Aus dem Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Evaluierung konventioneller und real-time RT-PCR-Protokolle für die spezifische Diagnose
des Virus der Klassischen Schweinepest
INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Dennis Axel Bente
aus Lingen
Hannover 2003
Wissenschaftliche Betreuung: Apl. Prof. Dr. Irene Greiser-Wilke
1. Gutachter: Apl. Prof. Dr. Irene Greiser-Wilke 2. Gutachter: Prof. Dr. Hassan Naim
Tag der mündlichen Prüfung: 28. November 2003
Für meine Eltern
in Dankbarkeit
1 EINLEITUNG ... 1
2 LITERATURÜBERSICHT... 3
2.1 VIRUS DER KLASSISCHEN SCHWEINEPEST... 3
2.1.1 Das Virus / Ätiologie ... 3
2.1.1.1 Taxonomie... 3
2.1.1.2 Morphologie... 3
2.1.1.3 Physikalische Eigenschaften des Virions ... 3
2.1.1.4 Genom: Organisation und Variabilität... 4
2.1.1.5 Proteine ... 5
2.1.1.6 Antigenität und Immunogenität... 6
2.1.2 Die Klassische Schweinepest... 6
2.1.2.1 Epidemiologie ... 6
2.1.2.2 Wirtsspektrum ... 7
2.1.2.3 Pathogenese... 8
2.1.2.4 Klinik und Pathologie... 8
2.1.2.5 Bekämpfung ... 10
2.1.3 Laboratoriumsdiagnose ... 10
2.1.3.1 Indirekter Erregernachweis ... 11
2.1.3.2 Direkter Erregernachweis... 11
2.2 POLYMERASEKETTENREAKTION NACH REVERSER TRANSKRIPTION... 16
2.2.1 Prinzip... 16
2.2.2 Auswertung der konventionellen PCR und Bestimmung der Spezifität ... 19
2.2.3 Probleme der PCR ... 20
2.2.3.1 Unspezifische Amplifikate ... 20
2.2.3.2 Falsch-positive Ergebnisse ... 21
2.2.3.3 Falsch-negative Ergebnisse ... 21
2.2.3.4 Negative/Positive Kontrollen ... 21
2.2.4 Optimierung der PCR... 22
2.2.4.1 PCR-Ansatz... 22
Matrize ... 22
Primer... 23
Magnesium-Ionen... 23
Nukleotide ... 25
Reverse Transkriptase und DNA-Polymerase ... 25
Reaktionspuffer ... 27
Zusätze ... 28
Inhibitoren ... 28
2.2.4.2 Arbeitsumfeld... 29
Laborausstattung und Geräte ... 29
Überschichtung mit Mineralöl... 29
Thermocycler ... 30
Thermoprofil ... 30
2.2.4.3 Wahl des Enzymsystems für die RT-PCR... 32
2.3 QUANTITATIVE REAL-TIME POLYMERASEKETTENREAKTION (QRT-PCR)... 35
2.3.1 Einleitung ... 35
2.3.2 Real-time PCR Systeme... 36
2.3.3 Nicht spezifische Detektionssysteme ... 38
2.3.3.1 Interkalierende Farbstoffe ... 38
2.3.3.2 Amplifluor™... 40
2.3.4 Spezifische Detektionssysteme mit Hilfe fluorogener Sonden ... 42
2.3.4.1 Hybridisierungssonden... 45
2.3.4.2 Double Dye Sonden... 46
2.3.4.3 Terbium Chelat Sonden... 47
2.3.4.4 Molecular Beacons... 48
2.3.4.5 Scorpions™... 49
2.3.4.6 Minor Groove Binder Sonden ... 50
2.3.5 Reaktionsansatz und Sondendesign... 52
2.3.6 Auswertung... 52
2.3.7 Multiplex real-time PCR ... 56
2.3.8 Quantifizierung ... 56
2.3.8.1 Relative Quantifizierung ... 57
2.3.8.2 Absolute Quantifizierung ... 58
2.3.9 Vergleich real-time RT-PCR und konventioneller RT-PCR ... 60
2.3.10 Einsatz der konventionellen RT-PCR und real-time PCR in der Virusdiagnostik... 61
2.4 PRINZIPIEN DER VALIDIERUNG VON DIAGNOSTISCHEN TESTS... 65
3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN ... 68
3.1 MATERIAL... 68
3.1.1 Zellen und Virusisolate... 68
3.1.1.1 Zelllinie Porcine Kidney (15) Amsterdam (PK(15)A) ... 68
3.1.1.2 Zelllinie Fetale Kälbernierenzellen (FKN) ... 68
3.1.1.3 Virusisolate ... 69
3.1.1.4 CSFV haltiges Organmaterial und Blut... 69
3.1.1.5 Weitere Materialien... 69
3.2 METHODEN... 70
3.2.1 Zellkulturtechnik ... 70
3.2.2 Virusanzucht... 70
3.2.3 RNA-Isolierung ... 70
3.2.3.1 RNA-Isolierung aus Zellkulturlysat ... 70
3.2.3.2 RNA-Isolierung aus Organmaterial und Blut ... 71
3.2.4 Positive und Negative Kontrollen... 72
3.2.5 RT-PCR ... 72
3.2.5.1 Protokoll 1 (nach CANAL et al. 1996)... 73
3.2.5.2 Protokoll 2 (nach DIAZ DE ARCE et al.1998) ... 75
3.2.5.3 Protokoll 3 (nach HARDING et al. 1996) ... 75
3.2.5.4 Protokoll 4 (nach KATZ et al. 1993)... 76
3.2.5.5 Protokoll 5 (nach WIRZ et al. 1993) ... 77
3.2.5.6 Protokoll 6 (nach GREISER-WILKE et al. 1998)... 77
3.2.5.7 Protokoll 7 (nach LOWINGS et al. 1996) ... 78
3.2.5.8 Protokoll 8 (nach VILCEK et al. 1994)... 79
3.2.5.9 BDV-spezifische/BVDV-spezifische PCR... 80
3.2.6 Agarose-Gelelektrophorese... 80
3.2.7 SYBR Green™ real-time PCR... 80
3.2.8 TaqMan real-time RT-PCR ... 81
3.2.8.1 One-tube/one-enzyme nested Protokoll ... 81
3.2.8.2 Two-tube/two-enzyme Protokoll ... 83
3.2.8.3 One-tube/two-enzyme Protokoll ... 85
3.2.9 Auswertung der real-time RT-PCR ... 85
3.2.9.1 Auswertung der SYBR Green™ real-time PCR... 85
3.2.9.2 Auswertung der real-time PCR (TaqMan-Sonde) ... 86
3.2.10 Herstellung der titrierten Virussuspension, recDNA- und recRNA-Standards ... 86
3.2.10.1 Titrierte Virussuspension... 86
3.2.10.2 recDNA-Standard... 87
3.2.10.3 recRNA-Standard ... 90
4 ERGEBNISSE ... 92
4.1 ERGEBNISSE DER LITERATURRECHERCHE... 92
4.2 MODIFIZIERUNG UND OPTIMIERUNG DER RT-PCR-PROTOKOLLE VOR DER UNTERSUCHUNG... 93
4.2.1 Optimierung des Protokolls 4 ... 93
4.2.2 Reverse Transkription ... 94
4.3 EVALUIERUNG DER RT-PCR ... 94
4.3.1 Spezifität... 95
4.3.1.1 Protokoll 1:... 95
4.3.1.2 Protokoll 2:... 97
4.3.1.3 Protokoll 3:... 98
4.3.1.4 Protokolle 4, 5, 6, 7: ... 98
4.3.2 Nachweis von CSFV-Nukleinsäuren ... 100
4.3.2.1 Protokoll 2:... 101
4.3.2.2 Protokoll 4:... 101
4.3.2.3 Protokoll 5:... 102
4.3.2.4 Protokoll 6:... 102
4.3.2.5 Protokoll 7:... 102
4.3.2.6 Protokoll 8 (Panpesti-Protokoll):... 102
4.3.3 Sensitivität ... 105
4.3.3.1 Protokoll 2:... 105
4.3.3.2 Protokoll 6:... 106
4.3.4 Nachweis von CSFV in Organproben ... 107
4.3.5 Auswertung mittels SYBR Green™ real-time PCR ... 108
4.3.5.1 Optimierung der SYBR Green™ real-time PCR... 108
4.3.5.2 Untersuchung der Spezifität ... 108
4.3.5.3 Untersuchung der Sensitivität... 108
4.3.5.4 Untersuchung der Organproben... 111
4.4 TAQMAN REAL-TIME PCR... 111
4.4.1 Etablierung eines TaqMan real-time PCR-Protokolls ... 111
4.4.1.1 One-tube/one-enzyme nested real-time RT-PCR-Protokoll... 111
4.4.1.2 Two-tube/two-enzyme real-time RT-PCR-Protokoll... 113
4.4.1.3 One-tube/two-enzyme PCR-Protokoll... 114
4.4.2 Optimierung der verwendeten TaqMan real-time RT-PCR-Protokolle ... 114
4.4.2.1 Two-tube/two-enzyme System ... 114
4.4.2.2 One-tube/two-enzyme System... 115
4.4.3 Evaluierung der TaqMan real-time RT-PCR ... 116
4.4.3.1 Ermittlung der Spezifität: Kreuzreaktivität mit anderen Pestiviren ... 116
4.4.3.2 Detektion von CSFV-Isolate ... 116
4.4.3.3 Ermittlung der Sensitivität... 117
4.4.3.4 Einsatz des Organmterials ... 120
5 DISKUSSION ... 121
5.1 AUSWAHL DER RT-PCRS, DES PROBENMATERIALS UND DER STANDARDS... 121
5.1.1 Auswahl der Isolate und Organproben ... 121
5.1.2 Auswahl der Standards... 122
5.2 ETABLIERUNG DER RT-PCRS... 123
5.3 VALIDIERUNG... 125
5.3.1 Spezifität... 125
5.3.2 Sensitivität ... 131
5.4 SCHLUSSFOLGERUNG UND AUSBLICK... 135
6 ZUSAMMENFASSUNG... 137
7 SUMMARY... 139
8 LITERATURLISTE... 141
9 ANHANG ... 168
9.1 VERWENDETE VIRUSISOLATE,ORGAN- UND BLUTPROBEN... 168
9.2 ENZYME UND KOMMERZIELL ERHÄLTLICHE SYSTEME... 173
9.2.1 Kommerziell erhältliche Systeme ... 173
9.2.2 Enzyme ... 175
9.3 MEDIEN,PUFFER,LÖSUNGEN,ANTIBIOTIKA... 176
9.3.1 Zellkulturmedien ... 176
9.3.2 Medien für die Bakterienkulturen... 176
9.3.3 Puffer... 177
9.3.4 Lösungen ... 179
9.3.5 Antibiotika ... 180
9.3.6 Wasser... 180
9.4 SONSTIGE REAGENZIEN... 181
9.5 PRIMER- UND SONDENSEQUENZEN... 181
9.5.1 Primersequenzen ... 181
9.5.1.1 CANAL et al. 1996 ... 181
9.5.1.2 DIAZ DE ARCE et al. 1998... 182
9.5.1.3 GREISER-WILKE et al. 1998... 182
9.5.1.4 HARDING et al. 1996... 182
9.5.1.5 KATZ et al. 1993... 182
9.5.1.6 LOWINGS 1996 ... 182
9.5.1.7 VILCEK et al. 1994... 182
9.5.1.8 WIRZ et al. 1993... 183
9.5.1.9 Real-time RT-PCR-Primer nach MCGOLDRICK 1998... 183
9.5.2 Sondensequenz ... 183
9.6 GERÄTE UND GEBRAUCHSGEGENSTÄNDE... 184
9.6.1 Geräte... 184
9.6.2 Verbrauchsmittel ... 188
9.7 REAL-TIME PCR-GERÄT... 190
9.8 SOFTWARE... 190
9.9 ABBILDUNGSVERZEICHNIS... 190
9.10 TABELLENVERZEICHNIS... 194
Verzeichnis der Abkürzungen und Termini technici
A Adenin Abb. Abbildung al. alii (Latein: andere) Amp. Ampicillin
AMV-RT Aviäre Myeloblastosevirus-Reverse-Transkriptase Aqua bidest. Aqua bidestillata, zweifach destilliertes Wasser BD Border Disease
BDV Border Disease Virus Bp Basenpaare
BVD Bovine Virusdiarrhoe
BVDV Bovines Virusdiarrhoe Virus bzw. beziehungsweise
C Cytosin ca. circa
cDNA Komplementäre (synthetische) DNA
CO2 Kohlenstoffdioxid
CSF classical swine fever, Klassische Schweinepest CSFV Classical swine fever virus
d.h. das heißt
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA deoxyribonucleic acid, Desoxyribonukleinsäure ds Doppelstrang
DTT Dithiothreitol E. coli Eschericha coli
EDTA Ethylendiamintetraacetat-Dinatriumsalz EMEM Eagle's Minimum Essential Medium
EU Europäische Union
EURL Europäisches Referenzlaboratorium für Klassische Schweinepest Fa. Firma
FAM 6-Carboxy-Fluorescein FRET Fluorescence resonance energy transfer g Erdanziehungskonstante G Guanin
h Stunde
HANDS Homo-tag assisted non-dimer system HCl Salzsäure
Kat. Katalog Kb Kilobasen
KID50 mittlere kulturinfektiöse Dosis
l Liter
LB Lucia Betrani
log10 Zehnerlogarithmus
µ mikro (x10-6)
m milli (x10-3)
M mol/l mA Milliampere
mAk monoklonaler Antikörper
Min Minute
mM Milli Molar
M-MLV-RT Moloney-Mausleukämievirus-Reverse-Transkriptase NaCl Natriumchlorid
nAk neutralisierende Antikörper
ng Nanogramm nm Nanometer
nM Nano Molar
Nr. Nummer NS-Protein Nichtstrukturprotein
OD optische Dichte
p.i. post infectionem, nach Infektion PBS Phosphat gepufferte Salzlösung
PCR polymerase chain reaction, Polymerasekettenreaktion pg Picogramm
PK "porcine kidney", Schweinenieren
pmol Pico Mol
PO Peroxidase QRT-PCR Quantitative real-time PCR Re. rechts
recDNA Rekombinante DNA
recRNA Rekombinante RNA
RNA ribonucleic acid, Ribonukleinsäure rpm rounds per minute,s.a. UPM
r-RNA Ribosomale RNA
RSq Streuungskoeffizient
RT Reverse Transkription
RT-PCR Polymerasekettenreaktion mit vorgeschalteter Reversen Transkription sec Sekunde
ß beta
T Thymin Tab. Tabelle
TAMRA 6-Carboxy-Tetramethylrhodamin
Tris Trishydroxymethylaminomethan t-RNA Transfer-RNA
U "unit", (Enzymeinheit) UPM Umdrehungen pro Minute V Volt vgl. Vergleiche VI Virusisolierung
Wbb Wasserstoffbrückenbindung
1 Einleitung
Klassische Schweinepest ist wirtschaftlich die wichtigste virale Infektionskrankheit des Schweins. Sie ist weltweit verbreitet und befällt Hausschweine und Wildschweine. In Ländern mit hoher Schweineproduktion führt sie zu Schäden in Milliardenhöhe. Auslöser der Krankheit ist das Virus der Klassischen Schweinepest, ein RNA-Virus, das zum Genus Pestivirus innerhalb der Familie Flaviviridae gehört.
Die Klassische Schweinepest ist international eine Liste A-Erkrankung und in Deutschland anzeigepflichtig. Die Bekämpfungsmaßnahmen sind in der Europäischen Union (EU) einheitlich geregelt und basieren auf der Richtlinie 2001/89/EC. Therapeutische Behandlungen sind grundsätzlich verboten. Seit 1990 besteht in der EU aufgrund handelspolitischer und ökonomischer Aspekte ein generelles Impfverbot für Hausschweine.
Die Tiere eines betroffenen Bestandes werden getötet. Weitere Maßnahmen sind die Errichtung von Sperr- und Beobachtungsbezirken mit Handelsverboten.
Die Klassische Schweinepest ist eine schwere Allgemeininfektion mit perakuter, akuter oder auch chronischer Verlaufsform mit einer vielseitigen Manifestation des Krankheitsbildes. Als charakteristisch gelten hämorrhagische Veränderungen der Haut und der inneren Organe, die allerdings bei Ausbrüchen in den letzten Jahren immer seltener beobachtet wurden. Je nach Virulenz des Virusisolates kann die Mortalität zwischen 20 % und 80 % betragen.
Neben den als typisch angesehenen akuten Krankheitsverläufen treten in den letzten Jahren vermehrt moderate und atypische Verläufe auf. Durch das Fehlen pathognomonischer Symptome kommt differentialdiagnostisch eine breite Reihe von anderen Krankheiten in Frage, was die klinische Verdachtsdiagnose erheblich erschweren und verzögern kann. Ein schneller, zuverlässiger Erregernachweis durch virologische Tests zur Bestätigung der klinisch-pathologischen Verdachtsdiagnose ist daher dringend erforderlich, um die Verbreitung dieses hochkontagiösen Virus zu verhindern und eine rasche Eindämmung des Seuchengeschehens zu ermöglichen.
Nach einem klinischen Verdacht kann die virologische Diagnostik im ersten Schritt mittels direkter Immunfluoreszenz an Gefrierschnitten aus Tonsille, Milz oder Lymphknoten erfolgen. Diese Methode ermöglicht eine rasche Diagnosestellung innerhalb von Stunden.
Allerdings ist sie aufgrund einer hohen Hintergrundfluoreszenz oft nicht aussagekräftig.
Eine hohe Spezifität des zu verwendenden Tests ist aufgrund des breiten Wirtsspektrums der Pestiviren zwingend notwendig. Hierbei sollte eine klare Diskriminierung des Virus der Klassischen Schweinepest von den anderen Pestiviren möglich sein. Als Goldstandard ist die Virusisolierung auf permanenten Nierenzellkulturen definiert, die zusätzlich zum Immunfluoreszenztest zur Bestätigung der Diagnose durchgeführt werden muss. Die Virusisolierung hat eine hohe Sensitivität und Spezifität, ist jedoch sehr zeitaufwendig.
1 Einleitung 2
Zudem kann eine Diagnose erst nach drei, in schwierigen Fällen erst nach sieben Tagen gestellt werden. In diesem Zeitraum kann es angesichts der hohen Kontagiosität des Virus zu einer weiteren Ausbreitung der Seuche kommen. Dies führt durch Tierverluste und den in den Sperrbezirken verhängten Handelsstopp zu hohen wirtschaftlichen Schäden. Ein Testverfahren, das eine schnelle Diagnosestellung bei hoher Spezifität und Sensitivität erlaubt, ist daher äußerst wünschenswert.
Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist eine in vitro-Technik zur enzymatischen Vermehrung eines spezifischen Genomfragmentes. Nach Vorschaltung einer Reversen Transkription (RT) kann diese Methode auch für die Diagnostik von RNA-Viren verwendet werden. Diese relativ junge Methode ist gekennzeichnet durch eine schnelle Durchführbarkeit und eine hohe Sensitivität. Bei Wahl geeigneter Primer ist auch von einer hohen Spezifität auszugehen. Ferner entfällt die Arbeit mit infektiösem Virus. Seit ca. 10 Jahren findet diese Methode auch Verwendung bei der Detektion von Pestiviren. Inzwischen existiert eine Reihe von RT-PCR-Protokollen für die spezifische CSFV-Diagnostik. Bei der konventionellen PCR erfolgt die Auswertung der Reaktion nach Auftrennung der Produkte in einer Agarose- Gelelektrophorese, Färbung der Nukleinsäure mit einem fluoreszierenden Farbstoff, und dessen Visualisierung unter UV-Licht. Bei der Untersuchung großer Probenzahlen ist die PCR-Methodik jedoch sehr arbeitsaufwendig. Des Weiteren steigt bei der Bearbeitung von großen Probenzahlen die Gefahr von falsch-positiven Ergebnissen durch Kontaminationen von Labor und Proben stark an. Da alle positiv diagnostizierten Bestände aufgrund der gesetzlichen Grundlagen zu keulen sind, ist ein falsch-positives Ergebnis fatal.
Eine wesentliche Vereinfachung und Verbesserung könnte durch die real-time RT-PCR erreicht werden. Bei dieser Methode wird bei der eigentlichen RT-PCR ein Fluoreszenz- Markersystem verwendet, das die entstehenden DNA-Fragmente durch ein optisches System computergestützt auswertbar macht. Durch das Wegfallen der aufwendigen Auswertung mittels Agarose-Gel ist diese Methodik wesentlich zeit- und arbeitssparender als die konventionelle RT-PCR. Zum anderen wird dadurch auch die Gefahr einer Kontamination der Proben und des Labors erheblich gesenkt. Bislang gibt es nur wenige veröffentlichte real-time RT-PCR-Protokolle zur Detektion des Virus der Klassischen Schweinepest.
Ziel dieser Arbeit war, alle derzeit verfügbaren konventionellen RT-PCR-Protokolle zur spezifischen Diagnostik der Klassischen Schweinepest auf ihre Verwendbarkeit in der Diagnostik zu validieren. Weiterhin sollte ein real-time PCR-Protokoll etabliert und für den Gebrauch in der Diagnostik validiert werden.
2 Literaturübersicht
2.1 Virus der Klassischen Schweinepest 2.1.1 Das Virus / Ätiologie
2.1.1.1 Taxonomie
Das Virus der Klassischen Schweinepest gehört zum Genus Pestivirus (HORZINEK 1973;
WESTAWAY et al. 1985) innerhalb der Familie Flaviviridae (HORZINEK 1991;
WENGLER 1991). Im internationalen Sprachgebrauch hat sich die Bezeichnung Classical Swine Fever Virus (CSFV) gegenüber der aus dem amerikanischen stammenden Bezeichnung Hog Cholera Virus durchgesetzt, um eine Verwechslung mit dem humanen Hepatitis-C-Virus (HCV) zu vermeiden (RICE et al. 1985; BUTTNER u. AHL 1998). Es ist antigenisch eng verwandt mit dem Virus der Bovinen Virus Diarrhoe (BVDV) und dem Virus der Border Disease (BDV) der Schafe (DARBYSHIRE 1960; HORZINEK et al. 1967; ENZMANN u.
HÄRTNER 1977; ZEEGERS et al. 1976). Weitere Genera innerhalb der Familie Flaviviridae sind das Genus Flavivirus und Hepacivirus (WENGLER et al. 1995).
2.1.1.2 Morphologie
Die Virionen sind sphärische, behüllte RNA-haltige Partikel mit einem Durchmesser zwischen 40 und 60 nm (MOENNIG u. PLAGEMANN 1992). Pestiviren besitzen drei strukturelle Glykoproteine. Diese erscheinen als Projektionen mit einer Größe von 6 bis 8 nm an der Oberfläche (IQBAL et al. 2000; RÜMENAPF et al. 2000). Die Virushülle umkleidet ein wahrscheinlich hexagonal geformtes, elektronendichtes Kapsid mit einem Durchmesser von 30 nm (HORZINEK et al. 1967).
2.1.1.3 Physikalische Eigenschaften des Virions
Bei höheren Temperaturen kommt es zu einer Inaktivierung des Virus. Durch Behandlungen mit Detergenzien und Lipidlösungsmitteln verlieren Pestiviren ihre Infektiosität. Im Gegensatz zu den Flaviviren sind Pestiviren in einem relativ breiten pH-Bereich von etwa pH 5,7 bis 9,3 stabil (HAFEZ u. LIESS 1972; LIESS 1981). In Organen, Muskelfleisch und feuchtem Kot sind sie widerstandsfähiger als in freier Form oder in proteinarmen Medien.
Temperaturschwankungen wie sie z.B. bei Gefrier-Tau-Zyklen zur Freisetzung von zellgebundenem Virus auftreten, beeinflussen den Virustiter nur geringfügig (HAYDON u.
TAYLOR 1963; USHIMI et al. 1969). Das CSFV kann über Jahre bei -70 °C tiefgefroren oder gefriergetrocknet gelagert werden, ohne dass ein größerer Titerverlust eintritt (HORZINEK et al. 1971).
2 Literaturübersicht 4
2.1.1.4 Genom: Organisation und Variabilität
Das Genom der Pestiviren besteht aus einem einzelsträngigen, linearen RNA-Molekül in der Plusstrangorientierung (Abb. 2.1; MOORMANN u. HULST 1988). Es hat eine Länge von ca.
12,5 Kilobasen (kb). Ein einzelner offener Leserahmen (ORF) kodiert für ein Polyprotein von etwa 3900 Aminosäuren Länge (COLLETT et al. 1988a, b; MEYERS et al. 1989a;
MOORMANN et al. 1990a, b), das co- und posttranslationell prozessiert wird (MEYERS u.
THIEL 1996). Das Genom wird von nicht-translatierten Regionen (NTR) flankiert (Abb. 2.1).
Die 5`NTR hat bei Pestiviren eine Länge von 372 bis 385 Basen (BECHER et al. 1998). Sie bildet die internal ribosomal entry site (IRES). Diese ermöglicht eine CAP-unabhängige Bindung an die Ribosomen (SIZOVA et al. 1998). Trotz hoher Konservierung weist die 5`NTR mindestens drei variable Loci auf (HARASAWA 1996). Die Funktion des 3`NTR konnte noch nicht geklärt werden. Die RNA ist nicht polyadenyliert (COLLET et al. 1988a;
MEYERS et al. 1989a; PURCHIO et al. 1983; RENARD et al. 1985). Beide nicht- translatierten Regionen sind unter den Pestiviren hochkonserviert (MEYERS et al. 1989b;
MOORMANN et al. 1990b).
Strukturproteine Nichtstrukturproteine Ableserichtung
5`NTR 3`NTR
Strukturproteine Nichtstrukturproteine Ableserichtung
5`NTR 3`NTR
Abbildung 2-1: Schematische Darstellung des Pestivirusgenoms: An die 5`NTR des Genoms schließen sich die für die Strukturproteine und Nichtstrukturproteine kodierenden Genombereiche an.
Schließlich folgt die 3`NTR.
Pestiviren zeigen im Basensequenzvergleich eine hohe Identität (BECHER et al. 1995;
HOFMANN et al. 1994; VILCEK et al. 1997a). So beträgt die Identität im 5`NTR-Bereich zwischen BDV-Isolaten und CSFV-Isolaten bis zu 80 %, zwischen BDV-Isolaten und BVDV- 1-Isolaten bis 65 % (VILCEK et al. 1997a). Es konnte ferner gezeigt werden, dass das CSFV- Genom auch nach diversen Passagen in Zellkultur genetisch stabil bleibt und das Genom nur geringe bis keine Mutationen zeigt (VANDERHALLEN et al. 1999). Diese geringe Variabilität steht im Kontrast zur Theorie der Quasispezies vieler anderer RNA-Viren (KISS et al. 1999). Dies bedeutet aber auch, dass schon Einzelmutationen im Genom bei phylogenetischen Analysen von Bedeutung sein können (VANDERHALLEN et al. 1999).
Zur Differenzierung von CSFV-Isolaten wurden die Nukleotidsequenzen verschiedener Genomregionen wie z.B. 5`NTR, E2 oder NS5B mit Hilfe phylogenetischer Methoden analysiert (GREISER-WILKE et al. 1998; LOWINGS et al. 1996; PATON et al. 2000c;
VILCEK et al. 1996). Anhand dieser Untersuchungen wurden die genetischen Gruppen (Genotypen) 1 bis 3 definiert. Die Gruppe 1 mit den Untergruppen 1.1 bis 1.3 beinhaltet vor allem Isolate aus den 1940er und 1950er Jahren, sowie Isolate aus der Ukraine, Kroatien,
Mexiko, Thailand und China aus den 1990er Jahren. Zur Gruppe 2 mit den Untergruppen 2.1 bis 2.3 gehören Isolate aus Westeuropa aus den 1980er und 1990er Jahren. Die Gruppe 3 mit den Untergruppen 3.1 bis 3.3 enthält ein Isolat aus Großbritannien (3.1 Isolat Kongenitaler Tremor) sowie Isolate aus Thailand und Korea der 1980er und 1990er Jahre (LOWINGS et al.
1996; PATON et al. 2000c). Durch die genetische Typisierung eines Isolates können epidemiologische Zusammenhänge im Seuchengeschehen gewonnen werden (MOENNIG 2000).
2.1.1.5 Proteine
Aus dem Translationsprodukt der viralen RNA, ein das ganze Genom umfassendes Polyprotein, entstehen durch Prozessierung die einzelnen viralen Proteine (COLLETT et al.
1988b; MEYERS et al. 1989; RÜMENAPF et al. 1991a). Dies sind die vier Strukturproteine, zu denen das Coreprotein (C) und die drei Glykoproteine Erns, E1 und E2 zählen, sowie die sieben Nicht-Strukturproteine Npro, p7, NS2-3, NS4A, NS4B, NS5A und NS5B (COLLETT et al. 1991). Am N-terminalen Ende des Polyproteins befindet sich die Autoprotease Npro, die co-translationell autokatalytische Aktivität zeigt (RÜMENAPF et al. 1993a; WISKERCHEN et al. 1991) und in Zellkultur nicht essentiell für die Virusreplikation ist (TRATSCHIN et al.
1998). Danach folgen die vier Strukturproteine, zuerst das Coreprotein C des Nukleokapsids (THIEL et al. 1991). C-terminal schließen sich die drei Hüllproteine Erns, E1 und E2 an (RÜMENAPF et al. 1989; STARK et al. 1990). Das Glykoprotein Erns ist stark glykosiliert und weist Ribonuklease-Aktivität auf (HULST et al. 1994). Erns induziert im natürlichen Wirt eine Immunantwort mit Ausbildung schwach neutralisierender Antikörper (RÜMENAPF et al. 1991b; WEILAND et al. 1992). Das glykosilierte Hüllprotein E1 besitzt aufgrund seiner hydrophoben Region vermutlich die Funktion eines Membranankers für das Hüllprotein E2 (RÜMENAPF et al. 1993a), mit dem es über Disulfidbrücken E1/E2 Heterodimere bildet (WEILAND et al. 1990). Das Glykoprotein E2 ist das Hauptstrukturprotein (GREISER- WILKE et al. 1990; WEILAND et al. 1990, 1992). Das Strukturprotein E2 ist das Protein der Pestiviren mit der geringsten Aminosäuresequenzidentität, nämlich 80 % innerhalb der Spezies und unterhalb 60 % innerhalb des Genus Pestivirus (BECHER et al. 1998). C- terminal folgt ein kleines, stark hydrophobes Protein (p7), welches sowohl einzeln als auch als Fusionsprodukt mit dem Protein E2 als E2p7 nachgewiesen werden konnte (ELBERS et al. 1996). Über die Funktion dieses Proteins ist bislang nichts bekannt. Der anschließende Bereich des Polyproteins enthält die Nicht-Strukturproteine. Das Protein NS2-3 wird vom CSFV als Fusionsprotein exprimiert (GREISER-WILKE et al. 1992, 1993; THIEL et al.
1991), während bei den cytopathogenen Mitgliedern des Genus Pestivirus die Produkte NS2 und NS3 getrennt exprimiert werden (COLLETT et al. 1988c). Das NS3 Protein enthält bei allen Pestiviren Sequenzmotive, die auf Serinprotease-, NTPase- und Helikaseaktivität hinweisen (MEYERS u. THIEL 1996). Solche Aktivitäten wurden für das NS3 des BVDV nachgewiesen (WARRENER u. COLLETT 1995; WISKERCHEN u. COLLET 1991). Das NS3 ist mit über 90 % konservierten Aminosäuren das am stärksten konservierte Protein der Pestiviren (MEYERS et al. 1989). Das NS4A dient beim verwandten HCV als Kofaktor für
2 Literaturübersicht 6
das als Protease wirkende NS3 (KIM et al. 1996). Die Rolle des NS4B in der Virusreplikation des CSFV ist hingegen unbekannt. Das Protein NS5A-B wird in die Produkte NS5A und NS5B gespalten; das NS5B fungiert als RNA-abhängige RNA-Polymerase (MEYERS et al.
1989; STEFFENS et al. 1999).
2.1.1.6 Antigenität und Immunogenität
Im Verlauf der Infektion kommt es zur Bildung von neutralisierenden Antikörpern (nAk), die jedoch frühestens in der zweiten Woche post infectionem (p.i). im Serum nachweisbar sind (DEPNER et al. 1994; LAEVENS et al. 1999).
Das Virus ist serologisch einheitlich. Es gibt nur einen Serotyp; wobei jedoch antigene Varianten auftreten können, wenn gleich in geringerem Umfang als beim BVDV. Pestiviren sind serologisch untereinander verwandt (DARBYSHIRE 1960; DONIS und DUBOVI 1987).
Eine Unterscheidung zwischen verschiedenen Virusspezies, Stämmen oder Isolaten mit polyklonalen Antikörpern ist schwierig. Gegen die Strukturproteine Erns und E2 gerichtete monoklonale Antikörper (mAk) besitzen neutralisierende Eigenschaften (GREISER-WILKE et al. 1990; PATON et al. 1991; RÜMENAPF et al. 1991). Die antigenen Determinanten, die nAk induzieren, liegen hauptsächlich auf dem E2-Glykoprotein (WENSVOORT et al. 1989a, b). Das Erns-Protein führt dagegen lediglich zur Bildung schwach neutralisierender Antikörper (BOULANGER et al. 1991; WEILAND et al. 1992).
2.1.2 Die Klassische Schweinepest
2.1.2.1 Epidemiologie
Erstmals beschrieben wurde die Klassische Schweinepest 1833 im Staat Ohio in den USA.
Kurze Zeit danach, 1862, trat die Seuche in Großbritannien auf und breitete sich später auf dem Weg über Skandinavien im restlichen Europa aus. Bereits 1903 entdeckten DE SCHWEINITZ und DORSIT die Virusätiologie der Klassischen Schweinepest (DE SCHWEINITZ u. DORSIT 1903). Nordamerika, Australien, Neuseeland und einige Staaten der EU sind nach einigen Jahren bzw. Jahrzehnten strikter Eradikationsmaßnahmen frei von CSF (ANON. 1997). In allen übrigen Gebieten der Erde kommt das CSFV weiterhin vor und richtet erheblichen wirtschaftlichen Schaden an. Stand früher in der EU die hohe Verlustrate der infizierten Tiere von 90 % im Vordergrund, so sind es heutzutage vornehmlich die wirtschaftlichen Aufwendungen in Form von Keulungsprogrammen, finanziellen Entschädigungen und immunprophylaktischen Maßnahmen, die zu hohen wirtschaftlichen Verlusten führen (FRITZEMEIER et al. 2000, GREISER-WILKE et al. 2000; MOENNIG 1993, 2000; TEUFFERT et al. 1998;).
Die Übertragung der Klassischen Schweinepest kann sowohl horizontal als auch vertikal stattfinden. Die horizontale Übertragung erfolgt vor allem durch direkten Tierkontakt, insbesondere durch Zukauf von adulten Schweinen in Mastbetrieben, die eine subklinische persistierende Infektion aufweisen oder nur abgeschwächte Symptome zeigen (DEPNER et
al. 1997a). Die vertikale Übertragung spielt für die Aufrechterhaltung des Seuchengeschehens eher eine untergeordnete Rolle. Tragende Sauen, selbst oft nur subklinisch erkrankt, übertragen das Virus in utero auf den Fetus. Die auf diese Weise infizierten Ferkel können als persistente Virämiker geboren werden (DONE u. HARDING 1966; MEYER et al. 1981;
FREY et al. 1980). Diese Ferkel stellen eine wesentliche Infektionsquelle für nicht infizierte Tiere dar, da das Virus mit sämtlichen Exkreten über Monate ausgeschieden wird. Sie sind zunächst nicht von nicht infizierten Ferkeln zu unterscheiden, erkranken und verenden jedoch einige Wochen bis Monate nach der Geburt an der chronischen Form des CSF (MEYER et al.
1981).
Mit Erregern kontaminiertes Tierfutter ist ein häufiger Weg zur Einschleppung der Viren.
Meist erfolgte dies in den letzten Jahren durch Küchenabfälle, die das Fleisch infizierter Tiere enthielten. Die Infektiosität des CSFV bleibt in nicht erhitzten Fleischprodukten bis zu zweieinhalb Monaten erhalten (HELWIG 1966; EDWARDS 2000). Auch in gefrorenem Fleisch ist das Virus überlebensfähig. Aktuelle Gesetzesrichtlinien verbieten daher das Verfüttern von Speiseabfällen strikt (FRITZEMEIER et al. 2000; ANON. 1999).
Für die Weiterverbreitung der Seuche ist vor allen Dingen der Handel mit infizierten Tieren verantwortlich, aber auch Personen- und Fahrzeugverkehr sind an der Verschleppung des CSF beteiligt (AHL u. BOTAIN 1997; KAADEN et al. 1994; TEUFERT et al. 1998;
FRITZEMEIER et al. 2000).
Schwarzwild ist als Virusreservoir ein weiteres bekanntes Risiko für den Hausschweinebestand. So sind in Deutschland viele Schweinepestausbrüche der jüngsten Zeit auf eine Übertragung des Virus von Wildschweinen auf Hausschweine zurückzuführen. Auch hier spielt der direkte Kontakt (Weide- mit Wildschweinen) oder das Verfüttern von Wildschweinfleisch (Jäger) eine entscheidende Rolle. Epidemiologische Verbindungen zwischen Schwarzwild und CSF-Ausbrüchen sind in Deutschland, Österreich und Sardinien beschrieben worden (FRITZEMEIER et al. 2000; KRASSNIK et al. 1995; LADDOMADA et al. 1994;). Weiterhin geht auch vom internationalen Handel, sowie dem Import von Tieren oder Nahrungsmitteln eine Gefahr der Einschleppung des CSF aus.
2.1.2.2 Wirtsspektrum
Die natürlichen Wirte des CSFV sind Hausschweine und Wildschweine, die im gleichen Maße empfänglich sind (DEPNER et al. 1997a, b; LADDOMADA 2000). Es konnten aber experimentelle Infektionen mit CSFV bei Rindern, Schafen (ZICHIS 1939; DEPNER et al.
1991; DAHLE et al. 1987), Ziegen (VANNIER 1989), Pekaris und Hirschen (LOAN u.
STORM 1968) induziert werden, allerdings ohne dass eine natürliche Übertragung auf Artgenossen oder auf Schweine nachgewiesen werden konnte. Das Fehlen von CSF- Infektionen bei Wiederkäuern in der Natur ist möglicherweise auf die niedrige Prävalenz des Virus im Feld zurückzuführen (MOENNIG u. PLAGEMANN 1992). Darüber hinaus ließ sich CSFV in Kaninchen passagieren und nach hohen Passagezahlen attenuieren (BAKER 1946;
KOPROWSKI et al. 1946). Weiterhin konnten beim Schwein experimentelle und natürliche
2 Literaturübersicht 8
Infektionen mit „ruminaten“ Pestiviren, namentlich mit dem BVDV und BDV, durch Auslösung einer Immunantwort nachgewiesen werden. Nach Infektionen mit dem BVDV können Schweine ein Krankheitsbild entwickeln, das klinisch nicht von der milden Verlaufsform der Klassischen Schweinepest zu unterscheiden ist (DAHLE et al. 1987;
TERPSTRA u. WENSVOORT 1987). Intrauterine Infektionen von Schweinefeten mit BVDV und BDV können pathologisch-anatomisch ebenfalls nicht von einer Infektion mit schwach virulenten CSFV unterschieden werden (PATON u. DONE 1994).
2.1.2.3 Pathogenese
Haupteintrittspforte für das CSFV in den Organismus ist der Mund- und Rachenraum (oronasal) (DONE u. HARDING 1966). Die Inkubationszeit beträgt etwa fünf bis neun Tage (DEPNER et al. 1994). Die primäre Virusvermehrung findet im lymphoretikulären Gewebe des Nasen-Rachenraums und in den regionären Lymphknoten statt (JEMERESIC et al. 2001;
MENGELING u. PACKER 1963). Nach lymphogener Ausbreitung und Virusvermehrung im lymphatischen Gewebe kommt es zur Virämie (RESSANG 1973a), die durch Lymphozyten vermittelt wird (MENGELING u. PACKER 1969). Die erste virämische Phase beginnt 16 bis 24 Stunden nach oraler Infektion (RESSANG 1973a). Der diagnostische Nachweis vom CSFV im Blut mittels Anzüchtung in der Zellkultur oder mittels RT-PCR gelingt allerdings frühestens nach zwei Tagen p.i. (DEPNER et al. 1994; DEPNER et al. 1996; KADEN et al.
1999). Die Ausbreitung des CSFV in lymphoretikuläres und lymphatisches Gewebe von Milz, Lymphknoten, Knochenmark und Peyer`schen Platten wird durch mononukleäre Zellen vermittelt (RESSANG 1973a). Es folgt eine Virusausscheidung über die Schleimhäute des Maul- und Nasenraumes, des Urogenitaltraktes, des Gastrointestinaltraktes sowie über die Konjunktivalflüssigkeit (RESSANG 1973a, b; VAN OIRSCHOT 1983). In der späten virämischen Phase kann Virusantigen in nahezu allen epithelialen Zellen von Tonsillen, Pharynx, Gastrointestinaltrakt, Niere, Nebenniere, Harnblase, Gallenblase, Pankreas, Speicheldrüsen und Schilddrüse nachgewiesen werden (RESSANG 1973a, b). Das CSFV verursacht dabei Schädigungen von Makrophagen, Endothelzellen (vor allem der Gefäße), Epithelzellen und lymphoretikulären Zellen (RESSANG 1973b). In der Hochphase der Krankheit findet man eine ausgeprägte Thrombozytopenie sowie eine Leukopenie, vor allem der B-Zellenpopulation (SUSA et al. 1992). Die Folge ist eine Immunsuppression, an die sich wiederum Sekundärinfektionen anhängen können. Bei akuten Verläufen beobachtet man eine generalisierte Vaskulitis, der sich vermutlich eine Verbrauchskoagulopathie mit disseminierter intravasaler Gerinnung anschließt. Der dabei entstehende Schockzustand kann dann vermutlich zum Tod des Tieres führen (HEENE et al. 1971; HOFFMANN et al. 1971).
Der genaue Pathomechanismus ist aber weiterhin nicht endgültig geklärt.
2.1.2.4 Klinik und Pathologie
Die Klassische Schweinepest verläuft als zyklische Allgemeininfektion mit einem Krankheitsbild, das durch schwere allgemeine sowie hämorrhagische Erkrankungssymptome gekennzeichnet ist. Dabei können verschiedene Verlaufsformen zur Ausprägung kommen: die
akute, die chronische und die „late-onset“-Form (DEPNER 1997a; MOENNIG 1994; VAN OIRSCHOT 1988). Der Verlauf der Klassischen Schweinepest ist sehr variabel und wird durch Eigenschaften des Wirtes und des Erregers bestimmt. Wichtig sind dabei vor allem Alter (junge Tiere erkranken gewöhnlich stärker), Konstitution des Wirtes und Virulenz des CSFV-Isolates (DAHLE u. LIESS 1995; DEPNER et al. 1997a ; LIESS 1987; VAN OIRSCHOT 1988).
Bei der akut verlaufenden Schweinepest sind die ersten klinischen Symptome eine zunehmende Depression der Tiere und ein Anstieg der Körpertemperatur innerhalb von zwei bis sechs Tagen p.i. auf Werte von 41 bis 42 °C. In der Folge werden häufig zunehmende Inappetenz, Augen- und Nasenausfluss, Konjunktivitis, Durchfall oder Verstopfung beobachtet. Im Endstadium der Krankheit treten i.d.R. ein Schwanken der Hinterhand, Krämpfe und die für die Krankheit charakteristischen Veränderungen in Form von petechialen und ekchymatösen Blutungen (=Hämorrhagisches Syndrom) auf, bevorzugt an Schnauze, Ohren, Gliedmaßen und Bauch aber auch an den inneren Organen (MOENNIG 1993;
DEPNER et al. 1997a; LIESS 1987). Die schließlich festliegenden Tiere verenden meist nach acht bis zwanzig Tagen. Die Mortalität liegt zwischen 20 und 80%. Neben den als typisch angesehenen perakuten und akuten Verlaufsformen werden gerade in den letzten Jahren zunehmend mildere oder auch atypische Verlaufsformen mit vollständiger Genesung beobachtet. Sie erschweren die schnelle klinische und pathologisch-anatomische Diagnose und begünstigen angesichts der hohen Kontagiosität des Virus eine verdeckte Ausbreitung des Virus (DAHLE u. LIESS 1995; DEPNER et al. 1996). Hierbei zeigen die Tiere Fieber, Appetitlosigkeit und Lethargie, die charakteristischen Hautveränderungen und zentralnervöse Störungen bleiben jedoch fast immer aus. Einer der dafür verantwortlichen Faktoren ist die Erregervirulenz. Deshalb wurde eine Unterscheidung von hoch-, schwach- und avirulenten Virusstämmen getroffen (VAN OIRSCHOT 1988; MITTELHOLZER et al. 2000).
Als chronische Form der CSF werden Verläufe mit einer Krankheitsdauer von 30 oder mehr Tagen bezeichnet (MENGELING u. CHEVILLE 1968). Die chronische Form der CSF ist meist mild und läuft ohne die typischen klassischen Symptome der CSF ab (DEPNER et al.
1994). Wachstumsverzögerung, Kümmern, intermittierendes Fieber selten über 41 °C, Diarrhöen und Dermatitiden werden hierbei beobachtet (DEPNER et al. 1996; LIESS et al.
1987). Alle Tiere, die an der chronischen Form leiden, sterben nach ca. 2 bis 3 Monaten.
Problematisch erweist sich die Infektion von tragenden Sauen. Einziger klinischer Hinweis auf eine Infektion ist oft nur ein leichter Temperaturanstieg (MEYER 1981; FREY et al.
1980; FLOEGEL et al. 2000). Pränatal kann das Virus jedoch die Plazentarschranke überwinden. Verlauf und Folgen der Infektion in utero sind abhängig vom fetalen Entwicklungsstadium zum Zeitpunkt der Infektion. Bei Infektionen vor dem 40.
Trächtigkeitstag kann es zu Aborten, Mumifizierungen oder zur Geburt toter oder lebensschwacher Ferkel kommen. Eine CSFV-Infektion zwischen dem 65. und 67.
Graviditätstag führt nicht zum fetalen Tod, sondern ein Großteil der Ferkel wird lebendig geboren und ist zeitlebens persistent virämisch, ähnlich wie Kälber bei der BVDV-Infektion
2 Literaturübersicht 10
des Rindes (FREY et al. 1980; LIESS 1974; MEYER et al. 1981). Dies wird dann als „late- onset“ bezeichnet (MEYER et al. 1981).
Das Auftreten und die Ausprägung der Symptome, vor allem bei der akuten Verlaufsform, sind äußerst variabel, so dass man keines der Krankheitssymptome als pathognomonisch bezeichnen kann. Es ist bei der klinischen Diagnosestellung also eine Vielzahl von Differentialdiagnosen in Betracht zu ziehen.
2.1.2.5 Bekämpfung
Die Klassiche Schweinepest ist international eine Liste A-Erkrankung und in Deutschland anzeigepflichtig. Weltweit lassen sich drei Bekämpfungsstrategien unterscheiden (EDWARDS et al. 2000):
1. CSF-freie Staaten (wie z.B. USA, Australien) erheben strenge Kontrollen und Beschränkungen auf die Einfuhr von Schweinen und deren Produkten aus anderen Ländern.
2. Staaten mit sporadischen CSF-Ausbrüchen (wie viele Länder der EU) setzen Bekämpfungsstrategien ohne Impfung ein.
3. Staaten mit endemischer CSF verfolgen eine Bekämpfungsstrategie mit Impfung.
Innerhalb der EU sind die Bekämpfungsmaßnahmen einheitlich geregelt und basieren auf der Richtlinie 2001/89/EC (ANON. 2001). Diese Richtlinie wurde in Deutschland in der
„Verordnung zum Schutz gegen die Schweinepest und Afrikanische Schweinepest (Schweinepestverordnung)“ in national geltendes Recht umgesetzt. Die Bekämpfung basiert auf Anzeigepflicht bei Verdacht, virologisch-diagnostischen Untersuchungen, epidemiologischen Ermittlungen und Errichtung von Sperr- und Beobachtungsbezirken zur Kontrolle des Tierverkehrs. Im Falle eines festgestellten Seuchenausbruchs werden die Schweine des betroffenen Bestandes und seuchenverdächtiger Kontaktbetriebe getötet (Stamping-out).
Therapeutische Behandlungen sind grundsätzlich verboten. Seit 1992 besteht aufgrund handelspolitischer und ökonomischer Aspekte ein generelles Impfverbot für Hausschweine, obwohl eine effektive attenuierte Lebendvakzine zur Verfügung steht (MOENNIG 2000).
Subunit-Marker-Vakzinen, die eine serologische Differenzierung zwischen Impfung und Feldinfektion zulassen, sind innerhalb der EU zwar arzneimittelrechtlich zugelassen, ihr Einsatz in einer Krisensituation wird von Fachleuten aber noch kontrovers diskutiert (MOENNIG 2000, EDWARDS 2000). Die Tilgung der CSF lässt sich derzeit nur durch Eliminierung des CSFV ohne Impfung erreichen.
2.1.3 Laboratoriumsdiagnose
Das variable klinische und pathologisch-anatomische Bild der Klassischen Schweinepest erfordert zur klaren Seuchenfeststellung eine virologische Laboratoriumsdiagnose. Es werden
hier der direkte Erregernachweis, d.h. die Identifizierung des Virus oder des Virusantigens, und der indirekte Erregernachweis, d.h. der serologische Nachweis CSFV-spezifischer Antikörper, unterschieden. Das Office International des Épizooties (OIE) definiert gemäß der Richtlinie 2001/89/EU der Europäischen Union die virologischen Standardmethoden zur Diagnosestellung (ANON. 2000).
2.1.3.1 Indirekter Erregernachweis
Serologische Nachweisverfahren spielen bei akuten CSF-Ausbrüchen eher eine untergeordnete Rolle. Hingegen haben sie bei der Suche nach Zuchtbeständen mit chronischen Verlaufsformen oder gar subklinischen oder persistenten CSFV-Infektionen eine Bedeutung (LIESS et al. 1974). Gegen CSFV gerichtete Antikörper lassen sich beim Schwein nicht vor der vierten Woche sicher detektieren (ANON. 2000). Bei der Infektion mit schwach virulentem Virus können Viren und nAk gleichzeitig im Blut auftreten, was die Laboratoriumsdiagnose erschwert (KORN 1965; VAN OIRSCHOT 1983). Die größte Sensitivität und Spezifität zur Detektion von Virus bietet der Virusneutralisationstest (VNT) (MOENNIG 2000), bei dem Zellkulturen gleichzeitig mit einer definierten Virusmenge und einer Verdünnungsreihe des zu untersuchenden Serums inkubiert werden. Im Fluorescent Antibody-VNT (FAVN) besteht das Indikatorsystem aus mit Fluoreszein gekoppelten Antikörpern (LIESS et al. 1977; RESSANG u. DEN BOER 1969), beim Neutralising Peroxidase-linked Assay (NPLA) werden infizierte Zellen durch an Antikörper gekoppelte Meerrettich-Peroxidase in Verbindung mit einem Substrat und einem Chromogen nachgewiesen.
Da diese Tests verhältnismäßig arbeits- und auch zeitaufwendig sind, wird für die Massenuntersuchung von Blutproben ein Antikörper-Enzym-linked Immunosorbent Assays (ELISA) verwendet.
2.1.3.2 Direkter Erregernachweis
Der direkte Infektionsnachweis ist in all jenen Fällen gefordert, in denen CSF-Infektionsverdacht bei Krankheits- oder Todesfällen geäußert wird (ANON. 1999).
Immunofluoreszenztest
Der Nachweis des CSFV-Antigens erfolgt im ersten Schritt laut EU-Vorgabe mit der Immunofluoreszenz an Gefrierschnitten von Organen betroffener Tiere oder Abklatschpräparaten. Besonders geeignet ist hierfür die Tonsille, da es sich um das primär affine Organ des Virus handelt (RESSANG 1970, 1973a). Ferner eignen sich auch Milz, Niere und das Ileum. Die Färbung der Schnitte erfolgt mit einem so genannten Konjugat, welches CSFV-spezifische Antikörper enthält, an die kovalent Fluoreszeinisothiocyanat gekoppelt ist. Die Auswertung erfolgt unter einem Fluoreszenzmikroskop. Zur Differenzierung von CSFV-Feldisolaten, Vakzinevirus und nicht CSFV-Pestiviren werden jeweils mehrere Schnitte angefertigt und mit verschiedenen mAk gefärbt (MENGELING et al. 1963; WENSVOORT et al. 1986; CAY et al. 1989; EDWARDS et al. 1991). Der Vorteil
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dieses Tests liegt in seiner schnellen Durchführbarkeit, so dass eine Diagnosestellung innerhalb weniger Stunden möglich ist. Nachteilig ist aber, dass dieser Test oft zweideutige Resultate erbringt. Diese sind auf eine hohe Hintergrundfluoreszenz oder eine Maskierung des Antigens durch frühe Antikörper zurückzuführen. Die Auswertung dieser zweideutigen Befunde bedarf daher eines besonders geschulten Personals. Ferner ist von Nachteil, dass das CSFV-Antigen durch Autolyse des umgebenden Gewebes eher zerstört wird, als dass die Infektiosität des kompletten Virus aufgehoben wird, so dass z.B. bei einem Transport der Proben unter suboptimalen Bedingungen (z.B. Transporttemperaturen >10 °C) dieser Test möglicherweise negativ ausfällt, während die kulturelle Virusisolierung positiv verläuft. Es konnte gezeigt werden, dass die Sicherheit des Ergebnisses dieses Methode nur bei ca. 80 % liegt (BOUMA et al. 2001). Die diagnostische Sicherheit dieses Tests ist zwar relativ gering, die diagnostische Brauchbarkeit aufgrund des schnellen Ergebnisses in positiven Fällen oder zusammen mit der kulturellen Virusisolierung ist aber vorhanden.
Virusisolierung in der Zellkultur
Die Virusisolierung (VI) in der Zellkultur ist zurzeit die sicherste Methode zum direkten Nachweis der Infektion und ist daher als Goldstandard definiert (MOENNIG 2000). Sie kann mit Verreibungen der o.g. Organe, Sekreten oder mit Leukozytenfraktionen einer Blutprobe auf permanenten Schweinenierenzellkulturen durchgeführt werden. Zum Nachweis der Infektion werden die infizierten Zellkulturen im Peroxidase-linked Antibody Assay (PLA) gefärbt (HOLM-JENSEN 1981; HYERA et al. 1987). Der Nachweis des infektiösen Virus ist die sicherste Methode. Allerdings ist sie auch sehr arbeits- und zeitaufwendig. Das Ergebnis liegt erst nach drei bis sieben Tagen vor. Enthält die zu untersuchende Probe Substanzen, die toxisch für die Zellen sind, muss das Virus unter Umständen mehrfach passagiert werden, was die Zeitspanne bis zur Diagnosestellung evtl. verdoppelt oder verdreifacht. In diesem langen Zeitraum kann es zur weiteren Ausbreitung des Virus kommen, bzw. müssen die Bauern unter den strikten Kontrollmaßnahmen erhebliche wirtschaftliche Schäden in Kauf nehmen. Da auch BVD-Virus bzw. BD-Virus im Schwein vorkommen und sich potentiell in den verwendeten permanenten Schweinenierenzellkulturen vermehren können, ist eine weitere Differenzierung mit mAk nötig. MAk mit Epitop-Spezifität für das CSFV, BVDV bzw. BDV erlauben eine sichere Identifizierung des Virus. Sie können im indirekten Immunfluoreszenzverfahren oder im indirekten Immunoperoxidase-Test (PLA) angewendet werden.
Antigen-ELISA
Antigen-ELISA-Verfahren zur Untersuchung von Blutproben ermöglichen aufgrund eines höheren Automatisierungsgrades die schnellere Bearbeitung einer bedeutend höheren Probenzahl als es bei der kulturellen Virusisolierung möglich ist. Auch ist keine aufwendige Probenaufbereitung nötig. Zudem kann Probenmaterial wie z.B. Serum direkt eingesetzt werden (CLAVIJO et al. 2001). Alle zurzeit auf dem Markt befindlichen Antigen-ELISAs verfügen allerdings nur über eine mäßige Sensitivität und Spezifität (BELAK und THOREN
2001; FLOEGEL-NIESMANN et al. 2001; HERGARTEN et a. 2001; KADEN et al. 1999a, b; PATON et al. 2000a). Trotz dieses Umstandes sind sie für die Herdendiagnostik geeignet.
Es ist zu betonen, dass positive Reagenten trotzdem kulturell überprüft werden müssen, da falsch positive Befunde nicht selten sind.
Polymerasekettenreaktion
Eine weitere Methode zum direkten Nachweis des CSFV ist die Polymerasekettenreaktion (PCR) nach Reverser Transkription (RT). Nach der Extraktion der RNA aus dem Probenmaterial wird diese mit Hilfe des Enzyms Reverse Transkriptase in komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben und in der eigentlichen PCR, ebenfalls ein enzymatischer Vorgang, wird ein spezifischer Teil des viralen Genoms milliardenfach vermehrt. Das Produkt wird dann sichtbar gemacht und ausgewertet. Seit ca. 10 Jahren findet diese molekularbiologische Methode zunehmend Einzug in die CSFV-Diagnostik. Seither ist eine große Anzahl an PCR-Protokollen erschienen, die sich vor allem auf den 5`NTR aber auch auf den E2-, NS5B- oder NS2-3-Bereich des CSFV-Genoms konzentrieren (PATON et al.
2000a). Als Probenmaterial kann eine Vielzahl von Materialien wie z.B. Blut, Serum sowie diverse Organmaterialien (Tonsille, Milz, Niere, Lymphknoten, Ileum) genutzt werden (DIAZ DE ARCE et al. 1998; THUR u, HOFFMANN 1998). Je nach Ausgangsmaterial ist eine geeignete RNA-Isolierungsmethode notwendig, da gezeigt werden konnte, dass dieser Teilschritt kritisch für das Gelingen der PCR ist (SCHEIBNER 2000). Der RNA- Isolierungsschritt ist bisher der zeit- und arbeitsaufwendigste Teilschritt der PCR und bedarf dringend einer Automatisierung.
Die PCR-Methode ist der Virusisolierung in punkto Zeitaufwand klar überlegen; im Gegensatz zur Virusisolierung in Zellkultur muss auch nicht mehr mit infektiösem Virus im Labor gearbeitet werden. Ähnlich wie beim ELISA und der Immunfluoreszenz ist eine Diagnosestellung innerhalb von Stunden möglich (THUR u. HOFFMANN 1998). Ein bis dato noch hoher Arbeitsaufwand, könnte zukünftig durch eine Automatisierung verringert werden (BELAK u. THOREN 2001).
In einem im Jahre 1999 mit internationaler Beteiligung durchgeführten Ringtest zur Evaluierung der Sensitivität und Spezifität verschiedener diagnostischer RT-PCRs zur CSFV- Diagnose konnte gezeigt werden, dass die RT-PCR der Virusisolierung, dem ELISA und der Immunfluoreszenz in punkto Sensitivität überlegen ist (PATON et al. 2000a). Es zeigte sich jedoch auch, dass die hohe Sensitivität allerdings auch die Gefahr eines falsch-positiven Resultats durch Kontaminationen in sich birgt (PATON et al. 2000a). Daher ist bei der Durchführung dieser Methode den strikten kontaminationsverhindernden Präventionsmaßnahmen im Labor, sowie dem Einsatz einer Reihe von negativen Kontrollen große Bedeutung zu schenken.
Auffällig war des Weiteren eine große Varianz der Ergebnisse, auch wenn verschiedene Laboratorien dieselben PCR-Protokolle verwendeten. Dies zeigt, dass die lokalen Konditionen des Labors, wie z.B. Personal, verwendete Geräte, Arbeitsprozeduren, etc., einen großen Einfluss auf die Ergebnisse haben. Eine Standardisierung der PCR-Methode ist daher
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äußerst erstrebenswert. Erste Versuche dahin gehend, wurden in einem zweiten internationalen Ringtest 2000 unternommen (PATON et al. 2000b). Zwei definierte RT-PCRs wurden in sechs teilnehmenden Laboratorien strikt nach Protokoll durchgeführt. Es konnte eine Verbesserung der Sensitivität und der Reproduzierbarkeit der Ergebnisse erreicht werden. Des Weiteren konnten weniger falsch-positive Resultate als im ersten Ringtest verzeichnet werden (PATON et al. 2000b). Trotzdem ist die Varianz der Ergebnisse und die Anzahl falsch-positiver Resultate als unbefriedigend zu werten, so dass eine Standardisierung und Evaluierung eines zuverlässigen RT-PCR-Protokolls noch aussteht (PATON et al.
2000b).
Kritisch gestaltet sich auch die Spezifität der Methode. Viele PCR-Protokolle wurden nur für eine Detektion von Pestiviren allgemein entwickelt, bzw. wurden nicht auf ihre Spezifität geprüft und lassen daher eine Diskriminierung des CSFV von den anderen Pestiviren nicht zu.
Demzufolge schließt sich an viele PCR-Protokolle, die eine sichere Identifizierung des CSFV- Genoms und eine Diskriminierung des CSFV von anderen Pestiviren erzielen wollen, ein weiterer Analyseschritt in Form einer Sequenzierung, Hybridisierung oder eines enzymatischen Restriktionsenzymverdaus des entstandenen Produktes an. Bis dato (Januar 2003) sind sechs PCR-Protokolle veröffentlicht, die eine Diskriminierung des CSFV von anderen Pestiviren ohne anschließenden Analyseschritt ermöglichen (CANAL et al. 1996;
DIAZ DE ARCE et al. 1998; HARDING et al.1994, 1996; KATZ et al. 1993; SANDVIK et al. 1997; WIRZ et al. 1993;). Eine Evaluierung dieser RT-PCRs fand bis zum heutigen Zeitpunkt nicht statt.
Da die RT-PCR genetisches Material des Virus amplifiziert, ist sie auch dann positiv, wenn kein infektiöses Viruspartikel mehr vorhanden ist, wie z.B. in autolytischem Gewebe oder in Proben konvaleszenter Schweine. Bei autolytischen Proben aus Schlachtkörpern von Haus- oder Wildschweinen, bei denen Zellkultur nicht möglich ist, stellt sie daher die Methode der Wahl dar (DIAZ DE ARCE et al. 1998).
Neben dem Einsatz in der Diagnostik wird die RT-PCR auch im Bereich der molekularen Epidemiologie eingesetzt. Hier ist sie mittlerweile unverzichtbar geworden. Sie stellt die Grundlage für die spätere Sequenzierung der Nukleinsäure des zu untersuchenden Isolates dar. Über die so gewonnene Nukleotidsequenz kann eine Genotypisierung erfolgen und so eine epidemiologische Aussage getroffen werden (Abb. 2.1).
Trotz des geringen Zeitaufwands erfordert die Durchführung der RT-PCR speziell geschultes Personal, teure Arbeitsmaterialien und separate Arbeitsräume. So ist bislang auch nur eine gleichzeitige Bearbeitung von einer begrenzten Probenanzahl möglich (limitierender Faktor ist hier die RNA-Isolierung). Kompensiert wird dieses Problem durch die Möglichkeit des Poolens (Sammelproben) von Proben (DREW et al. 1999).
Um Kontaminations- und Sensitivitätsprobleme der konventionellen PCR zu vermeiden, gehen neue Entwicklungen zum Einsatz der quantitativen real-time PCR. Real-time PCR kombiniert eine computer-gestützte PCR mit einer optischen Detektionstechnologie. Die Methodik basiert auf der Messung und Quantifizierung eines Fluoreszenzfarbstoffs, der als
Marker der eigentlichen PCR zugesetzt wird. Eine Auswertung mittels Agarose-Gel entfällt.
Dadurch werden zusätzlich Zeit- und Arbeitsaufwand gegenüber der konventionellen PCR reduziert. Die Etablierung und Validierung von real-time PCR-Protokollen für die Pestivirusdiagnostik steht heute noch ganz am Anfang. So gibt es für die Detektion des CSFV bis dato (Januar 2003) nur zwei Protokolle (MCGOLDRICK 1998; RISATTI et al. 2003), für BVDV ein (BHUDEVI u. WEINSTOCK 2001) und für BDV ebenfalls ein veröffentlichtes Protokoll (VILCEK u. PATON 2000). Alle Protokolle sind für die Diagnostik nur unzureichend validiert und auch nur in wenigen Laboratorien getestet. Ein validiertes und gemeinhin verwendetes real-time PCR-Protokoll könnte einen hohen Stellenwert in der schnellen und verlässlichen Schweinepestdiagnostik darstellen.
Abbildung 2-2: Das Flussdiagramm zeigt den Arbeitsablauf der molekularen Epidemiologie (BELAK und THOREN 2001)
RT-PCR
Sequenzierung Probe
PCR-Produkt Auswertung (Elektrophorese)
Evtl.
Hybridisierung Vergleich mit
Datenbank
Epidemiologische Daten
Phylogenetische Analyse
2 Literaturübersicht 16
2.2 Polymerasekettenreaktion nach reverser Transkription 2.2.1 Prinzip
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR, polymerase chain reaction) ist seit ihrer Entdeckung vor 16 Jahren zu einer der wichtigsten Techniken in der modernen Biomedizin geworden (MULLIS u. FALOONA 1987). Immer günstiger werdende Reagenzien und eine stetige Vereinfachung und Automatisierung einzelner Teilschritte machen die Technik auch zunehmend für Routineuntersuchungen einsetzbar.
Die PCR ist eine in vitro Technik zur gezielten Vermehrung eines spezifischen DNA-Genomfragmentes, das zwischen zwei Regionen mit bekannter Nukleotidsequenz liegt.
Die PCR ermöglicht die Vervielfältigug (Amplifikation) sehr geringer Nukleinsäuremengen aus den unterschiedlichsten Materialien (MULLIS u. FALOONA 1987). Das Prinzip der PCR lässt sich wie folgt beschreiben (Abb. 2.3): Zunächst erfolgt die Denaturierung der doppelsträngigen DNA (dsDNA), an welche sich am 5`- und 3`-Ende des zu amplifizierenden Bereichs spezifische Oligonukleotide, die Primer, anlagern. Dieser Vorgang wird als Annealing bezeichnet. Die Oligonukleotide werden von einer DNA-abhängigen DNA- Polymerase in Anwesenheit freier Desoxynukleosid-Triphosphate (dNTPs) verlängert (Elongation). Die DNA-Polymerase verlängert den entstehenden DNA-Doppelstrang so lange, bis sie von der DNA „abfällt“ oder die Reaktion unterbrochen wird (Abb. 2.3). Dieser Abbruch kann z.B. durch eine Erhöhung der Inkubationstemperatur auf 95 °C verbunden mit einer wiederholten Denaturierung der dsDNA erfolgen. Kühlt man den Reaktionsansatz in Anwesenheit freier Oligonukleotide auf 40-60 °C herunter, so binden diese in Abhängigkeit ihres mittleren Schmelzwertes (TM-Wertes) an die komplementäre Sequenz der DNA- Matrize. Die Synthese eines weiteren Doppelstranges kann nun wiederholt werden (ERLICH 1989; MULLIS und FALOONA 1987). Die Abfolge dieser drei Reaktionsschritte wird als Zyklus bezeichnet. Diese Zyklen werden zwischen 25 bis 40-mal wiederholt (MÜLHARDT 2002).
Führt man eine PCR durch und verwendet das Produkt als Matrize für eine weitere PCR mit anderen, innerhalb des ersten Fragmentes liegenden Primern, so wird dies als nested (deutsch
= verschachtelt) PCR bezeichnet. Über die nested PCR können sehr geringe Mengen an DNA nachgewiesen werden, da zwei exponentielle Amplifikationen miteinander kombiniert werden. Allerdings erhöht dies auch die Gefahr eines falsch-positiven Ergebnisses (vgl.
2.2.3.2).
Rein theoretisch verdoppelt sich in der PCR die Anzahl an DNA-Molekülen von Zyklus zu Zyklus. Aus einem Zielmolekül würden so innerhalb von dreißig Zyklen etwa eine Milliarde und nach vierzig Zyklen sogar eine Billionen Moleküle. Der rein theoretische Multiplikationsfaktor wäre hier also 2. Tatsächlich liegt der durchschnittliche
Multiplikationsfaktor (bezogen auf die Gesamtreaktion) je Zyklus bei ca. 1,6 bis 1,7 (KAINZ 2000).
Dies liegt daran, dass die Vermehrungsrate am Ende der PCR geringer ist, als in der Mitte der Zyklenanzahl (Abb. 2.4). Zu Beginn und in der Mitte der Reaktion ist der
Anlagerung der Primer Denaturierung der dsDNA
Elongation der Primer durch Polymerase
PCR -Produkt
Elektrophoretischer Nachweis des PCR - Produkts
Anlagerung der Primer Denaturierung der dsDNA
Elongation der Primer durch Polymerase
PCR -Produkt
Elektrophoretischer Nachweis des PCR - Produkts
Abbildung 2-3: Prinzip der Polymerasekettenreaktion: Nach Denaturierung des DNA-Doppelstranges kommt es zur Anlagerung der Primer und damit zur Synthese eines neuen DNA-Stranges durch die Polymerase. Durch Wiederholung dieser Teilschritte entstehen Nukleinsäurefragmente von definierter Länge. Diese PCR-Produkte können nach einer Elektrophorese im Agarose –Gel sichtbar gemacht werden.
Multiplikationsfaktor 2 und die Vermehrungsrate ist exponentiell. Gegen Ende geht die Reaktion in eine lineare und schließlich in eine Plateau-Phase über (Abb. 2.4; KAINZ 2000).
2 Literaturübersicht 18
Zyklenanzahl
L O G P C R P r o d u k t
A A
B B
exponentiell linear Plateau -Phase
Zyklenanzahl
L O G P C R P r o d u t
A A
B B
exponentiell linear Plateau -Phase
Zyklenanzahl
L O G P C R P r o d u k t
A A
B B
exponentiell linear Plateau -Phase
Zyklenanzahl
L O G P C R P r o d u t
A A
B B
exponentiell linear Plateau -Phase
Abbildung 2-4: Theoretischer (A) und tatsächlicher (B) Verlauf einer PCR-Reaktion; rein theoretisch bleibt die PCR-Effizienz bis zum Ende der Reaktion exponentiell. In der Praxis geht die PCR-Effizienz nach einer exponentiellen Phase in eine lineare und schließlich in eine Plateau-Phase über.
Das Phänomen der Verringerung der Vermehrungsrate während einer PCR hat mehrere Ursachen. So wird zum einen die Aktivität der Polymerase durch die Bindung an neu synthetisierte Produkte (ab einer Konzentration von ca. 0,3-1 pmol; MÜLHARDT 2002) und anfallende Pyrophosphate reduziert. Es konnte diesbezüglich gezeigt werden, dass die Polymerase sequenzunspezifisch an diese neu synthetisierten Produkte bindet (KAINZ 2000).
Wenn große Mengen an neu synthetisierten Produkt anfallen, ist die Wahrscheinlichkeit eines Reannealings des neu synthetisierten Produktes größer, als das Annealing zwischen DNA- Strang und Primern. Dies wiederum senkt die Effektivität der PCR.
Als zweites kommt es zur Zerstörung der Polymerase sowie der dNTPs durch wiederholt hohe Temperaturen während des Denaturierungsschritts. Auch werden im Verlauf der Reaktion dNTPs und Primer durch Einbau in neusynthetisierte Produkte verbraucht. Diese Reduktion von Reaktionsprodukten führt ebenfalls zum Rückgang der Vermehrungsrate der PCR (KAINZ 2000).
