Entwicklung einer quantitativen Real-Time PCR Methode

zur Bestimmung ^der Gesamtkeimzahl in Geflügelfleisch

Von der

Naturwissenschaftlichen

Fakultät der Gottfried

Wilhelm Leibniz Universität

Hannover

zur

Erlangung

^des

^Grades

Doktorin

der Naturwissenschaften

(Dr.

^rer.

nat.)

genehmigte

Dissertation

von

Diplom-Trophologin

^Raha

Vatanparast

2016

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

I

Abbildungsverzeichnis

^VI

Tabellenverzeichnis

VIII

Abkürzungsverzeichnis

^X

Zusammenfassung

^XIII

Abstract

XV

1

Einleitung

¹

1.1

Hintergrund ^und Problemstellung

¹

1.2

Literaturübersicht

4

1.2.1

Mikrobiologische ^Qualität

^des

Geflügelfleischs

⁴

1.2.1.1

Hintergrund

⁴

1.2.1.2

Haltbarkeitsdauer

6

1.2.1.3

Mikrowelle Assoziation

8

1.2.1.4

Mikrobieller Verderb

11

1.2.2 Gesamtkeimzahl 12

1.2.2.1

Gesamtkeimzahl als Indikator für

die

mikrobiologische Qualität

¹² 1.2.2.2 Methoden _zur

Bestimmung

^der

Gesamtkeimzahl

in Lebensmitteln 12

1.2.2.3

Plattenkulturverfahren

14

1.2.2.4

Aspekte

^der

Standardmethode

15

1.2.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

¹⁷

1.2.3.1 Hintergrund

¹⁷

1.2.3.2

Prinzip

der Methode 18

1.2.3.3 Detektionssysteme 19

1.2.3.4

Quantitative

Analyse

²⁴

1.2.3.5

Grundsätzliche Aspekte der Real-Time PCR-Quantifizierung

²⁵

1.2.4

Anwendung

^der

qPCR

ⁱⁿ

^der Lebensmittelmikrobiologie

²⁷

1.2.4.1

Hintergrund

²⁷

1.2.4.2

Aspekte

^der

Anwendung

^von

qPCR ^{in der} Lebensmittelmikrobiologie

²⁸

I

1.2.5

Überprüfung

^der

verfügbaren ^Literatur

³¹

1.2.6

rpoB-Gen

^als

Amplifikationsziel 33

1.2.7

Identifizierung

^von Bakterien mittels

der 16S rDNA-Analyse 35

1.2.7.1

Hintergrund

35

1.2.7.2

Aspekte

^{der 16S}

rf?A/>A-Sequenzenanalyse ³⁶

1.3

Zielsetzung

und Aufbau der Versuche 37

2 Material

39

2.1

Chemikalien 39

2.2

Lösungen

^{und Puffer}

40

2.3 Kulturmedien

40

2.4

Oligonukleotide 43

2.5

PCR-Reagenzien 43

2.6

PCR-Kits

44

2.7 Geräte

44

2.8 Software

44

2.9 DNA-Extraktionsverfahren

45

2.9.1

DNA-Extraktionskit

45

2.9.2

Komponenten

^{des Kits 45}

2.9.3

Genereller Überblick

über das

Arbeitsprotokoll

⁴⁵

2.9.4

Durchführung

⁴⁶

2.10

DNA-Aufreinigungsverfahren

⁴⁷

2.10.1 DNA

Purification

Kit 47

2.10.2

Prinzip der Methode

47

2.10.3

Komponenten ^{des Kits}

⁴⁸

2.10.4

Durchführung

⁴⁸

2.11 Bestimmung der DNA-Qualität

und DNA-Ausbeute 48

2.11.1 Thermo

Scientific NanoDrop

¹⁰⁰⁰

Spektrophotometer

⁴⁸

2.11.2 Prinzip

^der

Messung

⁴⁹

2.11.3 Durchführung ^der Messung

⁴⁹

2.12

Elektrophoretische Trennung ^der

^{DNA 50}

II

2.12.1 Prinzip

der Methode 50

2.12.2 Material 50

2.12.3

Durchführung

⁵¹

2.13

Real-Time PCR 52

2.13.1 Real-Time PCR Gerät 52

2.13.2

Chromo4

Real-Time PCR Detector 52

2.13.3 DNA

Engine Opticon®

²

System,

Version 3.1 53

3

Eigene Untersuchungen

⁵⁴

3.1 Vorversuche mittels Real-Time

PCR-Analyse

⁵⁴

3.1.1 Ziel und Aufbau der Versuche 54

3.1.2 Methode 54

3.1.3

Ergebnisse

⁵⁷

3.1.4 Diskussion 62

3.1.5

Schlussfolgerung

⁶³

3.2

Identifizierung

^der

Geflügelfleischflora

mittels 16S

rRNA-Sequenzenanalyse

⁶⁵

3.2.1 Ziel und Aufbau der Versuche 65

3.2.2

Methode

66

3.2.2.1 Isolation der Bakterien aus den

Geflügelfleischproben

⁶⁶

3.2.2.2

Vordifferenzierung

der Bakterienkolonien mittels

Gramfärbung

⁷⁴

3.2.2.3 DNA-Extraktion

aus

den ausgewählten Bakterienkolonien 74

3.2.2.4

Bestimmung

^der

Qualität und Ausbeute der gewonnenen Nukleinsäuren

⁷⁵

3.2.2.5

Real-Time PCR-Analyse

⁷⁵

3.2.2.6

Aufreinigung ^und elektrophoretische Trennung der PCR-Produkte

⁷⁷

3.2.2.7

Sequenzierung

^der

PCR-Produkte

77

3.2.2.8

BLAST-Analyse und Identifikation der Bakterienspezies

⁷⁷

3.2.3

Ergebnisse 78

3.2.3.1

Auswertung der Kolonienidentitäten 78

3.2.3.2

Auswertung

^des

DNA-Extraktionsverfahrens

⁸⁰

3.2.3.3

Auswertung

^der

^Real-Time

^PCR

Analyse ⁸²

3.2.3.4

Auswertung

^der

post-PCR-Analyse ⁸³

III

3.2.3.5 Auswertung

^der

BLAST-Analyse

⁸⁵

3.2.4 Diskussion 87

3.2.4.1 Identifizierung

^der

Bakterien in Geflügelfleisch

⁸⁷

3.2.4.2 Qualität

^{der 16S}

rRNA-Sequenzierung

⁸⁹

3.2.4.3 BLAST-Analyse

⁹⁰

3.2.5

Schlussfolgerung

⁹¹

3.3

Generieren

^{der Primer 92}

3.3.1

Ziel und Aufbau der Versuche 92

3.3.2

^{Methode 93}

3.3.2.1

Auswahl des

Zielgens

^{für die}

Quantifizierung

der Bakterien 93

3.3.2.2 Generieren der Primer 95

3.3.2.3

Durchführung

^der

PCR-Analysen ^{mit Hilfe}

^von

generierten

^{Primern 98}

3.3.3 Ergebnisse

¹⁰²

3.3.3.1 Auswahl des

Zielgens ^und rpoß-Gensequenzen

¹⁰²

3.3.3.2

Sequenzenalignment ^und Primergenerieren

¹⁰³

3.3.3.3

Primerspezifität

¹⁰³

3.3.3.4

Auswertung

^der

Korrelationsanalysen

¹⁰⁴

3.3.4 Diskussion 108

3.3.4.1 Auswahl des

Zielgens

¹⁰⁸

3.3.4.2 Sequenzalignment ^und Primer-Design

¹⁰⁹

3.3.4.3

Einsatz der

generierten ^Primer

^{in der}

PCR-Analyse

¹¹³

3.3.5

Schlussfolgerung

¹¹⁴

3.4

Korrelationsanalyse

¹¹⁵

3.4.1

Ziel und Aufbau der Versuche

¹¹⁵

3.4.2

Methode

¹¹⁵

3.4.3

Ergebnisse

¹¹⁹

3.4.3.1

Bestimmung der Gesamtkeimzahl

^und

Auswertung

^der

PCR-Analysen

^.119

3.4.3.2

Spezifität

^des

Primerpaares rpoB

^{15 122}

3.4.3.3

Bestimmung

^der

Annealing-Temperatur

^für

^rpoB

^{15 123}

3.4.3.4

Korrelationsanalyse

¹²⁷

IV

3.4.4

^{Diskussion ....128}

3.4.4.1 Korrelationsanalyse

¹²⁸

3.4.4.2 Schmelzkurvenanalyse

¹³⁶

3.4.4.3 Bestimmung

^der

Annealing-Temperatur

^{für das}

Primerpaar rpoB

^{15 137}

3.4.5 Schlussfolgerung

¹³⁸

3.5

Bestimmung

^der

Gesamtkeimzahl in Geflügelfleisch ^mittels qPCR

¹³⁹

3.5.1

Ziel und Aufbau der Versuche 139

3.5.2

^{Methode 140}

3.5.2.1

Erstellung

^einer

Standardkurve mit Hilfe einer Bakterienmischkultur

¹⁴⁰ 3.5.2.2 Absolute

Quantifizierung

^{mit Hilfe}

^der

Standardkurve 140

3.5.3

Ergebnisse

¹⁴²

3.5.3.1

Erfassung

^der

optischen Dichte der Bakterienmischkultur

¹⁴²

3.5.3.2

Auswertung

^der

qPCR-Analysen

¹⁴²

3.5.3.3

Auswertung

^der

ermittelten Keimzahlen

¹⁴⁷

3.5.4 Diskussion 155

3.5.4.1

Erstellung

^einer

geeigneten Kalibrationskurve

^{für die}

qPCR-Analyse

¹⁵⁵

3.5.4.2

Bestimmung der Gesamtkeimzahl

^mittels

qPCR

ⁱⁿ

Geflügelfleisch

¹⁵⁸

3.5.5

Schlussfolgerung

¹⁶⁵

4 Fazit 168

Literaturverzeichnis

¹⁷²

Anhang

¹⁹⁰

Danksagung

²²⁰

Lebenslauf 221

Wissenschaftliche Beiträge und Publikationen

²²²

V