Herstellung einer positiven Kontrolle für die real-time RT-PCR

Es wurde eine positive Kontrolle (PC RNA) durch Klonierung in den Vektor pGEM®-TEasy und sich anschließende in vitro-Transkription hergestellt. Die interne Kontrolle (IC2 RNA) wurde auf ähnliche Weise konstruiert (HOFFMANN et al. 2005) und basiert auf einem Fragment des Standard-Klonierungsvektors pEGFP-1 (BD Biosciences Clontech, accession number U55761).

3.3.2.1 Amplifizierung mittels RT-PCR

Für die Klonierung wurde zunächst ein 104 bp großes Fragment des VP60-Gens, welches auch in der real-time RT-PCR nachgewiesen wird, mittels konventioneller RT-PCR amplifiziert. Der Reaktionsansatz mit einem Endvolumen von 25 µl unter Verwendung des SuperScript™ III One-Step RT-PCR Systems setzte sich wie folgt zusammen:

Reaction Mix (2x; 0,4 mM je dNTP, 3,2 mM Magnesiumsulfat) 12,5 µl

A. bidest 4 µl

vp60-7_for (20 pmol/µl) 1 µl

vp60-8_rev (20 pmol/µl) 1 µl

Magnesiumsulfat (5 mM) 0,5 µl

SuperScript III™ RT / Platinum® Taq Mix 1 µl

template 5 µl

Endvolumen 25 µl

Als template wurde RNA aus der Leber eines Kaninchens, das experimentell mit

„RHDV Eisenhüttenstadt“ infiziert wurde, in einer 1:100-Verdünnung in RNase-freiem Wasser verwendet. Die Trennung der Arbeitsplätze für Mastermix und template und die Verwendung von Kontrollen wurde analog zu 3.4.2 gehandhabt. Die verwendeten Primersequenzen sind der Tabelle 6 (Anhang, 9.1.4) zu entnehmen.

MATERIAL UND METHODEN

Die Reaktion wurde in einem Primus 96^plus-Cycler mit dem folgenden Temperaturprofil durchgeführt:

30 min bei 50 °C (Reverse Transkription)

2 min bei 94 °C (Inaktivierung der RT, Aktivierung der Taq-Polymerase) 35 Zyklen mit:

30 s bei 94 °C (Denaturierung) 30 s bei 55 °C (Annealing) 90 s bei 70 °C (Elongation) 10 min bei 70 °C (finale Elongation)

Das gesamte PCR-Produkt wurde mit 10 µl Ladepuffer versetzt und mittels Elektrophorese in einem 1 % Agarosegel dargestellt. Die Banden wurden im durchscheinenden UV-Licht eines Transilluminators ausgeschnitten, und die DNA wurde unter Verwendung des QIAquick® Gel Extraction Kits aus dem Gel extrahiert und gereinigt. Die Vorbereitung der Puffer wurde dabei nach den Angaben des Herstellers durchgeführt. Zunächst wurden in einem 2 ml-Reaktionsgefäß 3 Volumen des Bindepuffers QG zu einem Volumen des abgewogenen Gelstückes gegeben (100 mg Gel entsprechen ca. 100 µl) und für ca. 10 min bei 50 °C inkubiert. Nachdem sich das Gelstück völlig aufgelöst hatte, wurde 1 Volumen Isopropanol zugesetzt und gemischt. Alle folgenden Zentrifugationsschritte erfolgten für 1 min bei 17900 g. Die Probe wurde in mehreren Schritten auf eine Säule in einem entsprechenden Auffanggefäß aufgetragen und jeweils zentrifugiert, wobei der Durchfluß verworfen wurde. Anschließend wurden weitere 500 µl Puffer QG zugegeben, zentrifugiert und der Durchfluß verworfen. Es folgte ein Waschschritt mit 750 µl Puffer PE und nochmaliger Zentrifugation. Nach Verwerfen des Durchflusses wurde erneut zentrifugiert.

Danach wurde die Säule in ein 1,5 ml-Reaktionsgefäß übertragen und 30 µl des Elutionspuffers EB zugegeben. Nach 1 min Inkubation bei RT wurde die DNA durch einen letzten Zentrifugationsschritt eluiert.

3.3.2.2 Klonierung

Das gereinigte PCR-Produkt wurde mit dem Standard-Klonierungsvektor pGEM®-TEasy ligiert. Dazu wurden unter Verwendung des pGEM®-TEasy Vector Systems II 5 µl Ligationspuffer (2x), 3 µl PCR-Produkt (38 ng/µl), 1 µl pGEM®-TEasy Vektor (50 ng/µl)

Klonierung und in vitro-Transkription

und 1 µl T4 DNA Ligase zu einem Endvolumen von 10 µl gemischt. Die Ligation erfolgte über Nacht bei 4 °C.

Für die Transformation wurden E. coli XL1blue als kompetente Bakterienzellen verwendet.

5 µl des Ligaseansatzes wurden zu 100 µl der auf Eis aufgetauten E. coli XL1blue gegeben, gemischt und für 30 min auf Eis gestellt. Es schloß sich eine Inkubation für 90 s bei 42 °C gefolgt von weiteren 2 min auf Eis an. Nach Zugabe von 400 µl Luria-Bertani (LB)-Medium wurde für 90 min bei 37 °C unter Schütteln (800 rpm) inkubiert. 300 µl des Transformationsansatzes wurden unter Zusatz von 60 µl x-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-galactopyranosid, 20 mg/ml in Dimethylformamid) und 6 µl IPTG (Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranosid, 200 mg/ml in A. bidest) auf einer Ampicillin-Selektionsagarplatte ausplattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert.

Die Selektion erfolgte am nächsten Tag über Blau-Weiß-Selektion: verdächtige, d.h. weiße, Bakterienkolonien wurden für die Plasmid-Mini-Präparation herangezogen. Dazu wurden je 2,5 ml LB-Medium mit 1,5 µl/ml Ampicillin (50 mg/ml) in ein 20 ml-Röhrchen gegeben, mit einer weißen Bakterienkolonie angeimpft und über Nacht bei 37 °C unter Schütteln (190 rpm) inkubiert. Aus 1,5 ml dieser Übernachtkultur erfolgte die Plasmid-Isolierung nach dem Prinzip der alkalischen Lyse (BIRNBOIM 1983). Zunächst wurden die Bakterien durch Zentrifugation für 1 min bei 2000 g in einem 1,5 ml-Reaktionsgefäß pelletiert. Das Pellet wurde in 100 µl kalter Lösung I resuspendiert und nach 5 min Inkubation bei RT mit 200 µl Lösung II versetzt. Anschließend wurde durch Schwenken gemischt und für 5 min auf Eis inkubiert. Danach wurden 150 µl Lösung III zugesetzt und erneut gemischt sowie auf Eis inkubiert wie oben beschrieben. Nach 7 min Zentrifugation bei 20000 g wurde der Überstand in ein neues 1,5 ml-Reaktionsgefäß übertragen, 500 µl Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) zugegeben und erneut zentrifugiert (7 min, 20000 g). Die sich oben befindende Phase wurde in ein neues 1,5 ml-Reaktionsgefäß übertragen. Nach Zugabe von 1 ml 100 % Ethanol, Mischen durch vortexen und 2 min Inkubation bei RT wurde erneut zentrifugiert (5 min, 20000 g). Der Überstand wurde verworfen, und das Pellet wurde durch Zugabe von 300 µl 70 % Ethanol und folgende Zentrifugation (2 min, 20000 g) gewaschen.

Nach Abnahme des Überstandes wurde das Pellet für 15 min bei 37 °C getrocknet, danach in 35 µl RNase A-haltigem Wasser resuspendiert und nochmals für 30 min bei 37 °C inkubiert.

MATERIAL UND METHODEN

Die isolierte Plasmid-DNA wurde durch Spaltung mit dem Restriktionsenzym NotI überprüft.

Dazu wurden 5,65 µl A. bidest, 3 µl Plasmid-DNA (2,5 µg/µl), 1 µl Puffer 3 (10x), 0,1 µl bovines Serumalbumin (BSA, 100x, 10 mg/ml) und 0,25 µl NotI (10 u/µl) zu einem Endvolumen von 10 µl zusammengegeben. Nach 2 h Inkubation bei 37 °C erfolgte die Darstellung der Fragmente über eine Agarosegelelektrophorese. Weiterhin wurden die Plasmide durch PCR (analog 3.3.1.1) und anschließende Agarosegelelektrophorese auf das Vorhandensein des gewünschten DNA-Fragmentes kontrolliert. Um die Orientierung der inserts zu bestimmen, wurde die Plasmid-DNA aus vier positiven Klonen mit der Methode nach SANGER et al. (1977) sequenziert, wobei das Thermo Sequenase Fluorescent Labelled Primer Cycle Sequencing-Kit verwendet wurde. Zunächst wurden pro Probe zwei Mastermixe aus je 6,15 µl Plasmid-DNA (2,5 µg/µl), 3 µl A. bidest, 0,35 µl Dimethylsulfoxid (DMSO) und 1 µl des IRD800-markierten M13for- bzw. M13rev-Primers (2 pmol/µl; Tabelle 6, Anhang, 9.1.4) erstellt. Von dem Mastermix wurden je 2,5 µl mit 0,7 µl G-, A-, T- bzw.

C-Reagenz zusammengegeben. Die Reaktion fand in einem Primus 96^plus-Cycler mit dem folgenden Temperaturprofil statt: 5 min bei 95 °C, gefolgt von 30 Zyklen mit: 30 s bei 95 °C (Denaturierung), 30 s bei 60 °C (Annealing) und 30 s bei 70 °C (Elongation). Im Anschluß wurden 1,8 µl Sequenz-Stop-Lösung zugegeben. Die Proben wurden im Labor von Dipl.-Chem. G. Strebelow auf ein Polyacrylamid-Harnstoffgel aufgetragen, und die Auswertung erfolgte mit dem LI-Cor DNA-Analyzer GENE READER 4200.

3.3.2.3 In vitro-Transkription

Für die in vitro-Transkription wurde das ausgewählte und als „pGEM-VP60_p7-8for“

bezeichnete Plasmid zunächst mit dem Restriktionsenzym MluI linearisiert, um T7-„run off“-Transkripte definierter Länge zu erhalten. Hierzu wurden 17 µl A. bidest, 8 µl Plasmid-DNA (2,5 µg/µl), 3 µl Puffer R+ mit BSA (10x) und 2 µl MluI (10 u/µl) zu einem Endvolumen von 30 µl zusammengegeben und für 2 h bei 37 °C inkubiert. Die Isolierung und Aufreinigung der DNA erfolgte analog zu 3.3.1.1 über eine Agarosegelelektrophorese und das QIAquick® Gel Extraction Kit mit Elution in 50 µl des Puffers EB.

Die linearisierte und gereinigte Plasmid-DNA wurde als template für die in vitro-Transkription eingesetzt. Unter Verwendung des Riboprobe® Systems - SP6/T7 wurden 10 µl Transkriptionspuffer (5x), 2 µl Dithiothreitol (DTT, 100mM), 1 µl rekombinanter RNasin® Ribonuklease Inhibitor (40 u/µl), je 2 µl der

Klonierung und in vitro-Transkription

Ribonukleosidtriphosphate rATP, rCTP, rGTP, rUTP (je 2,5 mM), 6 µl linearisierte template-DNA (460 ng/µl), 2 µl T7 RNA Polymerase (20 u/µl) und 11 µl Nuklease-freies Wasser bei RT zu einem Endvolumen von 50 µl zusammengegeben, gemischt und für 90 min bei 37 °C inkubiert.

Daraufhin wurden 2 µl der im Kit enthaltenen RQ1 RNase-freien DNase (1 u/µl) zugegeben und nochmals für 15 min inkubiert, um Reste von template-DNA zu entfernen. Die Aufreinigung der in vitro-transkribierten RNA geschah über das RNeasy® Mini Kit ergänzt durch einen weiteren DNase-Verdau mit dem RNase-free DNase Set. Die Vorbereitung der Puffer wurde entsprechend den Herstellerangaben durchgeführt. Als erstes wurde der Reaktionsansatz mit RNase-freiem Wasser auf ein Volumen von 100 µl aufgefüllt. Dann wurden 350 µl des Lysispuffers RLT zugegeben und gemischt. Nach Zugabe von 250 µl 100 % Ethanol wurde die Probe auf eine Säule in einem entsprechenden Auffanggefäß aufgetragen und zentrifugiert (15 s, 8000g). Das Auffanggefäß wurde gewechselt, 350 µl des Waschpuffers RW1 auf die Säule gegeben und wie oben zentrifugiert. Der Durchfluß wurde verworfen, und 80 µl einer Lösung von DNase I im Puffer RDD (RNase-Free DNase Set) wurden auf der Säule für 15 min bei RT inkubiert. Danach wurden 350 µl des Puffers RW1 zugegeben, erneut wie oben zentrifugiert und der Durchfluß verworfen. Nachdem die Säule in ein neues Auffanggefäß gegeben wurde, folgten zwei weitere Waschschritte mit je 500 µl des Puffers RPE. Zunächst wurde wie oben beschrieben zentrifugiert. Nach dem Verwerfen des Durchflusses erfolgte die zweite Zentrifugation für 2 min bei 8000 g. Die Säule wurde in ein neues Auffanggefäß übertragen und daraufhin nochmals zentrifugiert (1 min, 20000 g).

Daraufhin wurde die Säule in ein 1,5 ml-Reaktionsgefäß gegeben. Schließlich wurde die in vitro-transkribierte und aufgereinigte RNA in einem Gesamtvolumen von 100 µl eluiert durch zwei aufeinander folgende Zentrifugationsschritte (1 min, 8000 g) mit jeweils 50 µl RNase-freiem Wasser.

Um die Menge noch vorhandener DNA zu bestimmen, wurde eine real-time PCR durchgeführt. Die Trennung der Arbeitsplätze für Mastermix und template sowie das Mitführen einer negativen Kontrolle erfolgte wie unter 3.4.2 beschrieben. Die aufgereinigte und DNase-verdaute in vitro-transkribierte RNA wurde als template (1:1000 verdünnt in RNase-freiem Wasser) in zwei Reaktionsansätzen eingesetzt. Die verwendeten Oligonukleotide sind der Tabelle 6 (Anhang, 9.1.4) zu entnehmen. Einer der Ansätze enthielt

MATERIAL UND METHODEN

keine RT, so daß hier nur die evtl. noch vorhandene DNA amplifiziert werden konnte. Die Reaktionsansätze mit einem Endvolumen von 25 µl unter Verwendung des QuantiTect™

Probe RT-PCR Kits setzten sich somit wie folgt zusammen:

mit RT ohne RT

Die Reaktionen wurden in einem Mx3000P™ Real-Time PCR System mit dem folgenden Temperaturprofil durchgeführt:

30 min bei 50 °C (Reverse Transkription)

15 min bei 95 °C (Inaktivierung der RT, Aktivierung der Taq-Polymerase) 45 Zyklen mit:

30 s bei 95 °C (Denaturierung)

30 s bei 55 °C (Annealing, Messung der Fluoreszenzdaten) 30 s bei 68 °C (Elongation)

Die Konzentration der in vitro-transkribierten RNA wurde spektrophotometrisch bestimmt, und die Anzahl der Moleküle wurde anhand der Formel

[x g/µl RNA / (Transkriptlänge in Nukleotiden x 340)] x 6,022 x 10²³ = y Moleküle/µl berechnet.