Arbeitsumfeld

Zur Vermeidung von Kontaminationen sollten die PCR-Arbeitsplätze räumlich getrennt von anderen Arbeitsplätzen sein. Zusätzlich ist eine Abtrennung der verschiedenen Bereiche der PCR notwendig. So ist ein separater Bereich für Nukleinsäure-Isolierung, Vorbereitung des PCR-Reaktionsansatzes und Post-PCR Analysenbereich erstrebenswert. Um das Kontaminationsrisiko weiter zu senken, sollten gestopfte Einweg-Pipettenspitzen aus Plastik verwendet werden. Des Weiteren sollten während des gesamten Handlings der PCR Latexhandschuhe getragen werden, die regelmäßig gewechselt werden. Geregeltes Entfernen des nukleinsäurehaltigen Abfalls und regelmäßige Dekontamination der Raumluft und der Oberflächen können das Kontaminationsrisiko weiter minimieren.

Tabelle 2-4: Übersicht häufiger PCR Beschleuniger und Inhibitoren²

Substanz Beschleunigung Inhibition

Dimethylsulfoxid (DMSO) <10 % >10 %

EDTA --- >0,5%mM

Formamid <5% >5%

Glycerin 10-15% >15%

Heparin --- >5 u

Natriumdodecylsulfat (SDS) --- >0,01%

Nonidet P40 <5% >5%

Polyethylenglykol-6000 5-15% >15%

Triton X-100 <1% >1%

TWEEN-20 0,1-2,5% >2,5%

Überschichtung mit Mineralöl

Bis vor wenigen Jahren wurden die Reaktionsansätze mit Mineralöl überschichtet, um so ein Verdunsten des Reaktionsansatzes und eine Kondensation am Gefäßdeckel zu verhindern (MEZEI 1990). Die neuen Thermocycler besitzen einen heizbaren Deckel, der eine Hitzebarriere über dem Reaktionsgefäß schafft. So wird eine Kondensation am Deckel verhindert. Kondensation findet allerdings trotzdem statt. Oft sammeln sich Tröpfchen am

2 Nach Mülhardt 2002

2 Literaturübersicht 30

Gefäßrand zwischen Heizblock und beheiztem Reaktionsgefäßdeckel. Dieser Vorgang hat keinen Einfluss auf große Volumina, doch bei Reaktionsansätzen, die kleiner sind als 20 µl, kann es durch die verdunstete Flüssigkeit zu Konzentrationsverschiebungen kommen. In solchen Fällen hilft es, den Reaktionsansatz mit Mineralöl zu überschichten (WILLIAMS 1989).

Thermocycler

Die ersten Thermocycler, die für die PCR verwendet wurden, bestanden aus drei unterschiedlich beheizten Wasserbädern, bei denen die PCR-Gefäße erst von Hand und mit Stoppuhr, später dann mit Robotorarmen von Bad zu Bad umgesetzt wurden. Seit einigen Jahren gibt es relativ kleine, kompakte Geräte, in denen die Gefäße in einem Metallblock stehen, der zyklisch aufgeheizt und abgekühlt wird. Andere Geräte arbeiten mit drei separaten Metallblocks und erfordern ein automatisches Umsetzen der Gefäße. Sie besitzen zwar einige Vorteile, scheinen sich aber am Markt nicht durchzusetzen. Wesentliches Unterscheidungsmerkmal der heutigen Thermocycler ist ihre Heiztechnik, die entweder auf der Basis von Peltier-Elementen oder mit Hilfe von Flüssigkeiten funktioniert. Jüngste Entwicklungen auf diesem Gebiet zielen auf einen drastischen Zeitgewinn durch Miniaturisierung hin (PCR in einer Glaskapillare mit sehr geringem Volumen). Der Thermocycler muss akkurat und reproduzierbar die drei Inkubationstemperaturen des PCR-Zyklus ansteuern und halten. Es sollte dabei möglichst wenig Variation der Temperatur geben. Außerdem sollte die Zeit zwischen den drei Inkubationszeiten des PCR-Zyklus (ramping-time) möglichst kurz sein (MOSSA et al. 1991).

Thermoprofil

In der Regel gilt die Zyklenzahl von 25 bis 30 als optimal. Wie oben schon erwähnt, kann die Zykluszahl nicht unendlich hoch gewählt werden. Es sollte vermieden werden, weit in den Plateaubereich der PCR-Reaktion vorzudringen, da es in diesem Bereich nicht nur zur starken Abnahme der Neusynthese, sondern auch zu verstärkten Fehlhybridisierungen kommt.

Denaturierung (Trennung des DNA-Doppelstranges)

Durch Erhitzen des Reaktionsgemisches auf eine Temperatur von 95 °C wird die dsDNA durch Auflösung der Wasserstoffbrückenbindungen (Wbb) voneinander getrennt. Da die DNA vor dem ersten Zyklus der PCR in einer noch recht komplexen hochmolekularen Struktur vorliegt, wird zu Beginn eine initiale einmalige Denaturierungstemperatur von 95 °C für 1 bis 5 min gewählt. Eine vollständige Denaturierung ist wichtig für eine akkurate PCR.

Wird die dsDNA nicht komplett denaturiert, wirkt sich dies in einer deutlichen Herabsetzung der Annealing-Effizienz der Primer aus, da nicht alle Ziel-DNAs aus ihrem zweisträngigen Zustand einzelsträngig vorliegen. Die Denaturierung setzt schon bei einer Temperatur ab 70 ° C ein. Andererseits werden weitere Komponenten der Reaktion unter der hohen Temperatur zerstört. Die Denaturierungszeit muss daher so kurz wie möglich gehalten werden. Bei modernen Thermocyclern reichen daher Zeiten von 10 - 30 Sekunden.

Annealing (Anlagerung)

Die Primer lagern sich über Wbb an den jeweiligen komplementären Strang an. Die Annealingtemperatur richtet sich ausschließlich nach den Primern, die verwendet werden. Sie liegt normalerweise zwischen 40 °C und 65 °C. Um die genaue Temperatur für das Annealing der Primer zu finden, berechnet man die Schmelztemperatur (TM). Die Schmelztemperatur ist definiert als diejenige Temperatur, bei der die Helixstruktur (zwischen Primer und Zielstrang) zur Hälfte verloren gegangen ist. Sie ist abhängig von der Basenzusammensetzung und wird wie folgt berechnet:

Eine genauere Formel stammt von BALDINO et al. (1989):

J = Konzentration monovalenter Kationen in mol/l

% G + C = Anteil der Basen Cytosin und Guanin in Prozent n = Anzahl der Nukleotide

Die Annealingtemperatur sollte man grundsätzlich 5 bis 10 °C niedriger wählen. Für fast alle PCR-Reaktionen muss die Annealingtemperatur empirisch optimiert werden. Die Wahl der richtigen Primer-Annealingtemperatur ist essentiel für die Etablierung einer spezifischen PCR (RYCHLICK et al. 1990). Mittlerweile gibt es viele Programme auf dem Markt (z.B. Pride 1.2, PrimerDesign 1.10, PCheck), die nicht nur die (theoretische) Schmelztemperatur (TM -Wert) des Primers errechnen, sondern auch potentielle Sekundärstrukturen ermitteln. Es ist zu betonen, dass die optimale Annealingtemperatur oft nur empirisch bestimmt werden kann.

Zusammenfassend lässt sich sagen:

Elongation (Verlängerung des Stranges)

Primer dienen als Startpunkte für die DNA-Polymerase, die die matrizenabhängige Synthese des komplementären zweiten Stranges katalysiert. Die Elongation wird beim Temperaturoptimum der verwendeten Polymerase durchgeführt. Die Elongationszeit sollte der Größe des erwarteten Amplifikats angepasst werden. Ist die Zeit zu kurz, kann die

TM = 81,5 + 16,6 (log10[J⁺] + 0,41 (% G + C) – (675/n)

Zu hohe Annealingtemperatur Æ kein Annealing und damit kein PCR Produkt Zu niedrige Annealingtemperatur Æ Fehlpaarung und damit unspezifische PCR

Produkte

TM = 4 (Anzahl G und C) + 2 (Anzahl A und T)

2 Literaturübersicht 32

Polymerase den Strang nicht mehr vollständig beenden. Ist sie hingegen zu lang, bleibt der Polymerase Zeit, Veränderungen an den Amplifikaten vorzunehmen. Dabei ist also die Aktivität der Polymerase zu beachten. Üblicherweise rechnet man 0,5 bis 1 min je Kilobasen Länge für die Taq- und andere gängige Polymerasen und 2 min je Kilobasen für die Proofreading Polymerase. Nach dem letzten Zyklus wird oft ein zusätzlicher 5 bis 15 minütiger Elongationsschritt bei 72 °C angehängt, um nur partiell verlängerte Produkte zu vervollständigen.