befindende wäßrige Phase wurde in ein neues 1,5 ml-Reaktionsgefäß gegeben und mit 500 µl Isopropanol/1 ml TRIzol®Reagent gemischt. Die Präzipitation der RNA erfolgte nach 10 min Inkubation bei RT durch Zentrifugation für 10 min bei 12000 g und 4 °C. Abweichend wurde die RNA aus 100 mg Lebergewebe mit einem Gemisch aus 250 µl Isopropanol und 250 µl hochkonzentrierter Salzlösung (0,8 M Natriumcitrat, 1,2 M Natriumchlorid)/1 ml TRIzol®Reagent gefällt. Nach der Fällung wurde der Überstand verworfen und das Pellet durch Zugabe von 1 ml 75 % Ethanol/1 ml TRIzol®Reagent und anschließendes Zentrifugieren (5 min, 7500 g, 4 °C) gewaschen. Danach wurde der Überstand abgenommen, und das Pellet wurde für ca. 10 min unter Vakuum getrocknet. Es wurde in RNase-freiem Wasser aufgenommen und schließlich für 10 min bei 57 °C zur besseren Lösung inkubiert.