Quantifizierung

Bei der absoluten Quantifizierung wird die absolute Menge der Zielsequenz in einer unbekannten Probe - meistens ausgedrückt als Kopienzahl pro Reaktion - bestimmt. Dazu werden mehrere Standards mit bekannten Mengen der Zielsequenz in separaten Reaktionen mitgeführt (externe Standards). Als DNA-Standards für eine real-time PCR werden gewöhnlich linearisierte Plasmide mit klonierter Zielsequenz verwendet. Für eine real-time RT-PCR bieten sich als RNA-Standards in vitro-Transkripte auf der Basis von Plasmiden an (BUSTIN 2000; FRONHOFFS et al. 2002). Alternativ können genomische DNA/RNA oder auch PCR-Produkte im Falle der Quantifizierung von DNA genutzt werden.

Für die Standards wird der jeweilig erhaltene Ct-Wert (auf der y-Achse) gegen die initiale Menge der Zielsequenz (als Kopienzahl auf der logarithmischen x-Achse) aufgetragen, wodurch eine Standardkurve entsteht (HEID et al. 1996). Der Ct-Wert einer unbekannten Probe wird mit der Standardkurve verglichen, so daß die absolute initiale Kopienzahl bestimmt werden kann (Abbildung 8). Dabei sollte die unbekannte Probe in den Bereich fallen, der mit der Standardkurve abgedeckt wird (BUSTIN 2000). Die Voraussetzung für eine exakte Quantifizierung ist die korrekte Bestimmung der Kopienzahl der Zielsequenz in den Standards, die über eine Umrechnung mittels des Molekulargewichtes nach der photometrischen Bestimmung der Absorption A260nm erfolgt. Außerdem müssen für die Standards und die Proben die identischen Oligonukleotide zur Amplifizierung und Detektion verwendet werden, die Sequenzen beider müssen möglichst ähnlich sein, und eine äquivalente

LITERATURÜBERSICHT

Effizienz der Amplifizierung muß gegeben sein (NIESTERS 2004). Optimal ist eine PCR-Effizienz von 100 %, die sich auch in einer Steigung der Standardkurve von -3,322 widerspiegelt. In diesem Fall wird die Amplifikatmenge pro Zyklus exakt verdoppelt. Der optimale Wert für den Korrelationskoeffizienten RSq, der die Qualität der Standards beschreibt, beträgt 1.

Dye Well Type Ct (dRn) Quantity (copies)

FAM Standard 18,23 1,00E+07

FAM Standard 25,15 1,00E+05

FAM Standard 31,79 1,00E+03

FAM Standard 38,05 1,00E+01

FAM Unknown 35,17 8,04E+01

FAM NTC No Ct No Ct

Abbildung 8: Standardkurve und tabellarische Darstellung der Ergebnisse bei der absoluten Quantifizierung. Für die Standardkurve wird die Zyklenzahl gegen die initiale Menge der Zielsequenz (als Kopienzahl auf der logarithmischen x-Achse) aufgetragen. Es wurden 4 Standards (gefüllte Kästchen) und eine unbekannte Probe (nicht gefüllte Kästchen) verwendet, die Amplifikationsgrafik ist in der Abbildung 7 dargestellt.

Ct Probe x

Kopienzahl Probe x

Die quantitative real-time Polymerasekettenreaktion

2.2.4.2 Relative Quantifizierung

Bei der relativen Quantifizierung wird davon ausgegangen, daß Veränderungen in der Menge der mRNA (engl. messenger RNA, Boten-RNA) den Veränderungen in der Menge des Proteins entsprechen. Die Menge der Zielsequenz in der Probe wird normalisiert auf ein endogenes Referenzgen und dann in Relation zu einer Referenzprobe (Kalibrator) gesetzt. Es werden also zwei Zustände miteinander verglichen, z.B. Zytokinprofile zu unterschiedlichen Versuchszeitpunkten.

Als erstes wird die Menge des Zielgens auf ein endogenes Referenzgen, das in den Proben vorhanden ist, normalisiert (HEID et al. 1996). Als Referenzgen werden gewöhnlich so genannte „housekeeping genes“, z.B. die mRNA für ß-Aktin, GADPH (Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase) sowie ß-2-Mikroglobulin genutzt (HEID et al. 1996). Die Voraussetzung für die Verwendung ist eine konstante Transkription des housekeeping genes unter den experimentellen Bedingungen und in unterschiedlichen Probenmaterialien. Mittels real-time RT-PCR, Northern Blot und Ribonuklease protection-assay (BHATIA et al. 1994; ZHONG u. SIMONS 1999;

TRICARICO et al. 2002) wurde gezeigt, daß diese nicht immer gewährleistet ist. Daher muß das housekeeping gene mit den geringsten Veränderungen ausgewählt oder ein Index aus mehreren housekeeping genes (VANDESOMPELE et al. 2002) verwendet werden. Eine Normalisierung auf ribosomale RNA oder totale RNA ist ebenfalls möglich (ZHONG u.

SIMONS 1999; TRICARICO et al. 2002). Alternativ können artifizielle Nukleinsäuren, wie z.B. Plasmid-DNA, der Probe während der Nukleinsäureisolierung zugesetzt und als Referenzgen genutzt werden (GRUBER et al. 2001). Die Zielsequenz und das Referenzgen werden entweder in separaten Reaktionen (single assay) oder zusammen im multiplex assay amplifiziert. Nachdem ein Kalibrator festgelegt wurde, wird dann für jede Probe die relative Menge der Zielsequenz in Bezug auf den Kalibrator berechnet, so daß die Proben miteinander verglichen werden können. Die Berechnungen erfolgen entweder über Standardkurven oder über die 2^-∆∆Ct-Methode (komparative Methode) nach LIVAK u. SCHMITTGEN (2001).

Bei der Standardkurve-Methode wird anhand einer Verdünnungsreihe zunächst eine Standardkurve für das Referenzgen und das Zielgen abgeleitet und die Mengen von Zielgen und Referenzgen in der Probe abgelesen (BUSTIN 2000). Wenn die PCR-Effizienzen für beide gleich sind, erübrigt sich die Standardkurve für das Zielgen. Es ist nicht nötig, die

LITERATURÜBERSICHT

absolute Menge der Zielsequenz in den Standards zu kennen, da die Einheiten bei der Berechnung einer relativen Menge der Zielsequenz in der Probe herausfallen. Im ersten Schritt wird nämlich die auf das Referenzgen normalisierte Menge des Zielgens bestimmt, indem die Menge des Zielgens durch die Menge des Referenzgens dividiert wird. Dann wird eine Probe als Kalibrator festgelegt, der den Wert 1 erhält. Die relative Menge der Zielsequenz in einer Probe in Bezug auf den Kalibrator wird berechnet, indem die normalisierte Menge des Zielgens in der Probe durch die normalisierte Menge des Zielgens des Kalibrators geteilt wird (Tabelle 1).

Tabelle 1: Beispiel der Berechnung über die Standardkurven-Methode zur relativen Quantifizierung.

Bei der Berechnung über die 2^-∆∆Ct-Methode (LIVAK u. SCHMITTGEN 2001) sind Standardkurven nur initial nötig, um zu gewährleisten, daß die nötigen vergleichbaren PCR-Effizienzen für das Referenzgen und das Zielgen vorhanden sind. Danach können Ct-Werte direkt miteinander verglichen werden, wobei die folgenden Berechnungen nötig sind. Als erstes wird der Wert ∆Ct für jede Probe und für den Kalibrator berechnet:

∆Ct (Probe) = Ct Zielgen - Ct Referenzgen

∆Ct (Kalibrator) = Ct Zielgen - Ct Referenzgen Dann wird ∆∆Ct für jede Probe berechnet:

∆∆Ct = ∆ Ct (Probe) - ∆Ct (Kalibrator) Unter der Voraussetzung vergleichbarer PCR-Effizienzen kann dann

2^-∆∆Ct = relative Menge der Zielsequenz in einer Probe

eingesetzt werden (Tabelle 2).

Probe Ct Zielgen Ct Referenzgen ∆Ct ∆∆Ct Menge Zielgen, relativ zum Kalibrator (2 ^-∆∆Ct)

Kalibrator 36,5 22,8 13,7 0 1

Probe x 31 23,1 7,9 -5,8 55,7

Tabelle 2: Beispiel der Berechnung über die 2^-∆∆Ct-Methode zur relativen Quantifizierung.

Probe Ct

Die quantitative real-time Polymerasekettenreaktion